KR101658655B1

KR101658655B1 - 뱀장어에서 분리된 신규한 락토바실러스플란타륨 균주 및 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스

Info

Publication number: KR101658655B1
Application number: KR1020150093685A
Authority: KR
Inventors: 장승희; 김해중; 박승춘; 이승진; 이중수; 박지용; 김진윤
Original assignee: (주)크린바이오; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2016-09-23

Abstract

본 발명은 뱀장어에서 분리된 신규한 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13 균주 및 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 효소활성, 내산성 및 내담즙성을 갖는 신규한 락토바실러스플란타룸 균주에 관한 것이다.

Description

뱀장어에서 분리된 신규한 락토바실러스플란타륨 균주 및 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스{Novel STRAIN of Lactobacillus plantarum Isolated from Anguilla japonica and Probiotics for Fish Using Thereof}

본 발명은 뱀장어에서 분리된 신규한 락토바실러스플란타륨 균주 및 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 효소활성, 내산성 및 내담즙성을 갖는 신규한 락토바실러스플란타룸 균주에 관한 것이다.

장어는 민물에서 성장하는 육식성 어종으로서, 수온이 낮아지면 진흙 속에서 겨울을 나고 수온이 올라가면 활동을 시작한다. 수컷은 3~4년, 암컷은 4~5년 정도 지나면 8월~10월에 짝짓기를 위해 바다로 간다. 이때 생식기가 발달하고 소화기관이퇴화하면서 굶은 상태에서 산란 장소를 찾아서 필리핀 인근의 깊은 바다에서 700m에서 12,000 만개의 알을 낳고 죽는다. 알은 부하하여 렙토세팔루스의 버들잎 모양의 유생기를 거쳐 실뱀장어로 변태를 한다. 이 실뱀장어는 강으로 거슬러 올라오는 길목에서 채취하여 양식을 실시한다. 이처럼 뱀장어는 환경적으로 극한 상황에서 생존하는 어종으로 장내에 있는 장관 미생물총 또한 견고한 항상성을 유지한다.

생균제(Probiotics)는 여러 종류의 정상 장내 세균총에서 병원성균에 대해 증식을 억제하는 항균력이 있는 것으로 알려져 있고 장내 세균총의 균형을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다(Fuller, R. 1989. Probiotics in man and animal. J. Appl. Bacteriol., 66, 365-378, Shahani, K. M. and A. D. Ayebo. 1980. Role of dietary lactobacilli in gastrointestinal microecology. Am. J. Clin . Nutr. 33: 2448-2457). 그러나 어류에서 사용되고 있는 생균제는 사람과 가축에 대한 실험보고 내용이 대부분을 차지하고 있고 개발된 프로바이오틱스들도 사람과 가축에 적용되는 제품들이다(Tournut, J. 1989. Applications of probiotics to animal husbundary.Rev. Sci . Tech. Off. Int . Epiz. 8: 551-566).

해수 양식어는 어종이 다양하고 바닷물이란 독특한 환경에서 양식이 되고 있다. 특히 뱀장어 및 양식어류에 사용하기 위한 생균제는 높은 염 농도에도 견딜 수 있는 생균제가 필수적이다. 항생제의 잔류가 심각한 어류에서 다양한 기능의 생균제가 개발이 되어 사용이 되어야 한다. 생균제로 사용되는 유산균은 그람양성간균, 비운동성, 비포자성, 및 카탈라제(Catalase) 음성인 세균으로서 자연계에 널리 분포하고 있을 뿐만 아니라 동물의 장이나 발효식품 등에서도 쉽게 발견된다(Ringo, E. and F. J. Gatesoupe. 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture. 160: 177-203).

유산균의 역할은 장내에서 항균활성을 보이는 것 이외에 장내균총의 균형을 유지시켜 주는 역할을 할 경우 건강한 숙주의 보호가 이루어진다. 특히 유산균의 항균활성 인자는 유기산과 과산화수소 및 박테리오신(bacteriocin) 등에 의한다(Piard, J. C. and M. Desmazeaud. 1992. Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria. 2. Bacteriocins and other antibacterial substances. Lait. 72: 113-142). 또한 유산균의 특징 중 하나는 장내 상피세포에 부착능이 뛰어나 병원성 미생물과 경쟁에서 우위를 점할 수 있으며 특히 병원균의 감염과 성장을 억제하게 된다. 병원성 세균 Listeria monocytogenes, Escherichia coli , Salmonella typhimurium, Vibrio anguillarum 등에 대한 항균활성이 있다고 보고되어 있고, 이허한균주는 대부분이 그람 음성인데 반하여 그 항균활성은 계통적으로 유사한 그람양성 세균에 대해서만 항균활성을 나타낸다는 한계점이 있다(Suma.K., M. C. Misra, and M. C. Varadaraj. 1998. Plantaricin LP84, a broad spectrum heat-stable bactriocin of L. plantarum NCIM 2084 produced in a simple glucose broth medium. Int. J. Food Microbiol. 40: 17-25).

생균제 제품으로 가기 위해서는 산업적인 문을 통과하여야 한다. 분리된 균주가 지속적인 항균작용과 유익한 효과를 갖기 위해서는 pH가 낮은 위와 담즙 그리고 여러 가지 소화효소 등의 환경조건에서도 생존하여야 한다(Verschuere L., G. Rombaut, P. Sorgeloos, and W. Verstraete. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol .Mole. Biol . Rev. 64: 655-656).

즉, 프로바이오틱스 균주가 갖추어야 할 또 다른 중요한 조건은 내산성 및 내담즙성 그리고 항생제에 대한 적절한 내성을 작고 있어야 한다는 점이다. 뱀장어 장내에서 분리한 생균제의 개발은 이루어진 것이 없다. 특히 어류의 생균제는 안전성이 확보된 균주이어야 한다. 최근에 본 발명자들은 뱀장어에서 Lactobacillus pentosus) PL-11 균주가 분리하여 특허를 획득하였다(특허 제10-1073731호, "장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스펜토서스 PL-11 균주와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스"). 이 균주를 생균제로 사용하기 위하여 개발이 진행되고 있으나, GRAS로 인정되지 않고 있어 아직 생균제로 개발이 되지 않고 있다.

따라서 어류의 다양한 어종을 생각할 때 뱀장어 장에서 극한상태에 생존할 수 있는 유산균 균주를 확보할 필요가 있다.

따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여, 안전성 확보된 신규한 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) 균주를 뱀장어 장내에서 선별하여 생균제로 개발을 하고자 하였다.

본 발명은 넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있으면서, pH내성, 저장성 및 항생제 내성 등을 갖고 있는 프로바이오틱스 균주를 뱀장어 장내에서 선발하여 어류의 세균성 질병 예방 혹은 치료를 함으로서 양식 산업의 효율성을 증대시키고자 한다.

이를 위하여, 본 발명은 극한 상태에서 일생을 보내는 뱀장어의 장내에서 직접 분리된 신기능성의 신규한 유산균주와 이 균주로부터 제조된 프로바이오틱스를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 pH 내성, 저장성 및 항생제 내성을 갖고, 장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수하고, 그람양성균이며, 통성혐기성(Facultative anaerobes)이고, 어류의 프로바이오틱스에 사용가능한, 락토바실러스 플랜타륨(Latobacillus plantarum) PSCPL-13 (수탁번호:KCCM11682P) 균주을 제공한다.

바람직하게는, 상기 균주는 담즙상 1% 조건에서 생존할 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 균주는 뱀장어에서 분리된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타륨(Latobacillus plantarum) PSCPL-13 (수탁번호:KCCM11682P) 균주를 유효성분으로 포함하는 어류용 프로바이오틱스를 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13 균주는 넓은 항균 스펙트럼을 가지면서, 우수한 저장성과 항생제 내성을 갖는다. 또한 본 발명에 따른 락토바실러스플란타륨 균주는 개선된 장내효소활성, 내산성 및 내담즙성을 가지고 있어, 어류용 프로바이오틱스로 사용할 수 있고, 어류의 세균성 질병을 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 이를 어류용 프로바이오틱스(Probiotics)로 이용할 경우 어류의 증체율 및 사료의 효율을 개선시키는 효과가 있다.

도 1은 뱀장어의 장에서 분리된 신규한 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13 균주의 계통수를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13 균주의 전자현미경 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13 균주의 NO 억제 활성을 도시한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 신규한 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13 균주 및 그 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 신균주락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13을 이용한 어류용, 바람직하게는 뱀장어용 프로바이오틱스(Probiotics)를 또 다른 특징이 있다.

본 발명의 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13 균주는 어류 전용유산균으로서, 뱀장어의 장내 환경에서 분리된 유산균이다. 본 발명의 신규한 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13 균주는 기능적으로는 효소활성, 내산성 및 내담즙성 등 우수한 생리활성을 가질 뿐만 아니라, 종-특이성의 문제도 극복한 어류 전용의 유비쿼터스 생균제이다.

본 발명에 따른 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13의 분리 및 동정과정은 다음과 같다.

유산균을 선별하기 위하여 일본산 뱀장어인 Anguilla japonica종으로 선택하였다. 뱀장어의 양식장은 전남 화순에 위치한 뱀장어농장에서 임상적으로 건강한 살아있는 뱀장어를 급속 냉동하여 실험실로 가져와 실험에 사용하였다. 급속 냉동된 뱀장어는 살아있는 상태의 뱀장어와 장내에서 유산균수를 조사하였을 경우 거의 동일한 것으로 알려져 있기 때문에 급속냉동된 뱀장어를 사용하였다.

뱀장어에서 장내 미생물을 배양하기 위한 균주 배양배지로는 혈액한천배지(Blood agar), Trypticase soy agar(TSA), MRS agar(MRS, Difco, Detroit, USA)와 pH 4.2로 조절된 MRS agar를 사용하였고, 호기성 조건인 37℃에서 24시간 이상 배양하였다. 또한 BBL Gaspak plus(Becton Dickinson, USA)을 이용하여 혐기기성인 조건으로 맞춘 다음, 30℃의 인큐베이터에서 24시간 이상 배양하였다.

배지 조성은 아래와 같다.

* 혈액한천 (Blood agar) 배지 조성

판크레아틴으로 소화시킨 카제인(Pancreatic Digest of Casein) 15g; 파파인으로 소화시킨 대두분(Papaic Digest of Soybean Meal) 5g; 염화나트륨(Sodium Chiloride) 5g; 한천(Agar) 15g; 혈액(Blood) 50ml.

* Trypticase soy agar( TSA ) 배지 조성

트립톤(Tryptone) 17g; 소이톤(Soytone: enzmatic digest of soybean meal) 3g; 텍스트로즈(Dextrose) 2.5g; 염화나트륨 5g; K₂HPO₄ 2.5g; 한천 15g.

* MRS 한천 배지 조성

펩톤(Peptone) 10g; 미트 익스트랙트(Meat extract) 8g; 이스트 추출물(Yeast extract) 4g; 글루코오즈(Glucose) 20g; 소듐 아세테이트 3 수화물(Sodium acetate 3H₂O) 5g; 트윈 80(Tween 80) 1g; 디포타슘 하이드로겐 포스페이트(Dipotassium hydrogen phosphate) 2g; 트리암모늄 시트레이트(Triammonium citrate) 2g; 마그네슘 설페이트 7수화물(Magnesium sulfate 7H₂O) 0.2g; 마그네슘 설페이트 4수화물(Magnesium sulfate 4H₂O) 0.05g;한천 10g.

24시간 배양 후에 유산균의 특징인 그람 양성의 간균으로서 16개 균주를 최종 분리하였다.

상기에서 1차 선별된 16개의 유산균 후보균의 특성을 아래 표 1에 나타내었다.

선별균주	그람 염색(Gram`s staining)	세포 형상(Cell morphology)	카탈라제	Acid production	Lactic acid form	Hemolysis	Toxicity in rat
PSCPL01	+	Round	+	+	-	+	+
PSCPL02	+	Rod	+	+	D,L	+	-
PSCPL03	+	Rod	+	-	L	+	-
PSCPL04	+	Round	-	-	L	+	-
PSCPL05	+	Rod	-	-	D	+	-
PSCPL06	+	Round	-	+	D	-	-
PSCPL07	-	Round	+	+	D	+	+
PSCPL08	+	Rod	-	-	D	-	-
PSCPL09	+	Rod	-	-	D	+	-
PSCPL10	+	Rod	-	+	D,L	+	-
PSCPL11	+	Rod	-	+	D,L	-	-
PSCPL12	+	Rod	-	+	D	-	-
PSCPL13	+	Rod	-	+	D,L	-	-
PSCPL14	+	Rod	-	+	D,L	-	-
PSCPL15	-	Round	-	+	L	-	-
PSCPL16	+	Rod	-	+	D,L	-	-
+: 양성; -: 음성

도 1은 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13 균주의 계통수를 나타낸 것이다.

신규 미생물의 동정하기 위하여 형태 및 배양학적 특성을 조사하였다. 최적 생육배지(MRS agar)에서 배양한 균주를 그람염색을 실시한 결과, 그람 양성균으로 밝혀졌다. 이 균주의 배양학적인 특징으로는 통성혐기성(Facultative anaerobes)이며, 첨부한 도 2에 나타낸 바와 같이 막대(rod)형태를 갖고 있고 포자는 형성하지 않는다. 이 균주에 대한 카탈라제(Catalase) 생성 시험 결과는 음성반응이고, 유산(Lactic acid) 및 유기산을 생산하는 특성을 가지고 있는 바, 전형적인 락토바실러스가 갖는 형태 및 배양학적 특성을 가지고 있었다.

신규한 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13 균주의 동정 및 명명을 위하여 형태적, 배양학적 특성을 분석하였다. 본 발명에서 분리된 균주는 락토바실러스에 속하는 미생물이며 분리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써, 균주를 최종적으로 동정하였다. Genomic DNA extraction kit(Qiagen)을 이용하여 분리 균주로부터 genomic DNA를 추출한 다음, eubacterial 16S rDNA 클로닝을 위하여 forward primer(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 reverse primer(5'-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3') 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 50 pmole 프라이머, 50 ng 템플레이트 DNA, 10ⅹTay DNA 중합효소 버퍼(polymerase buffer) 5㎕, Taq DNA 중합효소(Takara, Japen) 1U가 포함된 PCR 혼합물을 95℃에서 5분간 변성시킨 후에 95℃에서 1분, 55∼60℃에서 1분, 72℃에서 1분간 30 cycle을 반복함으로써 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 pSTBlue-1(Novagen, USA)에 클로닝 한 다음, BigDyeTM-terminator sequencing Kit과 ABI PRISM377 sequencer(Perkin-Elmer, USA)로 염기서열을 분석하였다. 분석 결과 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum)와 99.67% 유사한 것으로 판명되었다. 이 균주를 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13로 명명하고, 2015년 05월 03일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하여 국제특허기탁증(KCCM11682P)를 부여 받았다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같은바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 균주의 효소분해능 실험

락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13의 효소분해능 실험은 탄수화물, 단백질, 인을 분해할 수 있는 효소분해능력시험을 하였다. 단백질분해효소(Protease) 활성을 측정하기 위해서 MRS 한천(agar) 배지에 0.5% skim milk을 첨가하여 단백질 분해활성 배지를 만들었다. 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13의 셀룰로오즈(Cellulose) 분해능 여부를 확인하기 위하여 MRS 한천 배지에 0.2% 메틸 셀룰로오즈를 첨가하였다. 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13의α-알밀라아제(α-amylase) 활성을 알기 위해서 MRS 한천 배지에 0.2% 옥스스 전분(corn starch)을 배지에 첨가하였다. 사료에 있는 무기인을 흡수하기하기 위한 파이타아제(phytase) 활성능을 측정하고자 0.5% 파이테이트 칼슘염(Ca-phytate)을 첨가하였다.이렇게 준비된 효소 활성 배지 각각에 대하여 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13을 배지에 도말(streaking)한 후 24시간 배양 한 후 관찰하였다.α-아밀라아제와 셀룰라아제의 활성은 24시간 배양 한 배지에 균체를 제거한 후에 2% 콩고 레드(congo red) 시약을 처리한 후 1M Nacl을 이용하여 세척한 후에 분해효소여부를 관찰하였다. 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13에서 생산되는 효소의 결과 판정은 투명환의 크기를 근거로 효소의 분해능을 확인하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

선별균주	프로테아제	셀룰라아제	α-아밀라아제	파이타아제
PSCPL01	-	+	+	-
PSCPL02	-	-	+	-
PSCPL03	++	-	+	+
PSCPL04	-	-	-	-
PSCPL05	+	-	-	+
PSCPL06	-	-	-	+
PSCPL07	++	-	+	+
PSCPL08	++	-	-	-
PSCPL09	+	-	+	-
PSCPL10	-	-	+	-
PSCPL11	+++	+	+	+
PSCPL12	+	-	+	-
PSCPL13	+++	++	++	+
PSCPL14	+	+	+	-
PSCPL15	+	+	-	+
PSCPL16	+	+	+	+

실시예 2: 항염증 활성 확인

실시예 1에서 모든 효소에 대하여 분해능이 우수한 것으로 확인된 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13를 최종 후보군으로 선정하여 항염증 활성을 확인하였다. 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13의 배양액에서 항염증 활성의 유무 확인은 NO assay 방법(No production quantitative analysis:in vitro 상에서 cell supernatant에 녹아있는 NO의 양을 정량하는 것)을 이용하였다. 한국세포주 은행에서 분양받은 Raw 264.7 세포주에서 생성된 NO의 양은 NO² ^-의 형태로서 존재하고 이것을 그리스(Griess, 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine in H₂O) 시약으로 측정하였다.

실험 과정을 간략하게 설명하면, 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13의 세포 배양액(pH 3.5)+LPS(시료 1), 상기 세포 배양액(pH 7.0)+LPS, LPS(lisopolysaccaride)(시료 3) 100㎕씩과 그리스 시약 100㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분간 반응시킨 후 540nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. NO² ^-의 농도는 질산나트륨(sodium nitrate)을 희석하여 흡광도를 측정하여 표준곡선을 그린 후 그 표준곡선으로 농도를 계산하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3을 보면, pH3.5인 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13와 LPS로 이루어진 시료 1에 가장 우수한 항염증활성을 나타내는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 어류 병원성 미생물에 대한 억제능 실험

락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13균주의어류 병원성 미생물 균주에 대한 억제능의 효과를 확인하기 위하여 실험을 행하였다.

락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13의 최소억제농도 (Minimum inhibition concentration, MIC) 측정은 microtitire plate assay를 통하여 확인하였다. 어류세균인 피검균(Escherichia coli , Edwardsiellatarda , Streptococcus iniae , Vibrio anguillarum, Vibrio alginolyticus , Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi)를 사용하였다. 적정 배양액(BHI, LB broth)과 Lactobacillus pentosus PL11(pH3.5, pH7)상층액(100%, 50%, 25%, 12.5%, 6%, 3%, 1.5%)을 혼합한 후 피검균을 10⁵CFU/ml의 농도로 50㎕ 접종하여 37℃에서 24시간 배양하고 MRS 고체배지에 microtitire plate assay 방법을 통해서 희석한 후 도말하여 37℃ 24시간 배양 후 균수 측정하였다.

피검균에 대한 증식억제작용 혹은 살균작용을 나타내었으며, 이는 다음 표 3에 요약하였다. 즉, 이러한 결과는 이 균주가 생성하는 유산균에 의하여 기인하는 것으로 생균제로 적용시 매우 유용한 결과를 얻을 수 있다는 것을 의미한다.

균주	상층액 농도(%)
균주	100	50	25	12.5	6.2	3.1	1.5	0.7
V. anguillarum	---	--	-	-	++	++	+++	+++
V. alginolyticus	---	---	--	+	+	+++	+++	+++
V. parahaemolyticus	---	---	--	+	++	+++	+++	+++
V. harveyi	--	--	-	++	+++	+++	+++	+++
E. coli	---	--	-	++	++	+++	+++	+++
E. tarda	---	--	-	+	++	++	+++	+++
S. iniae	--	--	-	-	++	+++	+++	+++
--- : No growth, -- : <10² CFU/ml, - : <10³ CFU/ml, + : <10⁵ CFU/ml, ++ : <10⁷ CFU/ml, +++ : >10⁸ CFU/ml

실시예 4

내산성 프로바이오틱스로서 적합한 균주인지를 확인하기 위하여 5ml의 MRS 배지에 1N HCl을 첨가하여 pH 2,3,4,5, 대조군(pH 7.0)으로 조절한 후, 10 7 cfu/ml 이상인 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13균주와 L. plantarum KCCM 12116 균주 0.1%를 넣고 0시, 0.5시, 1시, 3시, 8시 간격으로 성장을 확인하였다. 락토바실러스플란타륨(Lactobacillus plantarum) PSCPL-13 균주가 생균제로서 기능을 발휘하기 위해서는 pH 3 이하의 조건인 위를 통과하여야 한다. 1N HCl로 pH 2, 3, 4, 5, 대조군(pH 7.0)으로 각각 조정한 MRS 액체배지에 L. plantarum PSCPL-13 균주를 접종한 후에 37℃에서 배양하면서 배양시간별 생균수의 변화를 관찰한 결과, pH 4, 5, 7에서는 8시간의 배양시간이 되었을 때 10⁵이상 균수가 증가하였고, pH 3에서는 균이 증식되지 않았지만 유지되었으며, 강산성인 pH 2에서는 3시간 이상 균이 생존하는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 음식물의 섭취량이나 종류에 따라 차이가 있겠지만 음식물이 위를 통과하는데 2 ~ 3시간이 소요되며, 위산의 pH가 2 ~ 3으로 희석되는 점을 고려할 때 내산성을 가진 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13이 실제로 위를 통과한 이후의 생존률은 실험치보다 더 높을 가능성을 배제할 수 없다.

락토바실러스플란타륨 PSCPL-13이 표준균주인 락토바실러스플란타륨 KCCM 12116보다 pH2에서 저항하는 것으로 보아서 기능적으로 신규함을 확인할 수 있었다.

Lactobacillus plantarum PSCPL-13	0시	0.5시	1시	3시	8시
Blank	2.5X10⁸cells/㎖	2.8X10⁸cells/㎖	3X10⁸cells/㎖	5.2X10⁸cells/㎖	7.5X10¹⁰cells/㎖
pH 5	2.5X10⁸cells/㎖	3.4X10⁸cells/㎖	7.9X10⁸cells/㎖	4X10⁹cells/㎖	2.95X10¹⁰cells/㎖
pH 4	2.5X10⁸cells/㎖	1X10⁷cells/㎖	1X10⁸cells/㎖	3.5X10⁸cells/㎖	4X10¹⁰cells/㎖
pH 3	2.5X10⁸cells/㎖	5X10⁶cells/㎖	6X10⁸cells/㎖	1X10⁸cells/㎖	4X10⁶cells/㎖
pH 2	2.5X10⁸cells/㎖	1X10⁶cells/㎖	3X1010⁸cells/㎖	5X10³cells/㎖	2X10⁶cells/㎖
Lactobacillus plantarum KCCM 12116	0시	0.5시	1시	3시	8시
Blank	3X10⁸cells/㎖	7.5X10⁸cells/㎖	9X10⁸cells/㎖	1.5X10⁹cells/㎖	2.35X10¹⁰cells/㎖
pH 5	3X10⁸cells/㎖	3.5X10⁸cells/㎖	4X10⁸cells/㎖	8.7X10⁸cells/㎖	1.8X10⁹cells/㎖
pH 4	3X10⁸cells/㎖	5X10⁷cells/㎖	2.7X10⁷cells/㎖	5.5X10⁶cells/㎖	2X10⁶cells/㎖
pH 3	3X10⁸cells/㎖	1X10⁷cells/㎖	2X10⁵cells/㎖	4.75X10⁶cells/㎖	1.4X10⁴cells/㎖
pH 2	3X10⁸cells/㎖	2X10⁷cells/㎖	2X10²cells/㎖	2X10³cells/㎖	2X10³cells/㎖

실시예 5

생균제의 조건으로서의 가장 중요한 요인은 담즙성에 대한 내성이다. 이를 위해 담즙산염 0%, 0.1%, 0.3%, 1%를 MRS 액체배지 5ml에 넣고, 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13과 락토바실러스플란타륨 KCCM 12116의 10⁵CFU/ml으로 희석된 균주 0.1%를 넣고 0시, 3시, 6시, 12시, 24시, 48시 간격으로 균수 측정하여 성장을 확인하였다. 37℃에서 24시간 배양한 다음, 균수를 측정한 결과를 다음 표 5에 요약하였다. 그 결과 담즙염 1%에서도 균이 생존하는 것으로 보아, 내담즙에 내성이 있다고 판단할 수 있다.

Lactobacillus plantarum PL13	0시	3시	6시	12시	24시	48시
Blank	3X10⁸cells/㎖	6X10⁸cells/㎖	8.2X10⁸cells/㎖	2X10⁹cells/㎖	2.3X10¹⁰cells/㎖	3X10⁹
0.1% Oxgall	3X10⁸cells/㎖	4.3X10⁸cells/㎖	5X10⁸cells/㎖	8X10⁸cells/㎖	1.4X10⁹cells/㎖	4X10⁹
0.3% Oxgall	3X10⁸cells/㎖	1X10⁷cells/㎖	7.3X10⁶cells/㎖	3X10⁶cells/㎖	3X10⁶cells/㎖	2X10⁵
1% Oxgall	3X10⁸cells/㎖	8.6X10⁵cells/㎖	5X10⁵cells/㎖	4.3X10⁵cells/㎖	2X10⁵cells/㎖	6.8X10⁴
Lactobacillus plantarum KCCM 12116	0시	3시	6시	12시	24시	48시
Blank	3.8X10⁸cells/㎖	5X10⁸cells/㎖	7.4X10⁸cells/㎖	4X10⁹cells/㎖	7.5X10¹⁰cells/㎖	1.75X10⁸
0.1% Oxgall	3.8X108cells/㎖	4X108cells/㎖	6.4X108cells/㎖	7X108cells/㎖	4X10⁹cells/㎖	5X10⁹
0.3% Oxgall	3.8X10⁸cells/㎖	7X10⁶cells/㎖	8X10⁵cells/㎖	4X105cells/㎖	8.3X10⁴cells/㎖	1X10⁴
1% Oxgall	3.8X10⁸cells/㎖	2.5X10⁴cells/㎖	5X10³cells/㎖	2X10³cells/㎖	2X10³cells/㎖	2X10³cells/㎖

실시예 6

항생제 내성 시험어류 및 동물의 사료 첨가 및 치료용으로 많이 사용되는 항생제의 내성을 조사하기 위하여 하룻밤 배양한 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13를 10⁶ CFU/ml로 조절한 후, 100㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 미리 희석된 시험하고자 하는 항생제를 100㎕ 첨가한 다음, 37℃ 인큐베이터에 넣고 24시간 후에 균의 생육을 조사하여 최소발육 억제농도와 최저 살균농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표에 기재하였으며, 대부분의 항생제에 대하 여 내성을 보유하고 있는 것으로 나타났고, 종래의 유산균들과 항생제의 내성을 비교한 결과 동등하거나 보다 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13 균주를 항생제가 포함된 사료에 사용해도 프로바이오틱스로서의 효과를 가질 수 있다는 사실을 확인해주는 것이다.

항생제	락토바실러스플렌타륨(Lactobacillus plantarum)
항생제	MIC(㎍/ml)	MBC(㎍/ml)
Cephalexin	>256	>256
Colistin sulfate	>256	>256
Enrofloxacin	8	8
Cefalonium	64	32
Amoxicillin trihydrate	4	2
Penicillin G procaine	32	32
Norfloxacin	>256	>256
Spectinomycin	128	128
Tylosin base	2	8
Cefuroxine sodium	4	32
Florfenicol	4	8
Penicillin G Benzathine	4	8
Gentamicin sulfate	128	128
Streptomycin sulfate	64	128
D.H.S.M	64	256

실시예 7: 락토바실러스플란타륨 PSCPL -13의 급성독성시험

락토바실러스플란타륨 PSCPL-13의 안전성을 평가하기 위해 급성독성시험을 실시하였다.

시험군은 대조군(control, 0.85% NaCl), 저용량군(10⁷ CFU/ml), 중용량군(10⁹ CFU/ml) 그리고 고용량군(10¹¹ CFU/ml)으로 구성하였으며, 7주령 Sprague-Dawley 계통의 특정병원균 부재(Specific pathogen free, SPF) 랫트을 투여 전에 하룻밤 절식시킨 후 랫트용 존대 부착한 주사관을 이용하여 1회 경구 투여하고 14일 동안 관찰을 실시하였다. 다음 결과에 대해 다음 표 7에 요약하였다.

락토바실러스플란타륨 PSCPL-13을 경구 투여 시10¹¹ CFU/ml인 고용량군을 포함한 모든 암수시험군에서 시험기간 동안 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13에 기인한 사망은 관찰되지 않았다. 또한 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13에 의한 독성증상과 특이할 만한 임상증상도 나타나지 않았다. 이상의 결과로 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13는 암 수 모두에서 LD₅₀은 10¹¹ CFU/ml 이상으로 추정된다.

성별	투여량 (mg/kg)	투여후 경과일														사망율 (%)	LD₅₀
성별	투여량 (mg/kg)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	사망율 (%)	LD₅₀
수컷	고용량군(10¹¹CFU/ml)	0^a)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	>10¹¹ CFU/㎖
	중용량군(10⁹CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	저용량군(10⁷CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	대조군	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
암컷	고용량군(10¹¹CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	>10¹¹ CFU/㎖
	중용량군(10⁹CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	저용량군(10⁷CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	e0조군	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

실시예 8: 뱀장어를 이용한 락토바실러스플란타륨 PSCPL -13가 뱀장어 생육에 미치는 영향

체중이 평균 200~300g의 뱀장어를 이용하여 락토바실러스플란타륨 PSCPL-13을 뱀장어 사료에 1%수준(108CFU/g)로 처리한 사료와 균주을 첨가하지 않은 사료를 뱀장어에 급여하면서 1개월 사양한 후, 뱀장어의 증체율 및 사료효율을 조사한 결과 표 8에 나타내었다.

구분	개체 무게증가량(g)	사료효율(%)
처리(1%처리)	82.36	1.89
무처리	76.45	2.44

상기에서 본 발명을 상세히 기술하였으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 상기 기술은 바람직한 일 실시형태에 불과하며 이에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11682P

20150402

Claims

세파렉신(Cephalexin), 콜리스틴 셀페이트(Colistin sulfate) 및 노르플록사신(Norfloxacin)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항생제에 대한 내성을 갖고, 프로테아제, 셀룰라아제, a-아밀라아제 및 파이타아제를 동시에 생산하는 활성을 갖고, pH 2 또는 pH 3에서 3시간까지 생존할 수 있는 내산성을 갖고, 내담즙성이 우수하고, 그람양성균이며, 통성혐기성(Facultative anaerobes)이고, 어류의 프로바이오틱스에 사용 가능한, 락토바실러스 플랜타륨(Latobacillus plantarum) PSCPL-13 (수탁번호:KCCM11682P) 균주).
제1항에 있어서, 상기 균주는 담즙산염 1%(w/v) 조건에서 생존할 수 있는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 뱀장어에서 분리된 것을 특징으로 하는 균주.
제1항의 락토바실러스 플랜타륨(Latobacillus plantarum) PSCPL-13 (수탁번호:KCCM11682P) 균주를 유효성분으로 포함하는 어류용 프로바이오틱스.