CN114806953A - 一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌 - Google Patents

一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌 Download PDF

Info

Publication number
CN114806953A
CN114806953A CN202210498278.0A CN202210498278A CN114806953A CN 114806953 A CN114806953 A CN 114806953A CN 202210498278 A CN202210498278 A CN 202210498278A CN 114806953 A CN114806953 A CN 114806953A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fwjl
lactobacillus gasseri
diabetes
lactobacillus
gasseri
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210498278.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114806953B (zh
Inventor
孙嘉
潘礼龙
李彬彬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202210498278.0A priority Critical patent/CN114806953B/zh
Publication of CN114806953A publication Critical patent/CN114806953A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114806953B publication Critical patent/CN114806953B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌，属于微生物技术领域。本发明的格氏乳杆菌FWJL‑4具有良好的耐受人体消化道不良环境的能力，例如，具有优异的胃肠液耐受性和胆盐耐受性，能够抑制肠内有害的病原菌、能较好的黏附于人体肠上皮细胞，具有良好的益生特性。本发明的格氏乳杆菌FWJL‑4具有较好的降血糖能力，将筛选得到的格氏乳杆菌FWJL‑4与鼠李糖乳杆菌GG相比，在降低1型糖尿病小鼠(NOD小鼠)饮食量、饮水量以及血糖等方面具有很好的优势，可以作为一种具有良好产业前景的微生物药物或产品，对改善1型糖尿病起到积极的作用。

Description

一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌
技术领域
本发明涉及一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌，属于微生物技术领域。
背景技术
近年来的研究发现肠道菌群在人类健康和疾病中发挥着举足轻重的作用。肠道菌群可通过影响宿主的功能如代谢、消化及肠道黏膜的完整性和免疫反应来发挥作用。肠道菌群紊乱指肠道微生物组成发生持续性失衡，导致病原微生物数量相对增多，肠道菌群代谢物含量异常。大量研究表明，肠道菌群紊乱参与了多种疾病的发病机制。
1型糖尿病(type 1 diabetes，T1D)常发生于儿童和青少年，其发病率正在呈逐年上升的趋势。据统计，全世界约有1000多万的T1D患病人群，而我国T1D总体人数就达600万，居世界第一。T1D起病急、病情重、社会认知度较低，患者如得不到及时诊治和管理，将受到生命威胁，且严重影响生长发育并带来沉重的社会经济负担。目前尚未找到对T1D发病机制有明确效果的特定药物，给患者注射胰岛素仍然是主要的干预手段。因此，寻求安全有效的T1D防治手段已成为人们重点关注的热点。益生菌及其代谢物因其具有整合环境因素、影响肠道稳态及调控宿主免疫反应的作用而在T1D预防和治疗中备受关注。据报道，某些益生菌的代谢物或细胞成分能够通过调节机体免疫来影响T1D的发病进程。因此，使用益生菌或益生菌的代谢产物，或用益生元、改善饮食等方式调节肠道菌群或能够正向调节免疫系统和能量平衡，从而延缓或防止1型糖尿病的发生发展。
乳杆菌属于人体消化道内的主要菌属，是最早发现的益生菌之一。乳杆菌与人类生活密切相关，是广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵及医疗保健领域的有益微生物之一。格氏乳杆菌作为乳杆菌的一种，是母婴肠道的主要优势菌，可产黏附素、细菌素、胆盐水解酶等物质，其胞外多糖还可抗炎和抑癌，因此赋予了其能够耐受人体极端环境(如胃酸、胆盐、消化酶等)的特性，更具有黏附人体肠道上皮从而发挥调节机体免疫的作用。目前国内外对于格氏乳杆菌防治T1D的研究较少，其对T1D的具体作用机制还有待深入探索，若采用可管控血糖的格氏乳杆菌活菌或其代谢物给药治疗，将给T1D的治疗带来极大的便利。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一株具有益生菌特性并能够改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)FWJL-4。
本发明提供了格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)FWJL-4，已于2022年4月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62365，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。为简便描述，以下将格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)FWJL-4简称为“格氏乳杆菌FWJL-4”。
所述格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri FWJL-4是从中国健康婴儿粪便中分离筛选得到的一株具有潜在益生特性的格氏乳杆菌。
本发明还提供了含有所述格氏乳杆菌FWJL-4的益生菌制剂。
在一种实施方式中，所述益生菌制剂含有所述格氏乳杆菌FWJL-4的活细胞和/或细胞代谢物、灭活的细胞。
在一种实施方式中，所述益生菌制剂中格氏乳杆菌FWJL-4的数量≥1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
本发明还提供含有所述格氏乳杆菌FWJL-4的药物。
在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的载体。
本发明还提供所述格氏乳杆菌FWJL-4在制备抑制肠道致病菌、预防和/或治疗1型糖尿病的药物中的应用。
在一种实施方式中，所述肠道致病菌包括但不限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、屎肠球菌((Enterococcus faecium))中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述预防和/或治疗1型糖尿病包括但不限于如下至少一种功能：
(1)降低空腹血糖；
(2)缓解因1型糖尿病引起的饮食量异常增加；
(3)缓解因1型糖尿病引起的饮水量异常增加。
本发明还提供含有所述格氏乳杆菌FWJL-4的食品、功能性食品、特殊医学用途配方食品或保健品。
在一种实施方式中，所述食品包括但不限于应用所述格氏乳杆菌FWJL-4发酵制备的发酵食品或饮品。
本发明还提供所述格氏乳杆菌FWJL-4在制备有助于维持血糖健康水平的功能性食品或保健品中的应用。
有益效果：本发明所分离的格氏乳杆菌FWJL-4是一种功能性乳酸菌，具有良好的耐受人体消化道不良环境的能力，例如，具有优异的胃肠液耐受性和胆盐耐受性，能够抑制肠内有害的病原菌、能较好的黏附于人体肠上皮细胞，具有良好的益生特性。本发明的格氏乳杆菌FWJL-4具有较好的降血糖能力，将筛选得到的格氏乳杆菌FWJL-4与鼠李糖乳杆菌GG相比，在降低1型糖尿病小鼠(NOD小鼠)饮食量、饮水量以及血糖等方面具有很好的优势，可以作为一种具有良好产业前景的微生物药物或产品，对改善1型糖尿病起到积极的作用。
生物材料保藏
格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)FWJL-4，分类学命名为Lactobacillusgasseri，已于2022年4月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62365，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1为格氏乳杆菌FWJL-4的菌落形态图。
图2为格氏乳杆菌FWJL-4革兰氏染色的菌体形态图。
图3为格氏乳杆菌FWJL-4用乳杆菌特异性引物扩增的电泳鉴定图。
图4为格氏乳杆菌FWJL-4在模拟消化液中的存活率。
图5为格氏乳杆菌FWJL-4的抑菌效果图。
图6为格氏乳杆菌FWJL-4对人肠上皮细胞的黏附能力。
图7为格氏乳杆菌FWJL-4对NOD小鼠体重的影响。
图8为格氏乳杆菌FWJL-4对NOD小鼠饮食量的影响。
图9为格氏乳杆菌FWJL-4对NOD小鼠饮水量的影响。
图10为格氏乳杆菌FWJL-4对NOD小鼠空腹血糖的影响。
**表示p＜0.01，*表示p＜0.05。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
鼠李糖乳杆菌GG(ATCC 7469)获取自美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)；格氏乳杆菌FWJL-4分离自江苏省无锡市纯母乳喂养健康婴儿粪便。金黄色葡萄球菌ATCC25923、肠沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌ATCC 25922、单核细胞增生李斯特菌ATCC 13932获取自美国典型微生物菌种保藏中心。屎肠球菌E27获取自江南大学食品生物技术中心。
实施例1格氏乳杆菌FWJL-4的筛选及鉴定
1.格氏乳杆菌FWJL-4的筛选
1.1样品来源
本发明所使用的菌株分离自江苏省无锡市纯母乳喂养健康婴儿粪便。
1.2菌株的分离纯化
取大约5g新鲜样品用无菌管收集，立即送至实验室进行菌株分离。取1g样品放入9mL的MRS肉汤培养基中，涡旋混匀后于37℃在厌氧培养箱中富集培养48h；然后在超净台中吸取富集液1mL，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取10-6、10-7、10-8三个稀释梯度，每个梯度取菌液100μL涂于MRS琼脂培养基上，于37℃厌氧培养48h。培养结束后，从琼脂培养基中选择生长有50-150个单菌落的平板，挑取形态、大小、颜色不同的菌落，在MRS琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到MRS肉汤培养基增菌培养。得到的菌株均在含40％甘油的MRS肉汤培养基中于-80℃冷冻保存。
MRS培养基：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、葡萄糖20g、吐温-80 1mL、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌。
2.格氏乳杆菌FWJL-4的鉴定
2.1菌落特征
格氏乳杆菌FWJL-4在MRS琼脂培养基培养48h后，直径在0.3-1.5mm之间，菌落圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑，见图1。
2.2显微镜下形态：
格氏乳杆菌FWJL-4菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，短杆状，单个、成对或成簇分布，两端呈圆形，见图2。
2.3乳杆菌特异性引物扩增及16S rDNA鉴定
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，将提取的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用乳杆菌特异性引物进行PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为550bp左右，见图3。随后，采用细菌通用引物27F和1492R进行16S rDNA的PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.2Kbp左右，引物将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO.1所示。在NCBI网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与格氏乳杆菌的16S rDNA序列同源性超过99％。
将菌株FWJL-4的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的乳酸菌FWJL-4为格氏乳杆菌FWJL-4(Lactobacillus gasseri)FWJL-4。
实施例2格氏乳杆菌FWJL-4菌株消化液耐受性的确认
1.模拟消化液的制备
1.1模拟唾液的制备方法：将PBS灭菌后，加入3g/Lα-淀粉酶(购于美国Sigma公司，货号：9000-90-2，酶活300-1500U/mg蛋白)、6.2g/L NaCl、2.2g/L KCl、0.22g/L CaCl2和1.2g/L NaHCO3，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟唾液。
1.2模拟胃液的制备方法：将PBS灭菌后，加入3.0g/L胃蛋白酶(购于美国Sigma公司，货号：9001-75-6，酶活≥2000U/mg蛋白)，3g/L NaCl、1.1g/L KCl、0.15g/L CaCl2和0.6g/L NaHCO3，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液。
1.3模拟肠液的制备方法：将PBS灭菌后，加入3g/L牛胆盐(购于美国Sigma公司，货号：48305)、0.1g/L脂肪酶(购于美国Sigma公司，货号：9001-62-1，酶活≥20,000U/mg蛋白)、1g/L胰蛋白酶(购于美国Sigma公司，货号：9002-07-7，酶活1,000-2,000U/mg蛋白)、5g/L NaCl、0.6g/L KCl、0.3g/L CaCl2和0.6g/L NaHCO3，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液。
2.消化液耐受性实验方法：
将所述格氏乳杆菌FWJL-4菌株在MRS培养基中活化培养两代，离心洗菌两次，收集菌体，先重悬至1mL模拟唾液中5min，然后将细胞离心(4℃，12000rpm，2min)并重悬于2mL模拟胃液中，并在37℃温育2h。同时用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌率。每个样品重复3次，求平均值。
随后，将已消化2h的人工含菌胃液再次离心(4℃，12000rpm，2min)并重悬于2mL模拟肠液中，并在37℃下孵育2h。最后将菌悬液稀释后接种于MRS琼脂上，在37℃厌氧条件下培养36-48h。用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌率。根据下式分别计算菌株在模拟胃液以及模拟肠液中的存活率。
存活率(％)＝LogN1/LogN0×100
其中，N1代表经过模拟胃液或者模拟肠液处理后菌株体系中的活菌数；N0代表菌株体系中的初始活菌数。
实验结果如图4所示，由图4可知，格氏乳杆菌FWJL-4在模拟胃液(pH＝2.5)条件下存活2h后的活菌数呈现下降的趋势，在2h时的存活率为96.33％，在pH＝2.5人工胃液中37℃保持2h后，转入pH＝8.0的人工肠液中保持2h，其存活率高达91.32％。
由上述实验结果可知，本发明提供的所述格氏乳杆菌FWJL-4具有优良的胃肠液耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，并存活于包括人在内的动物的胃肠器官内，发挥健康功效，而上述特性是菌株作为益生菌的基础。
实施例3格氏乳杆菌FWJL-4抑菌效果评价
1.菌株发酵液的制备
将于甘油管中保存的菌株先在MRS琼脂平板上划线活化2-3次，然后挑取单菌落在MRS肉汤培养基中扩大培养18h(于37℃厌氧条件下培养)，将培养液用蒸馏水调整至菌体浓度为1×109CFU/mL，4℃，8000r/min离心20min，收集上清液即为菌的发酵上清液。
2.菌株抑制致病菌的效果
使用牛津杯法检测格氏乳杆菌FWJL-4对几种主要肠道致病菌(包括金黄色葡萄球菌ATCC 25923、肠沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌ATCC 25922、单核细胞增生李斯特菌ATCC13932和屎肠球菌E27)的抑制作用。具体而言，将37℃下孵育16-24h(约1×109CFU/mL)的不同致病菌涂布于各自的固体培养基上，将牛津杯小心地放在培养基上，每杯加入200μL上述细菌上清液。在37℃培养24h后，测定抑菌圈直径。抑菌圈直径评分如下：≤7mm(无，-)；7-15mm(弱，+)，>15mm(强，++)。将青霉素(30mg/mL)用作阳性对照。相应的液体培养基用作阴性对照。每个样品重复3次，求平均值。
实验结果如图5和表1所示，由图5和表1可知，本发明筛得的格氏乳杆菌FWJL-4发酵上清液的具有较强的抑菌效果。
表1 菌株对不同致病菌的抑制结果
Figure BDA0003633740890000061
由上述实验结果可知，本发明提供的所述格氏乳杆菌FWJL-4相较鼠李糖乳杆菌GG具有较好的抑制致病菌的效果，该特性是菌株作为益生菌的基础。
实施例4格氏乳杆菌FWJL-4对人肠上皮细胞的黏附能力
1.人结肠腺癌(Caco-2)细胞系的培养
以人结肠腺癌(Caco-2)细胞系(获自中国细胞库)为靶细胞，检测乳酸杆菌对肠上皮细胞的细胞粘附。将Caco-2细胞在含1％青霉素-链霉素和10％胎牛血清的DMEM细胞培养基中复苏后，置于37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。待细胞稳定后，将Caco-2细胞接种在24孔培养板(2×105个细胞/孔)中并孵育至融合。
2.格氏乳杆菌FWJL-4与Caco-2细胞共培养
在黏附之前，用无菌PBS清洗掉每个孔中的培养基，并加入预热过的不含抗生素的新鲜培养基。将过夜培养的新鲜细菌细胞(108CFU/mL)用无菌PBS洗涤两次后添加到每个孔中。在37℃共培养3h后，用无菌PBS洗涤细胞两次。随后将细胞用胰蛋白酶/EDTA在37℃下处理3min。将来自每个孔的悬浮液转移到生理盐水中进行10倍梯度稀释，然后接种到MRS琼脂板上。37℃厌氧条件下培养36-48h后计数菌落总数。通过测定黏附之前的细菌数和黏附后的细菌数来计算黏附率。每个样品做3个平行，求平均值。
黏附率(％)＝C1/C0×100
其中，C1代表黏附在Caco-2细胞上的细菌总数；C0代表处理前的细菌总数。
结果如图6所示，与鼠李糖乳杆菌GG相比，本发明筛得的格氏乳杆菌FWJL-4对肠上皮细胞具有较强的黏附能力。
由上述实验结果可知，本发明提供的所述格氏乳杆菌FWJL-4相较鼠李糖乳杆菌GG具有较好黏附肠上皮细胞的能力，保护肠道粘膜，防止致病菌的侵袭，抵御肠道炎症类疾病，如炎症性肠病等。此外，该益生菌能更好的黏附于机体细胞，有助于更好地定植于肠道中，从而发挥益生作用。
实施例5格氏乳杆菌FWJL-4对抗生素的敏感性
将八种抗生素(万古霉素、氯霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、红霉素和氨苄青霉素)用适当的溶液溶解并过滤。将格氏乳杆菌FWJL-4菌株以及从同一样品中同批筛得的两株格氏乳杆菌在添加了不同终浓度(2、4、8、16、32、64、128、256、512和1024μg/mL)抗生素的MRS肉汤中37℃厌氧培养24-36h。每个样品重复3次。培养完毕后测定96孔板中OD610nm处的吸光值。MIC(最小抑菌浓度)被认为是可以抑制菌株生长的最低抗生素浓度，用于评估选定菌株的抗生素耐药性。
结果如表2所示，本发明筛得的格氏乳杆菌FWJL-4对这几种抗生素都具有不同程度的敏感性。
表2 菌株对不同抗生素的敏感性结果
Figure BDA0003633740890000071
由上述实验结果可知，本发明提供的所述格氏乳杆菌FWJL-4相较其他几株乳杆菌对不同的抗生素较为敏感，表明该益生菌具有作为活菌产品的潜力。
实施例6格氏乳杆菌FWJL-4对NOD小鼠体重、饮食量、饮水量及血糖的影响
1.菌悬液的制备
将格氏乳杆菌FWJL-4及阳性对照菌鼠李糖乳杆菌GG分别于MRS平板中活化两次后，分别接种单菌落于MRS液体培养基中扩大培养(37℃厌氧培养36-48h)。培养完毕后，离心菌泥，用无菌PBS洗涤两次后重悬，使重悬后的终浓度为1×1010-12CFU/mL，于70℃水浴锅中放置30min，制成格氏乳杆菌FWJL-4或鼠李糖乳杆菌GG的灭活菌液。将等量的格氏乳杆菌FWJL-4菌泥及鼠李糖乳杆菌GG菌泥分别用各自菌的培养上清液重悬，制成格氏乳杆菌FWJL-4及鼠李糖乳杆菌GG菌悬液。确保菌的终浓度为1×1010-12CFU/mL。
2.NOD小鼠的分组及处理
将3-4周龄的雌性NOD小鼠随机分为四组(每组6只小鼠)，即：格氏乳杆菌FWJL-4活菌组(LIVE)、格氏乳杆菌FWJL-4死菌组(DEAD)、鼠李糖乳杆菌GG活菌组(LGG)及PBS组。每天下午三点左右以灌胃的方式处理小鼠，处理组分别灌胃0.2mL的灭活菌/活菌液，对照组灌胃等量的无菌PBS。
3.NOD小鼠体重、饮食量、饮水量及血糖的测定
在小鼠生长过程中，每隔一周测定并记录小鼠的体重、饮食量、饮水量及空腹血糖的变化。在小鼠20周周龄时用Accu-chek血糖仪测定小鼠空腹血糖水平。
小鼠体重结果如图7所示，由图7可知，四组小鼠的体重并无明显差异。
小鼠饮食量结果如图8所示，由图8可知，与PBS组相比，灌菌组均能够显著降低NOD小鼠的饮食量(活菌组降低了16％，死菌组降低了15％，LGG组降低了13％)，且格氏乳杆菌FWJL-4活菌的效果最优，高出LGG组3个百分点。
小鼠饮水量结果如图9所示，由图9可知，与PBS组相比，灌菌组均能够显著NOD小鼠的饮水量(活菌组降低了21％，死菌组降低了9％，LGG组降低了12％)，且格氏乳杆菌FWJL-4活菌的效果更优，高出LGG组9个百分点。
小鼠20周的血糖值如图10所示，由10可知，与PBS组相比，灌菌组均能够使NOD小鼠的平均空腹血糖水平降低：活菌组血糖水平由PBS组的8.86mmol/L降低至5.47mmol/L，死菌组血糖水平为7.30mmol/L，LGG组为5.8mmol/L。
由上述结果可知，本发明提供的所述格氏乳杆菌FWJL-4相较常用的益生菌鼠李糖乳杆菌GG能够显著改善1型糖尿病的相关表型指标，表明该益生菌在调节糖尿病方面具有优势。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌
<130> BAA220386A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1408
<212> DNA
<213> Lactobacillus gasseri
<400> 1
atttggtgct tgcaccaaat gaaactagat acaagcgagc ggcggacggg tgagtaacac 60
gtgggtaacc tgcccaagag actgggataa cacctggaaa cagatgctaa taccggataa 120
caacactaga cgcatgtcta gagtttaaaa gatggttctg ctatcactct tggatggacc 180
tgcggtgcat tagctagttg gtaaggtaac ggcttaccaa ggcaatgatg catagccgag 240
ttgagagact gatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag 300
cagtagggaa tcttccacaa tggacgcaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga 360
agggtttcgg ctcgtaaagc tctgttggta gtgaagaaag atagaggtag taactggcct 420
ttatttgacg gtaattactt agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa gcgagtgcag gcggttcaat 540
aagtctgatg tgaaagcctt cggctcaacc ggagaattgc atcagaaact gttgaacttg 600
agtgcagaag aggagagtgg aactccatgt gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag 660
aacaccagtg gcgaaggcgg ctctctggtc tgcaactgac gctgaggctc gaaagcatgg 720
gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgagt gctaagtgtt 780
gggaggtttc cgcctctcag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac 840
gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 900
gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatccagtg caaacctaag 960
agattaggag ttcccttcgg ggacgctgag acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcatta gttgccatca 1080
ttaagttggg cactctaatg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140
caagtcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac ggtacaacga 1200
gaagcgaacc tgcgaaggca agcggatctc tgaaagccgt tctcagttcg gactgtaggc 1260
tgcaactcgc ctacacgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga 1320
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gagagtctgt aacacccaaa 1380
gccggtggga taacctttat aggagtca 1408

Claims (10)

1.一株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)FWJL-4，已于2022年4月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62365。
2.含有权利要求1所述格氏乳杆菌FWJL-4的益生菌制剂。
3.根据权利要求2所述的益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂含有所述格氏乳杆菌FWJL-4的活细胞和/或细胞代谢物、灭活的细胞。
4.根据权利要求2或3所述的益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂中格氏乳杆菌FWJL-4的数量≥1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
5.含有权利要求1所述格氏乳杆菌FWJL-4的药物。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，还含有药学上可接受的载体。
7.权利要求1所述的格氏乳杆菌FWJL-4在制备抑制肠道致病菌、预防和/或治疗1型糖尿病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肠道致病菌包括但不限于金黄色葡萄球菌、肠沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、屎肠球菌中的一种或多种。
9.含有权利要求1所述格氏乳杆菌FWJL-4的食品、功能性食品、特殊医学用途配方食品或保健品。
10.权利要求1所述的格氏乳杆菌FWJL-4在制备有助于维持血糖健康水平的功能性食品或保健品中的应用。
CN202210498278.0A 2022-05-09 2022-05-09 一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌 Active CN114806953B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210498278.0A CN114806953B (zh) 2022-05-09 2022-05-09 一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210498278.0A CN114806953B (zh) 2022-05-09 2022-05-09 一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114806953A true CN114806953A (zh) 2022-07-29
CN114806953B CN114806953B (zh) 2023-07-04

Family

ID=82514030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210498278.0A Active CN114806953B (zh) 2022-05-09 2022-05-09 一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114806953B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117025479A (zh) * 2023-08-30 2023-11-10 上海市儿童医院 格式乳杆菌shmb 0001及其在预防和缓解急性结肠炎中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112458027A (zh) * 2020-12-16 2021-03-09 江南大学 一株格氏乳杆菌及其缓解和治疗高尿酸血症的用途
CN114292766A (zh) * 2021-10-14 2022-04-08 卡士乳业(深圳)有限公司 一种具有降糖能力的格氏乳杆菌及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112458027A (zh) * 2020-12-16 2021-03-09 江南大学 一株格氏乳杆菌及其缓解和治疗高尿酸血症的用途
CN114292766A (zh) * 2021-10-14 2022-04-08 卡士乳业(深圳)有限公司 一种具有降糖能力的格氏乳杆菌及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117025479A (zh) * 2023-08-30 2023-11-10 上海市儿童医院 格式乳杆菌shmb 0001及其在预防和缓解急性结肠炎中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114806953B (zh) 2023-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113913322B (zh) 乳双歧杆菌BLa80在缓解腹泻和提升肠道免疫能力中的应用
CN112625979B (zh) 一种对抗幽门螺杆菌的干酪乳杆菌及其应用
CN112812999B (zh) 一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌slb01及其衍生产品和应用
CN114381411B (zh) 乳酸乳球菌jyll-60及其在制备提高免疫力的产品上的应用
CN115851500B (zh) 一株植物乳杆菌及其应用
CN115029260B (zh) 一种具有抗炎及抗氧化特性的格氏乳杆菌及应用
CN114350578A (zh) 一株产溶菌酶并高效拮抗多药耐药幽门螺杆菌的植物乳杆菌lp1z及其应用
CN114958658B (zh) 一株抑制幽门螺旋杆菌的鼠李糖乳杆菌a21149及其应用
CN114752529B (zh) 植物乳杆菌hom3201菌株及其活菌制剂、制备方法和用途
CN114480231A (zh) 一种抗幽门螺杆菌感染的罗伊氏乳杆菌及其应用
CN114317334B (zh) 一株能够与幽门螺杆菌共聚集的清酒乳杆菌及其应用
CN116200290A (zh) 一种具有抑制结直肠癌细胞增殖的副干酪乳酪杆菌及其应用
CN114806953B (zh) 一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌
CN111000244A (zh) 一种可改善肠道健康的干酪乳杆菌及其应用
CN116445356B (zh) 一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种ba67及其应用
CN117143767A (zh) 可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌msjk0025及其应用
CN112322553A (zh) 一种抗艰难梭菌的乳酸乳球菌及其应用
CN111743158A (zh) 一种具有增强免疫功能的益生菌片剂及其制备方法
CN113881592B (zh) 一株罗伊氏乳杆菌及其应用
CN113913334B (zh) 一株粪肠球菌ef-za1107-06及其应用
CN111004735A (zh) 一株发酵乳杆菌及其在改善肠道健康方面的应用
CN113508907A (zh) 一株耐热型发酵乳杆菌在制备促排便食品或药品中的应用
CN114395514B (zh) 一株嗜酸乳杆菌、菌剂及其应用
CN114574405B (zh) 植物乳杆菌菌株wka86及其在制备防治口臭制品方面的用途与制品
CN117305187B (zh) 一种改善肠道健康状况的乳酸片球菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant