CN109810917B - 唾液乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16199。本发明还公开了一种发酵制品及其制备方法，以及如上所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)在制备发酵制品中的应用。相比于现有的菌株，本发明提供的唾液乳杆菌CGMCC No.16199可以快速发酵大豆蛋白，初凝乳时间缩短，制备的发酵豆乳的质构、口感、风味(豆腥味)等得到改善，4℃条件下贮藏27天，依然保持较高的活菌数，具有良好的胃肠道环境耐受性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株唾液乳杆菌及其应用。
背景技术
大豆古代称为“菽”，起源于中国，其营养成分丰富，是一种优质的、 理想的植物性蛋白质资源。大豆蛋白质的氨基酸组成与牛奶蛋白质相近，必 需氨基酸中除蛋氨酸含量略低之外，其余含量均较丰富；并且大豆蛋白是植 物蛋白中唯一接近全价蛋白的粮食作物，又被称作“绿色牛乳”。豆浆是一 种传统的中性大豆蛋白乳，含有丰富的优质蛋白，且氨基酸的比例构成与人 体所需接近，有利于人体吸收。另外，豆浆中还含有大量活性成分，如大豆 磷脂具有清除血管垃圾的作用，被称为血管的“清道夫”，同时可以促进细 胞的生长和发育；大豆异黄酮具有类雌激素的作用，并具有双向调节激素水 平的功能；硒、维生素C、维生素E等具有很强的抗氧化功能，具有一定的 延缓衰老、抗癌作用。
发酵豆乳是利用乳酸菌对豆浆进行发酵产酸，使大豆蛋白发生凝固。发 酵后的产品不仅具有豆浆中的营养成分，还增加了肠道益生菌的数量和维生 素等物质，具有促进肠道蠕动、促进消化、增强免疫力等功能，使得豆乳更 具有营养保健功效。发酵酸豆乳与发酵牛乳相比，不含胆固醇，含有大量多 不饱和脂肪酸，对预防心脏病、糖尿病、心血管疾病、骨质疏松症以及对于 乳糖不耐受人群等起到重要的作用市场开发前景十分广阔。
目前，对于豆乳的大部分研究还是仅限于豆奶粉、液态豆奶等产品，或 者是通过添加牛奶、脱脂乳粉等辅料得到的发酵制品，而对于研究以纯大豆 作为单一发酵原料制作发酵豆乳将是未来研究的一个主要的方向，此外，改 善发酵豆乳质构特性、口感和风味(豆腥味)，改善发酵豆奶贮藏期的稳定 性、缩短凝乳时间以及提高发酵菌剂在胃肠道中的耐受性等方面仍是研究热 点。
发明内容
本发明的目的是为了提高制备发酵豆乳的发酵菌株在胃肠道中的耐受 性，改善发酵豆乳质构特性、口感和风味(豆腥味)、发酵豆奶贮藏期的稳 定性以及缩短凝乳时间，从而提供一株唾液乳杆菌及其在制备发酵豆乳中的 应用。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种唾液乳杆菌 (Lactobacillussalivarius)，所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No. 16199。
第二方面，本发明提供了一种发酵菌剂，该发酵菌剂含有如上所述的唾 液乳杆菌。
第三方面，本发明提供了如上所述的唾液乳杆菌或如上所述的发酵菌剂 在制备发酵豆乳中的应用。
第四方面，本发明提供一种发酵豆乳，所述豆乳含有如上所述的唾液乳 杆菌。
第五方面，本发明提供一种发酵豆乳的制备方法，该方法包括：将如上 所述的唾液乳杆菌或如上所述的发酵菌剂接种至待发酵的豆乳中，并进行发 酵。
本发明可取得如下的有益效果：
(1)本发明提供的唾液乳杆菌CGMCC No.16199(以下简称唾液乳杆 菌M18-6)可以快速发酵大豆蛋白，初凝乳时间为2.5小时，显著短于现有 的其他菌株。
(2)由本发明提供的唾液乳杆菌M18-6制备的发酵豆乳的质构、口感、 风味(豆腥味)等感官评价评分，均显著好于现有的其他菌株。
(3)本发明提供的唾液乳杆菌M18-6在发酵豆乳体系中的稳定性良 好，4℃条件下贮藏27天，依然保持较高的活菌数，高于现有的其他菌株。
(4)本发明提供的唾液乳杆菌M18-6具有良好的胃肠道环境耐受性， 在pH 2.0的环境下处理4h，依然保持108.5CFU/mL的活菌数；在人工胃液 的环境下处理4小时，依然保持108.8CFU/mL的活菌数，在人工胃液的环境 下处理4小时，依然保持109.2CFU/mL的活菌数，显著高于现有的其他菌株。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，于2018年8月6日被 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保 藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16199，简称M18-6。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，其 中，所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16199。
本发明的唾液乳杆菌从广西巴马村天然发酵米粉中分离得到。
本发明提供的唾液乳杆菌经过液体培养能够产生大量唾液乳杆菌的活 菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述唾液乳杆菌增殖即 可，例如可以按照107CFU/mL的接种量将所述唾液乳杆菌的活菌体接种于 乳杆菌培养基中，并且在厌氧或好氧的条件下，在15-38℃的温度下培养8-72 小时后，得到培养液。所述乳杆菌的培养基可以为本领域公知的各种适合乳 杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或《乳酸菌——生物学基础及应用》 (杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版)中所述的乳酸菌(MRS)培养基。
本发明可以进一步分离上述培养液中的唾液乳杆菌的活菌体，所述分离 的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过 离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件， 本发明在此不再赘述。
第二方面，本发明提供了发酵菌剂，该发酵菌剂含有如上所述的唾液乳 杆菌。
根据本发明，该发酵菌剂可以由所述唾液乳杆菌在发酵培养基中进行发 酵培养后制得。所述发酵培养基可以为本领域常规的各种用于发酵乳酸菌， 例如，可以为如上所述的MRS培养基，也可以为在MRS培养基的基础上优 化的各种适合于发酵乳酸菌的培养基。
根据本发明，所述发酵的条件可以为本领域公知的常规的用于乳酸菌发 酵培养的条件，例如，所述发酵培养的温度可以为30-40℃。
根据本发明，所述发酵菌剂的制备方法可以按照本领域常规的方法进行 制备，在本发明的一种实施方式中，可以按以下方法制备得到：培养唾液乳 杆菌CGMCC No.16199至活菌数达到108cfu/mL以上，混合均匀后进行真 空冷冻干燥制得。
第三方面，本发明提供了如上所述的唾液乳杆菌或如上所述的发酵菌剂 在制备发酵豆乳中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种发酵豆乳，所述豆乳含有如上所述的唾 液乳杆菌。
第五方面，本发明提供了一种发酵豆乳的制备方法，该方法包括：将如 上所述的唾液乳杆菌或如上所述的发酵菌剂接种至待发酵的豆乳中，并进行 发酵。
根据本发明，接种至待发酵的豆乳中的唾液乳杆菌为活菌。但本领域技 术人员公知的是，在菌体培养的过程中，其通常也伴随着菌体的死亡，所述 活菌体并不指严格意义上的全部为活菌体。
本发明对接种的唾液乳杆菌的菌体的数量并没有特别的限定，可以根据 不同的用途进行具体的调整。优选的，以每毫升或每克的待发酵的原料为基 准，所述唾液乳杆菌的接种量为106-108CFU。
CFU(Colony-Forming Units，菌落形成单位)指活菌个数。在活菌培养 计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成 的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。
根据本发明，为了进一步提高所述唾液乳杆菌的发酵性能，优选的，所 述豆乳还含有白砂糖，优选的，基于100g的所述豆乳，所述白砂糖的含量 为4-6g。
根据本发明，为了进一步提高最终制备的发酵豆乳的风味和口感，优选 的，该方法还包括发酵结束中，将发酵所得物料在2-6℃的条件下冷藏10-20 小时以进行后熟。
根据本发明，所述发酵的条件可以按照本领域常规的条件进行，例如， 所述发酵的温度可以为30-40℃，其中，所述发酵的时间以能够形成凝块为 基准。采用本发明提供的唾液乳杆菌对豆乳进行发酵能够显著缩短发酵的时 间。
根据本发明，所述待发酵的豆乳可以为豆浆。
以下的制备例、实施例和对比例将对本发明作进一步的说明，但并不因 此限制本发明。
在下述制备例、实施例和对比例中：
实验菌株：本发明的唾液乳杆菌(该菌株于2018年8月6日被保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单 位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.16199)，以下简称菌株 M18-6；
对比的菌株为植物乳杆菌Zhang-ll(CGMCC No.6936， CN201410763406.5)、干酪乳杆菌KL1(CGMCC No.1809)、保加利亚乳 杆菌(
11842D-5)及嗜热链球菌(
BAA-491)。
MRS液体培养基配方：磷酸氢二甲2g，无水乙酸钠5g，酵母浸粉5g， 七水合硫酸镁0.5g，牛肉膏10g，柠檬酸铵2g，葡萄糖20g，胰蛋白胨10g， 硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水1000mL(固体培养基加20g琼脂)， pH6.5，115℃灭菌15min后备用，以上试剂均购自科百奥生物技术公司；
滴定酸度测定方法：10g发酵豆乳，加20mL蒸馏水，2mL0.1体积％酚 酞的酒精溶液，摇匀，用浓度为0.1moL/L的NaOH标准溶液滴定至红色， 30s内不褪色。以100mL样品消耗0.1M NaOH的毫升数为酸度°T。
活菌数的测定方法：取1ml的发酵乳加入9ml 0.85重量％的生理盐水管 中依次进行10倍梯度稀释，选择3个合适的稀释梯度从中取1ml稀释液加 入至90mm培养皿中，倾注加入55℃、15mlMRS固体培养基，轻轻混匀后 静置待凝固后倒置放入37℃恒温培养箱，培养48h后计菌落总数。
制备例
本制备例用于说明菌株的活化
将冻存于-80℃超低温冰箱内的唾液乳杆菌M18-6、植物乳杆菌Zhang-ll、 干酪乳杆菌KL1、保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌甘油管保藏的菌种，按2体 积％的接种量分别接种至MRS液体培养基中，然后在37℃，180r/min条件 下，培养12h，连续活化3代后进行后续试验。
实施例
本实施例用于说明本发明提供的唾液乳杆菌的发酵性能
(1)将黄豆豆浆(市售经过高压均质处理，购自天润丰农业科技发展 (北京)有限公司)与白砂糖按照100:5的重量比进行混合，然后115℃下 灭菌15min，得到豆乳发酵基料。
(2)在超净工作台内分别以107CFU/mL的接种量分别制备例活化的唾 液乳杆菌M18-6、植物乳杆菌Zhang-ll、干酪乳杆菌KL1、保加利亚乳杆菌 及嗜热链球菌接种到上述豆乳发酵基料中，充分振荡混匀后，于恒温培养箱 内37℃下发酵，当豆乳初步凝固后即可判定发酵终点到来，停止发酵，并记 录发酵时间，结果如表1所示。
(3)将发酵结束后的物料迅速降温至4℃，并在4℃下低温冷藏12h， 得到发酵豆乳。
表1不同菌株发酵豆乳的凝乳时间
| 发酵菌株 | 发酵时间(h) |
| 唾液乳杆菌M18-6 | 2.5 |
| 植物乳杆菌Zhang-ll | 3 |
| 干酪乳杆菌KL1 | 5 |
| 保加利亚乳杆菌 | 5 |
| 嗜热链球菌 | 5.5 |
由表1可以看出，本发明提供的唾液乳杆菌CGMCC No.16199可以快 速发酵大豆蛋白，初凝乳时间为2.5小时，显著短于其他菌株。
测试例
(1)发酵豆乳的贮藏稳定性评价
将实施例制备的唾液乳杆菌M18-6、植物乳杆菌Zhang-ll、干酪乳杆菌 KL1发酵豆乳分别在4℃下进行贮藏，检测每隔3天的pH、酸度和活菌数 的变化，连续测定27天，结果见表2-4，其中，表2为pH值变化，表3为 酸度变化，表4为活菌数变化。
表2不同菌株发酵酸豆乳在贮藏期中pH的变化
| 发酵菌株 | 0d | 3d | 6d | 9d | 12d | 15d | 18d | 21d | 24d | 27d |
| 唾液乳杆菌M18-6 | 5.12 | 4.45 | 4.23 | 4.43 | 4.21 | 4.16 | 4.05 | 4.26 | 4.19 | 4.16 |
| 植物乳杆菌Zhang-ll | 5.44 | 4.87 | 4.42 | 4.50 | 4.215 | 3.95 | 4.05 | 3.90 | 3.97 | 3.88 |
| 干酪乳杆菌KL1 | 5.44 | 4.63 | 3.95 | 3.77 | 3.84 | 3.77 | 3.70 | 3.47 | 3.56 | 3.49 |
表3不同菌株发酵酸豆乳在贮藏期中酸度(0T)的变化
表4不同菌株发酵酸豆乳在贮藏期中活菌数(lg CFU/mL)的变化
| 发酵菌株 | 0d | 3d | 6d | 9d | 12d | 15d | 18d | 21d | 24d | 27d |
| 唾液乳杆菌M18-6 | 9.37 | 9.17 | 9.57 | 9.50 | 8.65 | 9.02 | 8.48 | 8.56 | 8.59 | 9.21 |
| 植物乳杆菌Zhang-ll | 8.57 | 9.16 | 9.79 | 9.53 | 9.22 | 9.19 | 8.54 | 8.37 | 8.62 | 8.37 |
| 干酪乳杆菌KL1 | 8.93 | 9.23 | 9.19 | 9.50 | 9.96 | 9.26 | 8.92 | 8.92 | 8.55 | 8.31 |
由表2-4可以看出，本发明提供的唾液乳杆菌M18-6在发酵豆乳体系中 的稳定性(变化较小)良好，4℃条件下贮藏27天，依然保持较高的活菌数， 性能优于其他菌株。
(2)发酵豆乳的感官评价
选择10名经过专业训练的感官评价人员(年龄在20-26岁之间)成立 感官评价小组，并按照如下的表5进行评价，评价结果如表6所示。
表5酸豆奶感官评分标准
表6发酵豆乳的感官评价
| 发酵菌株 | 色泽 | 滋味 | 气味 | 组织状态 |
| 唾液乳杆菌M18-6 | 30 | 60 | 58 | 53 |
| 植物乳杆菌Zhang-ll | 30 | 56 | 55 | 50 |
| 干酪乳杆菌KL1 | 30 | 52 | 50 | 48 |
由表6可以看出，由本发明提供的唾液乳杆菌M18-6制备的发酵豆乳的 质构、口感、豆腥味等性能，相比于其他菌株，得到了显著的改善。
(3)胃肠道环境耐受性
1、菌株耐酸性评价
将活化好的2代菌液(唾液乳杆菌M18-6和植物乳杆菌Zhang-ll)， 4000r/min离心10min，得到的沉淀用生理盐水洗涤两次。再将菌体沉淀重悬 于pH2.0的MRS培养基中，37℃，180r/min的条件下培养4h后，测定活菌 数，结果如表7所示。
2、菌株在模拟胃肠道耐受性评价
将活化好的M18-6菌液，离心(4000r/min，10min)得到的沉淀，重悬于 人工胃液、肠液中，胁迫4h，计算胁迫后菌体的存活率，结果如表7所示。
表7不同菌株在模拟胃肠道条件下4小时后的活菌数
| 发酵菌株 | 耐酸性 | 人工胃液 | 人工肠液 |
| 唾液乳杆菌M18-6(lg CFU/mL) | 8.58 | 8.77 | 9.22 |
| 植物乳杆菌Zhang-ll(lg CFU/mL) | 6.00 | 6.02 | 6.74 |
由表7可以看出，本发明提供的唾液乳杆菌M18-6具有良好的胃肠道环 境耐受性，在pH 2.0的环境下处理4h，依然保持108.5CFU/mL的活菌数； 在人工胃液的环境下处理4小时，依然保持108.8CFU/mL的活菌数，在人工 胃液的环境下处理4小时，依然保持109.2CFU/mL的活菌数，相比于其他菌 株，得到了显著的改善。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (9)
1.一株唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，其特征在于，所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16199。
2.一种发酵菌剂，其特征在于，该发酵菌剂含有权利要求1所述的唾液乳杆菌。
3.权利要求1所述的唾液乳杆菌或权利要求2所述的发酵菌剂在制备发酵豆乳中的应用。
4.一种发酵豆乳，其特征在于，所述豆乳含有权利要求1所述的唾液乳杆菌。
5.一种发酵豆乳的制备方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的唾液乳杆菌或权利要求2所述的发酵菌剂接种至待发酵的豆乳中，并进行发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，以每毫升的豆乳为基准，以所述唾液乳杆菌计的接种量为106-108CFU。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述豆乳还含有白砂糖，基于100g的所述豆乳，所述白砂糖的含量为4-6g。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括：发酵结束中，将发酵所得物料在2-6℃的条件下冷藏10-20小时。
9.根据权利要求5-7中任意一项所述的方法，其中，所述发酵的温度为30-40℃。
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