CN116121110A - 一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌yj0801及其应用 - Google Patents

一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌yj0801及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)YJ0801及其应用。本发明提供的乳酸乳球菌菌株YJ0801，保藏号为CGMCC NO.25642。该菌株从采自自然保护区的中华蟾蜍(Bufo gargarizans)肠道中分离筛选得到，在MRS琼脂培养基上生长良好，没有溶血现象，对多种抗生素敏感，不携带抗生素抗性基因，对酸、胆盐、人工胃液、人工肠液有较好的耐受能力，对人结肠癌细胞HT‑29黏附能力强，产乙酸能力较好，对多种致病菌具有较强的抑制能力，对于服用过量抗生素引起的肠道菌群失调有促进菌群恢复作用，对DSS诱导的小鼠结肠炎模型有较好的预防和治疗效果，炎症指标明显降低。该菌株应用于食品或药品领域，不仅具有实际生产价值，而且对人和动物健康具有非常重要的意义。

Description

一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌YJ0801及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是一种具有较强抑菌和抗炎作用的乳酸乳球菌YJ0801及其应用。
背景技术
中华蟾蜍(Bufo gargarizans)在我国分布广、数量多，对环境适应能力强，还是我国传统药用两栖动物，蟾酥、蟾衣均有悠久的药用历史。最近，我们对中华蟾蜍体表和肠道微生物进行了16S rRNA测序和宏基因组测序研究，发现蟾蜍体表和肠道微生物非常丰富，多达数千种，包括众多对人体和动物有益的益生菌类群，是十分珍贵的微生物资源库。
细菌性肠炎是多种细菌如大肠杆菌、沙门菌、梭菌、痢疾杆菌等感染引起的消化系统疾病(如小肠炎和结肠炎等)，是人和家养动物的常见病，临床上主要使用各种抗生素进行治疗，但由于细菌容易产生抗生素抗性，常常达不到预期的效果。大量研究表明，乳酸菌作为益生菌的一类，被美国食品和药品监督管理局(FDA)认定是高度安全的食品级微生物。国内应用也越来越普遍，到目前为止，国家卫生健康委员会批准的《可用于食品的菌种名单》中共列入38种，其中包括大量乳酸菌，乳酸乳球菌也名列其中。作为肠道中的主要益生菌群之一，乳酸乳球菌可调节肠道菌群，可以抑制病原微生物的生长繁殖，所以利用乳酸乳球菌预防或抑制病原菌感染，调节肠道菌群结构已引起人们的广泛关注。因此，从中华蟾蜍(Bufo gargarizans)肠道中分离筛选抑菌抗炎能力强的乳酸菌，将其应用于功能性食品领域，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌YJ0801，并提供该乳酸乳球菌YJ0801在制备具有抑菌、抗炎及调节人和动物肠道菌群的功能性食品中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：本发明提供一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)YJ0801，其于2022年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.25642。
进一步的，所述乳酸乳球菌YJ0801是从自然保护区采集的野生中华蟾蜍消化道中分离筛选获得。
进一步的，所述乳酸乳球菌YJ0801通过采用细菌通用引物16S rRNA的27F/1492R对其基因组总DNA为模板进行PCR扩增，得到由1002碱基对(bp)组成的目的基因序列，序列如附表所示。将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，其与GenBank中的标准菌株Lactococcus lactis strain Guimu 24相似率达99.90％，鉴定该菌株为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
进一步的，所述乳酸乳球菌YJ0801，在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色。
本发明还提供所述乳酸乳球菌YJ0801在制备具有抑菌、抗炎的组合物上的应用，所述组合物包括食品或药品。
本发明还提供所述乳酸乳球菌YJ0801在制备调节人和动物肠道菌群的组合物上的应用，所述组合物包括食品或药品。
进一步的，所述乳酸乳球菌YJ0801，对酸和胆盐有一定的耐受能力，对人结肠癌细胞HT-29黏附能力较强，产乙酸能力较强。
进一步的，所述乳酸乳球菌YJ0801，对乙型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌具有抑菌能力。
进一步的，所述乳酸乳球菌YJ0801，对的肠道菌群失调有较好的促进菌群恢复作用。
进一步的，所述乳酸乳球菌YJ0801，对DSS小鼠结肠炎模型有较好的预防和治疗效果，炎症指标明显降低。
本发明具有以下优点：
1、本发明提供的乳酸乳球菌YJ0801，分离筛选自保护区野生中华蟾蜍消化道，在MRS琼脂培养基上生长良好，对酸和胆盐有较好的耐受能力，对人结肠癌细胞HT-29黏附能力强。
2、所述乳酸乳球菌YJ0801，对乙型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等常见肠道病原细菌抑菌能力较强。
3、本发明提供的乳酸乳球菌YJ0801，通过动物实验表明，对肠道菌群失调有较好的促进菌群恢复作用，对DSS小鼠结肠炎模型有较好的预防和治疗效果，炎症指标明显降低，因此，应用于食品或药品领域，不仅具有实际生产价值，而且对人和动物健康也具有非常重要的意义。
附图说明
图1为乳酸乳球菌YJ0801菌株与GenBank中其它菌株的系统进化关系图。
图2为本发明乳酸乳球菌YJ0801在MRS琼脂培养基上的菌落形态图。
图3为乳酸乳球菌YJ0801菌株的溶血性实验图。
图4为乳酸乳球菌YJ0801菌株发酵液短链脂肪酸GC-MS测定图
图5为乳酸乳球菌YJ0801促进抗生素引起的小鼠肠道菌群失调后的恢复
图6为乳酸乳球菌YJ0801预防和治疗DSS诱导结肠炎小鼠结肠HE染色。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。凡在本发明原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，培养基中所涉及的百分比，均为质量体积比。
实施例1
乳酸乳球菌YJ0801的分离、筛选及分子生物学鉴定：
本发明提供一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)YJ0801，其于2022年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.25642。
所述乳酸乳球菌YJ0801的16S rRNA序列如SEQ ID:1所示。
1.1、材料准备
中华蟾蜍采自四川自然保护区野生个体；
16s rRNA通用引物27F和1492R通用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列如下：
27F：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3；
1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。
MRS肉汤培养基的配方(每升)：酪蛋白酶消化物10.0g，牛肉膏粉10.0g，酵母膏粉4.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80，最终pH为5.7左右。使用时称取该品54.0g，加入蒸馏水或去离子水1L，分装于锥形瓶，于121℃高压条件灭菌15min。
1.2、具体方式
1.2.1乳酸菌的分离纯化：活体中华蟾蜍解剖后，取少量肠道内容物，接种于50mLMRS肉汤中，充分振荡混匀，置于37℃恒温摇床培养24h。吸取培养液1ml，采用10倍梯度稀释法，各取菌液20μL，涂布接种于含有CaCO3的MRS琼脂培养基平板上，37℃培养24h后，挑取有明显溶钙环、且形态各异的单菌落100个，连续纯化培养3次。将纯化后的菌株接种于600μLMRS肉汤培养基中，37℃摇床培养18h，加入400μL浓度50％的灭菌甘油，于-80℃超低温冰箱中冻存，作为初选菌株备用。
1.2.2耐酸耐盐菌株筛选：用盐酸和猪胆盐调节MRS肉汤培养基的酸碱度和盐度。将冻存的100株初选菌株分别活化培养后先接种于pH＝3.0的MRS肉汤培养基中，37℃培养12h后，吸取1mL接种于盐浓度为0.3％的MRS肉汤培养基中，37℃培养12h后，吸取20μL涂布于MRS琼脂平板上，37℃培养24h后，观察菌落生长情况。结果表明，有62株在平板上长出菌落，符合肠道益生菌耐酸耐盐要求。从各平板上挑取10个单菌落，纯化后加50％的甘油-80℃冻存，作为耐酸、耐盐菌株供进一步评估使用。
1.2.3菌株鉴定：将冻存的耐酸耐盐菌株活化和增殖培养后，用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，使用通用引物扩增16S rRNA序列，PCR扩增产物送生工生物工程(上海)有限公司测序。测序结果经NCBI BLAST比对，有12株为乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，根据溶钙圈明显程度和耐酸耐盐培养后菌落生长情况，确定其中一株为进一步评估的候选菌株。该菌株扩增的16S rRNA序列长度为1005bp(序列附后)，经NCBI BLAST比对，与GenBank中的Lactococcus lactis strain Guimu 24菌株相似率达99.90％，命名为乳酸乳球菌YJ0801，与GenBank中其它菌株的系统进化关系如图1所示。所述乳酸乳球菌YJ0801菌株在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落形态乳白色、圆形凸起、边缘平整、表面光滑，如图2所示。革兰氏染色后，在光学显微镜下可见紫色菌体，革兰氏阳性，符合乳酸乳球菌特征，与分子生物学鉴定结果一致。
实施例2
乳酸乳球菌YJ0801菌株的安全性评估
2.1.溶血性实验：将乳酸乳球菌YJ0801菌株复苏培养后，划线接种于哥伦比亚血平板上，37℃培养24h后观测待测菌落周围是否出现溶血环，并用溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970)标准菌株为溶血性阳性对照。溶血性实验结果表明，在乳酸乳球菌YJ0801菌落周围没有出现溶血现象，而在溶血性葡萄球菌菌落周围溶血现象明显可见，如图3所示，在图3中，左半边为溶血性葡萄球菌阳性对照；右半边为乳酸乳球菌YJ0801)。
2.2.抗生素抗性：采用纸片琼脂扩散法(K-B法)测试菌株的抗生素抗性。将所述乳酸乳球菌YJ0801菌株活化培养后，将活菌浓度调整至1×106CFU/mL，用无菌棉签将菌液均匀涂抹于MRS培养基平板表面，室温10min后放入药敏纸片，37℃培养24h后，用游标卡尺测量各药敏纸片周围的抑菌圈直径，每种抗生素重复3次，试验结果参照NCCLS标准判断菌株的药物敏感性，结果以敏感(S)、中介(I)和耐药(R)表示。如表1所示，所述乳酸乳球菌YJ0801对测试的四环素、氨苄西林、头孢曲松、克林霉素、克拉霉素和氯霉素等6种抗生素表现均为敏感(S)，说明所述乳酸乳球菌YJ0801菌株的安全性。
表1乳酸乳球菌YJ0801菌株对几种抗生素的敏感性
编号 四环素 氨苄西林 头孢曲松 克林霉素 克拉霉素 氯霉素
YJ0801 S S S S S S
实施例3
乳酸乳球菌YJ0801的细胞粘附性和胃肠液耐受性评估
3.1细胞粘附性试验：将待测菌株活化培养后挑单菌落接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h，-4℃、5000r/min条件下离心10min，弃上清后用无菌PBS缓冲液洗涤3次，调整菌悬液浓度至1×106CFU/mL，备用。人结肠癌细胞HT-29复苏后接种至细胞培养板，添加DMEM完全培养基后在37℃、5％ CO2的培养箱中培养，每隔一天更换一次培养液。当细胞贴壁生长融合状态达70％-80％时，使用0.25％胰酶-EDTA混合消化液进行传代培养。培养完毕后用细胞血球计数板计数，将细胞浓度调整至5×106个/mL。每个细胞培养孔中加1mL细胞悬浮液，于37℃、5％ CO2的培养箱中培养。待培养板中的细胞长至单层，弃掉DMEM培养液，用无菌PBS液冲洗3次，然后每孔加入1mL已制备好的待测菌悬液，轻微晃动细胞培养板，使菌液在细胞孔中分布均匀，从每孔中吸少量菌液用于平板计数，其结果作为菌悬液中的初始活菌数。将细胞板置于37℃孵育2h，弃去培养基并用无菌PBS缓冲液洗涤3次。使用0.7mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化细胞10min，待细胞完全脱落后加入0.3mL DMEM培养液终止消化，吸取少量培养液进行平板计数，其结果作为黏附活菌数。并用标准菌株LGG作为对照。粘附率计算公式如下：
粘附率(％)＝粘附乳酸菌的数目/初始接种数目×100％。
细胞粘附性试验结果见表2。所述乳酸乳球菌YJ0801对人结肠癌细胞HT-29的粘附率为92.05％，明显高于标准菌株LGG的粘附能力。
表2乳酸乳球菌YJ0801对人结肠癌细胞HT-29的粘附率
Figure BDA0003913340670000051
Figure BDA0003913340670000061
3.2模拟胃液、肠液耐受实验：模拟胃液和肠液购自上海源叶生物科技有限公司。人工胃液模拟液成分为稀盐酸、胃蛋白酶和氯化钠，最终pH 2.5；人工肠液模拟液成分为磷酸二氢钾和胰蛋白酶，最终pH 6.8。将所述乳酸乳球菌YJ0801菌株活化培养后，调整菌液浓度至1×108CFU/mL，取1mL菌液加入9mL模拟人工胃液液中，充分混匀后进行10倍梯度稀释，吸取20μL涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的初始活菌值；接菌的模拟胃液于37℃培养3h后，再次涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的结束活菌值。同理，将1mL浓度为1×108CFU/mL的所述乳酸乳球菌YJ0801发酵液加入9mL模拟肠液中，并进行活菌计数，37℃培养6h后再次计活菌数，计算存活率(存活率(％)＝结束时活菌数/初始活菌数×100％)。
模拟胃液、肠液耐受实验结果见表3，结果表明，所述乳酸乳球菌YJ0801菌株对于人工模拟胃、肠液有较好的耐受能力，人工胃液中3h后存活率为85.0％，人工肠液6h后存活率为65.0％。
表3乳酸乳球菌YJ0801菌株对于人工模拟胃、肠液的耐受能力
菌株 模拟胃液3h存活率(％) 模拟肠液6h存活率(％)
乳酸乳球菌YJ0801 85.0 65.0
标准菌株LGG 51.2 49.5
实施例4
乳酸乳球菌YJ0801菌株的抑菌活性评估
将乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella para-typhi B CMCCB 50094)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli CMCCB 44102)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCCB50094)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CMCCB 10104)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes ATCC 19115)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC 14028)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida ATCC51689)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus ATCC29970)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica ATCC23715)分别接种于营养琼脂培养基，复苏并传代3次。吸取适量胰酪大豆胨液体培养基至离心管，将活化好的致病菌接种于肉汤培养基中，并调节菌液浓度达到1×108CFU/mL。吸取上述致病菌和肉汤的混合液1mL加至500mL灭菌后暂处于液体状态的营养培养基内(温度冷却至50℃左右)，充分混匀后按每皿约20mL的量制平板，冷却凝固后，用直径6mm的打孔器在平板上打孔，吸取40μL的待测菌菌液(菌液浓度达到1×108CFU/mL)加入孔内，重复3次，于37℃培养24h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，并用LGG标准菌株为对照。
参见表4乳酸乳球菌YJ0801菌株的抑菌活性评估，结果表明，所述乳酸乳球菌YJ0801菌株的发酵液对乙型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等致病菌的生长具有较强的抑制活性，大多优于LGG标准菌株。
表4乳酸乳球菌YJ0801菌株的抑菌活性评估(直径：mm)
Figure BDA0003913340670000071
实施例5
乳酸乳球菌YJ0801菌株发酵液短链脂肪酸含量GC-MS测定
发酵液的制备：将所述乳酸乳球菌YJ0801保存菌株活化培养24h后，吸取4ul菌液加入到4mL肉汤培养基中，37℃培养24h备用。
短链脂肪酸的检测：检测仪器为日本岛津公司气质联用仪(GCMS-QP2010 Plus)，色谱柱为美国RESTEK(瑞斯泰克)公司Rtx-5熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25um)。GC升温程序为初始温度40℃保持5min，每分钟5℃升至150℃，然后以每分钟10℃升到280℃，并维持2min。载气为高纯氦气(纯度＞99.999％)，流速：1.0mL/min。MS条件：电离方式为EI；温度为200℃，接口温度220℃，质量扫描范围m/z 33-500。取发酵液4mL,加入浓度为200ug/mL 2-乙基丁酸内标液10ul，样品以分流模式1:3的方式进样1μL，溶剂延迟时间设定为0.1min，进样口温度270℃。5种短链脂肪酸(乙酸、正丁酸、异丁酸、异戊酸、异己酸)的浓度采用内标法计算(图4)。
测定结果表明所述乳酸乳球菌YJ0801菌株发酵液中含多种短链脂肪酸，其中乙酸含量最高，达到8.405ug/mL，其次是异戊酸0.207，此外还检测到三种丁酸(表5)。
表5乳酸乳球菌YJ0801菌株发酵液短链脂肪酸含量(ug/mL)
菌株号 菌种名 乙酸 正丁酸 异丁酸 2-甲基丁酸 异戊酸
YJ0801 乳酸乳球菌 8.405 0.055 0.077 0.075 0.207
实施例6
乳酸乳球菌YJ0801对大剂量抗生素使用后小鼠肠道菌群的恢复实验
购买雄性三周龄昆明小鼠12只(体重20克左右)，随机分为3组：空白对照组CK0、LGG组和乳酸乳球菌YJ0801处理组，每笼4只，共3笼。常规方法适应性饲养1周后，空白对照组每天灌胃0.2mL生理盐水，其它两组每天每只灌胃0.2mL头孢曲松溶液(40mg/d)，持续灌胃两周，两周结束后测定粪便16S rRNA。随后，每天给LGG组灌胃0.2mL LGG菌悬液，乳酸乳球菌处理组灌胃0.2mL乳酸乳球菌YJ0801菌株菌悬液，活菌数均为1×109CFU/mL)，并在第3、第6和第9天测定粪便16S rRNA。
实验结果表明，处理组灌喂头孢曲松溶液(40mg/d)两周后，小鼠肠道菌群大大减少，物种多样性指数(Shannon指数)仅为0.1217(YJ0801组)和0.3631(LGG组)，仅剩下一些对抗生素耐性较强的细菌，而空白对照组多样性指数为3.5296。停用抗生素后，灌喂LGG或乳酸乳球菌YJ0801三天后即可发现菌群明显恢复，6天后多样性指数分别为3.0669和3.2054，基本恢复正常，9天后肠道菌群完全恢复，多样性指数与对照非常接近，如图5。
实施例7
乳酸乳球菌YJ0801对小鼠结肠炎模型的预防和治疗作用试验
7.1、实验动物及分组
共60只小鼠，随机分成12笼，每笼5只。随机分为4组，每组3笼，分组包括空白对照组(CK)、自然恢复组(DSS)、标准菌株组(LGG)和YJ0801处理组。实验处理如表6所示。
表6动物实验处理
Figure BDA0003913340670000081
7.2、实验内容
葡聚糖硫酸钠盐溶液(DSS)：无菌水溶解葡聚糖硫酸钠盐配制浓度3％的DSS溶液。
菌悬液的制备：将标准菌株LGG和YJ0801复苏并活化3代。将菌液于-4℃、6000r/min条件下离心5min，弃掉上清液。使用无菌PBS缓冲液重悬菌体，调节菌液浓度为5×109CFU/mL，低温保存备用。
实验期间，每天观察其活动状况、粪便状态、血便现象。在预防期和治疗期结束时，分别随机处死3只小鼠，取血进行血清炎症因子检测。新鲜血样用无菌离心管收集，3000r/min离心10min，获得血清。使用ELISA试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司)测定血清的炎症因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)，操作步骤按照试剂盒说明书进行。与此同时，解剖剪取1cm结肠，用4％多聚甲醛固定液固定24h，经包埋切片和HE染色制片，在光学显微镜下观察小鼠结肠组织的病理变化。
血清炎症因子测定结果如表7所示。从表7可知，在预防期和治疗期TNF-α、IL-6和IL-1β三个炎症因子指标都明显低于DSS组，说明所述乳酸乳球菌YJ0801菌株对DSS诱导的小鼠结肠炎有明显的缓解作用；结肠组织学观察如图6所示，结果表明DSS诱导组小鼠结肠黏膜及肌层变薄，腺体层次减少，肠腔扩张，局部溃疡形成(图6A)，而DSS诱导加乳酸乳球菌YJ0801处理的小鼠结肠未出现明显的组织异常和溃疡，仅见黏膜有少许慢性炎症细胞浸润(图6B)，进一步证明了所述乳酸乳球菌YJ0801的抗炎作用，因此，将其应用于食品或药品领域，不仅具有广阔的应用前景，而且对人体健康十分有益。
表7小鼠血清炎症因子测定结果(pg/mL)
Figure BDA0003913340670000091
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)YJ0801，其特征在于：所述乳酸乳球菌YJ0801已于2022年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.25642。
2.根据权利要求1所述的一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌YJ0801，其特征在于：所述乳酸乳球菌YJ0801，在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色。
3.权利要求1所述的一种抑菌和抗炎作用较强的乳酸乳球菌YJ0801的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为制备具有抑菌、抗炎的组合物上的应用，所述组合物包括食品或药品。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为制备调节人和动物肠道菌群的组合物上的应用，所述组合物包括食品或药品。
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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023471A2 (en) * 1998-10-20 2000-04-27 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Use of a cytokine-producing lactococcus strain to treat colitis
EP1862080A1 (en) * 2006-05-31 2007-12-05 Ajinomoto Co., Inc. Protease-resistant bacteriocins produced by lactic acid bacteria and their use in livestock
WO2008134450A2 (en) * 2007-04-24 2008-11-06 Kemin Industries, Inc. Broad-spectrum antibacterial and antifungal activity of lactobacillus johnsonii d115
WO2009066537A1 (ja) * 2007-11-19 2009-05-28 Meiji Dairies Corporation 免疫調節性機能誘導剤及び食品組成物
US20130336944A1 (en) * 2010-12-17 2013-12-19 Compagnie Gervais Danone Lactococcus Lactis Strains for Use in Improving Digestive Condition
EP3081227A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-19 Institut National De La Recherche Agronomique Lactococcus lactis producing tslp or il-25 and their uses as probiotics and therapeutics
US20170106058A1 (en) * 2014-04-08 2017-04-20 Lysando Ag Pharmaceutical composition against chronic bacterial infections
WO2019199048A1 (en) * 2018-04-12 2019-10-17 Genome And Company Lactococcus lactis gen3013 strain and a composition for preventing or treating cancer comprising the same
KR102121568B1 (ko) * 2019-02-19 2020-06-10 삼육대학교산학협력단 클로스트리듐 디피실에 대해 항균 활성을 갖는 신규 페디오코쿠스 에시디락티시 spm138 및 이를 포함하는 조성물
WO2021040086A1 (ko) * 2019-08-28 2021-03-04 (주)네오리젠바이오텍 신규한 유산균, 이를 포함하는 조성물 및 건강기능식품

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023471A2 (en) * 1998-10-20 2000-04-27 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Use of a cytokine-producing lactococcus strain to treat colitis
EP1862080A1 (en) * 2006-05-31 2007-12-05 Ajinomoto Co., Inc. Protease-resistant bacteriocins produced by lactic acid bacteria and their use in livestock
WO2008134450A2 (en) * 2007-04-24 2008-11-06 Kemin Industries, Inc. Broad-spectrum antibacterial and antifungal activity of lactobacillus johnsonii d115
WO2009066537A1 (ja) * 2007-11-19 2009-05-28 Meiji Dairies Corporation 免疫調節性機能誘導剤及び食品組成物
US20130336944A1 (en) * 2010-12-17 2013-12-19 Compagnie Gervais Danone Lactococcus Lactis Strains for Use in Improving Digestive Condition
US20170106058A1 (en) * 2014-04-08 2017-04-20 Lysando Ag Pharmaceutical composition against chronic bacterial infections
EP3081227A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-19 Institut National De La Recherche Agronomique Lactococcus lactis producing tslp or il-25 and their uses as probiotics and therapeutics
WO2019199048A1 (en) * 2018-04-12 2019-10-17 Genome And Company Lactococcus lactis gen3013 strain and a composition for preventing or treating cancer comprising the same
KR102121568B1 (ko) * 2019-02-19 2020-06-10 삼육대학교산학협력단 클로스트리듐 디피실에 대해 항균 활성을 갖는 신규 페디오코쿠스 에시디락티시 spm138 및 이를 포함하는 조성물
WO2021040086A1 (ko) * 2019-08-28 2021-03-04 (주)네오리젠바이오텍 신규한 유산균, 이를 포함하는 조성물 및 건강기능식품

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