CN111000244A - 一种可改善肠道健康的干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents
一种可改善肠道健康的干酪乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可改善肠道健康的干酪乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明筛选得到的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038可改善肠道健康，具体体现在：(1)能以低聚果糖、低聚木糖和低聚半乳糖为唯一碳源生长并代谢产酸，具有良好的低聚糖利用能力；(2)体外代谢能产生乙酸、丙酸、丁酸等多种短链脂肪酸；(3)可降低肠道中Parabacteroides的相对丰度，因此，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038在制备改善肠道健康的产品(如食品、药品或保健品等)中，具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种可改善肠道健康的干酪乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
人体肠道内的微生物中，超过99％都是细菌，这些数目庞大的细菌大致可以分为三个大类：有益菌、有害菌和中性菌。其中，有益菌，也称之为益生菌，是人体健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等；有害菌，数量一旦失控大量生长，就会引发多种疾病，产生致癌物等有害物质，或者影响免疫系统的功能；中性菌，即具有双重作用的细菌，在正常情况下对健康有益，一旦增殖失控，或从肠道转移到身体其他部位，就可能引发许多问题。
有研究指出，体魄强健的人肠道内有益菌的比例达到70％，普通人则是25％，便秘人群减少到15％，而癌症病人肠道内的益生菌的比例只有10％。因此，人体健康与肠道内的菌群结构息息相关。
但是，当今社会，由于抗菌药物的广泛应用，人群肠道菌群结构失衡的问题日益突出。这主要是因为抗菌药物会抑制肠内敏感菌(这些敏感菌多为益生菌)，而易对抗菌药物产生抗性的原籍菌或过路菌则会出现增长优势(这些易对抗菌药物产生抗性的原籍菌或过路菌多是一些有害菌与中性菌，主要包括大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌以及霍乱弧菌)，两者共同造成了肠道菌群结构紊乱，使得肠道微生物从能量吸收、内毒素血症、断链脂肪酸、胆碱和胆汁酸代谢等多种途径影响宿主的健康。
Parabacteroides就属于存在于人体肠道内的一种易对抗生素产生抗性的有害菌，若机体肠道菌群失衡，Parabacteroides会在机体大量增殖，进而引起机体阑尾炎、腹腔炎症、菌血症等疾病；并且，由于抗生素无法选择性抑制Parabacteroides，Parabacteroides在抗生素施用过程中也易获耐药性，另外，有研究显示，低剂量的青霉素甚至能提高肠道中Parabacteroides的相对丰度，增加患菌血症的风险，因此，人体一但感染Parabacteroides很难治疗，急需找到可抑制肠道内Parabacteroides的方法。
目前，已经有部分研究通过筛选获得了一些具有改善肠道菌群失衡的益生菌，例如，公开号为CN107312726A的专利申请文本公开了一种植物乳杆菌，此植物乳杆菌可抑制肠道内大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌以及金黄色葡萄球菌等有害菌的生长；公开号为CN104232515A的专利申请文本公开了一种动物双歧杆菌，此动物双歧杆菌能够增加肠道中双歧杆菌和乳杆菌的数量，同时，能够降低肠道中拟杆菌和大肠杆菌的数量。
但是，上述益生菌均对Parabacteroides缺乏针对性，目前，仍没有一株可显著抑制人体肠道内Parabacteroides的益生菌，这无疑阻碍了Parabacteroides感染的治疗。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株可显著抑制人体肠道内Parabacteroides相对丰度的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)；所述相对丰度是指样品中某一种菌的数量占样品中细菌总数量的百分比。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038已于2018年11月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60489，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038是从来源于四川省钟祥镇的泡菜样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038。
所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038具有以下特征：
(1)在MRS培养基上培养48h后的菌落呈圆形、乳黄色、不透明、边缘光滑；
(2)耐模拟胃肠液：在pH为3的含有3g/L胃蛋白酶的生理盐水中培养3h后，存活率高达91.43±6.27％；在pH为8的含有1g/L胰蛋白酶和0.3％(m/v)(即0.3g/100mL)胆盐的生理盐水中培养4h后，存活率为31.19±0.07％；在pH为3的含有3g/L胃蛋白酶的生理盐水中培养3h后，继续在pH为8的含有1g/L胰蛋白酶和0.3％(m/v)胆盐的生理盐水中培养4h，存活率仍有28.53±1.54％；
(3)能以低聚果糖、低聚木糖和低聚半乳糖为唯一碳源生长并代谢产酸；
(4)体外代谢能产生乙酸、丙酸、丁酸等多种短链脂肪酸；
(5)可降低肠道中Parabacteroides的相对丰度。
本发明提供了上述一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038在制备改善肠道健康的产品中的应用。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038的活菌数为不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、药物载体和/或药用辅料。
本发明提供了一种用于改善肠道健康的产品，所述产品含有上述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038的活菌数为不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、药物载体和/或药用辅料。
有益效果：
1、本发明筛选出了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038，此干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038可改善肠道健康，具体体现在：
(1)功能性低聚糖不能被胃与小肠中被消化吸收，但可以被大肠中的益生菌利用，增殖有益菌、抑制有害菌，调节肠道菌群平衡，而本发明的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1038能以低聚果糖、低聚木糖和低聚半乳糖为唯一碳源生长并代谢产酸，具有良好的低聚糖利用能力；
(2)短链脂肪酸可以降低肠道内pH值，改善肠道酸性环境，增殖有益菌、抑制有害菌以调节肠道菌群，改善肠道功能，而本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038体外代谢能产生乙酸、丙酸、丁酸等多种短链脂肪酸，并且，灌胃本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM103815天后，小鼠粪便中短链脂肪酸的含量明显上升；
(3)Parabacteroides属于存在于人体肠道内的一种易对抗生素产生抗性的有害菌，会引起机体阑尾炎、腹腔炎症、菌血症等疾病，而本发明的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1038可降低肠道中Parabacteroides的相对丰度，灌胃本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM103815天后，小鼠粪便中Parabacteroides的相对丰度明显下降，
因此，本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038在制备改善肠道健康的产品(如食品、药品或保健品等)中，具有巨大的应用前景；
2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)来源于传统发酵食品，且通过了美国GRAS认证，属公认安全的菌种，因此，本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038对人体不会产生任何伤害。
生物材料保藏
一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038，分类学命名为Lactobacilluscasei，已于2018年11月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.60489，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同株干酪乳杆菌在模拟胃液下培养3h后继续于模拟肠液下培养4h的存活率；其中，横坐标是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、LC2、LC3、LC4、LC5、LC6、LC7、CCFM1038的编号。
图2：不同株干酪乳杆菌在体外培养过程中总短链脂肪酸的产量；其中，横坐标是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、LC2、LC3、LC4、LC5、LC6、LC7、CCFM1038的编号。
图3：不同株干酪乳杆菌在体外培养过程中乙酸的产量；其中，横坐标是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、LC2、LC3、LC4、LC5、LC6、LC7、CCFM1038的编号。
图4：不同株干酪乳杆菌在体外培养过程中丙酸的产量；其中，横坐标是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、LC2、LC3、LC4、LC5、LC6、LC7、CCFM1038的编号。
图5：不同株干酪乳杆菌在体外培养过程中丁酸的产量；其中，横坐标是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、LC2、LC3、LC4、LC5、LC6、LC7、CCFM1038的编号。
图6：实施例9中CCFM1038组小鼠粪便中Parabacteroides的相对丰度，其中，“*”表示与空白组具有显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的胃蛋白酶1:10000U(产品编号：A600688、CAS：[9001-75-6])购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的胰蛋白酶1:250(产品编号：64008867、CAS：[9002-07-7])购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的胆盐购自上海拜力生物科技有限公司；下述实施例中涉及的葡萄糖购于国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)购自保龄宝生物股份有限公司；下述实施例中涉及的低聚木糖(XOS)购自上海源叶生物科技有限公司；下述实施例中涉及的脱脂乳粉购自伊利。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O 0.25g/L、吐温-801g/L、蒸馏水1000g/L。
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O 0.25g/L、吐温-801g/L、琼脂20g/L、蒸馏水1000g/L。
实施例1：干酪乳杆菌的筛选及菌种鉴定
1、筛选
以来源于四川省钟祥镇的泡菜为样本，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6，然后分别取100μL稀释梯度为10-4、10-5、10-6的稀释液于MRS固体培养基上进行平板涂布，37℃培养48h，观察并记录菌落形态；挑取MRS固体培养基上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取MRS固体培养基上不同形态的单菌落进行划线分离，直至得到形态一致的纯的单菌落；挑取MRS固体培养基上的纯菌落接种于5mLMRS液体培养基中，37℃培养18h；取1mL菌液于无菌离心管中，8000r/min离心3min后弃去上层培养基，菌泥重悬于30％甘油溶液中置于-80℃中保藏，得到菌株。
2、鉴定
对分离得到的菌株进行PCR扩增16S rDNA，PCR产物送至华大基因测序有限公司进行测序(CCFM1038的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示)，将测序得到的结果在NCBI中进行核酸序列比对，最终得到8株干酪乳杆菌，分别命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC4、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7。
实施例2：干酪乳杆菌的培养
将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038接入MRS固体培养基上于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落呈圆形、乳黄色、不透明、边缘光滑。
实施例3：不同干酪乳杆菌对模拟胃肠液的耐受性
具体步骤如下：
1、不同干酪乳杆菌对模拟胃液的耐受性
将实施例1获得的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC4、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，将收集到细胞经生理盐水洗涤，洗涤结束后，再次离心收集细胞，将收集到细胞分别重悬于pH为3(pH由HCl调节)的含有3g/L胃蛋白酶的生理盐水中至菌液OD600为5.0，取1mL菌液进行平板活菌计数作为菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数，将剩余菌液置于37℃培养3h后，取1mL菌液进行平板活菌计数作为耐受模拟胃液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数。
其中，耐受胃液后的存活率(％)＝(耐受模拟胃液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数/菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数)100％。
检测结果如下：在pH为3的含有胃蛋白酶的生理盐水中培养3h后，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038的存活率为91.47±4.73％、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC1的存活率为32.25±0.68％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2的存活率为166.75±2.19％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC3的存活率为102.45±3.86％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC4的存活率为123.22±0.25％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5的存活率为64.02±4.64％、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC6的存活率为117.43±0.77％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7的存活率为95.36±14.62％。
可见，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、LC3、LC4、LC6、LC7对模拟胃液的耐受能力较强。
2、不同干酪乳杆菌对模拟肠液的耐受性
将实施例1获得的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC4、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，将收集到细胞经生理盐水洗涤，洗涤结束后，再次离心收集细胞，将收集到细胞分别重悬于pH为8(pH由NaOH调节)的含有1g/L胰蛋白酶和0.3％(m/v)胆盐的生理盐水中至菌液OD600为5.0，取1mL菌液进行平板活菌计数作为菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数，将剩余菌液置于37℃培养4h后，取1mL菌液进行平板活菌计数作为耐受模拟肠液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数。
其中，耐受肠液后的存活率(％)＝(耐受模拟肠液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数/菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数)100％。
检测结果如下：在pH为8的含有有胰蛋白酶和胆盐的生理盐水中培养4h后，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038的存活率为31.19±0.07％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1的存活率为2.22±0.03％、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC2的存活率为3.89±0.10％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC3的存活率为4.81±0.00％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC4的存活率为2.57±0.06％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5的存活率为13.38±1.36％、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC6的存活率为8.60±1.09％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7的存活率为12.97±0.02％。
可见，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、LC5、LC7对模拟肠液的耐受能力较强。
3、不同干酪乳杆菌对模拟胃肠液的耐受性
将实施例1获得的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC4、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，将收集到细胞经生理盐水洗涤，洗涤结束后，再次离心收集细胞，将收集到细胞分别重悬于pH为3(pH由HCl调节)的含有3g/L胃蛋白酶的生理盐水中至菌液OD600为5.0，取1mL菌液进行平板活菌计数作为菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数，将剩余菌液置于37℃培养3h，将培养后的菌液离心收集细胞，将收集到的细胞再次重悬于pH为8(pH由NaOH调节)的含有1g/L胰蛋白酶和0.3％(m/v)胆盐的生理盐水中至菌液OD600为5.0，置于37℃培养4h后，取1mL菌液进行平板活菌计数作为耐受模拟胃肠液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数。
其中，耐受胃肠液后的存活率(％)＝(耐受模拟胃肠液后菌液中干酪乳杆菌的活菌数/菌液中干酪乳杆菌的原始活菌数)100％。
检测结果如下：由图1可知，在pH为3的含有胃蛋白酶的生理盐水中培养3h后，继续在pH为8的含有胰蛋白酶和胆盐的生理盐水中培养4h，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038的存活率为28.53±1.54％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1的存活率为0.72±0.03％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2的存活率为6.48±0.08％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC3的存活率为4.93±0.18％、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC4的存活率为3.17±0.08％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5的存活率为8.57±0.25％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6的存活率为10.10±1.21％、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7的存活率为12.37±1.87％。
可见，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、LC6、LC7对模拟胃肠液的耐受能力更强。
实施例4：不同干酪乳杆菌的低聚糖利用能力
具体步骤如下：
(1)在MRS固体培养基的基础上，去掉配方中的葡萄糖与牛肉膏，以不添加任何糖作为空白对照，分别添加0.5％(m/v)的葡萄糖、低聚果糖、低聚木糖以及低聚半乳糖作为碳源，并加入溴甲酚紫作为酸碱指示剂，得到无糖、含葡萄糖、含低聚果糖、含低聚木糖或含低聚半乳糖的固体培养基平板；
(2)将实施例1获得的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC4、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于生理盐水中至OD600为0.5，获得菌液；
(3)吸取10μL菌液分别点在步骤(1)获得的固体培养基平板上，待菌液完全吸收后，于37℃倒置培养，12h后，观察固体培养基平板内的溴甲酚紫指示剂是否变黄，若变黄，则表明碳源被利用，若不变黄，说明碳源没被利用(结果见表1)。
由表1可知，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)普遍具有良好的利用低聚糖的能力，其中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC4、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7能广泛利用低聚果糖、低聚木糖和低聚半乳糖产酸，使固体培养基中的溴甲酚紫指示剂变黄。
表1不同干酪乳杆菌利用不同碳源的能力
其中，+表示乳杆菌能利用该种碳源，-表示不能利用。
实施例5：不同干酪乳杆菌的产短链脂肪酸能力
具体步骤如下：
将实施例1获得的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC4、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC5、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于生理盐水中至菌浓度为2×108CFU/mL，获得菌液。
将菌液与10％硫酸以25:1的体积比混合酸化后，加入4倍10％硫酸体积的乙醚振荡混匀以提取脂肪酸，得到提取液；将提取液于18000g的条件下离心15min后分离上层乙醚相，将上层乙醚相通过无水Na2SO4进行干燥后静置30min，继续于18000g的条件下离心5min，用GC-MS分析上层乙醚相中的各种短链脂肪酸(分析结果见图2-5)。
由图2-5可知，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038的总短链脂肪酸产量高达1.256±0.11μmol/mL，其中，乙酸产量最高，达1.226±0.11μmol/mL，较其余干酪乳杆菌有明显优势。
由实施例3-5可知，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7的耐受模拟胃肠液、低聚糖利用以及体外产短链脂肪酸能力均较佳，能够在人体胃肠道环境中生存并发挥作用，因此，下面选择干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7进行进一步的实验以研究其益生功能。
实施例6：不同干酪乳杆菌对小鼠健康指标、粪便含水量以及粪便中短链脂肪酸浓度的影响
具体步骤如下：
将实施例1获得的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于12％(m/v)的脱脂乳粉溶液中至菌浓度为5×109CFU/mL，获得菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。
取体重在20～22g的SPF级BALB/c雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，4组分别为：空白组、灌胃干酪乳杆菌CCFM1038菌悬液的CCFM1038组、灌胃干酪乳杆菌LC6菌悬液的LC6组、灌胃干酪乳杆菌LC7菌悬液的LC7组，其中，CCFM1038组、LC6组、LC7组均为实验组。
实验共22天：第一周(7天)为小鼠适应期；第8天开始灌胃直至实验结束，实验组分别灌胃干酪乳杆菌CCFM1038、LC6以及LC7菌悬液，以0.2mL菌悬液/只/天的剂量进行灌胃，空白组仅灌胃等量脱脂乳粉溶液作为对照；共灌胃15天。
15天后，检测每只小鼠粪便中短链脂肪酸的含量(检测结果见表2，短链脂肪酸含量的检测方法见实施例5)。
由表2可知，与空白组相比，灌胃干酪乳杆菌CCFM1038的小鼠粪便中的总短链脂肪酸含量为66.47±15.48μmol/g，其中，乙酸含量为35.89±4.10μmol/g，丙酸含量为21.66±7.07μmol/g，异丁酸含量为1.02±0.44μmol/g，正丁酸7.88±5.05μmol/g，四种酸均显著高于空白组；此外，灌胃干酪乳杆菌LC6、LC7的小鼠粪便中的各种短链脂肪酸也略高于空白组，但未出现显著差异。
可见，本发明干酪乳杆菌CCFM1038能显著提高小鼠粪便中短链脂肪酸含量，具有明显优势。
表2不同组小鼠粪便中的短链脂肪酸的种类及含量
实施例7：不同干酪乳杆菌对小鼠粪便菌群的影响
具体步骤如下：
将实施例1获得的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1038、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC6以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC7分别接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，离心收集细胞，经生理盐水洗涤后分别重悬于12％(m/v)的脱脂乳粉溶液中至菌浓度为5×109CFU/mL，获得菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。
取体重在20～22g的SPF级BALB/c雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，4组分别为：空白组、灌胃干酪乳杆菌CCFM1038菌悬液的CCFM1038组、灌胃干酪乳杆菌LC6菌悬液的LC6组、灌胃干酪乳杆菌LC7菌悬液的LC7组，其中，CCFM1038组、LC6组、LC7组均为实验组。
实验共22天：第一周(7天)为小鼠适应期；第8天开始灌胃直至实验结束，实验组分别灌胃干酪乳杆菌CCFM1038、LC6以及LC7菌悬液，以0.2mL菌悬液/只/天的剂量进行灌胃，空白组仅灌胃等量脱脂乳粉溶液作为对照；共灌胃15天。
在灌胃第15天的上午收集每只小鼠的粪便，通过购自美国MP公司的粪便样品基因组提取试剂盒提取小鼠粪便样品中细菌基因组，并以此为模板，扩增16S rDNA的V4区，PCR验证后进行切胶回收，回收产物按照购自美国Life Technologies公司的QuantTM dsDNABR Assay Kit试剂盒的说明书进行定量(ng/μL)；根据PicoGreen荧光染料的定量结果，按等质量浓度混合样品，样品之间barcode不重复；按照购自美国Life Technologies公司的Illumina建库试剂盒TurSeq DNALT Sample Preparation Kit的说明书构建文库，主要包括末端修复、3’端加A、接头连接以及PCR扩增等步骤；将文库进行上机测序；根据测序结果进行线下处理，得到不同实验组小鼠粪便中的菌群在门水平上的分布情况、不同实验组小鼠粪便中的菌群在属水平上的分布情况以及不同实验组小鼠粪便中Acinetobacter的相对丰度(检测结果见图6)。
由图6可知，空白组小鼠粪便中Parabacteroides的相对丰度较高，约为1.70±0.35％；与空白组相比，灌胃干酪乳杆菌CCFM1038、LC6、LC7的小鼠粪便中Parabacteroides的相对丰度均显著下降，其中，灌胃干酪乳杆菌CCFM1038的小鼠粪便中Parabacteroides的相对丰度仅为0.002±0.004％，下调作用最为显著。
可见，本发明干酪乳杆菌CCFM1038可显著小鼠肠道中Parabacteroides的相对丰度，具有明显优势。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种可改善肠道健康的干酪乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 746
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggggtcgcag ctatacatgc agtcgaacga gttctcgttg atgatcggtg cttgcaccga 60
gattcaacat ggaacgagtg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccttaagt 120
gggggataac atttggaaac agatgctaat accgcataga tccaagaacc gcatggttct 180
tggctgaaag atggcgtaag ctatcgcttt tggatggacc cgcggcgtac tagctagttg 240
gttaggtccc ggctgtattc aggcgcaaat gcctattaat gcgtcatttc gaccctccag 300
cccccgggct aggtgttggg gatcgctgcg ttattgcatt gcctagatac ttgcgcaaag 360
gaagtaatcg ggtggagctc cctccggatt ttaccaaccc ccctcgaaca taaactccga 420
caactcttgt taatgtggat tagtaactgt tcggggaacg tggctcgagg ggaaaacgaa 480
tgctaagttc gggtcgggac ccccgggatg cgaaaattca cccttgtccc cattattgtg 540
gggtcccccc gagattacgt tgttttttaa actctggatg tgaaaacccc ccaggtgaac 600
cgatttaaac cctctgcgac cccggggaaa atggcgggac acctcacgac acctggaact 660
tcctggttac agcttgagat cgactaggta atttaatact gtccgctgtc caaagctctc 720
tagactgctc tggtaagtta acgaaa 746
Claims (10)
1.一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，其特征在于，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)已于2018年11月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60489，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.如权利要求1所述的一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在制备改善肠道健康的产品中的应用。
3.如权利要求2所述的一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在制备改善肠道健康的产品中的应用，其特征在于，所述产品中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
4.如权利要求2或3所述的一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在制备改善肠道健康的产品中的应用，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健品。
5.如权利要求4所述的一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在制备改善肠道健康的产品中的应用，其特征在于，所述药品含有干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、药物载体和/或药用辅料。
6.一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品含有如权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
7.如权利要求6所述的一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
8.如权利要求6或7所述的一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的活菌数为不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
9.如权利要求6-8任一所述的一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健品。
10.如权利要求9所述的一种可改善肠道健康的产品，其特征在于，所述药品含有干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、药物载体和/或药用辅料。
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