CN111849810B - 拮抗幽门螺旋杆菌的乳酸菌zjuids03及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种拮抗幽门螺旋杆菌的副干酪乳杆菌ZJUIDS03，为副干酪乳杆菌Lactobacillus Paracasei，保藏编号为CGMCC NO.19857。其可用于制备尿素酶活性抑制剂，用于制备幽门螺杆杆菌抑制剂，即，能用于制备能预防由于幽门螺旋杆菌感染而导致的胃部疾病的药品、功能产品及保健品。

Description

拮抗幽门螺旋杆菌的乳酸菌ZJUIDS03及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种新筛选的微生物，尤其涉及一种对幽门螺旋杆菌有拮抗作用的乳酸菌及其具有同样抑制效果的菌体发酵产物。
背景技术
由于中国人口密度较大和其独特的饮食习惯，中国人的幽门螺旋杆菌感染量为世界之最。幽门螺旋杆菌传染性较高，可通过飞沫喷溅、餐具接触和接吻等方式进一步扩散传播。幽门螺旋杆菌可定植于胃部，诱发不同程度的胃溃疡、胃窦炎、胃癌和十二指肠溃疡等。对于免疫力强、作息规律且饮食健康的群体来说，即便体内有幽门螺旋杆菌也不会对胃造成进一步损伤，但对免疫力差的群体来说，感染后可诱导较为严重的胃部损伤。
从中医角度给出的建议是，在医院查出了幽门螺旋杆菌感染，一般不建议使用药物去除，做到规律作息健康饮食即可。并且临床上常见的治疗方法“抗生素三联/四联”法长期服用会使患者造成一定的耐药性。基于此以及幽门螺旋杆菌较强的传染性，故需要研发一种含乳酸菌的保健性食品，此种乳酸菌既可在人体内存活，其本身或发酵产物又可以抑制幽门螺旋杆菌的生长，以此达到以“食疗”来治病的目的。
目前市面上已经有可以抑制幽门螺旋杆菌的益生菌产品，并且作为临床治疗的辅助手段结合抗生素一同食用已经初见成效。考虑到幽门螺旋杆菌潜在感染群体较大且定期体检意识弱，研发此类乳酸菌并作为日常食品来降低感染程度非常必要。
目前现有的副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)，例如内蒙古乳业技术研究院有限责任公司的副干酪乳杆菌K56、浙江工商大学的副干酪乳杆菌ZFM54和中国科学院近代物理研究所微生物实验室的干酪乳杆菌JY等，上述副干酪乳杆菌的菌体本身及产物对生长中的幽门螺旋杆菌抑制/灭活效果差。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一株具有拮抗幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyloriATCC 43504)能力的副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)及其应用，即，提供一种可以抑制幽门螺旋杆菌生长的副干酪乳杆菌及其在日常功能性食品中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种拮抗幽门螺旋杆菌的副干酪乳杆菌ZJUIDS03，为副干酪乳杆菌Lactobacillus Paracasei，保藏编号为CGMCC NO.19857。
本发明还同时提供了上述副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus ParacaseiZJUIDS03)的用途：用于制备尿素酶活性抑制剂。
作为本发明的用途的改进：用于制备幽门螺杆杆菌(Helicobacter pylori ATCC43504)抑制剂。
作为本发明的用途的进一步改进：用于制备能预防由于幽门螺旋杆菌感染而导致的胃部疾病的药品、功能产品及保健品。
作为本发明的用途的进一步改进：功能产品为功能性发酵果汁、功能性酸肉。
本发明还同时提供了利用上述副干酪乳杆菌ZJUIDS03制备而得的活菌制剂，所述活菌制剂中，ZJUIDS03活菌数为1.0×109～1.0×1011CFU/g。
本发明还同时提供了活菌制剂的用途，其特征在于：用于制备具有降低幽门螺旋杆菌感染风险功能的产品(药品、功能产品及保健品)。
本发明菌株ZJUIDS03的保藏信息如下：
保藏名称为副干酪乳杆菌Lactobacillus Paracasei，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.19857，保藏时间2020年05月21日。
本发明从云南地区收集的未经商业化的乳扇样品中筛选出一株副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)，通过细菌形态学、生理学和培养特征和16S rDNA测序等对该菌进行了鉴定。
该副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)的菌落形态学特征为：在MRS琼脂培养基上形成明显的菌落，菌落大小0.01～1.5mm。菌落不规则圆形，边缘不光滑，白色，表面湿润且光滑。其菌体形态特性为：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，光镜下形态为短杆菌。
该副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)的16S rDNA全序列为SEQ ID No.1所示。
本发明的副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)，疏水率达45％～55％之间；培养24h后的自凝集能力在70％-85％之间。
本发明的副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)具有较强的尿素酶活性抑制作用。即，菌体产物对幽门螺旋杆菌所产生的尿素酶活性有较强的抑制作用，与幽门螺旋杆菌有明显的生长竞争，可以在生长过程中对幽门螺旋杆菌有明显的生长抑制作用。
本发明的副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)，对成熟的幽门螺旋杆菌存在抑制作用，且抑菌圈肉眼可见十分明显；在体外对幽门螺杆杆菌(Helicobacter pylori ATCC 43504)的抑制实验中，菌体本身和菌体产物(上清液)的抑菌圈直径分别高达13.5mm和13.6mm。
本发明的副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)的菌体沉淀或菌体产物均对幽门螺旋杆菌生长过程中产生的尿素酶活性有一定程度的抑制作用。
本发明的副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)培养24h后，与幽门螺旋杆菌的交互凝集能力在75％-80％之间；与幽门螺旋杆菌存在生长竞争现象，并对幽门螺旋杆菌具有一定的生共培养制作用。
本发明的ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)有很强的酸耐受性及一定程度的胆盐耐受性；
本发明的ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)对常见的抗生素敏感；
本发明的ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)具有抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H 7和鼠伤寒沙门氏菌具有抗菌活性。
本发明所提供的副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)能耐受胃肠道环境、无抗生素耐性、抑制肠内有害的病原菌；证明该菌株具有良好的益生特性。
本发明提供副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)制备具有预防胃部感染幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori ATCC 43504)功能的功能性发酵果蔬汁。
本发明提供副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)制备具有辅助预防胃部感染幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori ATCC 43504)功能的发酵酸肉。
本发明提供副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)制备具有修复胃黏膜损伤、预防由胃溃疡导致的十二指肠溃疡、辅助治疗肠道腹泻及缓解由饮酒过量引起醉酒行为的活菌制剂。
本发明提供副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)制备具有与抗生素、中药等联合辅助治疗胃溃疡及胃部损伤功能的活菌制剂。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为副干酪乳杆菌ZJUIDS03的菌落形态图。
图2为副干酪乳杆菌ZJUIDS03革兰氏染色的菌体形态图。
图3为副干酪乳杆菌ZJUIDS03的16S rDNA的电泳鉴定图；
分别为ZJUIDS03、标准品(大小为5000bp)。
图4为ZJUIDS03对幽门螺旋杆菌的抑菌圈图片；
右上角为空白对照，实验材料为MRS液体培养基；
右下角为阳性对照组，实验材料为甲硝唑溶液；
左上角为实验组，实验材料为乳酸菌产物；
左下角为实验组，实验材料为乳酸菌体。
图5为0-24h内的乳酸菌体自凝集率(％)。
图6为0-24h内的乳酸菌与幽门螺旋杆菌交互凝集率(％)。
图7为乳酸菌体与尿素酶混合物OD550nm吸光度；
注：CG：为空白对照，该组试验材料仅为尿素酶试剂；
NC：为阴性对照，该组试验材料为MRS液体培养基与尿素酶试剂的混合物；
实验组的试验材料为乳酸菌体(即菌悬液)与尿素酶试剂的混合物。
图8为乳酸菌产物与尿素酶混合物OD550nm吸光度。
图9为酸耐受率(％)。
图10为胆盐耐受率(％)。
图11、乳酸菌对常见致病菌的抑菌圈直径；
注：SQ代表乳酸菌体上清液，即乳酸菌产物；JY代表乳酸菌体液，即乳酸菌本身。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中，微需氧环境，是指氧气浓度6～12％、二氧化碳浓度5～8％的环境，该％为体积％。
实施例1、副干酪乳杆菌ZJUIDS03的筛选及鉴定：
1.副干酪乳杆菌ZJUIDS03的筛选
1.1样品来源
本发明所使用的菌株均收集自10份云南地区传统发酵制品---农家自制乳扇；即，本发明以来自云南的农家自制乳扇作为样品。
1.2培养基的配制
样品分离和菌株筛选所用的培养基为MRS固体培养基，购自于北京路桥公司，MRS固体培养基成分见表1；取消表1中的“20g琼脂”，所得为MRS液体培养基。
以去离子无菌水为溶剂，溶解后的培养基pH调至6.2～6.4，用高压锅在121℃灭菌15min，于55℃左右将未凝固的MRS固体培养基倾注入无菌培养平皿中，静置至培养基凝固，室温倒置备用。
表1、MRS固体培养基配方
Figure BDA0002584741090000051
1.3菌株的分离纯化
取新鲜制备的农家自制乳扇作为样品。
取1g样品放入9mL的MRS液体培养基中，涡旋混匀后于37℃下富集培养48h；然后在超净台中吸取富集液1mL，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取10-6、10-7、10-8三个稀释梯度，每个梯度取菌液100μL涂于含有无菌MRS琼脂培养基的培养皿上，于有氧条件下37℃静置培养18～48h。培养至有明显单菌落形成后，从琼脂培养基中选择生长有50～150个单菌落的平板，挑取典型菌落，在MRS琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致。
挑取单菌落到MRS液体培养基进行增菌培养，于37℃培养24h，吸取400ul菌液加入0.8ml 60％(v/v)的甘油管中，每只甘油管做好标记，后置于-80℃冷冻保藏。
2.副干酪乳杆菌ZJUIDS03的鉴定
2.1菌落特征
副干酪乳杆菌ZJUIDS03在MRS琼脂培养基(MRS固体培养基)培养24-48h后，直径在0.01～1.5mm之间，菌落呈不规则圆形，边缘不圆滑，白色，表面湿润且光滑，见图1。
2.2显微镜下形态：
副干酪乳杆菌ZJUIDS03菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，圆端直杆菌，单个、成对或短链状，见图2。
2.3 16S rDNA鉴定
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，将提取的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用细菌通用引物27F和1492R进行16S rDNA的PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.5kb左右，见图3。图3中，分别为ZJUIDS03和标准品(大小为5000bp)。
将PCR产物送至北京六合华大基因有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与副干酪乳杆菌的16S rDNA序列同源性超过99％。
根据菌株ZJUIDS03的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的乳酸菌ZJUIDS03为副干酪乳杆菌ZJUIDS03(Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03)。
实施例2、副干酪乳杆菌ZJUIDS03共培养抑制幽门螺旋杆菌ATCCA43504
1.幽门螺旋杆菌的培养
将装有幽门螺旋杆菌ATCCA43504的甘油管从-80℃取出，涂布于含绵羊血5％(v/v)的哥伦比亚血琼脂培养基进行活化培养，培养条件为微需氧环境中，37℃，培养72h-96h。
在固体培养基(含绵羊血5％的哥伦比亚血琼脂培养基)中活化1代后挑取单菌落继续划线传代两代，挑取纯化培养后的单菌落接入幽门螺旋杆菌液体培养基中，液体培养条件为微需氧环境中，37℃，时间为48h-72h。8000rmp/min，4℃离心15min分别收集上清液和沉淀。用干净的幽门螺旋杆菌液体培养基洗涤沉淀两次，重悬使活菌浓度达到109CFU/mL。
2.乳酸菌及其菌体产物的培养
对本实验室菌库中的乳酸菌进行筛选，根据菌属丰度和生长性能的优劣选出6株益生菌作为对照菌株与ZJUIDS03一同实验。
此6株菌分别为：1.约氏乳杆菌(编号YF0101)、2.杆菌鼠李糖乳杆菌(编号YF0102)、3.瑞士乳杆菌(编号GQ1501)、4.植物乳杆菌(编号GQ1701)、5.植物乳杆菌(编号GQ2004)、6.发酵乳杆菌(编号AB2303)。本实施例2与后续实施例中的乳酸菌均指上述1-6号乳酸菌及ZJUIDS03。
将装有1-6号菌和ZJUIDS03的甘油管从-80℃冰箱取出，放置室温中解冻，挑取少量甘油管中菌液于MRS固体培养基上活化(37℃培养24h)，24h后挑取MRS固体培养基上的乳酸菌单菌落再活化2次。将最后一次活化后的单菌落接于MRS液体培养基中，37℃静置培养18h后取出，8000rmp/min，4℃离心15min分别收集上清液和沉淀。
乳酸菌的所产生的菌体产物，如有机酸等物质，都存在于上述收集的上清液中。本实施例2与后续实施例中的乳酸菌菌体产物(以下简称乳酸菌产物)，均指上述乳酸菌培养液离心后所收集的上清液(乳酸菌上清液)。
用高温灭菌处理(121℃，20min)后PBS液体培养基洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使活菌浓度达到1010CFU/mL。此时得到的菌体悬浊液中只含有乳酸菌体本身。在实施例2与后续实施例中所提到的乳酸菌菌体，均指：乳酸菌培养液离心后，去除上清液，PBS洗涤沉淀两次后，重悬于一定浓度的菌悬液(乳酸菌悬液)。
3.共培养试验方法和结果
向已制备好的幽门螺旋杆菌菌液(109CFU/mL)中加入乳酸菌菌液(1×1010CFU/ml)，得混合液；幽门螺旋杆菌菌液：乳酸菌菌液＝10:1的体积比，得混合液；
或者，向已制备好的幽门螺旋杆菌菌液(109CFU/mL)中加入乳酸菌产物(乳酸菌上清液)，幽门螺旋杆菌菌液：乳酸菌上清液＝1:1的体积比；得混合液。
考虑到幽门螺旋杆菌菌体颜色较浅且哥伦比亚血琼脂培养基颜色较深，若倾注法恐计数有误，故使用涂布法将100μl混合液涂于含绵羊血5％的哥伦比亚血平板(约20ml)，微需氧(氧气浓度6～12％、二氧化碳浓度5～8％)环境下37℃培养96h，计数并与阴性对照(灭菌的PBS)做对比，计算共培养后ZJUIDS03对幽门螺旋杆菌的生长抑制率。
所述阴性对照为对应的乳酸菌菌液、或者为乳酸菌上清液。
乳酸菌体及乳酸菌产物对幽门螺旋杆菌的生长抑制情况所得结果如下表2。
Figure BDA0002584741090000072
Ax为：幽门螺旋杆菌菌液，在幽门螺旋杆菌固体培养基上培养后的活菌数量；
Ay为：幽门螺旋杆菌菌液与乳酸菌菌液/乳酸菌上清液的混合液体，在幽门螺旋杆菌固体培养基上培养后的活菌数量。
注：根据阴性对照的生长结果来看，乳酸菌无法在幽门螺旋杆菌固体培养基上生长，也就是说，幽门螺旋杆菌与乳酸菌菌液/乳酸菌上清液的混合液培养后，能生长的菌皆为幽门螺旋杆菌。
表2、不同菌株对幽门螺旋杆菌共培养的抑制率(％)
Figure BDA0002584741090000071
Figure BDA0002584741090000081
上述结果表明菌株菌体和上清液对幽门螺旋杆菌有较好的共培养抑制率。尤其是菌体本身有较好的效果，显著高于其他的乳酸菌菌株。
实施例3、副干酪乳杆菌ZJUIDS03抑制幽门螺旋杆菌ATCCA43504的生长
1.幽门螺旋杆菌的培养
同实施例2的步骤1。
2.乳酸菌的培养
用高温灭菌处理的PBS洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使活菌浓度达到1011CFU/mL；其余等同于实施例2的步骤2。
3.生长抑制实验
将100μl幽门螺旋杆菌的菌液(109CFU/mL)涂布到不含抗生素的且已打孔的含绵羊血5％的哥伦比亚血琼脂培养基的平板(约20ml)上，分别加入以下任一，从而形成不同的实验组别：
待测乳酸菌悬液100μl、待测乳酸菌上清液100μl；阳性对照(质量浓度为0.025％的甲硝唑溶液)100μl；阴性对照(PBS缓冲液100μl)；空白对照(MRS液体培养基100μl)。
微需氧环境下37℃培养96h后测量抑菌圈大小，测量各个乳酸菌体和乳酸菌产物对幽门螺旋杆菌的抑制程度，用抑菌圈直径大小表示。
抑菌圈直径大小(R＝R抑菌圈-R药敏试纸；单位：cm)。所得结果如下表3所述。
注：
1.药敏试纸片购自于杭州微生物公司，肉眼观察到明显抑菌圈后，抑菌圈直径大小由游标卡尺测量得出。
2.由于阴性对照PBS缓冲液没有对幽门螺旋杆菌的抑制效果，抑菌圈直径均为0，故在结果中不做统计。设置此阴性对照是为了证明孔径周围的菌体，不会因为孔径中的培养基缺失而造成的生长影响。
表3、不同菌株的菌体和上清液对幽门螺旋杆菌的抑菌圈(cm)
项目 Con 1 2 3 4 5 6 ZJUIDS03
上清液(S) 0.6 1.48 1.48 1.17 1.37 1.42 1.02 1.47
菌悬液(J) 0.6 1.37 1.33 1.35 1.35 1.52 1.17 1.72
甲硝唑 1.93 1.82 1.90 1.94 1.87 1.88 1.91 1.88
MRS液体(M) 1.24 1.26 1.21 1.20 1.20 1.27 1.23 1.19
4.结果分析
通过牛津杯法抑菌试验测定抑菌圈的大小，从而从体外实验数据来筛选具有拮抗幽门螺旋杆菌的菌株。本实验方法以0.025mg/ml的甲硝唑作为阳性对照，PBS缓冲液作为阴性对照，MRS作为空白对照，筛选具有抑制拮抗幽门螺旋杆菌效果的乳酸菌。
通过表3可知，ZJUIDS03具有较好的抑菌性能，可以抑制幽门螺旋杆菌的生长，乳酸菌体和菌体产物对幽门螺旋杆菌的抑菌圈半径分别为1.72cm和1.47cm，尤其是菌体本身的抑菌效果显著高于其他菌株，远高于空白对照MRS1.2cm的抑菌圈半径。
实施例4、副干酪乳杆菌ZJUIDS03疏水能力的确认
1.疏水性的测量
用高温灭菌处理的PBS液体培养基洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使OD610的吸光度约为0.5左右，得乳酸菌悬液；其余等同于实施例2的步骤2。
取2ml乳酸菌悬液和2ml二甲苯彻底混合，37℃水浴充分震荡5min后，并于0h、2h后分别测量水相的OD610吸光值。
Figure BDA0002584741090000091
A0＝0h的吸光值，At＝th的吸光值。
所得结果如下表4所示。
表4、不同菌株的表面疏水性(％)
项目 1 2 3 4 5 6 ZJUIDS03
疏水性 39.4 26.2 33.5 11.8 28.3 40.5 53.4
2.结果分析
经测量，ZJUIDS03的疏水性在53.4％，显著高于其他菌株。该表明该菌株具有较强的粘附能力，可粘附到人的肠道，改善肠道菌群的健康。
实施例5、副干酪乳杆菌ZJUIDS03自凝集能力的确认
1.自凝集能力的测定
用高温灭菌处理的PBS液体培养基洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使OD610的吸光度为0.5，得乳酸菌悬液；其余等同于实施例2的步骤2。
取适量菌液放入灭菌洁净试管中，37℃静置培养，测量24h内不同时间点的OD610的吸光值。
Figure BDA0002584741090000092
A0＝0h的吸光值，At＝th的吸光值。
所得结果如图5所示。
2.结果分析
与对照菌株1-6号菌株相比，ZJUIDS03具有较好的自凝集性能。自凝集率越高，说明该菌株自身的凝集率越高。通过数据我们可以看出，所有菌株的自凝集率在24h内都随时间的增加而加强，ZJUIDS03在24h时自凝集率达到约80％。
菌株的自凝集率与其在肠道的粘附力相关，凝集率越高，说明在胃肠道中的粘附力越高。菌株自凝集率高到一定地步，菌体凝集到一定数量还能形成生物保护膜从而保护胃肠道黏膜。此外，菌株的凝集作用可以使菌体保持活力，提高人体上消化道抵抗致病菌，并且可以形成空间位阻阻碍致病菌在肠道的定植。
实施例6、副干酪乳杆菌ZJUIDS03与幽门螺旋杆菌ATCCA43504交互凝集能力的确认
幽门螺旋杆菌ATCCA43504的培养同实施例2的步骤1。重悬所得的菌悬液中活菌浓度达到109CFU/mL。
乳酸菌的培养：用高温灭菌处理的PBS液体培养基洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬所得的菌悬液中活菌浓度达到1010CFU/mL。其余等同于同实施例2的步骤2。
每种乳酸菌分别进行以下操作：
将等体积量的乳酸菌和幽门螺旋杆菌混合，彻底震荡5min，37℃静置培养，测量24h内不同时间点的OD620的吸光值。
计算方法：
Figure BDA0002584741090000101
Ax＝0h的乳酸菌的吸光值，Ay＝0h幽门螺旋杆菌的吸光值，Amix＝th后的混合吸光值。
所得结果如图6所示。
结果分析
ZJUIDS03与对照菌株1-6相比，体现出了较高的、与幽门螺旋杆菌的交互凝集率。且交互凝集利随时间的增加而增大，在24h后的凝集率约为78.5％。ZJUIDS03较高的交互凝集率也代表着其可以与幽门螺旋杆菌更加有力的结合，从而轻易的将幽门螺旋杆菌从体内排出。
实施例7、副干酪乳杆菌ZJUIDS03对幽门螺旋杆菌产生的尿素酶活性抑制率的确认
1.幽门螺旋杆菌的培养
同实施例2的步骤1。
2.乳酸菌的培养
用高温灭菌处理的PBS液体培养基洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使活菌浓度达到1010CFU/mL；其余同实施例2的步骤2。
3.乳酸菌抑制尿素酶活性实验
在96孔板中，取40μl幽门螺旋杆菌菌液分别与10μl乳酸菌的菌悬液/上清液混匀后放入微需氧环境中37℃培养48h，然后取出加入150μl尿素酶试剂，对照是幽门螺旋杆菌液体培养基代替上清液测定。
CG(空白对照)为：实验对象为200μl的尿素酶指示剂；
NC(阴性对照)为：实验对象为40μl幽门螺旋杆菌与10μlPBS混合后，放入微需氧环境中37℃培养48h，然后取出加入150μl尿素酶试剂；
尿素酶指示剂配方为：0.9％NaCl，20mmol/L尿素，14μg/ml苯酚红，用HCl调至PH＝6.8，分光光度计OD550nm测定其密度。
乳酸菌体(菌悬液)作用所得结果如图7所示；乳酸菌产物作用所得结果如图8所示。
4.结果分析
尿素酶由幽门螺旋杆菌产生，尿素酶可以使体内的尿素分解产生CO2和NH3，，从而使PH降低，形成一个利于幽门螺旋杆菌生长的微环境。
ZJUIDS与其他6株均相比，体现出一定的尿素酶活性抑制的能力。该乳酸菌体和菌体产物在OD550下的值约为0.35和0.7，与其他6株菌相比处于一个较高的状态，这可能与其产生的酸性物质使PH重新降低有关。有报道称乳酸菌中的乳酸而非有机酸可以增加革兰氏阴性菌的细胞膜渗透性，从而增加抑菌效果，从而会使尿素酶的活性降低。
实施例8、副干酪乳杆菌ZJUIDS03对酸耐受的确认
1.乳酸菌液的培养
用高温灭菌处理的PBS液体培养基洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使活菌浓度达到108CFU/mL；其余同实施例2的步骤2。
2.耐酸实验方法
将调试好的乳酸菌悬液以10％(V/V)的量接种于PH为3.0的MRS液体培养基中，即，乳酸菌悬液：MRS液体培养基＝1:9体积比；分别在在试验的0h、3h采样，用倾注法对发酵液进行活菌数的计数，固体培养基为MRS固体培养基，并基于所得数值计算各乳酸菌3h后的酸耐受率。
酸耐受率的计算公式为：
Figure BDA0002584741090000121
所得结果如图9所示。
3.结果分析
ZJUIDS03的酸耐受性虽然与其他6株菌相比优势不是很大，但是也足够使其在体内良好的存活而不被较快代谢。
实施例9、副干酪乳杆菌ZJUIDS03对胆盐耐受的确认
1.乳酸菌液的培养
用高温灭菌处理后PBS液体培养基洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使活菌浓度达到108CFU/mL。其余同实施例2的步骤2。
2.耐胆盐实验方法
将调试好的乳酸菌体以10％(V/V)的量接种于8％牛胆盐(V/V)的MRS液体培养基中，分别在在试验的0h、3h采样，用倾注法对发酵液进行活菌数的计数，固体培养基为MRS固体培养基，并基于所得数值计算各乳酸菌3h后的胆盐耐受率。
菌株的胆盐耐受能力以3h时每毫升含胆盐培养基中活菌数与不含胆盐培养基中活菌数的差值的对数来表示(log CFU/mL)。
所得结果如图10所示。
3.结果分析
ZJUIDS03的酸耐受率在34.5％，表明该菌株有一定的胆盐耐受性，可以在肠道存活，进而改善肠道菌群，起到益生的效果。
实施例10、副干酪乳杆菌ZJUIDS03抗生素敏感性的确认
1.乳酸菌液的培养
用高温灭菌处理后PBS液体培养基洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使活菌浓度达到106CFU/mL。其余同实施例2的步骤2。
2.抗生素敏感性实验
挑选了10种常见抗生素，根据CLSI的药敏试验标准，对ZJUIDS03和1-6号菌株分别进行抗生素敏感性判断。药敏试纸片品牌为HANGWEI。
将重悬后的菌悬液以1％(V/V)的接种量，注入55℃左右的MRS固体培养基中，摇匀后倒平板。待固体平板冷却后分别贴入不同种类的抗生素药敏试纸，并用已经消毒过的镊子轻轻按压药敏纸片，以保证其不会在平皿倒置培养时掉落，37℃培养24h，培养完毕后取出平皿并做好抑菌圈直径的数值记录。
抗生素敏感圈直径(R＝R抑菌圈-R药敏试纸；单位：cm)
所得结果如表5所示。
表5、乳酸菌常见抗生素敏感圈直径数据
Figure BDA0002584741090000131
注：标有不同小写字母表示菌种的敏感圈大小存在显著差异(P<0.05)。
3.结果分析
ZJUIDS03对10种抗生素的敏感性各不相同，且差异性较大。其对丁胺卡那、庆大霉素、复方新诺明和诺氟沙星不敏感，说明其可以不被这几种抗生素抑制而良好生长，而对环丙沙星、氯霉素、红霉素、氨苄西林和青霉素等非常敏感，说明该菌不适合在这种环境下生长。与其他6株菌的对比说明各个乳酸菌对每一种抗生素的耐药性都不尽相同。
实施例11、副干酪乳杆菌ZJUIDS03抗菌活性的确认
1.乳酸菌液的培养
用高温灭菌处理后PBS液体培养基洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使活菌浓度达到108CFU/mL。其余同实施例2的步骤2。
2.致病菌液的培养
本试验中采用了4种致病菌株对ZJUIDS03及菌体1-6的抗菌活性进行测定，此4种致病菌分别为金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H 7和鼠伤寒沙门氏菌。此四种致病菌及幽门螺旋杆菌均为自购菌株，具体来源见表6。
表6
Figure BDA0002584741090000132
Figure BDA0002584741090000141
保有致病菌的甘油管从-80℃冰箱取出，放置室温中解冻，挑取少量甘油管中菌液于MRS固体培养基上活化，24h后挑取MRS固体培养基上的乳酸菌单菌落再活化2次。
将最后一次活化后的单菌落接于MRS液体培养基中，37℃静置培养18h后取出，8000rmp/min离心15min收集沉淀。用干净的MRS液体培养基洗涤两次，重悬使活菌浓度达到106CFU/mL。将重悬后的菌悬液以1％的接种量，注入55℃左右的MRS固体培养基中，摇匀后倒入已均匀放置4只无菌牛津杯的平板中。待固体平板冷却后轻轻拔掉牛津杯，正置待用。
3.抗菌性能试验方法
取上述6株1-6号对照菌株和实验菌株ZJUIDS03，对其乳酸菌悬液或/上清液200μl分别注入已打孔的MRS固体培养基中，37℃正置培养24h，培养完毕后取出平皿并做好记录。抑菌圈直径(R＝R抑菌圈-R牛津杯；单位：cm)
所得结果如图11所示。
4.结果分析
ZJUIDS03与1-6号菌相比，不论是乳酸菌体体还是菌体产物都体现出对大肠杆菌极高的抗性，这说明ZJUIDS03可以抑制大肠杆菌这种致病菌株。对单增李斯特菌的抑菌圈直径为0.575cm，对金黄葡萄球菌的抑菌圈直径为0.6cm，这说明ZJUIDS03具有一定的金黄葡萄糖菌和单增李斯特菌菌抗性。
实施例12利用副干酪乳杆菌ZJUIDS03制备功能性发酵果蔬汁
选取新鲜的南瓜和火龙果作为原料，清洗、去皮(南瓜去瓤)、切成小块。采用闪蒸的方法灭酶，0.5～1min，121℃处理，迅速排气。按照南瓜∶水(重量比)＝1∶1的比例，将南瓜和水适量的逐渐放入胶体磨中研磨，进行粗磨和细磨各一次。将火龙果用打浆机打浆至果肉均匀无块状。调配、均质：按南瓜汁15％，火龙果汁30％，再用蔗糖调节可溶性固形物含量至10°Brix，加入0.2％的稳定剂CMC混合均匀，采用两段均质法，先低压(15MPa)，后高压(25MPa)，使瓜肉颗粒直径粒径为2～3μm。调配好的复合果蔬汁在100℃下保温10min，冷却至40℃左右。在无菌条件下，接入活化好的副干酪乳杆菌ZJUIDS03，初始菌数控制在107CFU/mL。在37℃条件下恒温发酵24h。发酵结束后，放入4℃冰箱中3h。后熟完成后，灌装到250mL的灭菌玻璃瓶中，送至冷库冷藏。
实施例13利用副干酪乳杆菌制备功能性发酵酸肉
将市售新鲜五花肉，切成3cm见方薄片。拌糯米粉：1000g原料肉与250g糯米粉混匀，加入葡萄糖1％。在无菌条件下，接入活化好的副干酪乳杆菌ZJUIDS03，初始菌数控制在107CFU/mL。在37℃条件下恒温发酵18h。加入2％的盐，于25℃下腌制20d。
实施例14利用副干酪乳杆菌ZJUIDS03制备功能性菌粉
挑取副干酪乳杆菌ZJUIDS03单菌落接种于50mL MRS液体培养基中，放置37℃培养箱中培养18h。再次按5％的接种量于250mL MRS液体培养基中活化，放置37℃培养箱中培养24h。最后将活化好的副干酪乳杆菌ZJUIDS03以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH 6.8的条件下培养18h。之后在8000r/min、4℃条件下离心15min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗菌体2次。即可得到副干酪乳杆菌ZJUIDS03菌泥。保护剂：15％的脱脂乳粉，5％的海藻糖，3％的谷氨酸钠，1％的甘油，0.5％的半胱氨酸盐酸盐，余量为蒸馏水(并以蒸馏水作为溶剂)，于110℃灭菌备用。
将上述制备的副干酪乳杆菌ZJUIDS03沉淀按1:5的比例与保护剂溶液充分混匀。于-40℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18～20h后，即可得到副干酪乳杆菌ZJUIDS03菌粉。用生理盐水复水后，洗涤两次，测得副干酪乳杆菌菌粉中活菌数为1.0×1010～5×1010CFU/g。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 拮抗幽门螺旋杆菌的乳酸菌ZJUIDS03及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1377
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 1
ttacaaactc tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 60
gcgtgctgat ccgcgattac tagcgattcc gacttcgtgt aggcgagttg cagcctacag 120
tccgaactga gaatggcttt aagagattag cttgacctcg cggtctcgca actcgttgta 180
ccatccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc 240
cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt cttactagag tgcccaacta aatgctggca 300
actagtcata agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 360
acgacaacca tgcaccacct gtcattttgc ccccgaaggg gaaacctgat ctctcaggtg 420
atcaaaagat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 480
ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc 540
caggcggaat gcttaatgcg ttagctgcgg cactgaaggg cggaaaccct ccaacaccta 600
gcattcatcg tttacggcat ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt 660
tcgagcctca gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata 720
tatctacgca tttcaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc 780
ccagtttccg atgcgcttcc tcggttaagc cgagggcttt cacatcagac ttaaaaaacc 840
gcctgcgctc gctttacgcc caataaatcc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc 900
ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttggat accgtcacgc cgacaacagt 960
tactctgccg accattcttc tccaacaaca gagttttacg acccgaaagc cttcttcact 1020
cacgcggcgt tgctccatca gacttgcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc 1080
cgtaggagtt tgggccgtgt ctcagtccca atgtggccga tcaacctctc agttcggata 1140
cgtatcatcg ccttggtgag ccattacctc accaactagc taatacgccg cgggtccatc 1200
caaaagcgat agcttacgcc atctttcagc caagaaccat gcggttcttg gatctatgcg 1260
gtattagcat ctgtttccaa atgttatccc ccacttaagg gcaggttacc cacgtgttac 1320
tcacccgtcc gccactcgtt ccatgttgaa tctcggtgca agcaccgatc atcaacg 1377

Claims (5)

1.拮抗幽门螺旋杆菌的副干酪乳杆菌ZJUIDS03，其特征在于：为副干酪乳杆菌Lactobacillus Paracasei，保藏编号为CGMCC NO.19857。
2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZJUIDS03（Lactobacillus Paracasei ZJUIDS03）的用途，其特征在于：用于制备尿素酶活性抑制剂以及用于制备幽门螺杆杆菌抑制剂。
3.根据权利要求2所述的副干酪乳杆菌ZJUIDS03的用途，其特征在于：用于制备能预防由于幽门螺旋杆菌感染而导致的胃部疾病的药品。
4. 利用如权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZJUIDS03制备而得的活菌制剂，其特征在于：所述活菌制剂中，ZJUIDS03活菌数为1.0×109~1.0×1011 CFU/g。
5.如权利要求4所述的活菌制剂的用途，其特征在于：用于制备具有降低幽门螺旋杆菌感染风险功能的产品。
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