CN116919995A - 乳酸菌或其发酵物用于维持或改善肠胃状况的用途 - Google Patents

乳酸菌或其发酵物用于维持或改善肠胃状况的用途 Download PDF

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CN116919995A CN202210427352.XA CN202210427352A CN116919995A CN 116919995 A CN116919995 A CN 116919995A CN 202210427352 A CN202210427352 A CN 202210427352A CN 116919995 A CN116919995 A CN 116919995A
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Abstract

本发明提出一种乳酸菌用于制备维持或改善肠胃状况的组合物的用途，乳酸菌包括：副干酪乳杆菌ET‑66菌株。本发明另提出一种乳酸菌发酵物用于制备维持或改善肠胃状况的组合物的用途，乳酸菌发酵物包括：副干酪乳杆菌ET‑66菌株发酵物。本发明揭示了特定乳酸菌具有附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长与尿素酶活性、或凝集幽门螺旋杆菌的优点。

Description

乳酸菌或其发酵物用于维持或改善肠胃状况的用途
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌或其发酵物的医药保健用途，特别涉及一种乳酸菌或其发酵物用于维持或改善肠胃状况的用途。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)为引起胃炎的主要致病原之一。感染幽门螺旋杆菌后可能会发展成慢性胃炎、十二指肠与胃溃疡，严重者可能会引发胃腺癌及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤。幽门螺旋杆菌可在强酸且微氧的胃内环境生存，常附着于黏膜层表面并形成云雾状薄膜，以中和胃酸来在低pH环境下存活。胃内环境也提供幽门螺旋杆菌必要营养物质尿素，其可经幽门螺旋杆菌的尿素酶水解产生NH3与CO2以提高胃内环境的pH值。
幽门螺旋杆菌感染的治疗目前主要采三合一治疗，其并用一种氢离子帮浦阻断剂(proton pump inhibitor)与两种不同抗生素。此种治疗方式易造成病患高副作用率、低顺从性，且易受细菌的抗药性及感染量影响而治疗失败，因此开始寻求温和、安全且简单的替代方案。近年来发现特定微生物能有效抑制幽门螺旋杆菌并促进肠胃健康。
一般而言，乳酸菌食用上相当安全，因此透过服用乳酸菌来治疗幽门螺旋杆菌感染确实为可行的目标之一。
发明内容
依本发明发现特定乳酸菌的活性菌株可附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长与尿素酶活性、或凝集幽门螺旋杆菌。
依本发明又发现特定乳酸菌的去活性菌株可附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长与尿素酶活性、或凝集幽门螺旋杆菌。
依本发明再发现特定乳酸菌的发酵物可附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长与尿素酶活性、或凝集幽门螺旋杆菌。
鉴于上述发现，本发明提出一种乳酸菌用于制备维持或改善肠胃状况的组合物的用途，乳酸菌包括：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-66菌株(寄存编号：CGMCC13514)。
在一实施例中，乳酸菌进一步包括：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivariussubsp.salicinius)AP-32菌株(寄存编号：CCTCC M2011127)、以及植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)LPL28菌株(寄存编号：CGMCC 17954)。
在一实施例中，副干酪乳杆菌ET-66菌株为活性菌株或去活性菌株。
在一实施例中，唾液乳酸杆菌AP-32菌株为活性菌株或去活性菌株，植物乳酸杆菌LPL28菌株为活性菌株或去活性菌株。
在一实施例中，组合物用以附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长、抑制尿素酶活性、及/或凝集幽门螺旋杆菌。
鉴于上述发现，本发明另提出一种乳酸菌发酵物用于制备维持或改善肠胃状况的组合物的用途，乳酸菌发酵物包括：副干酪乳杆菌ET-66菌株发酵物。
在一实施例中，乳酸菌发酵物进一步包括：唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、以及植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物。
在一实施例中，副干酪乳杆菌ET-66菌株发酵物包括未含菌株的发酵液、含活性菌株的发酵液、含去活性菌株的发酵液、含菌体片段的发酵液、或其粉末。
在一实施例中，唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物包括未含菌株的发酵液、含活性菌株的发酵液、含去活性菌株的发酵液、含菌体片段的发酵液、或其粉末，植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物包括未含菌株的发酵液、含活性菌株的发酵液、含去活性菌株的发酵液、含菌体片段的发酵液、或其粉末。
在一实施例中，副干酪乳杆菌ET-66菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株、以及植物乳酸杆菌LPL28菌株的发酵起始菌量比为(1至8)：1：1。
在一实施例中，组合物用以附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长、抑制尿素酶活性、及/或凝集幽门螺旋杆菌。
附图说明
图1为显微镜照片，呈现胃细胞吸附不同种类的乳酸菌活性菌株的情况；
图2为长条统计图，说明胃细胞对不同种类的乳酸菌活性菌株的吸附数量；
图3为长条统计图，说明不同种类的乳酸菌去活性菌株粉末对幽门螺旋杆菌的沉降率；
图4为长条统计图，说明不同种类的乳酸菌活性菌株对幽门螺旋杆菌生长的影响；
图5为长条统计图，说明不同种类之菌株发酵粉末对幽门螺旋杆菌生长的影响；
图6为长条统计图，说明不同种类的乳酸菌活性菌株对尿素酶活性的影响；以及
图7为长条统计图，说明不同种类之菌株发酵粉末对尿素酶活性的影响。
具体实施方式
为让本发明上述及/或其他目的、功效、特征更明显易懂，下文特举较佳实施方式，作详细说明于下：
本发明所用的菌株寄存于中国典型培养物保藏中心，地址为中国、武汉、武汉大学、或中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，详细寄存信息如表1。
表1、菌株的寄存信息
本发明之一实施方式提出一种乳酸菌用于制备维持或改善肠胃状况的组合物的用途，乳酸菌包括：副干酪乳杆菌ET-66菌株。可投予组合物至所需个体来维持或改善肠胃状况。依以下实施例所证，副干酪乳杆菌ET-66菌株至少可附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长与尿素酶活性、或凝集幽门螺旋杆菌，因此组合物可在个体内实现上述生物功能来维持或改善肠胃状况。
为进一步提升肠胃状况的维持或改善功效，乳酸菌可再包括：唾液乳酸杆菌AP-32菌株、以及植物乳酸杆菌LPL28菌株。此外，副干酪乳杆菌ET-66菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株、与植物乳酸杆菌LPL28菌株可单独地为活性菌株或去活性菌株。在活性菌株的条件下，组合物有运送与保存造成活性降低的问题；在去活性菌株的条件下，组合物则无上述问题。
本发明之另一实施方式提出一种乳酸菌发酵物用于制备维持或改善肠胃状况的组合物的用途，乳酸菌发酵物包括：副干酪乳杆菌ET-66菌株发酵物。可投予组合物至所需个体来维持或改善肠胃状况。依以下实施例所证，副干酪乳杆菌ET-66菌株发酵物至少可附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长与尿素酶活性、或凝集幽门螺旋杆菌，因此组合物可在个体内实现上述生物功能来维持或改善肠胃状况。
为进一步提升肠胃状况的维持或改善功效，乳酸菌发酵物可再包括：唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、以及植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物。此外，副干酪乳杆菌ET-66菌株发酵物、唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、以及植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物可单独地包括未含菌株的发酵液、含活性菌株的发酵液、含去活性菌株的发酵液、含菌体片段的发酵液、或其粉末。在含活性菌株之发酵液的条件下，组合物有运送与保存造成活性降低的问题；在其他条件下，组合物则无上述问题。
副干酪乳杆菌ET-66菌株发酵物、唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、及植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物为将对应种类的菌株于发酵培养基中培育取得的。发酵培养基可为MRS肉汤培养基，MRS肉汤培养基可包含碳源及/或氮源。碳源的实例可为葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、海藻糖(trehalose)、淀粉(starch)、马铃薯淀粉(potato starch)、麦芽萃取物(malt extract)、麦芽糊精(maltodextrin)、或其任意组合，而氮源的实例可为(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、蛋白胨(peptone)、聚蛋白胨(polypeptone)、胰化胨(tryptone)、肉类萃取物(meat extract)、酵母萃取物(yeastextract)、酵母粉(yeast powder)、牛奶、脱脂奶粉、大豆粉(soybean flour)、乳清、或其任意组合。举例而言，发酵培养基可包含1至20wt％碳源及/或4至35wt％氮源。又举例而言，发酵培养基可包含1至5wt％葡萄糖，较佳地包含5wt％葡萄糖。再举例而言，发酵培养基可包含2至15wt％脱脂奶粉、3至10wt％蛋白胨、及/或1至5wt％酵母萃取物，较佳地包含12wt％脱脂奶粉、7wt％蛋白胨、及/或3wt％酵母萃取物。
本文所用的词语“培育”与“培养”或“发酵”实质上为相同意思而可交替使用。培育的条件可参考New Microbiol.2013Apr；36(2):167-79。举例而言，培育温度可为25至40℃，较佳地为37℃。又举例而言，培育时间可为6至12小时，较佳地为6小时。
在乳酸菌发酵物含有副干酪乳杆菌ET-66菌株发酵物、唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物、及植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物的条件下，可先将不同种类的菌株混合成菌株混合物，再将菌株混合物于发酵培养基中培育；或者，可先将不同种类的菌株各于发酵培养基中培育，再将发酵培养基混合。无论采用任何培养方式，副干酪乳杆菌ET-66菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株、以及植物乳酸杆菌LPL28菌株的发酵起始菌量比可为(1至8)：(1至8)：1，较佳地为(1至8)：1：1。所谓“发酵起始菌量比”定义为培育时(或培育前)将不同种类的菌株添加至发酵培养基的菌量比。
可透过固液分离培育后的发酵培养基以取得不含菌体的上层液，以上层液作为未含菌株的发酵液。所谓“固液分离”可包含离心(centrifugation)、过滤(filtration)、浓缩(concentration)或其任意组合，较佳地为离心。
可透过干燥发酵液以取得对应的发酵粉末。举例而言，可透过干燥未含菌株的发酵液以取得未含菌株的发酵粉末，以此类推。所谓“干燥”可包含冷冻干燥(freezedrying)、喷雾干燥(spray drying)、流化床干燥(bed drying)、或其任意组合。
兹以下列实施例例示说明本发明：
＜实施例1：发酵培养基的配方＞
以下实施例所用的发酵培养基依如表2所示的配方制备。
表2、发酵培养基的配方
成分 重量百分比(wt％)
葡萄糖 1至5
脱脂奶粉 2至15
蛋白胨(peptone) 3至10
酵母萃取物(yeast extract) 1至5
磷酸氢二钾(potassium hydrogen phosphate) 0.05至0.2
柠檬酸钠(sodium citrate) 0至0.01
硫酸锰 0至0.01
麸胺酸钠(monosodium glutamate) 1至5
Tween 80 0.05至0.2
水 余量
＜实施例2：菌株的选用＞
以下实施例所用的乳酸菌菌株陈列于表3。
表3、菌株信息
＜实施例3：活性菌株的制备＞
将菌株接种在含0.05％半胱胺酸(cysteine)的MRS肉汤培养基(MRS broth)，并在培养箱中以37℃与5％CO2的环境培养16小时以活化菌株。将活化菌株以浓度10vol％接种于MRS肉汤培养基，并在培养箱中以37℃与5％CO2的环境继代培养24小时。最后，以新鲜MRS肉汤培养基调整培养液的活性菌株浓度至1x108至1x109CFU/mL。
＜实施例4：去活性菌株的制备＞
在37℃培养菌株来初步活化。之后，100℃隔水加热30分钟将菌株热杀去活性。以转速4,000rpm离心10分钟后，移除上清液并以新鲜液体培养基回溶沉淀物调整去活性菌株浓度至5x108CFU/ml。之后，离心回溶的菌液使去活性菌株沉淀，再以喷雾干燥得到去活性的菌株粉末。
＜实施例5：菌株发酵物的制备＞
将单种菌株接种至100mL的发酵培养基中，并在37℃下培养24小时活化菌株。接着，将单种活化菌株以浓度3vol％接种至5L的发酵培养基中(总菌株浓度约5×108CFU/mL)，并在厌氧与37℃的条件进行发酵培养隔夜。接着，将发酵培养基进行离心使菌体沉淀，取上层液进行喷雾干燥得到单种菌株发酵粉末。
将单种菌株接种至100mL的发酵培养基中，并在37℃下培养24小时活化菌株。接着，将多种活化菌株以不同菌量比混合，并将活化菌株混合物以浓度3vol％接种至5L的发酵培养基中(总菌株浓度约5×108CFU/mL)，并在厌氧与37℃的条件进行发酵培养隔夜。接着，将发酵培养基进行离心使菌体沉淀，取上层液进行喷雾干燥处理得到多种菌株发酵粉末。
＜实施例6：人类胃细胞的吸附测试＞
本实施例参考Exp Ther Med.2021Mar；21(3):188进行。AGS细胞为人类胃腺癌细胞，购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
将灭菌过的盖玻片置于培养孔内。将AGS细胞以密度每孔3x105个细胞种于孔内，而每孔含有含5μL之10％FBS的F12K培养基。在培养箱中以37℃与5％CO2的环境培养直到细胞满度近100％。替换培养基后，在培养箱中以37℃与5％CO2的环境继续培养1小时。移除培养基并以PBS清洗细胞二次，将1.5mL的待测样品与1.5mL的新鲜培养基添加至孔内，在培养箱中以37℃与5％CO2的环境与细胞共培养1至4小时。在PBS清洗细胞后，以10％甲醇溶液固定细胞10分钟。自孔内取出盖玻片并进行革兰氏染色(Gram Staining)。最后，利用直立式显微镜观察并计算盖玻片单一视野下的菌株数量。
如图1、2所示，相较于AP-32活性菌株与LPL28活性菌株，ET-66活性菌株具较优异的附着于胃细胞的活性。
＜实施例7：共凝集测试＞
将幽门螺旋杆菌培养在含5％绵羊血的哥伦比亚肉汤培养基(Columbia broth)72小时。以转速4,000rpm离心1ml的菌液10分钟，去除上清液。接着，以1ml的PBS清洗幽门螺旋杆菌，并在离心后，回溶至1ml的PBS。另取1g待测样品与9mL的PBS均匀混合。之后，取450μL回溶的菌液与50μL待测样品溶液至eppendorf中均匀混合10秒。在室温静置隔夜后，观察共凝集情况。详细地说，取200μL上清液测量OD600吸光值。以下列公式计算沉降率：
其中，A为添加去活性的ET-66菌株粉末或市售的Pylopass粉末测得的OD600吸光值，Pylopass粉末为购自丹麦Novozymes A/S的去活性的罗伊氏乳酸杆菌DSM 17648菌株粉末；B为添加麦芽糊精测得的OD600吸光值。
如图3所示，相较于Pylopass粉末，去活性的ET-66菌株粉末具有优异的幽门螺旋杆菌共凝集活性。
＜实施例8：幽门螺旋杆菌的生长测试＞
将幽门螺旋杆菌培养在含5％绵羊血的哥伦比亚肉汤培养基72小时。以转速4,000rpm离心1ml菌液10分钟，去除上清液。将幽门螺旋杆菌回溶至1ml的含5％绵羊血的哥伦比亚肉汤培养基后，以新鲜哥伦比亚肉汤培养基进行10倍稀释。另取1g待测样品与9mL哥伦比亚肉汤培养基均匀混合。之后，取450μL回溶的幽门螺旋杆菌菌液与50μL待测样品溶液至微好氧的37℃环境培养72小时。取100μL混合培养液进行序列稀释后，涂在哥伦比亚琼脂。最后，在微好氧的37℃环境培养72小时后，计算菌落数。
首先，探讨活性菌株对幽门螺旋杆菌生长的影响。如图4所示，相较于DSM 17648活性菌株与LCA506活性菌株，ET-66活性菌株、AP-32活性菌株与LPL28活性菌株具较优异的抑制幽门螺旋杆菌生长的活性。
其次，探讨菌株发酵物对幽门螺旋杆菌生长的影响。如图5所示，相对于仅利用DSM17648菌株得到的发酵粉末，仅利用ET-66菌株发酵粉末与利用含ET-66菌株的混合物得到的菌株发酵粉末具较优异的抑制幽门螺旋杆菌生长的活性。更进一步地说，相较于仅利用ET-66菌株得到的发酵粉末，利用含ET-66菌株的混合物得到的菌株发酵粉末于ET-66菌株、AP-32菌株与LPL28菌株的发酵起始菌量比为(1至8)：(1至8)：1的条件下具较优异的抑制幽门螺旋杆菌生长的活性，特别是发酵起始菌量比为(1至8)：1：1的条件下。
＜实施例9：尿素酶活性测试＞
将幽门螺旋杆菌培养在含5％绵羊血的哥伦比亚肉汤培养基72小时。以转速4,000rpm离心1ml菌液10分钟，去除上清液。将幽门螺旋杆菌回溶至1ml的含5％绵羊血的哥伦比亚肉汤培养基后，以新鲜哥伦比亚肉汤培养基进行10倍稀释。另取1g待测样品与9mL哥伦比亚肉汤培养基均匀混合。之后，取450μL回溶的幽门螺旋杆菌菌液与50μL待测样品溶液至微好氧的37℃环境培养72小时。以转速4,000rpm离心混合培养液10分钟后，取10μL上清液与300μL尿素酶反应缓冲液混合并在37℃作用1.5小时。最后，测量反应液的OD550吸光值。
首先，探讨活性菌株对尿素酶活性的影响。如图6所示，相较于DSM 17648活性菌株与LCA506活性菌株，ET-66活性菌株、AP-32活性菌株与LPL28活性菌株具较优异之抑制尿素酶活性的能力。
其次，探讨菌株发酵物对幽门螺旋杆菌的尿素酶活性的影响。如图7所示，相对于仅利用DSM 17648菌株得到的发酵粉末，仅利用ET-66菌株发酵粉末与利用含ET-66菌株之混合物得到的菌株发酵粉末具较优异的抑制尿素酶活性的能力。更进一步地说，相较于仅利用ET-66菌株得到的发酵粉末，利用含ET-66菌株的混合物得到的菌株发酵粉末于ET-66菌株、AP-32菌株与LPL28菌株的发酵起始菌株量比为8：1：1的条件下具较优异的抑制幽门螺旋杆菌生长的活性。
惟以上所述者，仅为本发明的较佳实施例，但不能以此限定本发明专利保护范围；故，凡依本发明专利保护范围及发明说明书内容所作的简单的等效改变与修饰，皆仍属本发明专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种乳酸菌用于制备维持或改善肠胃状况的组合物的用途，其特征在于，该乳酸菌包括：
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-66菌株(寄存编号：CGMCC 13514)。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该乳酸菌进一步包括：
唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株(寄存编号：CCTCC M2011127)；以及
植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)LPL28菌株(寄存编号：CGMCC 17954)。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，该副干酪乳杆菌ET-66菌株为活性菌株或去活性菌株。
4.根据权利要求2所述的用途，其中该唾液乳酸杆菌AP-32菌株为活性菌株或去活性菌株，该植物乳酸杆菌LPL28菌株为活性菌株或去活性菌株。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，该组合物用以附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长、抑制尿素酶活性、及/或凝集幽门螺旋杆菌。
6.一种乳酸菌发酵物用于制备维持或改善肠胃状况的组合物的用途，其特征在于，该乳酸菌发酵物包括：副干酪乳杆菌ET-66菌株发酵物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，该乳酸菌发酵物进一步包括：
唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物；以及
植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，该副干酪乳杆菌ET-66菌株发酵物包括不含菌株的发酵液、含活性菌株的发酵液、含去活性菌株的发酵液、含菌体片段的发酵液、或其粉末。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，该唾液乳酸杆菌AP-32菌株发酵物包括不含菌株的发酵液、含活性菌株的发酵液、含去活性菌株的发酵液、含菌体片段的发酵液、或其粉末，该植物乳酸杆菌LPL28菌株发酵物包括不含菌株的发酵液、含活性菌株的发酵液、含去活性菌株的发酵液、含菌体片段的发酵液、或其粉末。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该副干酪乳杆菌ET-66菌株、该唾液乳酸杆菌AP-32菌株、以及该植物乳酸杆菌LPL28菌株的发酵起始菌量比为(1至8)：1：1。
11.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，该组合物用以附着于胃细胞、抑制幽门螺旋杆菌生长、抑制尿素酶活性、及/或凝集幽门螺旋杆菌。
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