KR100803532B1

KR100803532B1 - 내산성, 내담즙성의 적응력이 강하고, 병원성 미생물의 생육을 억제하고, 알파-갈락토시데이지 효소를 생산하는 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 df20(kctc10942bp) 미생물

Info

Publication number: KR100803532B1
Application number: KR1020060072632A
Authority: KR
Inventors: 민재윤; 김광욱; 배형철; 남명수; 이조윤
Original assignee: 민재윤; 김광욱; 배형철
Priority date: 2006-08-01
Filing date: 2006-08-01
Publication date: 2008-02-14
Also published as: KR20080011901A

Abstract

본 발명은 사람의 분변으로부터 분리하고 두과류의 탄수화물에 대한 분해능이 우수한 알파-갈락토시다제를 생산하는 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 동 미생물을 사용하여 두유와 우유를 혼합 발효시킨 발효유제품의 조성과 발효유제품을 섭취한 가축에 증체율을 향상시키고, 대장균과 살모넬라 등 장내 유해미생물의 증식을 억제시켜 세균성 설사 질병을 예방하고 가축의 폐사를 억제시키는 효과가 있는 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20 미생물에 관한 것이다.

락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스, 젖산균, 알파갈락토시데이즈, 효소

Description

내산성, 내담즙성의 적응력이 강하고, 병원성 미생물의 생육을 억제하고, 알파-갈락토시데이지 효소를 생산하는 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20(KCTC10942BP) 미생물{Lactobacillus salivarius sp. salivarius DF20 having been Acid-tolerant, Bile-tolerant, Antibacterial activity, and possesed Alpha-galactosidase }

도 1은 본 발명에 따른 젖산균주[락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20 (KCTC10942BP)]의 선발과정과 신균주를 이용한 발효물의 효과를 나타내는 절차도

도 2는 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 분자계통학적 유사성 분석결과

도 3은 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20을 함유한 생균제를 이유자돈에 급여후 증체량

도 4는 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20을 함유한 생균제를 이유자돈에 급여후 돈분중 암모니아 가스의 농도측정 결과

도 5는 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20을 함유한 생균제의 냉장(7℃) 보존중 생균수의 변화

본 발명은 두과류의 탄수화물중 난소화성 당류에 대한 뛰어난 분해능을 가지는 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20(Lactobacillus salivarius sp. salivarius DF20)과 이 젖산균을 이용하여 제조한 발효유와 발효두유 등 혼합발효유의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사람의 분변으로부터 분리된 신규 미생물로서 내산성, 내담즙성, 내산소성, 항생제 저항성을 지니면서 동시에 유해미생물의 생육을 효과적으로 억제할 수 있는 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20과 동 미생물은 알파갈락토시데이즈 효소를 생성하는 젖산균으로서 두과류의 난소화성 탄수화물인 스타치로즈 (starchyrose), 라피노즈(raffinose), 멜로비오즈(melobiose) 등의 다당류를 소화 흡수되기 쉬운 글르코스(glucose) 단당류로 분해하고, 발효 중 다른 생성물로서 유산, 초산, 구연산 등과 같은 유기산을 생성하여 유해미생물을 억제하고 정상적인 장내균총을 유지하게 하는 등 상기 젖산균을 대두와 같은 두과류 곡물의 발효에 이용한 두유발효유와 생균활성제 등의 사료첨가제로서 산업적인 용도에 관한 것이다.

현재 가축용 생균제로서의 역할은 강한 산 생성력에 의한 유해세균의 억제력을 중심으로 락토바실러스 엑시도필러스, 락토바실러스 퍼멘튬, 락토바실러스 블가리커스, 락토바실러스 카제이, 비피더스 박테리움 등의 젖산균이 주종을 이루고 있으며, 그 밖의 미생물로는 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 오리제, 아스퍼질 러스 타마리, 피키아 릴리에몬디, 칸디다 자반니카, 바실러스 스테아로써모필스, 코르티시움 롤프시, 엔테로코커스 페시움, 엔테로코커스 페칼리스, 콜로스트리디움 등이 보고되고 있으며 가축의 생균제로 사용되고 있다.

젖산균은 사람과 동물의 장내에 정상적으로 상재된 균총으로서 장내 산성화에 의한 유해세균의 억제와 함께 기능성 향상, 그리고 면역력 향상에 의한 각종 내분비 및 소화기관의 항암효과가 입증되고 있다. 이러한 젖산균의 프로바이오틱 특성으로 사람에게는 건강식품으로 가축에게는 생산성 향상 및 건강한 육축으로서 질 좋은 신선육을 생산하고, 또한 현재 반려동물로서 각광을 받고 있는 애완동물에게는 소화기관의 건강과 질병예방 등의 사료 첨가제로서 큰 영향을 미치는 것으로 판명되었다.

그러나, 아직 국내 뿐만아니라 국외에서도 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 젖산균에 대한 기능과 특성에 관련하여 명확하게 규명되지 않은 상태이며 그 특성과 이용성은 상당히 미진한 실정이다.

그리고 상기 미생물은 가축 사료의 주요 단백질원으로서 첨가되고 있는 두과류 사료에 이용성이 있으며, 특히 두과류의 난소화성 탄수화물에 대한 소화력 저하는 가축뿐만 아니라 사람에게도 문제되는 점으로서 이러한 두과류 사료의 문제점을 해결하기 위하여 바실러스 등의 균체를 미생물제제로서 첨가하지만 그 효용은 극히 저조한 실정이다. 그리고 이러한 미생물의 급여는 건조된 미생물로서 사료와 함께 장내 도착하여 미생물이 원래의 활력을 갖기 위해서는 상당한 영양분과 시간이 필요하나, 소화기관에서 분비하는 위산이나 담즙산 등의 영향에 의해 제대로 활력을 찾기도 전에 사멸하는 등 장내 미생물의 생존력은 극히 저하되고 미생물이 제 기능을 발휘하기 어려운 실정이다.

따라서, 본 발명은 사료에 많이 첨가되어 사용하고 있는 두과류에는 난소화성 탄수화물인 다당류를 단당류로 분해하여 사료의 소화이용률을 높이고, 두유와 우유 혼합발효유에 젖산균이 생성한 유기산에 의해 장내 유해미생물의 생장을 억제하는 혼합발효유를 제조하는 방법에 관한 것이다.

사람 및 동물의 장내 미생물총은 약 1천억 이상의 미생물총이 존재하며 상재하고 있다. 사람을 비롯한 단위동물의 정상적인 장내 정상균총에는 유익한 미생물 뿐만 아니라 유해한 미생물균총이 상재하고 있다. 이러한 장내 미생물의 정상균총에서 유익한 미생물 중에는 젖산균이 있어 장내 정장효과와 함께 여러 가지 프로바이오틱 기능이 있다. 이러한 유익한 미생물로 제조된 생균제가 장내 정상균총으로 상재하기 위해서는 우선 위내 pH2-4정도의 강산에 잘 생존능력이 있어야 하며, 십이지장의 담즙산에도 강한 생존능력을 가져야 소장과 대장에서 정상균총으로 상재하면서 단위동물의 장내 건강을 유지할 수 있다.

기존의 돼지사료는 성장에 필요한 영양과 질병예방을 위한 항생제 첨가를 위주로 개발되어왔다. 콩과 우유를 혼합하여 젖산균을 첨가하고 발효시킨 사료는 국내외에 아직까지 제공되어 사용된 적이 없으며, 상기 두유발효유를 돼지에 급여시 두과류에 존재하고 있는 대다수의 탄수화물은 난소화성 다당류로서 젖산균에 의해 단당류로 모두 분해되므로 돼지에 급여시 모두 흡수하여 에너지원으로 사용하게 되고, 흡수 이용된 에너지원에 의해 체중증가가 보다 빨리 이룰 수 있다. 뿐만 아니 라 두유 및 우유 발효시 젖산균에 의해 생성된 유기산은 기존의 사료에 항생제를 첨가하여 유해미생물의 생장을 억제하므로 설사 등의 질병을 예방하였지만, 항생제의 과량 또는 남용함으로써 체내 잔류농도와 유해미생물의 항생제에 대한 내성세균의 출현되어 실제 질병에 걸렸을 때 항생제에 의한 치료효과가 없어진다. 따라서 두유발효시 젖산균에 의해 생성된 유기산은 유해세균의 억제력이 항생제와 비슷한 효과를 보이고 있으며, 두유발효유에는 유기산이 약 2% 정도로 유산, 초산 등이 주종으로서 유기산에 의해 약 pH4.0 이하의 산성 환경을 제공함으로써 유해미생물의 생장을 억제하는 효과가 있어 장내 유해세균이 생장할 수 없도록 한다.

본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로 그 주된 목적은 난소화성 탄수화물(스타치로즈, 라피노즈 등)을 효과적으로 분해할 수 있고, 인체에도 안전하여 식품 및 사료제조 분야에도 매우 유용한 균주를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 젖산 균주를 이용하여 우유와 두과류를 발효하여 난소화성 탄수화물을 분해하고 그 배양산물(단당류 및 각종 유기산)을 사료첨가제로서 제공함에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 두과류에 발효하여 난소화성 탄수 화물에 대한 발효 성능이 우수한 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다. 본 발명에 따른 균주는 두과류의 난소화성 탄수화물에 대한 분해능이 우수한 알파갈락토시다제를 생산하는 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20으로서, 특히 동균주가 생산하는 효소는 스타치로즈(starchyrose), 라피노즈(raffinose), 멜로비오즈(melobiose)를 분해할 수 있어 식품가공비용의 절약과 두과류를 이용한 생균제 사료로서 이용하게 한다.

상기 균주는 도 1에 도시된 절차에서와 같이, 사람의 분변으로부터 LBS와 MRS 아가 배지를 이용하여 젖산 균주를 순수 분리하고, 내산성과 내담즙성 배지 및 호기성 상태에서도 생육이 양호한 젖산 균주를 선발한 다음, 선발된 균주의 당이용성 시험과 균체의 지방산조성 및 rDNA를 분석하여 균주를 동정한 후 콜레스테롤 저하 효과와 항생제 내성이 있는 균주를 선발하여 이 중에서 알파갈락토시다제 활성이 있는 젖산균주를 선발하여 두유에 발효시켜 발효능력이 우수한 균체를 선발한 것이다.

본 발명에 따른 균주는 그람양성의 간균으로서 전형적인 젖산균의 특성을 가지며, 산성의 조건에서도 생육이 가능하며 담즙산에서도 생육이 활발한 내담즙성 젖산균으로 장내 흡착성이 우수하여 장내에 오랫동안 상재할 수 있으며, 발효시 혐기 및 호기 발효에도 생장이 활발하여 발효를 용이하게 한다. 또한 상기 균주의 발효에 의해 생산되는 유기산(젖산, 구연산, 초산 등)은 장내 유해균의 생장을 억제 하고 장의 연동운동을 활발히 함으로써 소화촉진 및 대사작용을 원활하게 해 준다. 또한 상기 균주는 사람에 있어서 장내 유리되는 콜레스테롤의 흡수를 줄여 체내의 과도한 콜레스테롤에 의한 동맥경화 등의 순환기 장애 질병을 예방하는데 좋은 효과가 있다. 뿐만 아니라, 상기 젖산균은 다양한 항생제에 내성이 있어 장내에 투여되는 항생제에 의한 장내균총의 비정상적인 생육을 예방할 수 있다. 즉, 상기 균주의 생육은 다양한 항생제에 대한 생육효과가 높아 항생제 투여에 의한 치료 후에도 장내에 잘 생육할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 젖산 균주는 대전광역시 유성구 어은동 52번지 소재 생명공학연구원에 2006년 4월 27일자로 KCTC10942BP로서 기탁 되어졌다. 상기 균주는 두과류의 탄수화물 중 90%이상 함유하는 스타치로즈, 라피노오즈, 메로비오즈와 같은 난소화성 탄수화물의 분해력이 95% 이상으로 매우 우수하여 단위동물에 많이 사용되는 두과류에 대한 소화장애를 효과적으로 대응하여 활용할 수 있다.

상기 균주를 이용하여 대두유와 우유를 혼합하여 살균하고 냉각하여 상기균주를 첨가하고 발효한 두유 혼합발효유를 가축의 보조사료로서 급여시 가장 활력이 좋은 젖산균의 형태로 가축의 장내에 상재할 수 있으며, 두유 혼합발효유의 유기산에 의한 가축 장내 유해세균의 억제효과가 있으므로 유해세균의 번식을 억제하여 설사 예방과 각종 질병으로부터 예방할 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20은 발효 부산물로서 유산을 주요 유기산으로서 생산하는 젖산균이며 기존의 우유를 이용한 유제품에 국한되어 사용되어 왔던 젖산균으로서의 효과와 함께 두과류 중의 난소화성 탄수화물인 스타치로즈, 라피노즈, 멜로비오즈 등을 단당류인 글르코스로 분해하여 사람과 가축의 에너지원으로 쉽게 흡수 이용할 수 있는 젖산균주를 제공함에 있다.

따라서 미생물의 활력이 최대로 유지된 상태에서 사람 및 가축에 급여되면, 장내 분비물로부터 내성을 가지고 생존하므로서 젖산균의 프로바이오틱 특성을 발휘하게 된다. 상기 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 젖산균을 사료에 다량 포함되어 있는 두과류와 우유를 이용하여 발효시킨 후 발효산물로서 유기산과 가장 활력이 왕성한 생균제로서 가축의 보조사료로서 급여함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 콩을 이용한 두유에 우유를 첨가하고 젖산균을 접종하여 발효시켜 제조한 혼합발효 두유의 제조에 관한 방법을 제공한다.

<실시 예 1> 유용 젖산균주의 분리 및 생리적 특성

사람의 분변으로부터 LBS 아가(BBL사, 미국)와 MRS 아가(Difco사, 미국)를 사용하여 순수분리하였고, pH 4.0, pH5.0 및 pH 7.0으로 조정한 내산성 배지내에서 생육이 활발한 젖산균을 1차 유용 젖산균주를 표 1과 같이 시험하여 분리하였다. 2단계로 혐기성과 호기성 상태에서 배양하여 호기성 상태에서도 잘 자라는 유용 젖산균주를 표 2와 같이 시험하여 분리하였다. 3단계 유용 젖산균의 분리조건은 장내 담즘산에서도 잘 생장할 수 있는 유용 젖산균주를 분리하기 위하여 0.3%와 1.0%의 담즙산이 함유된 배지내에서 생육이 활발한 유용 젖산균주를 표 3과 같이 선발하였다. 선발된 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20은 표 1, 2, 3에서와 같이 다른 분리 젖산균주에 비하여 가장 뛰어난 생육효과를 나타내었다. 분리된 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 생리적 특성은 표 4에서와 같이 그람양성의 간균으로서 전형적인 젖산균의 특성을 나타내었다.

분리균주	pH 4			pH 5			pH 7
분리균주	8 h	16 h	24 h	8 h	16 h	24 h	8 h	16 h	24 h
락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20	0.156	1.123	1.362	0.980	1.589	1.727	1.348	1.567	1.649
비교 1*	0.026	0.048	0.290	0.650	0.916	1.020	1.294	1.354	1.445
비교 2	0.030	0.158	0.230	0.645	0.906	0.838	0.264	1.233	1.233
비교 3	0.053	0.080	0.122	0.659	0.960	0.872	0.657	1.195	1.278
비교 4	0.047	0.085	0.120	0.551	0.847	0.882	0.114	1.103	1.189
비교 5	0.055	0.080	0.122	0.379	0.660	0.624	0.260	1.284	1.362
비교 6	0.015	0.445	0.464	0.320	0.998	1.142	0.028	1.303	1.379
비교 7	0.019	0.084	0.110	0.701	1.408	1.420	0.379	1.505	1.558
비교 8	0.035	0.048	0.294	0.594	0.836	1.208	1.120	1.252	1.345
비교 9	0.039	0.096	0.584	0.580	0.889	1.327	0.319	1.342	1.398
비교 10	0.032	0.069	0.282	0.802	0.972	1.188	0.933	1.261	1.386

* 비교1 : 락토바실러스 엑시도필로스, 비교2 : 락토바실러스 엑시도필로스, 비교3 : 락토바실러스 람노스, 비교4 : 락토바실러스 람노스, 비교5 : 락토바실러스 람노스, 비교6 : 락토바실러스 락티스, 비교7 : 락토바실러스 락티스, 비교8 : 락타바실러스 카제이, 비교9 : 락타바실러스 카제이, 비교10 : 락토바실러스 브레비스 (이하 동일함).

분리균주	호기성 상태에서의 생장능력(%)
락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20	89
비교 1	48
비교 2	54
비교 3	68
비교 4	78
비교 5	94
비교 6	58
비교 7	78
비교 8	70
비교 9	53
비교 10	75

분리균주	담즙산 0 %			담즙산 0.3 %			담즙산 1.0 %
분리균주	8 h	16 h	24 h	8 h	16 h	24 h	8 h	16 h	24 h
락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20	0.556	1.472	1.757	0.359	2.339	2.481	0.147	0.524	2.485
비교 1	0.382	1.205	1.239	0.382	2.301	2.459	0.052	0.208	0.268
비교 2	0.352	1.209	1.358	0.352	2.256	2.310	0.062	0.080	0.133
비교 3	0.107	1.243	1.444	0.107	2.234	2.343	0.130	0.304	1.220
비교 4	0.237	1.353	1.472	0.237	2.156	2.245	0.082	0.146	0.914
비교 5	0.300	1.332	1.392	0.300	0.554	1.414	0.108	0.170	2.384
비교 6	0.264	1.233	1.233	0.264	0.643	2.049	0.065	0.074	1.502
비교 7	0.557	1.195	1.278	0.657	1.986	2.016	0.097	0.338	1.687
비교 8	0.114	1.103	1.189	0.114	2.340	2.402	0.050	0.899	2.297
비교 9	0.260	1.284	1.362	0.260	2.066	2.130	0.066	0.079	0.353
비교 10	0.028	1.303	1.379	0.028	0.277	1.321	0.117	0.070	1.235

구분	락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20
카탈라아제 생성능력	음성
세포의 그람염색성	양성
운동성	음성
형태	간균
가스 발생	음성
생육온도	30∼43℃

<실시 예 2> 분리된 젖산균주의 동정

분리하고 선발된 유용 젖산균주를 동정하기 위하여 첫 번째로 젖산균의 세포질내에 함유하고 있는 세포지방산을 분리하여 MIDI 시스템(미국)을 사용하여 검사한 결과 표 5와 같이 세포질의 각 세포지방산 함량이 나타났으며, 포화지방산 16과 18, 그리고 19를 소유한 전형적인 젖산균의 세포지방산으로 나타났다.

두 번째 분리된 유용 젖산균 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 탄수화물 이용능력을 API CHL50 킷트를 사용하여 표 6과 같이 검사하였다. 그 결과 갈락토스, 프럭토스, 람노스, 락토스 등의 탄수화물을 분해하는 전형적인 락토바실러스 젖산균의 생리적 특성을 나타내었다.

세 번째 분리된 유용 젖산균의 DNA 염기서열에 의한 분자계통학적 동정을 실시하였다. 프라이머는 5‘-GCGGCGTGCTTAACACATGCA-3', 5'-GGCCTTGTACACACCGCCCG-3'을 사용하여 PCR 기계를 사용하여 16S rDNA를 증폭하였다. 증폭된 16S rDNA는 PCR 산물 정제키트(Qiagen사)를 사용하여 정제한 후 염기서열분석에 사용하였다. 염기서열 결정은 ABI 377 DNA sequencer applied biosystems (Perkin-Elmer 사)을 사용하였으며 염기서열 분석은 CLUSTAL W 및 PHYLIP 프로그램을 사용하여 분자계통학적으로 동정 하였다.

본 신균주 젖산균은 rDNA 염기서열을 검사한 결과 서열번호 1과 같이 약 1,498bp의 염기서열을 조사하였으며 분자계통학적 염기서열의 유사성을 분석한 결과 도 2 및 표 7과 같다.

세포지방산 구성	세포지방산 함량(%)
14:0 FAME	4.88
14:1 CIS 7 DMA	-
15:0 FAME	0.77
16:1 CIS 9 FAME	5.34
16:0 FAME	16.81
16:0 DMA	-
17:0 FAME	0.84
16:0 2OH FAME	1.06
18:1 CIS 9 FAME	25.98
18:1 CIS 13 FAME	1.59
18:0 FAME	7.39
22:0 NHC	4.97
19 CYC 9,10/:1 FAME	21.22
20:0 FAME	-
17:0 ANTEISO FAME	-
17:0 CYC DMA	-
18:1 CIS 9 FAME	-
12:0 FAME	-
9:00 FAME	-
UN 18. 199 18:Oa DMA	-
19 CYC 11,12/:1FAME	-

탄수화물 종류	발효능력
글리세롤	음성(-)
에리트리톨	음성(-)
D-아라비노즈	음성(-)
L-아라비노즈	양성(+)
리보즈	양성(+)
D-자일로즈	음성(-)
L-자일로즈	음성(-)
아도니톨	음성(-)
베타 메틸-자일로사이드	음성(-)
갈락토오즈	양성(+)
D-글루코오즈	양성(+)
D-프락토오즈	양성(+)
D-만노오즈	양성(+)
L-솔보오즈	양성(+)
람노오즈	양성(+)
듈시톨	양성(+)
이노시톨	음성(-)
만니톨	양성(+)
솔비톨	양성(+)
알파 메틸-D-만노오사이드	음성(-)
알파 메틸-D-글루코사이드	음성(-)
N 아세틸 글루코사민	양성(+)
아미그달린	양성(+)
알부틴	양성(+)
에스클린	음성(-)
살리신	양성(+)
셀로바이오즈	양성(+)
말토오즈	양성(+)
락토오즈	양성(+)
멜리비노오즈	양성(+)
슈크로오즈	양성(+)
트레할로오즈	양성(+)
이눌린	음성(-)
멜레지토오즈	양성(+)
D-라핀노오즈	양성(+)
아미돈	의양성(±)
글리코젠	음성(-)
자일리톨	음성(-)
베타 젠티오바이오즈	양성(+)
D-튜란노오즈	양성(+)
D-라이소즈	양성(+)
D-타가토오즈	양성(+)
D-퓨코오즈	음성(-)
L-퓨코오즈	음성(-)
D-아라비톨	양성(+)
L-아라비톨	음성(-)
글루코네이트	양성(+)
2 케토-글루코네이트	음성(-)
5 케토-글루코네이트	음성(-)

분리 균주		표준균주와 유사성 (%)
분리 균주		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1	락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20
2	락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 ATCC 11741^T	99.7
3	락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리신니어스 DSM 20554^T	99.7	99.5
4	락토바실러스 아비리어스 DSM 20655^T	95.0	94.9	95.5
5	락토바실러스 아길리스 DSM 20509^T	94.4	94.9	94.8	94.2
6	락토바실러스 애니말리스 DSM 20602^T	92.7	93.6	93.7	93.3	94.8
7	락토바실러스 힐가디 DSM 20176^T	90.5	91.2	91.4	91.3	91.8	91.7
8	락토바실러스 플라타륨 JCM 1149^T	89.6	90.8	90.4	89.9	92.2	91.4	93.2
9	락토바실러스 카제이 JCM 1134^T	90.9	91.7	91.6	91.3	91.6	91.3	93.3	91.9
10	락토바실러스 비퍼멘탄스 DSM 20003^T	88.8	89.7	90.2	89.9	90.6	90.1	92.1	92.2	91.5
11	락토바실러스 사케이 DSM 20017^T	90.1	91.4	91.2	90.8	90.7	91.8	92.5	93.3	92.7	91.8
12	락토바실러스 루테리 DSM 20016^T	89.0	89.9	89.4	90.1	90.0	90.2	91.7	90.9	91.7	90.6	91.3

<실시 예 3> 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 유해미생물 억제능력

분리 동정된 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 유해미생물의 억제능력을 조사하기 위하여 8mm 페이퍼 디스크를 사용하여 각 유해 미생물이 도포된 LB 아가 및 SPC 아가에 부착하여 37℃에서 48시간 배양하고, 억제환의 크기를 측정하는 방법으로 유해미생물의 억제능력을 비교 조사하였다.

분리 동정된 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 유해미생물(대장균군과 살로넬라균속)에 대한 억제작용을 시험한 결과 표 8과 같은 결과를 나타내어 시험한 페이퍼 디스크가 8mm 인것에 비하여 2배에서 3배의 억제환을 형성함으로써 식중독을 유발하는 대장균군과 살모넬라균속에 대하여 억제하는 능력이 탁월한 것으로 나타났다.

유해미생물	락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20	비교1	비교2	비교3	비교4
대장균(E. coli ) KCTC1039	23	18	19	20	19
대장균(E. coli ) KCTC1021	19	16	15	16	15
대장균(E. coli ) KCTC0115	14	12	14	14	13
살모넬라 티피머리움 M-15	25	22	22	22	23
살모넬라 티피머리움 KCCM40253	23	20	21	21	22
살모넬라 엔터리디스 KCCM3313	22	21	20	21	21

* 억제환의 지름(단위: mm)

<실시 예 4> 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20 DF20의 항생제 내성능력 측정

분리 동정된 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 항생제 내성능력을 조사하기 위하여 각 농도별로 함유된 항생제 바이오 디스크(바이오메르쯔사, 프랑스)를 젖산균이 도포된 MRS 아가상에 부착하여 37℃에서 48시간 배양하고 억제환의 크기를 측정하는 방법으로 항생제 내성능력을 비교 조사하였다.

분리된 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20 젖산균의 항생제 내성능력은 표 9와 같이 일반 다른 젖산균보다 유사하거나 높은 항생제 생육능력을 나타내었다.

항생제	락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20	비교1	비교2	비교3	비교4
Amikacin (30㎍)	12	11	10	11	11
ampicillin (10㎍)	32	31	28	30	30
Cephaiexin (30㎍)	19	17	15	18	17
Colistin (10㎍)	9	9	9	9	9
Ciprofloxacine (5㎍)	9	9	9	9	9
Erythromycin (15㎍)	27	25	24	25	26
Gentamycin (10㎍)	14	12	11	12	11
Neomycin (30㎍)	14	13	11	13	12
Nofloxacin (10㎍)	9	9	9	9	9
Penicillin G (10 units)	33	31	30	32	31
Spiramycin (100㎍)	22	20	19	21	20
Tetracycline (30㎍)	24	22	19	22	21

* 억제환의 지름(단위: mm)

<실시 예 5> 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 효소발현 특성

분리된 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 효소발현 정도를 측정하여 API-ZYM(bioMerieux SA사, 프랑스)을 사용하여 19가지의 효소발현 능력을 조사하였다. MRS broth에서 배양하여 활력이 좋은 젖산균주를 원심분리하여 멸균수로 3회 세척한 후 희석하여 API-ZYM의 각 효소판에 2방울 떨어뜨려 37℃에서 4시간 배양하고 각각의 시약을 떨어뜨려 변색의 정도에 따라서 각 효소의 발현능력을 판별하였다.

분리된 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 효소발현 능력을 실험한 결과는 표 10과 같이 α-glucosidase와 β-glucosidase의 효소를 가장 활발히 발현하는 것으로 조사되었다. 따라서 두유의 난소화성 탄수화물인 스타치로스와 라핀노스의 분해능력이 클 수밖에 없으며, 표 11에서 각 난소화성 탄수화물의 분해능력을 고속액체크로마토그래프를 이용하여 검증한 결과로서 락토즈의 분해는 다른 젖산균과 유사하였고 스타치로즈, 라피노즈, 멜로비오즈는 다른 젖산균이 약 5 - 20%의 분해율을 보이었지만 신균주의 경우 모두 97% 이상의 높은 분해율로 나타났다. 이와 같은 현상은 신균주가 우유중의 주요 탄수화물인 락토스를 분해하는 β-glucosidase 효소를 상당히 많이 분비할 뿐만아니라, 대부분의 다른 젖산균은 두과류 작물에 풍부한 탄수화물(스타치로즈, 라피노즈, 멜로비오즈)을 분해하는 α-glucosidase 효소의 생산이 저조한데 비하여 신균주는 최대의 효소를 생산하기 때문에 두유에서 높은 발효 효과를 나타내는 유용한 젖산균주라 하겠다.

구성효소	효소활성
Alkaline phosphatase	보통
Esterase(C4)	아주많음
Esterase Lipase(C8)	많음
Lipase(C14)	보통
Leucine arulamidase	아주많음
Valine arylamidase	아주많음
Crystine arylamidase	보통
Trypsin	없음
α-chymotrypsin	보통
Acid phospatase	아주많음
Naphtol-AS-B1-phosphohy drolase	아주많음
α-galactosidase	아주많음
β-galactosidase	아주많음
β-glucuronidase	없음
α-glucosidase	아주많음
β-glucosidase	조금
N-acetyl-β-glucosaminidase	없음
α-mannosidase	없음
α-fucosidase	없음

균 주	탄수화물 분해율 (%)
균 주	락토즈	스타치로즈	라피노즈	멜로비오즈
락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20	26.53	97.49	98.84	98.79
비교 1	24.28	15.49	17.92	20.32
비교 2	21.47	5.95	6.92	12.11
비교 3	27.72	12.25	16.32	19.22
비교 4	21.61	22.93	23.94	29.53
비교 5	25.62	11.45	18.32	21.03

<실시 예 6> 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20을 이용한 우유와 두유의 혼합발효유의 돼지 생균제로서의 급여효과

표 12에서와 같이 배합한 우유와 두유 혼합물을 85에서 30분간 살균하고 37℃로 냉각하여 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20을 접종하고 배양하여 pH4.0에서 발효 종료하고 4 ℃로 냉각 보관하면서 자돈의 급여시험에 사용하였다. 자돈은 생후 3주에 이유한 이유자돈 120두를 2주 동안 시험에 사용하였다. 우유와 두유 혼합발효유는 일일 두당 100g씩 급여하여 증체량, 사료섭취량, 돈분중의 암모니아 가스의 농도, 설사 발생 빈도, 유산간균과 대장균의 장내세균총 변화 등을 조사하였다.

시험 자돈의 장내균총의 변화는 분변을 기간별로 채취하여 혐기희석액에 희석하고, 젖산균은 0.1% 탄산칼슘이 함유된 BCP 아가(Eiken사, 일본)에서 37℃에서 48시간 평판배양하고 투명환 및 노란색을 나타내는 집락을 잠정적인 젖산균 집락으로 측정하였으며, 대장균군은 MacConkey 아가(DIFCO사, 미국)에서 평판 배양하여 집락의 형태에 따라 구분하여 EMB 아가(BBL사, 미국)와 Brilliant Green Bile Broth(BBL사, 미국)를 통하여 확정 계수하였다. 일반세균군은 Standard plate agar 아가(Difco사, 미국)에 평판배양법을 배양후 집락수를 측정하였다.

시험 자돈의 암모니아 가스의 농도는 Gastec 검지관을 사용하여 분변 500g씩 투입 후 밀봉 1시간 후의 가스 농도를 측정하였다.

표 13과 도 4의 결과에 의하면 사료요구율은 대조구에 비하여 시험구A는 31% 시험구B는 29% 낮은 수준을 보여 발효유를 섭취한 자돈이 상대적으로 적은 양의 사료를 소비하는 경향이 있음을 나타내었다. 투여한 사료소비량과 얻어진 증체량의 비율을 계산하여 증체율의 개선효과는, 시험구A와 B에서 대조구에 비하여 약 39%가 향상되어 발효유의 첨가 급여가 높은 증체량 효과를 나타내는것을 알 수 있었다.

표 13의 이유자돈의 설사발생율은 대조구에서 17.4%로서 폐사에 이른 자돈은 없었으며, 일반적인 알려진 이유자돈의 설사율이 20-47%인데 비하여 낮은 수준이다. 발효유를 첨가한 시험구A와 시험구B는 설사발생율이 전혀 없어 생균제의 설사유발 미생물의 억제효과가 임상실험에서도 효과가 월등하게 나타나 신균주를 이용한 발효유는 설사의 방지효과가 있음을 알 수 있다.

발효유 생균제를 이유자돈에 급여후 돈분중 암모니아 가스의 농도측정 결과는 도 4의 결과와 같이 대조구에 비하여 발효유를 급여한 자돈의 분변에서의 암모니아가스의 농도가 5배 이상의 감소효과가 있어 첨가제 급여자돈에서 사료의 소화능력이 월등히 높은 것을 알 수 있으며, 돈사내 작업환경의 개선에도 좋은 효과를 보이고 있다.

이유자돈에게 발효유 급여 5일후의 장내 균총의 변화를 보기 위하여 분변을 채취하여 시험한 결과 표 14와 같이 나타났다. 발효유를 급여하지 않은 대조구에서는 대장균군과 일반세균이 시험구에 비하여 각각 2.29배와 3.79배의 균수가 존재하는 반면, 젖산균의 수는 발효유를 급여한 시험구에서 대조구에 비하여 1.70배의 균수가 존재함으로써 장내균총중 유익균인 젖산균의 분포가 월등히 많이 존재하고 있었다. 따라서 발효유를 급여시 대장균군과 일반세균의 분포가 적게 나타나므로 혼합발효유의 급여로 젖산균에 의한 장내 정장효과가 크게 나타나는 것을 알수 있다.

원재료	시험구 A(%)	시험구 B(%)
대두유	61	31
환원전지우유	31	61
분말포도당	8	8

	대조구	시험구A	시험구B
시험두수	40	40	40
개시체중(kg)	7.34	7.03	7.15
종료체중(kg)	10.07	10.83	10.95
일당증체량(g/day)	195.12	271.79	271.43
사료섭취량(g/day)	401.81	385.77	397.77
사료요구율	2.06	1.42	1.46
사료요구율 개선효과(%)	100	145.1	140.7
증체율 개선효과(%)	100	139.3	139.1
설사 발생율(%)	17.4	0	0

	대조구(평균±표준편차)	시험구(평균±표준편차)	비 고
유산균	8.39^a±0.04	8.62^b±0.07	대조구 < 시험구 (1.70배)
대장균	7.08^a±0.04	6.72^b±0.04	대조구 > 시험구 (2.29배)
일반세균	8.50^a±0.24	7.96^b±0.10	대조구 > 시험구 (3.79배)

* 단위 : viable cell count of log / g

^a,b In a row, means followed by a common letter are not significantly different at the 5% level by DMRT.

<실시 예 7> 신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20의 저장성

분리된 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20을 이용하여 우유와 두유를 혼합물에서 발효하여 pH를 4.0까지 배양한 후 5℃, 20℃, 30℃, 40℃에서 30일간 보존하면서 신균주의 생존율을 측정하였다. 분리된 신균주의 보존성은 표 15에서와 같이 20℃에서 보존시에는 7일 이후에 급속히 감소하였고, 30℃와 40℃에서 보존시에는 보존 1일까지 계속 발효가 진행되어 균수가 증가하다가 3일 이후에는 급속히 감소하였다. 그러나 5℃의 냉장보존시에는 도 5의 결과와 같이 20일까지는 생균수가 크게 변동이 일어나지 않으므로 냉장 저장시 최소 20일까지는 생균수의 보존능력이 유지되는 결과를 나타내었다.

보관온도	각 온도별 보관 후 균수(CFU/ml)
보관온도	0 일	1일	3일	7일	10일	20일	30일
5 ℃	5.22×10⁹	5.49×10⁹	4.36×10⁹	2.63×10⁹	9.84×10⁸	3.52×10⁸	4.95×10⁶
20 ℃	6.42×10⁹	5.89×10⁹	4.58×10⁸	3.31×10⁸	7.82×10⁵	6.39×10⁴	3.63×10³
30 ℃	4.87×10⁹	3.38×10¹⁰	4.73×10⁷	6.82×10³	3.74×10²	1.67×10²	2.00×10¹
40 ℃	5.64×10⁹	7.82×10¹⁰	2.35×10⁷	7.93×10²	6.29×10²	5.00×10¹	3.00×10¹

신균주 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20은 내산성, 내담즙성, 내산소성 등의 Probiotic 특성을 가진 젖산균이며, 알파-갈락토시데이지 효소를 다량 생산하여 두유중 소화되기 어려운 고분자 탄수화물을 손쉽게 단당류로 분해하는 희귀한 젖산균이다. 또한 항생물질에도 적응능력이 우수하며, 설사 및 질병을 유발하는 병원성 미생물에 대한 성장억제력도 탁월하게 우수한 신균주를 발명하였다. 신균주는 두유 뿐만아니라 우유에서도 잘 성장하므로 두유와 우유의 혼합하여 배양하는 최적의 발효조성물을 제조하였고, 그 배양물을 돼지의 자돈에 급여하여 증체율이 뛰어나게 향상하였고, 설사가 억제되고, 폐사율이 저하되는 등 자돈의 보조사료(천연생균제)로서 그 특성이 우수하였다.

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Claims

내산성, 내담즙성의 적응력이 강하고, 병원성 미생물의 생육을 억제하고, 알파-갈락토시데이지 효소를 생산하는 락토바실러스 살리바리우스 에스피 살리바리우스 DF20(KCTC10942BP) 미생물
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