TWI812128B - 乳酸菌或其發酵物用於維持或改善腸胃狀況的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提出一種乳酸菌用於製備維持或改善腸胃狀況之組合物的用途，乳酸菌包括：副乾酪乳桿菌ET-66菌株。本發明另提出一種乳酸菌發酵物用於製備維持或改善腸胃狀況之組合物的用途，乳酸菌發酵物包括：副乾酪乳桿菌ET-66菌株發酵物。
Description
本發明關於一種乳酸菌或其發酵物的醫藥保健用途，特別攸關一種乳酸菌或其發酵物用於維持或改善腸胃狀況的用途。
幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)為引起胃炎的主要致病原之一。感染幽門螺旋桿菌後可能會發展成慢性胃炎、十二指腸與胃潰瘍，嚴重者可能會引發胃腺癌及胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤。幽門螺旋桿菌可於強酸且微氧的胃內環境生存，常附著於黏膜層表面並形成雲霧狀薄膜，以中和胃酸來於低pH環境下存活。胃內環境亦提供幽門螺旋桿菌必要營養物質尿素，其可經幽門螺旋桿菌的尿素酶水解產生NH3與CO2以提高胃內環境的pH值。
幽門螺旋桿菌感染的治療目前主要採三合一治療，其併用一種氫離子幫浦阻斷劑(proton pump inhibitor)與兩種不同抗生素。此種治療方式易造成病患高副作用率、低順從性，且易受細菌的抗藥性及感染量影響而治療失敗，因此開始尋求溫和、安全且簡單的替代方案。近年來發現特定微生物能有效抑制幽門螺旋桿菌並促進腸胃健康。
一般而言，乳酸菌食用上相當安全，因此透過服用乳酸菌來治療幽門螺旋桿菌感染確實為可行的目標之一。
依本文發現特定乳酸菌的活性菌株可附著於胃細胞、抑制幽門螺旋桿菌生長與尿素酶活性、或凝集幽門螺旋桿菌。
依本文又發現特定乳酸菌的去活性菌株可附著於胃細胞、抑制幽門螺旋桿菌生長與尿素酶活性、或凝集幽門螺旋桿菌。
依本文再發現特定乳酸菌的發酵物可附著於胃細胞、抑制幽門螺旋桿菌生長與尿素酶活性、或凝集幽門螺旋桿菌。
鑑於上述發現，本發明提出一種乳酸菌用於製備維持或改善腸胃狀況之組合物的用途，乳酸菌包括：副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)ET-66菌株(寄存編號：BCRC910753)。
於一實施樣態中，乳酸菌進一步包括：唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株(寄存編號：BCRC910437)、以及植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)LPL28菌株(寄存編號：BCRC910536)。
於一實施樣態中，副乾酪乳桿菌ET-66菌株為活性菌株或去活性菌株。
於一實施樣態中，唾液乳酸桿菌AP-32菌株為活性菌株或去活性菌株，植物乳酸桿菌LPL28菌株為活性菌株或去活性菌株。
於一實施樣態中，組合物用以附著於胃細胞、抑制幽門螺旋桿菌生長、抑制尿素酶活性、及/或凝集幽門螺旋桿菌。
鑑於上述發現，本發明另提出一種乳酸菌發酵物用於製備維持或改善腸胃狀況之組合物的用途，乳酸菌發酵物包括：副乾酪乳桿菌ET-66菌株發
酵物。
於一實施樣態中，乳酸菌發酵物進一步包括：唾液乳酸桿菌AP-32菌株發酵物、以及植物乳酸桿菌LPL28菌株發酵物。
於一實施樣態中，副乾酪乳桿菌ET-66菌株發酵物包括未含菌株的發酵液、含活性菌株的發酵液、含去活性菌株的發酵液、含菌體片段的發酵液、或其粉末。
於一實施樣態中，唾液乳酸桿菌AP-32菌株發酵物包括未含菌株的發酵液、含活性菌株的發酵液、含去活性菌株的發酵液、含菌體片段的發酵液、或其粉末，植物乳酸桿菌LPL28菌株發酵物包括未含菌株的發酵液、含活性菌株的發酵液、含去活性菌株的發酵液、含菌體片段的發酵液、或其粉末。
於一實施樣態中，副乾酪乳桿菌ET-66菌株、唾液乳酸桿菌AP-32菌株、以及植物乳酸桿菌LPL28菌株的發酵起始菌量比為(1至8)：1：1。
於一實施樣態中，組合物用以附著於胃細胞、抑制幽門螺旋桿菌生長、抑制尿素酶活性、及/或凝集幽門螺旋桿菌。
圖1為一顯微鏡照片，呈現胃細胞吸附不同種類之乳酸菌活性菌株的情況；圖2為一長條統計圖，說明胃細胞對不同種類之乳酸菌活性菌株的吸附數量；圖3為一長條統計圖，說明不同種類之乳酸菌去活性菌株粉末對幽門螺旋桿菌的沉降率；圖4為一長條統計圖，說明不同種類之乳酸菌活性菌株對幽門螺旋桿菌生長的影響；
圖5為一長條統計圖，說明不同種類之菌株發酵粉末對幽門螺旋桿菌生長的影響；圖6為一長條統計圖，說明不同種類之乳酸菌活性菌株對尿素酶活性的影響；以及圖7為一長條統計圖，說明不同種類之菌株發酵粉末對尿素酶活性的影響。
為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：本發明所用的菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，地址為新竹市食品路331號、中國典型培養物保藏中心，地址為中國、武漢、武漢大學、或中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，詳細寄存資訊如表1。
本發明之一實施方式提出一種乳酸菌用於製備維持或改善腸胃狀況之組合物的用途，乳酸菌包括：副乾酪乳桿菌ET-66菌株。可投予組合物至所需個體來維持或改善腸胃狀況。依以下實施例所證，副乾酪乳桿菌ET-66菌株至少可附著於胃細胞、抑制幽門螺旋桿菌生長與尿素酶活性、或凝集幽門螺旋桿菌，因此組合物可於個體內實現上述生物功能來維持或改善腸胃狀況。
為進一步提升腸胃狀況的維持或改善功效，乳酸菌可再包括：唾液乳酸桿菌AP-32菌株、以及植物乳酸桿菌LPL28菌株。此外，副乾酪乳桿菌ET-66菌株、唾液乳酸桿菌AP-32菌株、與植物乳酸桿菌LPL28菌株可單獨地為活性菌株或去活性菌株。於活性菌株的條件下，組合物有運送與保存造成活性降低的問題；於去活性菌株的條件下，組合物則無上述問題。
本發明之另一實施方式提出一種乳酸菌發酵物用於製備維持或改善腸胃狀況之組合物的用途，乳酸菌發酵物包括：副乾酪乳桿菌ET-66菌株發酵物。可投予組合物至所需個體來維持或改善腸胃狀況。依以下實施例所證，副乾酪乳桿菌ET-66菌株發酵物至少可附著於胃細胞、抑制幽門螺旋桿菌生長與尿素酶活性、或凝集幽門螺旋桿菌，因此組合物可於個體內實現上述生物功能來維持或改善腸胃狀況。
為進一步提升腸胃狀況的維持或改善功效，乳酸菌發酵物可再包括：唾液乳酸桿菌AP-32菌株發酵物、以及植物乳酸桿菌LPL28菌株發酵物。此外，副乾酪乳桿菌ET-66菌株發酵物、唾液乳酸桿菌AP-32菌株發酵物、以及植物乳酸桿菌LPL28菌株發酵物可單獨地包括未含菌株的發酵液、含活性菌株的發酵液、含去活性菌株的發酵液、含菌體片段的發酵液、或其粉末。於含活性菌株之發酵液的條件下，組合物有運送與保存造成活性降低的問題；於其他條件下，組合物則無上述問題。
副乾酪乳桿菌ET-66菌株發酵物、唾液乳酸桿菌AP-32菌株發酵物、及植物乳酸桿菌LPL28菌株發酵物為將對應種類的菌株於發酵培養基中培育取得的。發酵培養基可為MRS肉湯培養基，MRS肉湯培養基可包含碳源及/或氮源。碳源的實例可為葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、乳糖(lactose)、蔗
糖(sucrose)、麥芽糖(maltose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、海藻糖(trehalose)、澱粉(starch)、馬鈴薯澱粉(potato starch)、麥芽萃取物(malt extract)、麥芽糊精(maltodextrin)、或其任意組合，而氮源的實例可為(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、蛋白腖(peptone)、聚蛋白腖(polypeptone)、胰化腖(tryptone)、肉類萃取物(meat extract)、酵母萃取物(yeast extract)、酵母粉(yeast powder)、牛奶、脫脂奶粉、大豆粉(soybean flour)、乳清、或其任意組合。舉例而言，發酵培養基可包含1至20wt%碳源及/或4至35wt%氮源。又舉例而言，發酵培養基可包含1至5wt%葡萄糖，較佳地包含5wt%葡萄糖。再舉例而言，發酵培養基可包含2至15wt%脫脂奶粉、3至10wt%蛋白腖、及/或1至5wt%酵母萃取物，較佳地包含12wt%脫脂奶粉、7wt%蛋白腖、及/或3wt%酵母萃取物。
本文所用的乙詞「培育」與「培養」或「發酵」實質上為相同意思而可交替使用。培育的條件可參考New Microbiol.2013 Apr；36(2)：167-79。舉例而言，培育溫度可為25至40℃，較佳地為37℃。又舉例而言，培育時間可為6至12小時，較佳地為6小時。
於乳酸菌發酵物含有副乾酪乳桿菌ET-66菌株發酵物、唾液乳酸桿菌AP-32菌株發酵物、及植物乳酸桿菌LPL28菌株發酵物的條件下，可先將不同種類的菌株混合成菌株混合物，再將菌株混合物於發酵培養基中培育；或者，可先將不同種類的菌株各於發酵培養基中培育，再將發酵培養基混合。無論採用任何培養方式，副乾酪乳桿菌ET-66菌株、唾液乳酸桿菌AP-32菌株、以及植物乳酸桿菌LPL28菌株的發酵起始菌量比可為(1至8)：(1至8)：1，較佳地為(1至8)：1：1。所謂「發酵起始菌量比」定義為培育時(或培育前)將不同種類
之菌株添加至發酵培養基的菌量比。
可透過固液分離培育後的發酵培養基以取得不含菌體的上層液，以上層液作為未含菌株的發酵液。所謂「固液分離」可包含離心(centrifugation)、過濾(filtration)、濃縮(concentration)或其任意組合，較佳地為離心。
可透過乾燥發酵液以取得對應的發酵粉末。舉例而言，可透過乾燥未含菌株的發酵液以取得未含菌株的發酵粉末，以此類推。所謂「乾燥」可包含冷凍乾燥(freeze drying)、噴霧乾燥(spray drying)、流化床乾燥(bed drying)、或其任意組合。
茲以下列實施例例示說明本發明：
<實施例1：發酵培養基的配方>
以下實施例所用的發酵培養基依如表2所示的配方製備。
<實施例2：菌株的選用>
以下實施例所用的乳酸菌菌株陳列於表3。
<實施例3：活性菌株的製備>
將菌株接種於含0.05%半胱胺酸(cysteine)的MRS肉湯培養基(MRS broth)，並於培養箱中以37℃與5%CO2的環境培養16小時以活化菌株。將活化菌株以濃度10vol%接種於MRS肉湯培養基，並於培養箱中以37℃與5%CO2的環境繼代培養24小時。最後，以新鮮MRS肉湯培養基調整培養液的活性菌株濃度至1x108至1x109CFU/mL。
<實施例4：去活性菌株的製備>
於37℃培養菌株來初步活化。之後，100℃隔水加熱30分鐘將菌株熱殺去活性。以轉速4,000rpm離心10分鐘後，移除上清液並以新鮮液體培養基回溶沉澱物調整去活性菌株濃度至5x108CFU/ml。之後，離心回溶的菌液使去活性菌株沉澱，再以噴霧乾燥得到去活性的菌株粉末。
<實施例5：菌株發酵物的製備>
將單種菌株接種至100mL的發酵培養基中，並於37℃下培養24小時活化菌株。接著，將單種活化菌株以濃度3vol%接種至5L的發酵培養基中(總菌株濃度約5×108CFU/mL)，並於厭氧與37℃的條件進行發酵培養隔夜。接著，將發酵培養基進行離心使菌體沉澱，取上層液進行噴霧乾燥得到單種菌株發酵粉末。
將單種菌株接種至100mL的發酵培養基中，並於37℃下培養24小時活化菌株。接著，將多種活化菌株以不同菌量比混合，並將活化菌株混合物以濃度3vol%接種至5L的發酵培養基中(總菌株濃度約5×108CFU/mL)，並於厭氧
與37℃的條件進行發酵培養隔夜。接著，將發酵培養基進行離心使菌體沉澱，取上層液進行噴霧乾燥處理得到多種菌株發酵粉末。
<實施例6：人類胃細胞的吸附測試>
本實施例參考Exp Ther Med.2021 Mar；21(3)：188進行。AGS細胞為人類胃腺癌細胞，購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
將滅菌過的蓋玻片置於培養孔內。將AGC細胞以密度每孔3x105個細胞種於孔內，而每孔含有含5μL之10%FBS的F12K培養基。於培養箱中以37℃與5%CO2的環境培養直到細胞滿度近100%。替換培養基後，於培養箱中以37℃與5%CO2的環境繼續培養1小時。移除培養基並以PBS清洗細胞二次，將1.5mL的待測樣品與1.5mL的新鮮培養基添加至孔內，於培養箱中以37℃與5%CO2的環境與細胞共培養1至4小時。於PBS清洗細胞後，以10%甲醇溶液固定細胞10分鐘。自孔內取出蓋玻片並進行革蘭氏染色(Gram Staining)。最後，利用直立式顯微鏡觀察並計算蓋玻片單一視野下的菌株數量。
如圖1、2所示，相較於AP-32活性菌株與LPL28活性菌株，ET-66活性菌株具較優異之附著於胃細胞的活性。
<實施例7：共凝集測試>
將幽門螺旋桿菌培養於含5%綿羊血的哥倫比亞肉湯培養基(Columbia broth)72小時。以轉速4,000rpm離心1ml的菌液10分鐘，去除上清液。接著，以1ml的PBS清洗幽門螺旋桿菌，並於離心後，回溶至1ml的PBS。另取1g待測樣品與9mL的PBS均勻混合。之後，取450μL回溶的菌液與50μL待測樣品溶液至eppendorf中均勻混合10秒。於室溫靜置隔夜後，觀察共凝集情況。詳細地
說，取200μL上清液測量OD600吸光值。以下列公式計算沉降率：
其中，A為添加去活性之ET-66菌株粉末或市售之Pylopass粉末測得的OD600吸光值，Pylopass粉末為購自丹麥Novozymes A/S之去活性的羅伊氏乳酸桿菌DSM 17648菌株粉末；B為添加麥芽糊精測得的OD600吸光值。
如圖3所示，相較於Pylopass粉末，去活性的ET-66菌株粉末具有優異的幽門螺旋桿菌共凝集活性。
<實施例8：幽門螺旋桿菌的生長測試>
將幽門螺旋桿菌培養於含5%綿羊血的哥倫比亞肉湯培養基72小時。以轉速4,000rpm離心1ml菌液10分鐘，去除上清液。將幽門螺旋桿菌回溶至1ml之含5%綿羊血的哥倫比亞肉湯培養基後，以新鮮哥倫比亞肉湯培養基進行10倍稀釋。另取1g待測樣品與9mL哥倫比亞肉湯培養基均勻混合。之後，取450μL回溶的幽門螺旋桿菌菌液與50μL待測樣品溶液至微好氧的37℃環境培養72小時。取100μL混合培養液進行序列稀釋後，塗於哥倫比亞瓊脂。最後，於微好氧的37℃環境培養72小時後，計算菌落數。
首先，探討活性菌株對幽門螺旋桿菌生長的影響。如圖4所示，相較於DSM 17648活性菌株與LCA506活性菌株，ET-66活性菌株、AP-32活性菌株與LPL28活性菌株具較優異之抑制幽門螺旋桿菌生長的活性。
其次，探討菌株發酵物對幽門螺旋桿菌生長的影響。如圖5所示，相對於僅利用DSM 17648菌株得到的發酵粉末，僅利用ET-66菌株發酵粉末與利用含ET-66菌株之混合物得到的菌株發酵粉末具較優異之抑制幽門螺旋桿菌生長的活性。更進一步地說，相較於僅利用ET-66菌株得到的發酵粉末，利用含ET-
66菌株之混合物得到的菌株發酵粉末於ET-66菌株、AP-32菌株與LPL28菌株的發酵起始菌量比為(1至8)：(1至8)：1的條件下具較優異之抑制幽門螺旋桿菌生長的活性，特別是發酵起始菌量比為(1至8)：1：1的條件下。
<實施例9：尿素酶活性測試>
將幽門螺旋桿菌培養於含5%綿羊血的哥倫比亞肉湯培養基72小時。以轉速4,000rpm離心1ml菌液10分鐘，去除上清液。將幽門螺旋桿菌回溶至1ml之含5%綿羊血的哥倫比亞肉湯培養基後，以新鮮哥倫比亞肉湯培養基進行10倍稀釋。另取1g待測樣品與9mL哥倫比亞肉湯培養基均勻混合。之後，取450μL回溶的幽門螺旋桿菌菌液與50μL待測樣品溶液至微好氧的37℃環境培養72小時。以轉速4,000rpm離心混合培養液10分鐘後，取10μL上清液與300μL尿素酶反應緩衝液混合並於37℃作用1.5小時。最後，測量反應液的OD550吸光值。
首先，探討活性菌株對尿素酶活性的影響。如圖6所示，相較於DSM 17648活性菌株與LCA506活性菌株，ET-66活性菌株、AP-32活性菌株與LPL28活性菌株具較優異之抑制尿素酶活性的能力。
其次，探討菌株發酵物對幽門螺旋桿菌之尿素酶活性的影響。如圖7所示，相對於僅利用DSM 17648菌株得到的發酵粉末，僅利用ET-66菌株發酵粉末與利用含ET-66菌株之混合物得到的菌株發酵粉末具較優異之抑制尿素酶活性的能力。更進一步地說，相較於僅利用ET-66菌株得到的發酵粉末，利用含ET-66菌株之混合物得到的菌株發酵粉末於ET-66菌株、AP-32菌株與LPL28菌株的發酵起始菌株量比為8：1：1的條件下具較優異之抑制幽門螺旋桿菌生長的活性。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發
明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
1、TW中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心2016/11/03 BCRC910753；2、TW中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心2009/07/30 BCRC910437；以及3、TW中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心2011/12/27 BCRC910536。
Claims (5)
- 一種乳酸菌發酵物用於製備抑制幽門螺旋桿菌生長之組合物的用途，該乳酸菌發酵物包括：副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) ET-66菌株(寄存編號：BCRC910753)發酵物、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株(寄存編號：BCRC910437)發酵物、及植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)LPL28菌株(寄存編號：BCRC910536)發酵物；該ET-66菌株、該AP-32菌株、及該LPL28菌株以發酵起始菌量比(1至8)：1：1混合並於一發酵培養基中培育得到該乳酸菌發酵物。
- 如請求項1所述之用途，其中該副乾酪乳桿菌ET-66菌株發酵物包括不含菌株的發酵液、含活性菌株的發酵液、含去活性菌株的發酵液、含菌體片段的發酵液、或其粉末；該唾液乳酸桿菌AP-32菌株發酵物包括不含菌株的發酵液、含活性菌株的發酵液、含去活性菌株的發酵液、含菌體片段的發酵液、或其粉末；該植物乳酸桿菌LPL28菌株發酵物包括不含菌株的發酵液、含活性菌株的發酵液、含去活性菌株的發酵液、含菌體片段的發酵液、或其粉末。
- 如請求項1所述之用途，其中該組合物更用於抑制尿素酶活性。
- 如請求項1所述之用途，其中該組合物更用於附著於胃細胞。
- 如請求項1所述之用途，其中該組合物更用於凝集幽門螺旋桿菌。
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