CN114317334B

CN114317334B - 一株能够与幽门螺杆菌共聚集的清酒乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN114317334B
Application number: CN202111552150.XA
Authority: CN
Inventors: 翟齐啸; 张华月; 陈卫; 于雷雷; 田丰伟; 陆文伟; 崔树茂; 王刚; 赵建新; 张灏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN114317334A

Abstract

本发明公开了一株能够与幽门螺杆菌共聚集的清酒乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了一株清酒乳杆菌CCFM1199，所述清酒乳杆菌CCFM1199保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61953，保藏日期为2021年09月26日。本发明清酒乳杆菌CCFM1199菌悬液能够与幽门螺杆菌在人工胃液(pH＝4)中发生共聚集作用，可显著降低幽门螺杆菌对AGS细胞的粘附力；清酒乳杆菌CCFM1199在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的产品(如食品或药品等)中具有巨大的应用前景。

Description

一株能够与幽门螺杆菌共聚集的清酒乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株能够与幽门螺杆菌共聚集的清酒乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种呈螺旋形或S形的微需氧革兰氏阴性菌株，是导致胃炎、消化性胃溃疡、甚至是胃癌的主要原因之一。幽门螺杆菌具有极高的感染率与传染率，在全球大约有50％的人患有该疾病，因其感染情况与种族、社会经济及卫生状况等密切相关，因此，发展中国家的感染率高于发达国家，更甚者能达到80％-90％。

当前，治疗幽门螺杆菌主要采用抗生素结合的三联或者四联的疗法。但由于抗生素的频繁使用，易于导致耐药性幽门螺杆菌菌株的出现，同时，在对幽门螺杆菌感染患者使用三联或四联疗法的过程中，常常伴随着严重的不良反应(如腹痛、恶心、腹泻等)，对患者造成极大伤害。因此，出现了膳食干预以缓解幽门螺杆菌感染的方法。例如公开号为CN111803628A的中国发明专利申请文件提供了一种抗幽门螺杆菌的食品配方，主要包含抗幽门螺杆菌特异性免疫球蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶和其他食品配料，利用抗幽门螺杆菌特异性免疫球蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的协同作用来达到较好的抑制幽门螺杆菌的预防、治疗效果。

除膳食干预之外，益生菌也被提出应用于幽门螺杆菌治疗中。大量体内及临床研究证明，某些益生菌的确具有预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的作用。公开号为CN111607538A的中国发明专利申请文件公开了一株鼠李糖乳杆菌CCFM1119在幽门螺杆菌预防和/或治疗上的应用，证明鼠李糖乳杆菌CCFM1119可以显著降低幽门螺杆菌患者体内幽门螺杆菌定殖量，缓解患者胃肠道不良症状，显著提高幽门螺杆菌患者体内幽门螺杆菌根除率。公开号为CN112940984A、CN112914103A、CN110812373A、CN104839684A等中国发明专利申请文件证明了包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、长双歧杆菌等混合益生菌在缓解幽门螺杆菌感染上的作用。

公开号为CN103648511A的中国发明专利申请文件也报道了许多与幽门螺旋杆菌具有共聚集作用的乳杆菌，包括乳酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、食淀粉乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌、类干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、希氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、绿色乳杆菌。

清酒乳杆菌是一株革兰氏阳性菌，普遍存在于多种生物环境中，主要在酸面团、泡菜、发酵肉制品中广泛存在，因其能够抵制一些苛刻的条件、如高浓度盐、低水活性、低温和低pH等条件，使得其在存储过程中得到了极好的应用。由于清酒乳杆菌产生的乳酸能酸化产品，赋予发酵产品特殊的味道和质地，还能够抑制腐败菌和食源性致病菌如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生长，被认为是极富潜力的肉和鱼制品生物防腐剂。

除此之外，有研究表明，清酒乳杆菌还能够在不产生副作用的情况下使肥胖人群体重减轻(公开于Lim S,Moon J H,Shin C M,et al.Effect of Lactobacillus sakei,aProbiotic Derived from Kimchi,on Body Fat in Koreans with Obesity:ARandomized Controlled Study.Endocrinol Metab(Seoul).2020Jun；35(2):425-434.论文中)。

共聚是指两种细胞彼此粘结形成聚集体的过程，当至少两种不同细胞类型彼此粘结并形成共聚体时，此过程被称为共聚集。合适的乳杆菌与幽门螺杆菌细胞接触形成共聚体，共聚集体的形成有利于防止幽门螺杆菌定殖。乳杆菌与幽门螺杆菌共聚集，使得幽门螺杆菌细胞表面黏附相关物质被乳杆菌细胞掩蔽，幽门螺杆菌细胞不能够与胃上皮细胞结合，从而降低因幽门螺杆菌结合胃上皮细胞所引起的宿主炎症反应。乳杆菌与幽门螺杆菌共聚集体通过胃肠道被排除，降低了宿主体内幽门螺杆菌载量。因此，合适的乳杆菌干预能够降低胃中的幽门螺杆菌载量，甚至有可能根除宿主胃中的幽门螺杆菌。

有研究表明，罗伊氏乳杆菌DSM(Z)17648能够通过共聚集作用拮抗幽门螺杆菌，并能够显著降低幽门螺杆菌患者体内幽门螺杆菌载量(公开在Holz C,Busjahn A,MehlingH,et al.Significant Reduction in Helicobacter pylori Load in Humans with Non-viable Lactobacillus reuteri DSM17648:A Pilot Study.Probiotics AntimicrobProteins.2015Jun；7(2):91-100.及Mehling H,Busjahn A.Non-viable Lactobacillusreuteri DSMZ 17648(Pylopass^TM)as a new approach to Helicobacter pylori controlin humans.Nutrients.2013Aug 2；5(8):3062-73.论文中)。

因此，我们可以利用乳杆菌识别幽门螺杆菌，附着在其表面，形成共聚合细菌体。共聚合细菌体最后顺着肠道被排泄掉，减少胃部幽门螺杆菌的定殖，因此可以显著抑制幽门螺杆菌活性。同时，乳杆菌具有调节胃酸、帮助杀灭Hp以及优异的耐胃酸胆盐特性，肠胃通过率高。而这种共聚反应能显著改善慢性胃炎、胃肠溃疡引起的胃痛、胃酸、胃胀等现象，是恢复慢性胃炎和胃肠溃疡的关键环节。

综上，得到一种能够有效的与幽门螺旋杆菌形成共聚合细菌体的乳杆菌，成为研究的重点和难点。

发明内容

为了得到一种能够有效的与幽门螺旋杆菌形成共聚合细菌体的乳杆菌，本发明提供了一株清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199，所述清酒乳杆菌CCFM1199保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61953，保藏日期为2021年09月26日。

所述清酒乳杆菌CCFM1199来源于江苏省南通市的发酵香肠样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为清酒乳杆菌，命名为清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199。

所述清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199在MRS固体培养基上的菌落呈乳白色半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。

本发明还提供了上述清酒乳杆菌在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的产品中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，清酒乳杆菌的活菌数为不低于5×10⁹CFU/mL或5×10⁹CFU/g。

本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)CCFM1199、药物载体和/或药用辅料。

本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂。

本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。

本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

本发明还提供了一种含有上述清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199的微生物制剂。

本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中，清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)CCFM1199的活菌数为不低于5×10⁹CFU/mL或5×10⁹CFU/g。

本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)CCFM1199。

本发明的一种实施方式中，所述产品为药品。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199的活菌数为不低于5×10⁹CFU/mL或5×10⁹CFU/g。

本发明还提供了上述清酒乳杆菌在抑制幽门螺杆菌方面不以疾病的诊断和治疗为目的的应用。

本发明还提供了一种幽门螺杆菌抑制剂，所述幽门螺杆菌抑制剂含有上述清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199。

本发明的一种实施方式中，所述抑制剂中，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199的活菌数为不低于5×10⁹CFU/mL或5×10⁹CFU/g。

有益效果

1、本发明提供了一株清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199，此清酒乳杆菌能够与幽门螺杆菌共聚，具体体现在：

(1)清酒乳杆菌菌悬液能够与幽门螺杆菌在人工胃液(pH＝4)中发生共聚集作用；

(2)清酒乳杆菌菌悬液可显著降低幽门螺杆菌对AGS细胞的粘附力；

可见，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199在抑制幽门螺杆菌(不以疾病的诊断和治疗为目的)以及制备幽门螺杆菌抑制剂方面具有巨大的应用前景。

2、本发明提供了一株清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199，此清酒乳杆菌具有预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的作用，具体体现在：

清酒乳杆菌可显著降低幽门螺杆菌感染AGS细胞后毒力因子VacA的相对表达量；

可见，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的产品(如药品等)中具有巨大的应用前景。

3、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，本发明的有效成分为清酒乳杆菌的产品不会使得幽门螺杆菌产生耐药性，同时，在治疗过程中不会导致患者产生不良反应。

生物材料保藏

一株清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199，分类学命名为Lactobacillussakei，已于2021年09月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61953，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

附图说明

图1：清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199生长曲线。

图2：不同种乳杆菌菌株对幽门螺杆菌的共聚集能力。

图3：不同清酒乳杆菌菌株对幽门螺杆菌的共聚集能力。

图4：不同种乳杆菌菌株处理后幽门螺杆菌黏附AGS细胞的相对黏附率。

图5：不同清酒乳杆菌菌株处理后幽门螺杆菌黏附AGS细胞的相对黏附率。

图6：不同种乳杆菌菌株对经幽门螺杆菌感染AGS细胞后毒力因子VacA表达的影响。

图7：不同清酒乳杆菌菌株对经幽门螺杆菌感染AGS细胞后毒力因子VacA表达的影响。

图8：热灭活清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199与幽门螺杆菌共聚作用的影响。

图9：热灭活清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199对幽门螺杆菌粘附力的影响。

图10：清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)CCFM1199菌落图。

具体实施方式

下述实施例中涉及的幽门螺杆菌为来源于NTCC国家典型培养物保藏中心的幽门螺杆菌SS1；下述实施例中涉及的F12液体培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；下述实施例中涉及的NaCl购自国药集团；下述实施例中涉及的苯酚红与尿素购自麦克林公司；下述实施例中涉及的哥伦比亚培养基购自英国OXOID公司；下述实施例中涉及的无菌脱纤维绵羊血购自杭州新锐公司；下述实施例中涉及的BHI液体培养基购自青岛海博公司；下述实施例中涉及的胃蛋白酶原购自上海生工生物工程有限公司；下述实施例中涉及的罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂购自上海维他生物科技有限公司。

下述实施例中所涉及的AGS细胞购买自中国科学院上海细胞库。下述实施例中所涉及F12培养基购自赛默飞世尔科技公司。

下述实施例中所涉及的卷曲乳杆菌FSCDJYL3、鼠李糖乳杆菌FSCYA1-2、发酵乳杆菌FJSWX25-2、嗜酸乳杆菌JCM1132、格氏乳杆菌FFJND16L4公开于《益生乳杆菌对慢性牙周炎的缓解作用研究》(徐晚晴.益生乳杆菌对慢性牙周炎的缓解作用研究[D].江南大学,2021.)；

清酒乳杆菌1L10与清酒乳杆菌CCFM1199为同期筛出；

清酒乳杆菌JXJ41、清酒乳杆菌1L10均公开于Integrated Phenotypic-GenotypicAnalysis of Lactobacillus sakei from Different Niches.(Chen Y,Li N,Zhao S,Zhang C,Qiao N,Duan H,Xiao Y,Yan B,Zhao J,Tian F,Zhai Q,Yu L,ChenW.Integrated Phenotypic-Genotypic Analysis of Lactobacillus sakei fromDifferent Niches.Foods.2021Jul 25；10(8):1717.)论文中。

下述实施例中所涉及的干酪乳杆菌ATCC334购自北纳生物科技有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LBS固体培养基(g/L)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、K₂PO₄·3H₂O6g/L、柠檬酸铵2g/L、无水乙酸钠17g/L、MgSO₄·7H₂O 1.18g/L、MnSO₄·H₂O 0.134g/L、FeSO₄·H₂O 0.036g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L

LBS液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、K₂PO₄·3H₂O6g/L、柠檬酸铵2g/L、无水乙酸钠17g/L、MgSO₄·7H₂O 1.18g/L、MnSO₄·H₂O 0.134g/L、FeSO₄·H₂O 0.036g/L、吐温80 1mL/L

MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L。

MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1mL/L。

BHI液体培养基：38.5g BHI液体培养基固体粉末溶于1L水中，121℃灭菌15min，使用时加入5％(v/v)胎牛血清。

哥伦比亚血平板：39g哥伦比亚培养基固体粉末溶于1L水中，121℃灭菌15min，待冷却到55℃～60℃后加入7.5％(v/v)的无菌脱纤维绵羊血，混匀后倒板。

下述实施例中所涉及的共聚率(共聚集能力)的计算方法如下：

式中，OD乳杆菌、OD致病菌和OD混合分别代表乳杆菌、致病菌和两者混合液在37℃静置2h后在600nm处的吸光度。

实施例1：清酒乳杆菌CCFM1199的筛选及鉴定

1、筛选

以来源于贵州省遵义市仁怀市茅台镇的酒糟为样本，将样本经预处理后，在30％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.2mL样本加到5mL LBS培养基中富集8h，将富集液用0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在LBS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS平板上划线纯化，挑取单菌落转接至液体MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1199。

2、鉴定

提取所筛选清酒乳杆菌的基因组，将其16S rDNA进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，经测序分析，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，与乳杆菌属的同源度为：98.17％；结果显示菌株均为清酒乳杆菌，命名为清酒乳杆菌CCFM1199。

同期筛选得到清酒乳杆菌1L10。

实施例2：清酒乳杆菌CCFM1199的培养

将实施例1制备得到的清酒乳杆菌CCFM1199接入MRS固体培养基中，于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落乳白色圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐(如图10所示)。

将实施例1制备得到的清酒乳杆菌CCFM1199接入MRS液体培养基中，于37℃下培养24h，培养过程中，间隔4h通过酶标仪测量培养液的OD₆₀₀，发现清酒乳杆菌在培养16～24h达到生长稳定期，结果如图1所示。

实施例3：清酒乳杆菌对幽门螺杆菌的共聚集作用

具体步骤如下：

(1)幽门螺旋杆菌的培养：

将幽门螺杆菌在哥伦比亚血平板上划线后，于37℃三气培养箱中(85％ N₂、10％CO₂、5％O₂)培养3天，得到单菌落；挑取单菌落接种于含5％(v/v)胎牛血清的BHI培养基中，于37℃三气培养箱中(85％ N₂、10％ CO₂、5％ O₂)培养4天得到种子液；将种子液以2％(v/v)的接种量接种于BHI培养基中，于37℃三气培养箱中(85％ N₂、10％ CO₂、5％ O₂)培养4天，得到活化三代幽门螺杆菌菌液；将幽门螺杆菌菌液8000g离心10min，得到幽门螺杆菌菌体；

将上述幽门螺杆菌菌体用PBS洗涤两次，用pH＝4的人工胃液(0.9％ NaCl、0.3％胃蛋白酶原)重悬至浓度为1×10⁹CFU/mL，得到幽门螺杆菌菌悬液；

(2)乳杆菌的培养

将乳杆菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到活化三代菌液；将菌液经8000g离心10min，得到乳杆菌菌体。

分别将干酪乳杆菌ATCC334、卷曲乳杆菌FSCDJYL3、鼠李糖乳杆菌FSCYA1-2、发酵乳杆菌FJSWX25-2、嗜酸乳杆菌JCM1132、格氏乳杆菌FFJND16L4、清酒乳杆菌CCFM1199组、清酒乳杆菌JXJ41、清酒乳杆菌1L10乳杆菌按照上述方法制备得到乳杆菌菌体；

将上述乳杆菌菌体用PBS洗涤两次后，调整至浓度为1×10⁹CFU/mL，制备得到乳杆菌菌悬液。

(3)幽门螺杆菌菌体与乳杆菌共培养

分别取步骤(1)得到的用人工胃液重悬的幽门螺杆菌菌悬液1mL，分别与步骤(2)得到的调整浓度后的乳杆菌菌悬液1mL混合后，放置在37℃中培养2h后，取上清液在600nm处用酶标仪进行测定，测定结果如表1～2及图2～3所示，其中，表1～2中的第一次、第二次、第三次代表三次平行实验，图中的a、b、c、d表示数据之间具有显著性差异(p<0.05)，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著,凡具不同标记字母的即为差异显著。

表1：不同种乳杆菌的共聚率(共聚集能力)

组别	第一次	第二次	第三次	均值(％)
					Hp+干酪乳杆菌ATCC334	50.4774	50.7778	49.0862	50.1138
Hp+卷曲乳杆菌FSCDJYL3	49.0862	37.6426	44.2478	43.6589
					Hp+鼠李糖乳杆菌FSCYA1-2	42.8023	41.0506	37.6812	40.5114
Hp+发酵乳杆菌FJSWX25-2	43.3584	43.9547	46.1255	44.4795
					Hp+嗜酸乳杆菌JCM1132	34.3328	35.7664	32.9705	34.3566
Hp+格氏乳杆菌FFJND16L4	42.7332	41.4254	42.3656	42.1747
					Hp+清酒乳杆菌CCFM1199	61.5238	60.0001	61.1399	60.8879

表2：不同株清酒乳杆菌的共聚率(共聚集能力)

组别	第一次	第二次	第三次	均值(％)
					Hp+清酒乳杆菌2L6	19.2547	21.5152	20.4268	20.3989
Hp+清酒乳杆菌CCFM1199	61.5238	60.0001	61.1399	60.8879
					Hp+清酒乳杆菌JXJ41	50.0000	50.2410	51.0745	50.4385
Hp+清酒乳杆菌1L10	21.4286	20.4358	20.8651	20.9098

结果显示，清酒乳杆菌CCFM1199与幽门螺杆菌的共聚集率在60％以上，在实验涉及到的不同种乳杆菌中，清酒乳杆菌CCFM1199与幽门螺杆菌的共聚集能力最强；在所选用的4株清酒乳杆菌中，清酒乳杆菌CCFM1199与幽门螺杆菌的共聚集能力也是最强的。

结果表明，清酒乳杆菌CCFM1199与幽门螺杆菌具有较强的共聚集能力。

实施例4：清酒乳杆菌对幽门螺杆菌粘附力的影响

菌体的培养方法同实施例3，具体步骤如下：

(1)按照实施例3的方法，将幽门螺杆菌菌体用F12培养基重悬至浓度为1×10⁷CFU/mL，得到幽门螺杆菌重悬液；将乳杆菌菌体用F12培养基重悬至浓度为1×10⁷CFU/mL，得到乳杆菌重悬液。

(2)空白组：以不经乳杆菌处理且未感染幽门螺杆菌的AGS细胞为空白组；

模型组(Hp组)：以不经乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞为模型组(Hp组)；

实验组：以经不同种乳杆菌及不同株清酒乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞为实验组：Hp感染的AGS细胞+干酪乳杆菌ATCC334、Hp感染的AGS细胞+卷曲乳杆菌FSCDJYL3、Hp感染的AGS细胞+鼠李糖乳杆菌FSCYA1-2、Hp感染的AGS细胞+发酵乳杆菌FJSWX25-2、Hp感染的AGS细胞+嗜酸乳杆菌JCM1132、Hp感染的AGS细胞+格氏乳杆菌FFJND16L4、Hp感染的AGS细胞+清酒乳杆菌2L6组、Hp感染的AGS细胞+清酒乳杆菌CCFM1199组、Hp感染的AGS细胞+清酒乳杆菌JXJ41组、Hp感染的AGS细胞+清酒乳杆菌1L10组，分别命名为：Hp+干酪乳杆菌ATCC334、Hp+卷曲乳杆菌FSCDJYL3、Hp+鼠李糖乳杆菌FSCYA1-2、Hp+发酵乳杆菌FJSWX25-2、Hp+嗜酸乳杆菌JCM1132、Hp+格氏乳杆菌FFJND16L4；Hp+清酒乳杆菌2L6组、Hp+清酒乳杆菌CCFM1199组、Hp+清酒乳杆菌JXJ41组、Hp+清酒乳杆菌1L10组；

具体实验如下：

(1)将AGS细胞用含5％(v/v)胎牛血清的F12培养基重悬后添加至96孔板中(2×10⁴个/孔)，于37℃、5％CO₂的条件下进行培养12～16h，待AGS细胞处于贴壁状态后，用PBS洗涤AGS细胞3次去除死细胞；将步骤(1)制备得到的0.2mL的幽门螺杆菌重悬液添加至洗涤后的AGS细胞中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h后，用PBS液洗涤3次，除去未吸附的幽门螺杆菌，得到幽门螺杆菌感染后的AGS细胞；

(2)在幽门螺杆菌感染后的AGS细胞中分别加入0.2mL不同种乳杆菌重悬液或不同株清酒乳杆菌重悬液，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h，得到经不同种乳杆菌及不同株清酒乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞；

(3)将经不同种乳杆菌或经不同株清酒乳杆菌处理的幽门螺杆菌AGS细胞(实验组)分别用PBS液洗涤3次后，在经不同种乳杆菌或经不同株清酒乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞中分别加入200μL尿素酶试剂(9g/L NaCL、14μg/mL苯酚红、20mM尿素，pH6.8)，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h，得到培养液；

分别将空白组、模型组按照上述方法处理，得到培养液；

通过酶标仪测定不同实验组的培养液在波长550nm处的吸光度，以模型组吸光度减去空白组吸光度测得的粘附率为100％；其余组吸光度减去空白组吸光度后所得差值，与模型组吸光度减去空白组吸光度后所得差值相比，得到相对粘附率，测定结果如表3～4及图4～5所示，其中第一次～第六次代表进行了六次平行实验，图中的a、b、c、d表示数据之间具有显著性差异(p<0.05)，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著。

表3：不同种乳杆菌处理的幽门螺杆菌黏附AGS细胞的相对黏附率

表4：不同清酒乳杆菌菌株处理的幽门螺杆菌黏附AGS细胞的相对黏附率

结果显示，在经不同种乳杆菌处理后，与其他种乳杆菌菌株相比，清酒乳杆菌CCFM1199具有显著降低幽门螺杆菌对AGS细胞粘附率的作用。在不同株清酒乳杆菌处理的实验组中，经清酒乳杆菌CCFM1199处理后，幽门螺杆菌对AGS细胞的粘附率显著下降，从模型组(Hp组)的100％下降到约65％左右，而清酒乳杆菌2L6、清酒乳杆菌1L10仅存在下降趋势，并没有显著降低幽门螺杆菌对AGS细胞粘附率的作用，清酒乳杆菌JXJ41甚至还提高了幽门螺杆菌的粘附率。

此结果表明，清酒乳杆菌CCFM1199可有效降低幽门螺杆菌对AGS细胞的粘附力。

实施例5：乳杆菌对经幽门螺杆菌感染AGS细胞后毒力因子Vac A表达的影响

菌体的培养方法同实施例3，具体步骤如下：

实验组：以经不同种乳杆菌及不同株清酒乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞为实验组，具体为：Hp感染的AGS细胞+干酪乳杆菌ATCC334、Hp感染的AGS细胞+卷曲乳杆菌FSCDJYL3、Hp感染的AGS细胞+鼠李糖乳杆菌FSCYA1-2、Hp感染的AGS细胞+发酵乳杆菌FJSWX25-2、Hp感染的AGS细胞+嗜酸乳杆菌JCM1132、Hp感染的AGS细胞+格氏乳杆菌FFJND16L4、Hp感染的AGS细胞+清酒乳杆菌2L6组、Hp感染的AGS细胞+清酒乳杆菌CCFM1199组、Hp感染的AGS细胞+清酒乳杆菌JXJ41组、Hp感染的AGS细胞+清酒乳杆菌1L10组；分别命名为：Hp+干酪乳杆菌ATCC334、Hp+卷曲乳杆菌FSCDJYL3、Hp+鼠李糖乳杆菌FSCYA1-2、Hp+发酵乳杆菌FJSWX25-2、Hp+嗜酸乳杆菌JCM1132、Hp+格氏乳杆菌FFJND16L4；Hp+清酒乳杆菌2L6组、Hp+清酒乳杆菌CCFM1199组、Hp+清酒乳杆菌JXJ41组、Hp+清酒乳杆菌1L10组；

具体实验如下：

(1)将AGS细胞用含5％(v/v)胎牛血清的F12培养基重悬后添加至6孔板中(1×10⁶个/孔)，于37℃、5％CO₂的条件下进行培养12～16h，待AGS细胞处于贴壁状态后，用PBS洗涤3次去除死细胞；将2mL步骤(1)制备得到的幽门螺杆菌重悬液添加至洗涤后的AGS细胞中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h后，用PBS液洗涤3次，除去未吸附的幽门螺杆菌，得到幽门螺杆菌感染AGS细胞；

(2)在幽门螺杆菌感染AGS细胞中分别加入2mL不同种乳杆菌重悬液或不同株清酒乳杆菌，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h，得到经不同种乳杆菌或经不同株清酒乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞；

(3)将经不同种乳杆菌或经不同株清酒乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞(实验组)分别用PBS液洗涤3次后在经不同种乳杆菌或经不同株清酒乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞中分别加入1mL Trizol，在室温下放置10min，用三氯甲烷和氯仿提取经不同种乳杆菌或经不同株清酒乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞的RNA，再用诺唯赞反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，测定浓度后置于-20℃冰箱中待用。

按照上述方法检测空白组、模型组的浓度。

本研究测定的细胞因子为Vac A，以Gyr B为内参基因，进行实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)，测定结果如表5～6及图6～7所示，图中的a、b、c、d表示数据之间具有显著性差异(p<0.05)，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著。

表5不同种乳杆菌对经幽门螺杆菌感染AGS细胞后毒力因子Vac A表达的影响

表6不同清酒乳杆菌菌株对经幽门螺杆菌感染AGS细胞后毒力因子Vac A表达的影响

结果显示，相较于Hp感染组，未经过感染的细胞体系(空白组)中毒力因子Vac A几乎没有表达，而在不同种乳杆菌菌株及不同株清酒乳杆菌干预后，毒力因子Vac A均得到了不同程度的下调，清酒乳杆菌CCFM1199对毒力因子Vac A的表达下调得最为明显。

该结果表明，清酒乳杆菌CCFM1199能够显著下调毒力因子Vac A的相对表达，或能降低H.pylori感染对AGS细胞的伤害。

实施例6：热灭活清酒乳杆菌CCFM1199与幽门螺杆菌共聚作用的影响

菌体的培养方法同实施例3，具体步骤如下：

按照实施例3中步骤(1)的方法，得到幽门螺杆菌菌悬液，浓度为1×10⁹CFU/mL；

按照实施例3中步骤(2)的方法，将清酒乳杆菌CCFM1199调整至1×10⁹CFU/mL，将其放在70℃金属浴中30min以灭活细菌。

将灭活的清酒乳杆菌CCFM1199用人工胃液重悬，得到热灭活后的清酒乳杆菌CCFM1199菌悬液。

将购买的罗伊氏乳杆菌DSM17648制剂用150mL人工胃液重悬，菌浓为：OD₆₀₀＝1.0，得到罗伊氏乳杆菌DSM17648菌悬液；用来做阳性参照。

按照实施例3中步骤(3)的方法，将清酒乳杆菌CCFM1199和与幽门螺杆菌37℃共培养2h，取上清液在600nm处用酶标仪进行测定，测定结果如表7及图8，其中，表7中的第一次、第二次、第三次代表三次平行实验，图中的a、b表示数据之间具有显著性差异(p<0.05)，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著。

表7热灭活后的清酒乳杆菌的共聚率(共聚集能力)

	第一次(％)	第二次(％)	第三次(％)	均值(％)
					罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂	40.4546	41.0885	40.2860	40.6097
清酒乳杆菌CCFM1199(热灭活)	50.9501	51.2100	50.7347	50.9649

结果显示，热灭活的清酒乳杆菌与幽门螺杆菌的共聚率(共聚集能力)在50.96％，大于市售菌株罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂(40.61％)，且未灭活的清酒乳杆菌CCFM1199的共聚集率(共聚集能力)在60％左右，明显大于热灭活的清酒乳杆菌与幽门螺杆菌的共聚率(共聚集能力)，说明热灭活会对清酒乳杆菌CCFM1199的共聚集能力产生较大的负面影响。

实施例7：热灭活清酒乳杆菌CCFM1199对幽门螺杆菌粘附力的影响

按照实施例4及实施例6中所述的方法：

(1)制备用F12培养基重悬的清酒乳杆菌CCFM1199菌悬液：将清酒乳杆菌CCFM1199调整至1×10⁷CFU/mL，将其放在70℃金属浴中30min以灭活细菌，将灭活后的菌液经8000g离心10min，得到灭活后的清酒乳杆菌CCFM1199菌体，将菌体用F12培养基重悬，得到用F12培养基重悬的清酒乳杆菌CCFM1199菌悬液；

将幽门螺杆菌菌体用F12培养基重悬至浓度为1×10⁷CFU/mL，得到幽门螺杆菌重悬液；

将购买的罗伊氏乳杆菌DSM17648制剂用150mL人工胃液重悬，菌浓为：OD₆₀₀＝1.0，得到罗伊氏乳杆菌DSM17648菌悬液。

(2)之后按照实施例4中实验方法：

空白组：以不经乳杆菌处理且未感染幽门螺杆菌的AGS细胞为空白组；

实验组：以经热灭活清酒乳杆菌CCFM1199菌悬液及经罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞为实验组。

具体实验如下：

将AGS细胞用含5％(v/v)胎牛血清的F12培养基重悬后添加至96孔板中(2×10⁴个/孔)，于37℃、5％CO₂的条件下进行培养12～16h，待AGS细胞处于贴壁状态后，用PBS洗涤AGS细胞3次去除死细胞；将制备得到的0.2mL的幽门螺杆菌重悬液添加至洗涤后的AGS细胞中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h后，用PBS液洗涤3次，除去未吸附的幽门螺杆菌，得到幽门螺杆菌感染后的AGS细胞；

在幽门螺杆菌感染后的AGS细胞中分别加入0.2mL罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂或者清酒乳杆菌CCFM1199重悬液，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h，得到经清酒乳杆菌CCFM1199菌制剂及经罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞；

将经清酒乳杆菌CCFM1199菌制剂及经罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞(实验组)分别用PBS液洗涤3次后，在经清酒乳杆菌CCFM1199菌制剂及经罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂处理的幽门螺杆菌感染AGS细胞中分别加入200μL尿素酶试剂(9g/L NaCl、14μg/mL苯酚红、20mM尿素，pH 6.8)，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h，得到培养液；

分别将空白组、模型组按照上述方法处理，得到培养液；

通过酶标仪测定不同实验组的培养液的在波长550nm处的吸光度，以模型组吸光度减去空白组吸光度测得的粘附率为100％，其余组吸光度减去空白组吸光度后所得差值，与模型组吸光度减去空白组吸光度后所得差值相比，得到相对粘附率，结果如表8及图9所示，其中第一次～第六次代表进行了六次平行实验，图中的a、b表示数据之间具有显著性差异(p<0.05)，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著。

表8热灭活清酒乳杆菌CCFM1199处理的幽门螺杆菌黏附AGS细胞的相对黏附率

相对粘附率(％)	Hp组	罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂	清酒乳杆菌CCFM1199(热灭活)
				第一次	100.4559	80.5882	72.9805
第二次	100.5071	82.6087	69.3939
				第三次	100.1835	82.8025	74.2132
第四次	100.0903	83.6364	75.1613
				第五次	100.1948	87.6812	74.1688
第六次	100.0423	86.4443	76.7313
				平均值	100.2457	83.9602	73.7748

结果显示，热灭活清酒乳杆菌CCFM1199处理的幽门螺杆菌黏附AGS细胞的相对黏附率均值为73.77％，小于市售菌株罗伊氏乳杆菌DSM17648菌制剂(83.96％)。在未灭活的清酒乳杆菌CCFM1199干预下，幽门螺杆菌黏附AGS细胞的相对黏附率在66％左右，明显小于热灭活清酒乳杆菌CCFM1199处理的幽门螺杆菌黏附AGS细胞的相对黏附率，说明热灭活会对清酒乳杆菌CCFM1199产生较大的负面影响。

实施例8：清酒乳杆菌在模拟胃酸环境中的生长

按照实施例3步骤(2)中的方法，取100μL活化三代后的清酒乳杆菌CCFM1199菌液按照2％(v/v)的接种量接种至5mL MRS液体培养基中，37℃静置培养16h后，取1mL清酒乳杆菌CCFM1199菌液，8000r/min离心10min弃上清，收集菌体。

将菌体悬浮于等体积，pH＝3.0的MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养，于0h和3h分别取样，用涂布法进行计数，以培养0h的活菌数为对照；

存活率公式如下：

式中：CFU0为在pH＝3.0的MRS液体培养基中培养0h的活菌数(CFU/mL)；CFU1为在pH＝3.0的MRS液体培养基中培养3h的活菌数(CFU/mL)。

表9清酒乳杆菌CCFM1199在pH＝3.0培养基中的存活率

由表9可知，清酒乳杆菌CCFM1199在pH＝3.0的酸性条件下3h后的存活率为88.31％，可以较好的在酸性条件下生存。

实施例9：清酒乳杆菌的应用

清酒乳杆菌CCFM1199可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：

清酒乳杆菌CCFM1199划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到清酒乳杆菌CCFM1199菌粉；

其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；

保护剂的成分包含：130g/L脱脂奶粉。

实施例10：清酒乳杆菌的应用

清酒乳杆菌CCFM1199可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下

清酒乳杆菌CCFM1199划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000r/min离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰CFU/mL，得到菌悬液；菌悬液添加至浓度为30g/L的海藻酸钠溶液中至浓度为2×10⁹CFU/mL后，充分搅拌，使得清酒乳杆菌CCFM1199的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/L的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品；

其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基。

实施例11：清酒乳杆菌的应用

清酒乳杆菌CCFM1199可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：

保护剂的成分包含：130g/L脱脂奶粉。

称取清酒乳杆菌CCFM1199菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用中南制药机械厂的压片机进行压片后使用青州市益康中药机械有限公司的小型药物干燥机进行干燥，得到片剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株能够与幽门螺杆菌共聚集的清酒乳杆菌及其应用

<130> BAA211546A

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1114

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (826)..(826)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (944)..(944)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1035)..(1036)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1044)..(1044)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1046)..(1050)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1056)..(1057)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1069)..(1070)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

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<222> (1075)..(1075)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1081)..(1083)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1112)..(1114)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

nnnnnnnnnn nnnnnncnnn acntgcagtc gaacgcactc tcgtttagat tgaaggagct 60

tgctcctgat tgataaacat ttgagtgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 120

tgccctaaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcataa aacctaacac 180

cgcatggtgt agggttgaaa gatggtttcg gctatcactt taggatggac ccgcggtgca 240

ttagttagtt ggtgaggtaa aggctcacca agaccgtgat gcatagccga cctgagaggg 300

taatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga 360

atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg 420

gatcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat gtatctgata gtaactgatc aggtagtgac 480

ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540

gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggtttct taagtctgat 600

gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660

gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720

ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcaaac 780

aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctangtgt tggagggttt 840

ccgcccttca gtgccgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag 900

gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggngcatgt ggtttaattc 960

gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatccttt gaccactcta gagatagagc 1020

tttcccttcg gggannaagt gacngnnnnn catggnngtc gtcagctcnn gtcgngagat 1080

nnngggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cnnn 1114

Claims

1.一株清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）CCFM1199，其特征在于，所述清酒乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：61953，保藏日期为2021年09月26日。

2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有权利要求1所述的清酒乳杆菌CCFM1199。

3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中，清酒乳杆菌CCFM1199的活菌数为不低于5×10⁹ CFU/mL或5×10⁹ CFU/g。

4.一种菌粉，其特征在于，所述菌粉中含有权利要求1所述的清酒乳杆菌CCFM1199。

5.一种药品，其特征在于，所述药品中含有权利要求1所述的清酒乳杆菌CCFM1199。

6.如权利要求5所述的药品，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述清酒乳杆菌CCFM1199、以及药物载体和/或药用辅料。

7.如权利要求6所述的药品，其特征在于，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

8.权利要求1所述的清酒乳杆菌CCFM1199在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药品中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药品中，清酒乳杆菌CCFM1199的活菌数为不低于5×10⁹ CFU/mL或5×10⁹ CFU/g。