CN112980737B - 一株促进动物双歧杆菌增殖的青春双歧杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株促进动物双歧杆菌增殖的青春双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了一株青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，所述青春双歧杆菌CCFM1169，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61547，保藏日期为2021年03月09日。本发明的青春双歧杆菌，可提高动物双歧杆菌对菊粉的利用率与生长速率，发酵液中动物双歧杆菌菌落数增加。动物实验表明该青春双歧杆菌能促进动物双歧杆菌在C57BL/6J小鼠肠道内增殖，具有巨大的应用及商业价值。

Description

一株促进动物双歧杆菌增殖的青春双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株促进动物双歧杆菌增殖的青春双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
动物双歧杆菌是常见的肠道微生物，它在维持肠道平衡，抑制肠道内有害微生物生长繁殖，抵抗病原体感染，增强机体免疫力等方面发挥重要作用。研究表明，当肠道内有高浓度水平的动物双歧杆菌时，外侵病原菌如大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌或内源的腐生菌、条件致病菌就会受到抑制。此外，双歧杆菌能够产生乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等短链脂肪酸增强肠道蠕动，促进排便，防止便秘。过往的研究已经表明动物双歧杆菌对人体健康有诸多益处。例如公开号为CN112159778A的中国发明专利申请文件提供了一种动物双歧杆菌CCFM1148，可以缓解银屑病。公开号为CN104928215A的中国发明专利申请文件提供了一种动物双歧杆菌BZ11，也具有降低胆固醇，抗氧化的作用。
并且，有文献表明，动物双歧杆菌在厌氧环境下产生较少的乙酸和乳酸，保证HPV患者体内弱酸环境，减少乙酸和乳酸对蛋白质的抑制效果，提高患者体内的抵抗力(记载于公开号为CN112322537A的中国发明专利申请文件中)。
此外，还有文献表明，经口施用的动物双歧杆菌抑制结肠直肠癌肿瘤生长，使用不同动物双歧杆菌菌株有利于治疗结肠直肠癌(记载于公开号为CN111356464A的中国发明专利申请文件中)。
可见，动物双歧杆菌不仅能缓解银屑病、降低胆固醇，也具有一定的预防癌症等功效。同时，动物双歧杆菌是如今应用在食品工业中最多的双歧杆菌菌种之一，尤其是乳制品行业，如动物双歧杆菌BB-12、动物双歧杆菌HN019和动物双歧杆菌bI-04等。但是，发明人课题组前期研究表明，动物双歧杆菌在体内的增殖效果较差，如何提高动物双歧杆菌在体内的增殖，成为研究的热点和难点。
目前已经有许多研究表明，补充菊粉可促进动物双歧杆菌增殖，例如，张泽生等人在“菊粉低聚果糖与蔗糖低聚果糖对双歧杆菌体外增殖的研究”中发现菊粉能有效促进动物双歧杆菌的体外增殖。(菊粉低聚果糖与蔗糖低聚果糖对双歧杆菌体外增殖的研究,《中国食品添加剂》，2016年，第1期，第76-80页)。
并且，中国发明专利申请文件CN105483059A也公开了一种利用菊粉促进双歧杆菌增殖的方法。但是，Watson等人研究发现，部分动物双歧杆菌利用菊粉能力较弱，仅补充菊粉无法促进其增殖(公开于D Watson,Motherway M O,Schoterman M,et al.Selectivecarbohydrate utilization by lactobacilli and bifidobacteria[J].Journal ofApplied Microbiology,2013,114(4).论文中)。
可见通过补充菊粉促进动物双歧杆菌增殖的方法收效不高，而公开号为CN104928215A的中国发明申请文件中，通过将菌株在二氧化碳培养箱中进行富集培养后，继续在发酵培养基中进行培养，周期长达8天，才能增加动物双歧杆菌的生物量，但是，该方法周期长、工艺复杂，也不适合于动物双歧杆菌在体内的增殖，因此，急需找到一种能够进一步提高动物双歧杆菌在体内和体外增殖的方法。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是：提供一种周期短，工艺简单的提高动物双歧杆菌的体内和体外增殖的方法，同时提供一种青春双歧杆菌及其应用。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)CCFM1169，所述青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61547，保藏日期为2021年03月09日。
所述青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，是从来源于山东济南的中老年人群粪便样本中分离得到的。该菌株经测序分析，其16S rDNA序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示与青春双歧杆菌的核酸序列相似度为100％，结果显示菌株属于双歧杆菌属的青春双歧杆菌，将其命名为青春双歧杆菌Bifidobacteriumadolescentis CCFM1169。
所述青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169在改良MRS固体培养基上的菌落呈乳白色半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。
本发明还提供了一种含有上述青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentisCCFM1169的微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述青春双歧杆菌在微生物制剂中的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明还提供了一种促进动物双歧杆菌增殖的方法，所述方法为，将上述青春双歧杆菌，或上述微生物制剂与动物双歧杆菌，在含有菊粉的培养基中共培养。
在本发明的一种实施方式中，所述含有菊粉的培养基为：将改良MRS培养基中的葡萄糖替换为菊粉。
在本发明的一种实施方式中，所述菊粉购自上海创赛科学仪器有限公司。
在本发明的一种实施方式中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624、动物双歧杆菌CCFM625中的任一种。
在本发明的一种实施方式中，所述青春双歧杆菌与动物双歧杆菌按照活菌数比为1:1的比例添加，其中活菌的浓度至少为1×106CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述含有菊粉的培养基为：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、无水乙酸钠5.0g、无水磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、一水半胱氨酸盐0.5g,加蒸馏水至1000mL，调整pH值至6.2-6.4，分装9mL培养液于厌氧管中，充入足量氮气后盖塞隔绝空气，121℃灭菌15分钟。
为了避免营养元素损失，培养基中的碳源为1g菊粉，先将1g菊粉溶解于10mL去离子水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，使用前取1mL菊粉溶液添加于装有9mL液体培养基的上述厌氧管中。
在本发明的一种实施方式中，培养方式为，厌氧环境下35～38℃恒温培养培养42～48h。
在本发明的一种实施方式中，通过荧光定量PCR实验评估青春双歧杆菌在体外促进动物双歧杆菌增殖的情况。
本发明还提供了一种促进动物双歧杆菌增殖的产品，所述产品中含有上述青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，或上述微生物制剂。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述青春双歧杆菌Bifidobacteriumadolescentis CCFM1169在产品中的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中包括食品、药物或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括发酵果蔬、发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或其他含有上述青春双歧杆菌的食品。
本发明还提供了上述青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，或上述微生物制剂在制备改善肠道健康的产品中的应用。
本发明还提供了上述青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，或上述微生物制剂在制备益生菌食品中的应用。
本发明还提供了上述青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，或上述微生物制剂在制备益生菌保健品中的应用。
本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和菊粉。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括食品、药物或保健品。
有益效果
(1)本发明提供了一株青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，所述此青春双歧杆菌CCFM1169能够促进动物双歧杆菌增殖，具体体现在：提高动物双歧杆菌CCFM1148对菊粉的利用能力，促进动物双歧杆菌CCFM1148在菊粉培养基上的增殖，使动物双歧杆菌CCFM1148体外培养活菌数不低于1.0×107CFU/mL。
(2)本发明提供了一株青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，此青春双歧杆菌CCFM1169能够促进动物双歧杆菌CCFM1148在C57BL/6J小鼠肠道内增殖，动物双歧杆菌CCFM1148在小鼠干粪便的菌落数不低于1.0×108CFU/g。
在C57BL/6J小鼠中，相比于动物双歧杆菌单菌，所述青春双歧杆菌能够提高动物双歧杆菌对菊粉的利用能力，提高动物双歧杆菌在小鼠体内的定殖量。此外，青春双歧杆菌还能够提高肠道内短链脂肪酸的含量，尤其是乙酸、丁酸，对便秘具有显著改善作用。
(3)青春双歧杆菌是益生菌的一种目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》。可见，本发明的有效成分为青春双歧杆菌CCFM1169的产品在服用过程中不会对身体造成不良影响。本发明所述的青春双歧杆菌能够用于制备具有缓解便秘的功能性食品、保健品和药品，具有非常广泛的应用前景。
生物材料保藏
一株青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169，分类学命名为：Bifidobacterium adolescentis，已于2021年03月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61547，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1：动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625分别与青春双歧杆菌CCFM1169、青春双歧杆菌CCFM1066单独培养和与混合培养于1％菊粉液体培养基上培养的生长曲线。
图2：动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625分别与青春双歧杆菌CCFM1169、青春双歧杆菌CCFM1066单独培养和与混合培养于0.5％菊粉液体培养基上培养的生长曲线。
图3：动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625分别与青春双歧杆菌CCFM1169、青春双歧杆菌CCFM1066单独培养和与混合培养于1％菊粉液体培养基上培养的代时(与CCFM1169+CCFM1148组比，**表示P<0.01,****表示P<0.0001；与CCFM1169+CCFM624组比，##表示P<0.01)。
图4：动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625分别与青春双歧杆菌CCFM1169、青春双歧杆菌CCFM1066单独培养和与混合培养于0.5％菊粉液体培养基上培养的代时(与CCFM1169+CCFM1148组比，**表示P<0.01,****表示P<0.0001；与CCFM1169+CCFM624组比，####表示P<0.0001)。
图5：本发明动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625分别与青春双歧杆菌CCFM1169在体外单独培养和共同培养后青春双歧杆菌的菌落数(与CCFM1169组比，**表示P<0.01，***表示P<0.001)。
图6：本发明动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625分别与青春双歧杆菌CCFM1169在体外单独培养和共同培养后动物双歧杆菌的菌落数(与CCFM1169组比，**表示P<0.01；与CCFM1148组比，#表示P<0.05)。
图7：动物实验分组及实验方法。
图8：动物双歧杆菌CCFM1148单独灌胃和与青春双歧杆菌CCFM1169混合灌胃干预4周后的动物双歧杆菌的定殖情况(与动物双歧组比，*表示P<0.05，***表示P<0.001；与复合益生菌组比，#表示P<0.05，##表示P<0.01；###表示P<0.001)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中所涉及的菌株的保藏信息如下：
一株动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis CCFM1148，分类学命名为Bifidobacterium animalis，已于2020年08月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61162，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
一株青春双歧杆菌CCFM1066，分类命名为Bifidobacterium adolescentis，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60702，保藏日期为2019年06月27日。
下述实施例中所涉及的动物双歧杆菌CCFM624，分类命名为Bifidobacteriumanimalis，已公开于论文(王琳琳,王刚,张灏,赵建新,陈卫.具粘附特性的动物双歧杆菌对便秘模型小鼠血清中胃肠调节肽水平的影响[J].中国食品学报,2019,19(06):13-20.)。
下述实施例中所涉及的动物双歧杆菌CCFM625，分类命名为Bifidobacteriumanimalis，已公开于论文(王琳琳,王刚,张灏,赵建新,陈卫.具粘附特性的动物双歧杆菌对便秘模型小鼠血清中胃肠调节肽水平的影响[J].中国食品学报,2019,19(06):13-20.)。
下述实施例中所涉及的雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。下述实施例中所涉及的菊粉购自上海创赛科学仪器有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
改良MRS液体培养基：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖20.0g、无水乙酸钠5.0g、无水磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、一水半胱氨酸盐0.5g、吐温80 1mL，加蒸馏水至1000mL，调整pH值至6.2-6.4，分装10mL培养液于厌氧管中，充入足量氮气后盖塞隔绝空气，121℃灭菌15分钟。
改良MRS固体培养基：在液体培养基的基础上再加琼脂粉15g。
1％菊粉液体培养基：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、无水乙酸钠5.0g、无水磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、一水半胱氨酸盐0.5g、吐温80 1mL，加蒸馏水至1000mL，调整pH值至6.2～6.4，分装9mL培养液于厌氧管中，充入足量氮气后盖塞隔绝空气，121℃灭菌15分钟。为了避免营养元素损失，培养基中的碳源为1g菊粉，先将1g菊粉溶解于10mL去离子水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，使用前取1mL菊粉溶液添加于装有9mL液体培养基的上述厌氧管中。
1％菊粉固体培养基：在液体培养基的基础上再加琼脂粉15g。
0.5％菊粉液体培养基：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、无水乙酸钠5.0g、无水磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、一水半胱氨酸盐0.5g、吐温80 1mL，加蒸馏水至1000mL，调整pH值至6.2-6.4，分装9mL培养液于厌氧管中，充入足量氮气后盖塞隔绝空气，121℃灭菌15分钟。为了避免营养元素损失，培养基中的碳源为0.5g菊粉，先将0.5g菊粉溶解于10mL去离子水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，使用前取1mL菊粉溶液添加于装有9mL液体培养基的上述厌氧管中。
0.5％菊粉固体培养基：在液体培养基的基础上再加琼脂粉15g。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
双歧杆菌增殖的检测方法(实时荧光定量检测方法)：
(1)PCR引物设计
查阅相关文献，利用引物设计软件设计各细菌的引物。为了验证引物的特异性，可通过电脑在基因库找到2种细菌的16SrRNA的全序列，所选用引物序列分别与全序列在BLAST数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行比较，其上下游引物如下:青春双歧杆菌AGCAATCTTCATGGTTGC；ACCGTCTCGGTTTTGCCGGTCCATG，扩增片段为296bp。动物CACCAATGCGGAAGACCAG；GTTGTTGAGAATCAGCGTGG，扩增片段为250bp。
(2)荧光定量PCR反应
10μL反应体系包括：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)5μL，上下游引物(0.25t～mol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，超纯水3μL。使用实时定量PCR仪(CFX Connect；Bio-Rad)PCR仪进行扩增与分析。
在PCR的反应过程中，所形成的DNA会和荧光染料结合，两者结合后形成的荧光信号可被检测到。结合细菌的溶解曲线，得到双歧杆菌引物二聚体的TM值为83～87℃。反应程序为:双歧杆菌95℃5s，60℃1min，72℃45s，87℃5s共40个循环，以72℃10min延伸后结束。
(3)标准曲线的制作
分别将动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1148和本申请的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1169接种于改良MRS琼脂平板，于37℃培养48h。之后挑取单菌落划线接种于改良MRS琼脂平板，相同方法培养分别转接3代，分别挑取菌落于无菌生理盐水中制成0.5McF(麦氏浓度)的菌悬液，再用无菌生理盐水梯度稀释菌悬液，并按照标准GB4789.34—2016测定各稀释度的菌落数，分别挑取菌落数约为109CFU/mL的稀释度作为待用样液。
做系列稀释后直接9200r/min离心3min，PBS洗2次，水洗1次，悬浮，破碎菌体，加热、即冷等步骤，所得细菌的DNA也同时进行荧光定量PCR。
分别将动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1148和本申请的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1169这2种细菌的标准样品和待测样品同时进行荧光定量PCR反应作为标准曲线。以不同浓度的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数(Ct)为纵坐标绘制而成。待测样品和标准曲线进行比较，分别获得这2种双歧杆菌的数量。
实施例1：青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169的分离筛选和鉴定
具体步骤如下：
1、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169的分离筛选
(1)将从山东济南不同地区收集的中老年人的粪便样品(该粪便样品保存在30％的甘油中)吸取1mL，经梯度稀释，将粪便样品涂布在改良MRS固体培养基上，在厌氧工作站培养48h，厌氧工作站的温度为37℃；
(2)挑取菌落形态存在差异的菌株在改良MRS固体培养基上进行划线分离纯化，并且详细记录菌体的形态特征(结果如表1所示)；
(3)挑取步骤(2)的培养基中分离出来的单菌，转移至改良MRS液体培养基，在37℃的厌氧工作站中培养48h，所得菌株进行革兰氏染色，记录菌落形态；
(4)弃除步骤(3)的菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌；
(5)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。
表1：青春双歧杆菌CCFM1169的生理特性
Figure BDA0003003763210000081
2、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169的分子学鉴定：
(1)基因组的抽提：
将获得的青春双歧杆菌分别在改良MRS液体培养基中培养20h，制备得到菌液，所获得的青春双歧杆菌菌液吸取1mL于2mL EP管中，在1000rpm的条件下离心3min，弃上清液得到菌体；
向得到的菌体中加入1mL无菌水，吹洗菌体后，在1000rpm条件下离心3min，所得沉淀即为菌体；向菌体中加入200μL SDS裂解液，在80℃孵化30min，得到菌体裂解液；然后向菌体裂解液中加入酚-氯仿混合溶液，其成分及体积比为Tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，然后颠倒混匀，在12000rpm的条件下离心5min，取上清200μL；然后加入400μL的冰乙醇或冰异丙醇于200μL上清中，-20℃静置1h，然后在12000rpm的条件下离心5min，弃上清；加入500μL 70％体积分数的冰乙醇重悬沉淀，在12000rpm的条件下离心3min，弃上清；然后置于60℃烘箱烘干或者自然晾干；然后用50μL dd H2O重新溶解沉淀得到模板DNA以进行PCR反应。
(2)16S rDNA PCR
A、PCR反应体系50μL:10×Taq buffer，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，0.5μL；模板，0.5μL；dNTP，5μL；ddH2O，38μL。
B、PCR反应条件为:95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-4 30×；72℃5min；12℃2min。
C、结束后制备1％浓度的琼脂糖凝胶，将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量为2μL，在120V的电压下运行30min，然后进行凝胶成像分析。
D、结束后将PCR产物送至测序公司测定，将获得的测序序列在NCBI数据库中进行比对，初步鉴定得到该株菌为青春双歧杆菌。
(3)全基因组测序
将提取的全基因组送到专业的测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，将得到的序列结果使用BLAST在GenBank中进行搜索和相似性比对，结果显示与青春双歧杆菌的核酸序列相似度为100％，结果显示菌株属于双歧杆菌属的青春双歧杆菌，将其命名为青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169；保藏在-80℃备用。
实施例2：不同的双歧杆菌菌株在不同碳源培养基的生长情况
在该实施例中，发明人以本发明的青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentisCCFM1169、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1066、动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis CCFM1148、动物双歧杆菌Bifidobacterium animalisCCFM624和动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis CCFM625作为研究对象，以菊粉、低聚果糖、果糖和葡萄糖作为唯一碳源，在碳源限定培养基中微孔培养，以此评估其对不同碳源的利用程度。
具体步骤如下：
(1)培养基的配制
葡萄糖液体培养基：采用的是改良MRS液体培养基；
无糖液体培养基：采用的是不添加葡萄糖的改良MRS液体培养基；
果糖液体培养基：将改良MRS液体培养基中的葡萄糖替换为果糖；
低聚果糖液体培养基：将改良MRS液体培养基中的葡萄糖替换为低聚果糖。
(2)双歧杆菌在不同培养基中的培养
分别将保藏在-80℃环境中的青春双歧杆菌CCFM1066、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169和动物双歧杆菌Bifidobacterium animalisCCFM1148、动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis CCFM624和动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis CCFM625菌株接入改良MRS液体培养基厌氧管中，于培养温度为37℃厌氧工作站(N2:CO2:H2＝80:10:10)内进行活化，然后按照2％(v/v)的接种量依次转接到改良MRS液体培养基厌氧管中，利用第三次传代的活化菌株，在超净台中取9mL菌液于10mL无菌离心管，在4500rpm、4℃条件下离心15min，倒掉上清，加入9mL无菌生理盐水混匀后作为种子液。
分别将上述制备得到的种子液按2％(v/v)的接种量分别转接到步骤(1)制备得到的无糖液体培养基、葡萄糖液体培养基、果糖液体培养基、低聚果糖液体培养基及1％的菊粉液体培养基中，厌氧环境下37℃恒温培养48h。
(3)菌株生长情况的检测
采用多功能检测酶标仪测定OD600值以及使用梅特勒-托利多pH计测定菌株生长48小时后上清液的pH值。结果如表2和表3所示：
表2：5株双歧杆菌菌株在不同碳源培养基生长48小时测定的OD600值
Figure BDA0003003763210000101
表3：5株双歧杆菌在不同碳源培养基生长48小时测定的pH值
Figure BDA0003003763210000102
由表2的OD600值可知，在葡萄糖作唯一碳源的培养基中菌株的生长的最好，在菊粉作碳源时则相对较好；不过在以果糖、低聚果糖、菊粉分别作唯一碳源时，动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625的OD600值最小，利用菊粉能力较弱。相比之下，青春双歧杆菌CCFM1169和青春双歧杆菌CCFM1066在以菊粉、低聚果糖分别作唯一碳源的限定培养基中可以生长，且青春双歧杆菌CCFM1169生长在菊粉中的生长优于参照菌株青春双歧杆菌CCFM1066(具体见表2)。
由表3的pH值可知，菌株在葡萄糖作唯一碳源的培养基中产酸最多，说明生长最好，在菊粉作碳源时则相对较好。不过在以菊粉作唯一碳源时，动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624、动物双歧杆菌CCFM625 pH值最大，说明其利用菊粉能力较弱，产酸较少。此外，实验结果还表明且青春双歧杆菌CCFM1169在以菊粉、低聚果糖、果糖分别作唯一碳源的培养基上，生长效果显著优于参照菌株青春双歧杆菌CCFM1066(具体见表3)。
由表2和表3可知，尽管双歧杆菌对葡萄糖的利用效果最好，但有文献(公开于Alony G,Lazidou K,Verschaeren A,et al.In Vitro Kinetic Analysis ofFermentation of Prebiotic Inulin-Type Fructans by Bifidobacterium SpeciesReveals Four Different Phenotypes[J].Applied&Environmental Microbiology,2009,75(2):454-461.论文中)表明，补充菊粉能增加人体内益生菌的丰度，尤其是双歧杆菌。因此，研究双歧杆菌对菊粉的利用能力对开发具有商业应用前景的益生菌制剂更有价值。
实施例3：5株双歧杆菌菌株在含量分别为1％和0.5％的菊粉培养基的生长情况
在该实施例中，发明人以本发明的青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentisCCFM1169、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1066、动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis CCFM1148、动物双歧杆菌Bifidobacterium animalisCCFM624和动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis CCFM625作为研究对象，以含量为1％和0.5％菊粉作为唯一碳源，在碳源限定培养基中微孔培养，以此评估不同含量的菊粉对其生长情况的影响。
具体步骤如下：
(1)制备种子液
制备方法同实施例2的步骤(2)，区别在于，调整双歧杆菌菌种为青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌CCFM1169，以及动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625，同时将青春双歧杆菌CCFM1169和青春双歧杆菌CCFM1066分别与动物双歧杆菌CCFM1148，动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625，按照活菌比为1:1的方式添加至培养基中，分别制备得到种子液；
其中，青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169的种子液中菌浓为：2×109CFU/mL；
动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625的种子液中菌浓均为：2×109CFU/mL；
混合培养时得到的种子液中，青春双歧杆菌CCFM1169和青春双歧杆菌CCFM1066的菌浓均为1×109CFU/mL，动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625的菌浓均为：1×109CFU/mL；
对照菌株青春双歧杆菌CCFM1066种子液的菌浓为：2×109CFU/mL。
(2)分别将以2％(v/v)的接种量转接于1％菊粉液体培养基和0.5％菊粉液体培养基中，在无菌环境下，将已接菌培养液移入96孔细胞培养板中，每孔成200微升体系，做3个孔平行，厌氧环境下37℃恒温培养培养45h。
(3)菌株生长曲线情况
多功能检测酶标仪Tecan infinite F50测定OD600值，每隔1分钟自动检测一次，连续测定45h。结果如图1～2和表3～4所示。
表4不同菌株分别在1％菊粉液体培养基中培养6h、12h、36h、45h的OD600值
Figure BDA0003003763210000121
结果显示，对照菌株青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧CCFM1169都有利用菊粉的能力，动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625利用菊粉的能力较弱(具体见图1，表4)。
当青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CCFM1169和动物双歧CCFM1148共同培养时，混菌的OD600值增加，菌落数增加，说明青春双歧杆菌CCFM1169对动物双歧杆菌CCFM1148的生长可能有促进作用。
而对照菌株青春双歧杆菌CCFM1066分别与动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625共同培养时，混菌的OD600值无明显变化，说明，对照菌株青春双歧杆菌CCFM1066对动物双歧杆菌生长无促进作用(具体见图1，表3)。
表5：不同菌株分别在0.5％菊粉液体培养基中培养6h、12h、36h、45h的OD600值
Figure BDA0003003763210000131
Figure BDA0003003763210000141
此外，相比较于0.5％菊粉液体培养基中共培养两株菌，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1169和动物双歧杆菌CCFM1148在1％菊粉液体培养基中混合培养的生长速率更快，说明1％菊粉液体培养基优于0.5％菊粉液体培养基(具体见图2，表4～5)。
并且，动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625分别与青春双歧杆菌CCFM1169、青春双歧杆菌CCFM1066单独培养和与混合培养于1％和0.5％菊粉液体培养基上培养的代时如图3～4所示，结论与上述一致。
实施例4：青春双歧杆菌能在体外促进动物双歧杆菌增殖的情况
在该实施例中，发明人以本发明的青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)CCFM1169和动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625作为研究对象，在1％菊粉作为唯一碳源的培养基中，分别以单菌培养和两种菌按1:1比例混合培养的方式，通过荧光定量PCR实验评估青春双歧杆菌在体外促进动物双歧杆菌增殖的情况。
具体步骤如下：
(1)制备方法同实施例2的步骤(2)，区别在于，调整双歧杆菌菌种为青春双歧杆菌CCFM1169、动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625，同时将青春双歧杆菌CCFM1169与动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625按照活菌比为1:1的方式添加至培养基中，分别制备得到种子液；
其中，青春双歧杆菌CCFM1169种子液中菌浓为：2×109CFU/mL；
动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625种子液中菌浓均为：2×109CFU/mL；
混合培养时得到的种子液中，青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentisCCFM1169菌浓均为：1×109CFU/mL；动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625的菌浓均为：1×109CFU/mL；
(2)培养方式
分别将以2％(v/v)的接种量，将上述种子液分别转接至1％菊粉液体培养基中，在无菌环境下，将已接菌培养液移入5mL无菌离心管中，做3个平行，厌氧环境下37℃恒温培养培养45h。取1mL菌悬液按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取纯菌DNA，检测双歧杆菌的增殖情况，结果如图5～6和表6所示。
表6青春双歧杆菌在不同培养方式下对应的菌落数
Figure BDA0003003763210000151
从图5和表6可以看出，与单独培养相比，共同培养后青春双歧杆菌CCFM1169的菌落数增加，如青春双歧杆菌CCFM1169和动物双歧CCFM1148共同培养的菌落数是单独培养菌落数的2.08倍，说明动物双歧杆菌和青春双歧杆菌共同培养能够促进青春双歧CCFM1169在菊粉上的增殖(具体见图5，表6)。
表7动物双歧杆菌在不同培养方式下对应的菌落数
Figure BDA0003003763210000152
从图6和表7可以发现，与单菌培养相比，与青春双歧杆菌CCFM1169共同培养的动物双歧杆菌CCFM1148、动物双歧杆菌CCFM624和动物双歧杆菌CCFM625的菌落数显著增加，如共同培养后的的动物双歧杆菌CCFM1148是单独培养菌落数的5.78倍，说明青春双歧杆菌CCFM1169能够促进动物双歧杆菌CCFM1148对菊粉的利用能力，复配益生菌的效果优于单株单菌(具体见图6，表7)。
实施例5：青春双歧杆菌在体内促进动物双歧杆菌增殖的情况
具体步骤如下：
(1)复合益生菌制剂的制备
采用改良的MRS液体培养基分别培养青春双歧杆菌Bifidobacteriumadolescentis CCFM1169和动物双歧杆菌CCFM1148，在厌氧工作站的环境温度为37℃，每隔20h进行一次传代，完成3次传代活化之后，得到种子液；
将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量进行扩配。所获得的菌液在8000×g，4℃的条件下离心15min，采用30％甘油保存菌泥，在灌胃时使用生理盐水溶解菌体，使复合益生菌按照1:1的比例菌浓到达2×109CFU/mL。
(2)动物实验分组和处理方法
25只雄性C57BL/6J小鼠，8周龄，体重18-20g，SPF级。实验鼠适应环境一周后，根据体重随机分为五组:正常对照组、菊粉组、青春双歧单菌干预组、动物双歧杆菌单菌干预组、青春双歧杆菌CCFM1169和动物双歧杆菌CCFM1148混菌灌胃组(简称混菌干预组)，每组含5只小鼠。实验鼠的生长环境条件为：环境温度(23±2)℃、相对湿度(50±10)％、光照模式(12h黑暗/12h光照)。实验鼠分组及饲养方案如下(具体见图7)：
其中，正常对照组：小鼠60Co辐照饲料，灌胃生理盐水,200μL/天/只。
菊粉组：小鼠60Co辐照饲料，菊粉摄入量为20g/天/只，灌胃生理盐水,200μL/天/只。
青春双歧单菌干预组：小鼠60Co辐照饲料，菊粉摄入量为20g/天/只，灌胃2×109CFU青春双歧杆菌CCFM1169，200μL/天/只。
动物双歧单菌干预组：小鼠60Co辐照饲料，菊粉摄入量为20g/天/只，灌胃2×109CFU动物双歧杆菌CCFM1148，200μL/天/只。
混菌干预组：小鼠60Co辐照饲料，菊粉摄入量为20g/天/只，灌胃1×109CFU青春双歧杆菌CCFM1169和1×109CFU动物双歧杆菌CCFM1148，200μL/天/只。
(3)实时荧光定量实验
实验鼠的灌胃剂量为0.2mL/只/天，灌胃周期为28天。在灌胃前采集小鼠粪便一次，灌胃前灌胃结束后每周采集小鼠粪便。
取灌胃后的小鼠干粪便用Fast DNA kit for soil提取小鼠的粪便基因组，采用动物双歧的种特异性引物进行qPCR实验,结果如图8和表8所示。
表8不同的灌胃方式对应的小鼠干粪便中菌落数
Figure BDA0003003763210000161
由图8和表7的结果可以看出，与单菌灌胃和对照组相比，复合益生菌促进动物双歧杆菌CCFM1148在小鼠肠道内的定殖。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (11)

1.一株青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1169，其特征在于，所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1169保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61547，保藏日期为2021年03月09日。
2.含有权利要求1所述的青春双歧杆菌的微生物制剂。
3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述青春双歧杆菌在微生物制剂中的活菌数为不低于1×106 CFU/mL或1×106 CFU/g。
4.一种促进动物双歧杆菌增殖的方法，其特征在于，将权利要求1所述的青春双歧杆菌，或权利要求2或3所述的微生物制剂与动物双歧杆菌，在含有菊粉的培养基中共培养。
5.一种能够促进动物双歧杆菌增殖的的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的青春双歧杆菌，或权利要求2或3所述的微生物制剂。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述青春双歧杆菌在产品中的活菌数不低于1×106 CFU/mL或1×106 CFU/g。
7.如权利要求5或6所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药物或保健品。
8.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和菊粉。
9.如权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药物或保健品。
10.权利要求1所述的青春双歧杆菌，或权利要求2或3所述的微生物制剂在制备改善肠道健康的产品中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述产品为益生菌保健品或益生菌食品。
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