KR100911115B1 - 내산성, 내담즙산성 및 항균 효과를 가진 신규한 유산균 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내산성 및 내담즙산성이 우수하며, 항균 효과를 갖는 신규한 유산균에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 소화효소에 대한 내성이 우수하여 장내 생존율이 높고, 항균 효과를 가져 유해 미생물의 성장을 억제할 수 있는 신규한 미생물인 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 및 상기 유산균 또는 유산균 배양물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 신규한 유산균 또는 유산균 배양물은 정장용, 생균용, 항균용 등의 용도로 발효제품, 식품, 의약품, 사료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

락토바실러스속 균주, 락토바실러스 플란타럼, 내산성, 내담즙산성, 항균 효과

Description

내산성, 내담즙산성 및 항균 효과를 가진 신규한 유산균 및 이를 포함하는 조성물{Novel lactic acid bacteria having acid resistance, bile-salt resistance and anti-bacterial effect and composition containing the same}

도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707의 대장균에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.

도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707의 포도상구균에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.

도 3은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707의 리스테리아균에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.

도 4는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707의 살모넬라균에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.

본 발명은 내산성 및 내담즙산성이 우수하며, 항균 효과를 갖는 신규한 유산균에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 소화효소에 대한 내성이 우수하여 장내 생존율이 높고, 항균 효과를 가져 유해 미생물의 성 장을 억제할 수 있는 신규한 미생물인 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 및 상기 유산균 또는 유산균 배양물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

프로바이오틱스(Probiotics)라는 말은 'for life'라는 뜻으로 그리스어에서 유래되었다. 프로바이오틱스는 1965년에 '미생물이 분비하는 물질로 다른 미생물의 성장을 자극하는 물질'이라고 정의되었고, 1974년에는 '숙주동물에게 유익한 효과를 주는 생물 또는 물질'이라고 정의되었다. 그 후 1989년에 풀러(Fuller)가 프로바이오틱스를 다시 정의하기를 '장내균총을 개선시킴으로서 숙주에게 유익한 영향을 주는 생균제제'라고 하여 살아있는 미생물에 대한 개념이 도입되었다. 이러한 프로바이오틱스에는 호기성균군, 혐기성균군, 유산균, 효모균들이 사용되고 있으나 주로 유산균들이 주요 균주로 이용되고 있다.

유산균은 자연계에 널리 존재하며 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 유산을 생산한다. 유산균이 발견되는 자연환경은 다양한데, 사람이나 동물의 장내에 존재할 뿐 아니라, 다양한 채소와 과일에서도 발견되며 우리나라의 김치나 요구르트, 독일의 사우어크라우트(sauerkraut)와 같은 발효식품에서 그 발효과정에 중요한 역할을 담당한다.

이들 유산균은 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 유해 미생물의 장 정착을 방지하고 항균 물질을 분비함으로써 유해 미생물의 생육을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 면역활성 증진, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 작용을 수행한다. 또한, 일반적으로 이들 유산균은 직접 혹은 간접적으로 식품에 첨가되어 이들의 대사산물인 유산에 의해 식품의 저장성을 향상시키 며 식품의 향미와 조직을 개선한다고 알려져 있다. 주요 유산균들은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 등인 것으로 보고되어 있고, 이러한 유산균들은 현재 전세계적으로 발효 유제품의 종균, 생균제제 등으로 널리 이용되고 있다.

최근 채소나 과일과 같은 식물, 혹은 김치와 같은 과채류를 발효한 식품에서 분리해 낸 식물유래 유산균들의 기능성이 밝혀지면서 새로운 기능성 소재로 떠오르고 있다. 이러한 식물 유래 유산균들에는 류코노스톡 속, 페디오코커스 속, 락토바실러스 속 중 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이나 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 등이 포함된다. 식물 유래 유산균들은 낮은 pH나 높은 염농도와 같은 척박한 환경에서도 강한 생존력을 보인다. 또한, 식물 유래 유산균은 동물 유래 유산균들에 비해 영양요구성이 덜 까다로와 배양이 용이하며, 과채류를 원료로 한 발효제품의 개발이 가능하여 발효유 제품 일색인 발효음료 시장에서 새로운 제품 개발이 가능하다.

이러한 유산균이 프로바이오틱스로서의 역할을 수행하기 위해서는 아래와 같은 특징을 가지고 있어야 한다.

첫째, 소화기관을 통과하더라도 생존해야 하고,

둘째, 숙주에게 유익한 효과를 주어야 하며,

셋째, 장내에서 증식 또는 정착할 수 있고,

넷째, 식품 제조시에 식품의 품질에 손상을 주지 않는 것을 충족해야 한다.

상기 유산균이 상술한 바와 같은 프로바이오틱스로서의 효과적인 활성을 위해서는 내산성, 내담즙산성을 지니는 것이 중요하다. 섭취한 유산균이 장내에 도달하기 위해서는 위액과 담즙산을 통과하게 되는데 일반적으로 이 과정에서 세균들이 죽거나 활성이 떨어지기 때문에 투여된 유산균이 그 기능을 장에서 발휘하기 위해서는 이러한 산 및 소화효소에 대한 내성을 지니고 있어야 한다. 따라서 내산성 및 내담즙성이 우수한 유산균을 사용해야만 실질적으로 인체에 유용한 기능을 수행할 수 있게 된다.

한국 특허공개 제2006-80130호에는 김치에서 분리한 항진균 활성 락토바실러스 플란타룸 AF1과 상기균의 배양액을 이용한 제품이 개시되어 있으나, 내산성, 내담즙성이 우수하고 소화효소에 대한 내성을 가지며, 항균 효과를 갖는 균주에 대한 개시는 없다.

이에 본 발명자들은 새롭게 내산성 및 내담즙성이 우수하고 항균력을 가진 락토바실러스 플란타럼 유산균을 분리하였다. 본 발명자들이 새로 분리, 동정한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CLP0707 균주는 종래 알려진 다른 균주들에 비해 우수한 내산성 및 내담즙성을 가지고 있으며 펩신과 판크레아틴과 같은 소화효소에 대한 내성을 가지고 있어 체내 생존율이 높을 것으로 기대된다. 또한 본 균주는 대장균 및 포도상구균에 대한 항균물질을 생성함을 보여줌으로써 유해 미생물 억제 및 장내 세균총의 정상화, 정장 작용을 기대할 수 있다.

본 발명의 목적은 내산성 및 내담즙산성이 뛰어나고, 소화효소에 대한 내성을 가지며, 항균 효과를 갖는 신규한 유산균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유산균 또는 그 배양물을 포함하는 발효제품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유산균 또는 그 배양물을 포함하는 정장용, 생균제, 사료첨가용, 항균용 또는 식품첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유산균의 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성 및 내담즙산성이 뛰어나며, 항균활성을 가진 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CLP0707 (수탁번호: KCCM10868P)을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 유산균 또는 유산균의 배양물을 포함하는 항균용, 정장용, 생균제용 또는 사료첨가용 조성물과 발효제품을 제공한다.

본 발명자들은 과일로부터 천연적으로 존재하는 유산균들 중 내산성 및 내담즙산성이 우수하며 항균력을 가진 유산균을 새롭게 분리, 동정하였다. 본 발명자들이 새롭게 분리 및 동정한 유산균은 내산성 및 내담즙산성이 우수하며, 유해 세균에 대한 항균활성을 보여 유해 미생물의 생육 억제 및 정장 효과를 기대할 수 있다.

이하, 본 발명의 신규한 유산균 및 이를 포함하는 조성물에 대해 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 내산성 및 내담즙산성이 뛰어나며 항균활성을 보여 생균제용, 항균용, 사료용 등의 조성물에 사용되기에 유용한 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CLP0707 (수탁번호: KCCM10868P)을 제공한다.

본 발명에 따른 유산균들은 다음과 같은 방법에 의해 분리 및 동정되었다. 본 발명자들은 과일을 pH 3.0까지 발효시킨 발효액으로부터 유산균 선별 배지를 이용하여 유산균만을 분리하고 이 중에서 내산성 및 내담즙산성이 우수한 균주를 분리하였다.

최종 선발된 유산균은 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 실시하였다. 그 결과, 본 발명에서 분리한 균주는 락토바실러스 플란타럼으로 동정되었다. 본 발명자들은 본 발명에서 분리된 균주를 락토바실러스 플란타럼 CLP0707이라 명명하고 2007년 4월 30일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩에 소재하는 한국미생물보존센터(KCCM)에 수탁번호 KCCM10868P로 기탁하였다.

본 발명에서 처음으로 분리 및 동정된 유산균 CLP0707은 다음과 같은 특성을 지닌다.

첫째, 본 발명에 따른 유산균은 뛰어난 내산성 및 내담즙산성을 보여 생균제로의 활용가치가 높다.

둘째, 본 발명에 따른 유산균은 펩신 및 판크레아틴과 같은 소화효소에 대한 내성을 보여 장내 생존율이 우수하다.

셋째, 본 발명에 따른 유산균 및 그 배양액은 유해미생물들의 성장을 억제하 는 효능을 가진다. 본 발명에 따른 신규 유산균으로 성장이 억제될 수 있는 유해 미생물로는 대장균(E. coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus) 등이 있으며, 구체적으로는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium), 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 장독성 대장균(enterotoxigenic E. coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 캠필러박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 본 발명에 따른 유산균 CLP0707은 통상적인 유산균의 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양 배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, MRS(Man-Rogosa-Sharp) 액체 배지 및 우유가 첨가된 액체 배지를 사용할 수 있다. 탄소원으로는 전분, 글루코스, 수크로스, 갈락토스, 프룩토스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 글루코스이다. 질소원으로는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨, 글루탐산, 카사미노산, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두박 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 미네랄은 염화나트륨, 인산제이칼륨, 황산마그네슘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.

미생물 배양 배지 내 상기 탄소원, 질소원 및 미네랄 각각은 리터당 10 내지 100 g, 5 내지 40 g 및 0.5 내지 4 g 을 이용할 수 있다.

상기의 통상의 배양 배지에 첨가되는 비타민은 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 비타민은 통상의 배양 배지에 상기에서 언급한 탄소원, 질소원, 미네랄 등의 배지와 동시에 첨가하거나, 멸균하여 준비된 배지에 첨가할 수 있다.

배양은 통상의 유산균 배양 조건으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 약 15-45℃에서 약 10-72시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 미생물은 당업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량될 수 있다.

한편, 본 발명의 CLP0707은 내산성 및 내담즙산성이 우수하고, 유해 세균에 대한 항균활성을 가져 발효식품의 종균, 정장용 조성물, 생균제, 항균용 조성물 등의 형태로 제공될 수 있다.

상기에서 '정장용'이란 사람이나 동물의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반증상을 치료 및 개선하는 용도를 말한다. 상기 증상으로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 유해 미생물에 의한 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증 및 장 급이성 설사 등이 포함된다.

상기에서 '생균제'는 살아 있는 균 즉, 사람이나 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서 특정 병리 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 말한다. 일반적으로 생균제는 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료하고 개선하는 효과가 있으며 사람 및 동물에 투여되면 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해 미생물이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며 유산을 생성하여 장내 pH를 낮추어서 유해 미생물의 증식을 억제한다.

상기에서 '항균용'이란 유해 미생물의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 말한다. 바람직하게는 상기 유해 미생물로는 생체 내 소화기관에 존재하면서 소화기관과 관련된 여러 질환을 유발하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium), 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 장독성 대장균(enterotoxigenic E. coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 캠필러박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상술한 조성물들은 본 발명에 따른 유산균의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유할 수 있으며 적합한 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 본 발명에 따른 유산균을 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균 주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등이 포함된다.

또한, 상기 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유산균 또는 이의 배양물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭시르(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 이에 한정되지는 않으나 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료가 포함된다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성율, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 및 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 생균제용 조성물의 경우에는 조성물 내 생균수가 1x10⁵~1x10¹¹ 세포/g, 바람직하게는 1x10⁷ 세포/g 이상이 되도록 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 또는 이의 배양물은 식품 조성물 또는 식품첨가용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 유산균 또는 이의 배양물과 적합한 담체, 부형제 또는 보조성분 등을 혼합하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태로 제조할 수 있다. 나아가, 본 발명의 유산균은 발효제품의 제조를 위한 종균으로 사용될 수 있다. 상 기 발효제품으로는 과채류 발효 음료, 햄 및 소시지와 같은 발효육 제품, 발효 생식 제품, 치즈, 버터밀크, 요구르크, 유청 등과 같은 발효유 제품 및 김치 등이 포함된다. 상기 발효제품은 본 발명의 유산균을 사용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 발효 제품의 제조는 하기 예에 한정된 것은 아니나 예를 들면, 상기 과채류 발효음료의 경우 사과, 배, 귤 등의 과일을 세척, 분쇄 후 정제수와 설탕과 같은 당원을 혼합한 후 본 발명의 유산균을 접종하여 20~37℃의 온도에서 발효를 통해 제조할 수 있다. 또한 발효 생식 제품의 경우 현미와 율무 등의 곡류 분말, 과채류 분말, 버섯류 분말에 본 발명의 유산균 분말을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 곡류 분말에 본 발명의 유산균을 혼합하여 적합한 온도에서 발효한 후 과채류, 버섯류 분말을 영양학적 균형과 기호성을 고려하여 적절히 배합함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 또는 이의 배양물은 사료 조성물 또는 사료첨가용 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 상기 사료 조성물은 기존 항생제의 대체용으로 사용되어 장내 유해균의 생육을 억제하며 장내 균총을 안정되게 유지하여 가축의 건강상태를 양호하게 하여 가축의 증체량과 육질을 개선시키고 산유량 및 면역력을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 이에 한정되지는 않으나 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 유산균과 여러 가지 미생물 또는 효소를 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 유산균을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 펠 렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명의 유산균으로 발효시킴으로써 제조할 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 조성물들은 본 발명의 유산균과 함께 인간을 포함하는 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 유해 미생물의 생육을 억제하며 장내 균총의 균형을 개선시키는 활성을 가지는 다른 종류의 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 미생물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisease) 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 유산균의 분리 및 동정

내산성이 우수한 과일 유래 유산균의 분리를 위해 먼저, 사과, 배, 바나나, 귤 등의 과일을 세척, 분쇄한 후 일정 중량의 정제수와 설탕을 첨가하여 30℃에서 pH 3.0까지 발효시켰다. 이 발효액을 BCP(Brom Cresol Purple) 평판 배지(Difco, USA)에 도말하여 노란색 집락을 형성하는 콜로니를 분리하였다. 분리된 콜로니들은 내산성 평가를 통해 내산성이 우수한 균주를 선별하였으며, 다음 실시예를 통해 선 별된 유산균이 락토바실러스 플란타럼임을 확인하고 CLP0707이라 명명하였다.

<1-1> 형태학적 분석 및 생화학적 특성

본 발명의 선별된 유산균을 MRS 평판 배지(Difco, USA)에서 배양하고 콜로니의 형태를 관찰하였다. 선발한 유산균의 콜로니 형태는 하기 표 1에 나타내었으며, 생화학적인 특징은 하기 표 2에 나타내었다.

MRS 평판 배지에서의 콜로니의 형태

형태	원형
크기	1.5-2mm
색	크림색
불투명도	불투명
융기	볼록
표면	매끄러움

CLP0707의 생화학적 특징

그람 염색	양성
호기적 생장	양성
혐기적 생장	양성
카탈라아제	음성
포자 형성	음성
운동성	음성

<1-2> 16S rDNA 분석

선발된 유산균을 동정하기 위해 16S rDNA 염기서열분석을 실시하였으며 그 결과는 서열번호 1에 나타내었다. 본 발명의 유산균 CLP0707은 락토바실러스 플란타럼의 16S rDNA와 99%의 서열 상동성을 보였으므로, 본 발명에서 분리된 균주 CLP0707은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)임을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에서 분리된 균주를 2007년 4월 30일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10868P로 기탁하였다.

<1-3> 선발된 유산균주의 당 발효 특성

당 발효 특성은 API 50 CHL 키트(Bio Merioux사)를 이용하여 공급회사의 실험방법에 따라 조사하였다. 상기 유산균 CLP0707의 당 발효 특성은 표 3에 나타낸 바와 같다. 당 발효 특성 조사 결과, CLP0707은 락토바실러스 플란타럼으로 동정되어 16S rRNA 서열결정의 동정 결과를 재확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 유산균의 당 발효 특성

당	반응	당	반응
글리세롤	-	살리신	+
에리스리톨	-	셀로바이오스	+
D-아라비노스	-	말토오스	+
L-아라비노스	+	락토오스	+
리보스	+	멜리바이오스	+
D-자일로스	-	수크로오스	+
L-자일로스	-	트레할로스	+
아도니톨	-	이눌린	-
메틸-자일로사이드	-	멜레지토스	+
갈락토오스	+	D-라피노오스	+
D-글루코오스	+	스타치	-
D-프럭토오스	+	글리코겐	-
D-만노오스	+	자일리톨	-
L-소르보스	-	젠티오바이오스	+
람노스	-	D-투라노오스	+
둘시톨	-	D-라이소스	-
이노시톨	-	D-타가토스	-
만니톨	+	D-푸코스	-
솔비톨	+	L-푸코스	-
메틸-D-만노사이드	+	D-아라비톨	-
메틸-D-글루코사이드	-	L-아라비톨	-
N-아세틸 글루코사민	+	글루코네이트	+
아미그달린	+	2 케토-글루코네이트	-
알부틴	+	5 케토-글루코네이트	-
에스쿨린	+
+: 발효함, -: 발효하지 않음

실시예 2:

<2-1> 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707과 다른 균주와의 내산성 비교

CLP0707과 다른 유산 균주들과의 내산성을 비교하기 위하여 유제품 발효 등에 많이 사용되는 유산 균주 4종을 선택하여 표준 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받았다. CLP0707 및 분양받은 균주들은 멸균된 MRS 액체 배지(Difco, USA)에 접종 후 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 HCl로 pH 3.0으로 조정한 MRS 액체 배지에 상기 유산균 배양액 1%를 접종하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 유산균 접종 직후와 1시간 배양 후의 각 시료를 회수하여 멸균 생리 식염수에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37℃에서 72시간 동안 배양한 후 평판 배지위의 집락 수를 계수하여 생균 수를 측정하였다. 유산균의 생존율은 접종 직후의 생균 수를 100%로 하고 접종 직후와 1시간 배양 후의 생균 수를 비교하여 백분율로 나타냈다 (표 4).

pH 3.0에서의 생존율

균 주 명	생존율(%)
CLP0707 (Lactobacillus plantarum)	100.0
ATCC15707 (Bifidobacterium longum)	0.0
KCTC3635 (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)	49.7
KCTC3109 (Lactobacillus casei)	80.6
KCTC3164 (Lactobacillus acidophilus)	96.8

그 결과, 본 발명에서 선별된 유산균 CLP0707은 pH 3.0에서 전혀 영향을 받지 않아 내산성이 매우 우수하였으며, 공지된 다른 유산균종과 비교하였을 때에도 더 높은 내산성을 확인할 수 있었다.

<2-2> 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 의 펩신효소 내성 및 내산성 조사

CLP0707의 펩신효소 내성 및 내산성을 조사하기 위해 다음의 방법으로 실험을 실시하였다. CLP0707은 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 HCl로 pH 3.0와 pH 2.0으로 조정하여 멸균한 후, 펩신효소(pepsin)를 1% 농도가 되도록 첨가한 MRS 액체 배지에 상기 유산균 배양액 1%를 접종하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 유산균 접종 직후와 1시간 배양 후의 각 시료를 회수하여 멸균 생리 식염수에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37℃에서 72시간 동안 배양한 후 평판 배지위의 집락 수를 계수하여 균수를 측정하였다. 유산균의 생존율은 접종 직후의 균수를 100%로 하고 접종 직후와 1시간 배양 후의 균수를 비교하여 백분율로 나타내었다 (표 5).

CLP0707의 펩신효소 및 내산성 평가

조 건	생존율(%)
pH 3.0, 펩신효소 무첨가	100.0
pH 3.0, 펩신효소 1%	100.0
pH 2.0, 펩신효소 1%	97.0

그 결과, 본 발명에서 선별된 유산균 CLP0707은 펩신효소를 첨가한 배지에서도 생존율에 영향을 받지 않았으며, pH 2.0에서도 생존율이 97%로 내산성 및 펩신효소에 대한 내성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다. 이러한 CLP0707의 특징은 위에서 분비되는 소화 효소와 위산분비로 인한 낮은 pH에서도 높은 생존율을 나타내 섭취시 장내 도달율이 매우 높을 것으로 예상할 수 있다.

실시예 3: 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 의 내담즙산성 조사

본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707과 공지 유산균의 내담즙산성을 다음과 같은 방법으로 비교 조사하였다. 즉, 본 발명에 따른 균주 및 공지 유산균들을 멸균된 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 이를 희석하여 각각 0.3%의 옥스갈(oxgall)이 함유된 MRS 평판 배지에 도말하고 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 이때 대조군으로 담즙산을 함유하지 않은 MRS 평판 배지에 각 균주를 도말하여 동일한 방법으로 배양하였다. 유산균의 생존율은 대조군의 집락수를 100%로 하고 대조군과 유산균의 집락수를 비교하여 백분율로 나타내었다 (표 6).

옥스갈 0.3% 첨가 배지에서의 생존율

균 주 명	생존율(%)
CLP0707 (Lactobacillus plantarum)	91.4
ATCC15707 (Bifidobacterium longum)	54.7
KCTC3635 (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)	0.0
KCTC3109 (Lactobacillus casei)	84.2
KCTC3164 (Lactobacillus acidophilus)	1.6

그 결과, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707은 공지된 균주에 비해 매우 우수한 내담즙산성을 보였다.

실시예 4: 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 의 판크레아틴 효소에 대한 내성 조사

본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707이 소장에 존재하는 췌장 효소인 판크레아틴에 대한 내성이 있는지를 조사하였다. 이를 위해 본 발명에 따른 균주를 멸균한 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 0.1% 판크레아틴이 함유된 MRS 액체 배지에 접종한 다음 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이때 대조군으로는 판크레아틴을 함유하지 않은 MRS 액체 배지를 사용하였다. 배양이 완료된 후 본 발명에 따른 유산균의 생존율을 계산하였다. 생존율은 배양이 완료된 후 생균 수를 측정하고 접종 직후의 생균 수와 비교하여 백분율로 나타내었으며, 대조군의 생존율을 100%로 하여 상대적으로 나타내었다 (표 7).

본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707의 췌장 효소에 대한 내성

판크레아틴의 농도(%)	생존율(%)
0.0	100.0
0.1	100.0

그 결과, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707은 췌장 효소가 들어간 배지에서도 생존율이 전혀 감소하지 않아 뛰어난 내성을 보였다.

지금까지의 결과를 종합해 보면, 본 발명의 CLP0707은 내산성 및 내담즙산성이 뛰어날 뿐만 아니라 펩신 및 판크레아틴과 같은 소화효소에도 강한 내성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다. CLP0707의 이러한 특징은 섭취 시 장내 도달율을 높여 프로바이오틱스 균으로서의 기능을 발휘할 수 있도록 할 것으로 생각된다.

실시예 5: 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 의 항균력 조사

프로바이오틱스 유산균들은 유산의 생성을 통해 주변의 pH를 낮춤으로써 다른 미생물들이 성장하는 것을 억제할 뿐 아니라 균주에 따라 박테리오신과 같은 항균물질을 생산하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 유산균 락토바실러스 플란타럼 CLP0707의 항균력을 조사하였다.

실험에 사용된 지시균들은 대장균(E. coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 리스테리아균(Listeria monocytogenes) 4종으로 모두 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다.

실험은 다음의 과정으로 이루어졌다. CLP0707은 멸균된 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양을 하였다. MRS 평판 배지를 제조하여 평판 배지 중앙에 CLP0707 배양액을 5㎕ 점적한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 지시균들은 각각 Tryptic soy 액체 배지(Difco, USA)에 접종하여 37℃에서 16시간 배양한 후, 멸균하여 45~50℃로 식힌 Tryptic soy 한천 배지(한천 0.75%, Difco, USA)에 1%씩 접종하였다. 지시균이 접종된 한천 배지를 미리 CLP0707을 점적하여 배양한 MRS 평판 배지 위에 8ml씩 분주하여 굳힌 후, 37℃에서 24시간 배양하여 저지환의 생성을 관찰하여 그 결과를 표 8 및 도 1~4에 나타내었다.

CLP0707이 생성한 저지환의 크기

지 시 균	저지환의 지름(mm)
KCTC2441 (Escherichia coli)	25
KCTC1621 (Staphylococcus aureus)	25
KCTC3710 (Listeria monocytogenes)	27
KCTC2514 (Salmonella typhimurium)	20

그 결과, CLP0707이 유해미생물의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. CLP0707이 보이는 항균활성이 유산에 의한 것이 아니라 항균물질의 생성에 의한 것임을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

CLP0707을 멸균된 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양을 한 후, 이 배양액을 8000rpm으로 5분간 원심분리하여 균체를 제거하였다. 배양액의 낮은 pH로 인한 항균활성을 배제하기 위해 배양액의 pH를 6.5로 조절한 후, 원심분리 진공 농축기(Centrifugal vacuum concentrator)을 이용하여 10배로 농축하였다. 농축한 배양액은 0.22㎛ 필터로 여과하여 항균력 실험에 사용하였다.

지시균으로는 대장균(E.coli)와 포도상구균(Staphylococcus aureus)를 사용하였다. 지시균은 각각 Tryptic soy 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 배양한 후, 멸균하여 45~50℃로 식힌 Tryptic soy 한천 배지에 1%씩 접종하였다. 지시균이 접종된 한천 배지를 페트리 디쉬에 15ml씩 분주하여 굳힌 후, 멸균한 페이퍼 디스크를 올려놓고 그 위에 준비한 배양액을 100㎕씩 떨어뜨리고 37℃에서 24시간 배양하여 저지환의 생성을 관찰하였다 (표 9).

CLP0707이 생성한 저지환의 크기

지 시 균	저지환의 지름(mm)
	농축전 배양액	농축 배양액
KCTC2441 (Escherichia coli)	17	25
KCTC1621 (Staphylococcus aureus)	12	28

그 결과, 농축한 배양액은 대장균과 포도상구균에 대해 저지환을 생성하는 것을 관찰할 수 있었으며, 농축전 pH가 6.5로 조정된 배양액에서도 저지환을 볼 수 있었다. 따라서 CLP0707이 유산 외에도 다른 항균물질을 생성함을 알 수 있었다.

본 발명은 내산성 및 내담즙산성이 우수하며 항균활성을 가진 신규 유산균, 및 상기 유산균 및/또는 유산균 배양물을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 유산균, 유산균 배양물 또는 조성물은 내산성, 내담즙산성 및 소화효소에 대한 내성이 우수하고, 항균효과가 있어 식품, 의약품, 화장품, 사료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> CTCBIO INC. <120> Novel lactic acid bacteria having acid resistance, bile-salt resistance and anti-bacterial effect and composition containing the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1444 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> gene <222> (1)..(1444) <223> CLP0707 16S rDNA sequence <400> 1 tacatgcaag tcgaacgaac tctggtattg attggtgctt gcatcatgat ttacatttga 60 gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc cagaagcggg ggataacacc 120 tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca tggtccgagc ttgaaagatg 180 gcttcggcta tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag ctagatggtg gggtaacggc 240 tcaccatggc aatgatacgt agccgacctg agagggtaat cggccacatt gggactgaga 300 cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct 360 gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaaactct gttgttaaag 420 aagaacatat ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta tttaaccaga aagccacggc 480 taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg 540 gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa 600 gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta 660 gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt 720 aactgacgct gaggctcgaa agtatgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780 taccgtaaac gatgaatgct aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac 840 gcattaagca ttccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg 900 gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca 960 ggtcttgaca tactatgcaa atctaagaga ttagacgttc ccttcgggga catggataca 1020 ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080 cgcaaccctt attatcagtt gccagcatta agttgggcac tctggtgaga ctgccggtga 1140 caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200 cacgtgctac aatggatggt acaacgagtt gcgaactcgc gagagtaagc taatctctta 1260 aagccattct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag 1320 taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380 acaccatgag agtttgtaac acccaaagtc ggtggggtaa ccttttagga accagccgcn 1440 taat 1444

Claims (8)

1. pH 2에서 내산성이 우수하고, 내담즙산성이 우수하며, 항균 효과를 갖는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CLP0707 (수탁번호: KCCM10868P).
2. 제1항의 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 또는 그 배양물을 포함하는 발효제품.
3. 제1항의 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 또는 그 배양물을 포함하는 정장용 조성물.
4. 제1항의 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 또는 그 배양물을 포함하는 생균제 조성물.
5. 제1항의 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 또는 그 배양물을 포함하는 사료첨가용 조성물.
6. 제1항의 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 또는 그 배양물을 포함하는 항균용 조성물.
7. 제1항의 락토바실러스 플란타럼 CLP0707 또는 그 배양물을 포함하는 식품첨가용 조성물.
8. 삭제

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