KR20170050527A - 신선유지를 위한 항균 및 항진균 활성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 dsr kf15 및 이의 용도 - Google Patents

신선유지를 위한 항균 및 항진균 활성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 dsr kf15 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신선유지를 위한 항균 및 항진균 활성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15(KCCM11772P) 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 김치로부터 유산균을 분리 동정한 균주는 세균의 생육을 저해하는 항균성 이외에 식품 유해 진균인 효모나 곰팡이에 대한 항균력 뿐 아니라, 내산성, 내염성, 내답즙성 및 항생제 내성이 우수한 유산균이다. 본 발명의 균주 및 그 배양물은 천연 보존재로 식품에 적용하여 유통기한 연장의 효과를 제공할 수 있다. 또한 정장용, 생균제, 사료용, 항균용 등의 약학 조성물 및 식품 또는 기능성식품 조성물로 제공될 수 있다.

Description

신선유지를 위한 항균 및 항진균 활성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 및 이의 용도{Vegetable Lactobacillus plantarum DSR KF15 having Activities on Antimicrobial And Antifungal for keeping freshness and Use Thereof}
본 발명은 신선유지를 위한 항균 및 항진균 활성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15(균주기탁번호 KCCM11772P, 2015.9.18. 기탁) 균주 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명의 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15는 세균의 생육을 저해하는 항균성 이외에 식품 유해 진균인 효모나 곰팡이에 대한 항균력 뿐 아니라, 내산성, 내염성, 내답즙성 및 항생제 내성이 우수한 유산균이다.
본 발명의 균주 및 그 배양물은 천연 보존재로 식품에 적용하여 유통기한 연장의 효과를 제공할 수 있다. 또한 정장용, 생균제, 사료용, 항균용 등의 약학 조성물 및 식품 또는 기능성식품 조성물로 제공될 수 있다.
소득수준의 향상과 웰빙생활을 추구하는 소비자들이 증대됨에 따라 건강에 대한 관심이 높아져 화학합성의 식품 보존제에 대한 거부감이 커지고 있으므로, 우수한 효능의 천연 항균제 개발의 필요성이 증대되고 있다. 더욱이 천연항균제 개발과 관련하여 미생물 또는 미생물이 생산하는 배양물질의 항균능력에 대한 관심도가 높아지고, 보다 중요한 것은 일반적으로 안전하다고 인정하는 물질(GRAS, generally recognized as safe)인 유산균 중에서 항균력이 우수한 균주를 개발하는 데 관심이 집중되고 있다. 그러나 유산균의 경우 좁은 항균 스펙트럼으로 식품에 천연항균제로 적용이 어렵고, 병원성 세균 뿐 아니라 효모나 곰팡이와 같은 진균에 항균효능이 있는 유산균 개발이 시급히 요구되고 있다. 유산균 중에서 비교적 안전성이 우수하다고 알려진 락토바실러스속 균주는 사람과 동물의 장관에 일정한 균총을 생성하고 면역증진작용, 유해독소의 중화, 영양분의 소화흡수의 증대 및 생리활성에 유익한 것 이미 잘 알려져 있어 여러 가지 형태로 복용되고 있다.
식중독을 잘 일으키는 병원성 세균에는 살모넬라 속균, 스타필로코코스 에우리우스, 장독성 대장균, 바실러스 세레우스, 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)가 있다. 이러한 병원성 세균의 감염을 예방 또는 치료하기 위해 주로 합성 또는 천연 항생제를 사용하였으나 내성 및 잔류 등의 문제로 규제가 엄격하고, 장내 유익한 균총을 파괴하기도 하고, 정상 균총에 의한 병원성 세균 감염예방을 방해한다. 또한 천연 항생제로 알칼로이드, 후라보노이드, 피토알렉신, 항균 펩타이드, 유기산 및 지방산이 알려져 있으나 항균성, 안정성 및 제형상의 문제점으로 인하여 상용화되지 못하고 있다. 이와 같이 합성 또는 천연항균제가 갖는 문제점을 해결할 수 있는 대안으로 유산균이 있으나 유산균은 소화기관들에서 분비되는 여러 물질들을 견딜 수 있는 내산성, 내담즙성, 장내 생존력, 항생제 내성 및 병원성 세균 억제능 등이 우수한 유산균의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이러한 문제점을 해결할 수 있는 유산균을 이용한 항균제가 개발된다면 산패를 억제하여 저장 유통기간을 늘릴 수 있으며, 인체에 안전하기 때문에 식품 제조에 유익하게 사용될 수 있다. 또한 병원성 세균의 생육 저해로 인하여 항생제 남용을 억제할 수 있다.
본 발명과 관련된 종래기술로는 한국특허등록번호 10-0536108(김치에서 분리한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 및 이를 이용한 맛있는 김치의 제조 방법)은 저온에서 최적으로 숙성시켜 가장 맛이 좋은 김치에서 분리한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 균주, 그리고 상기 균주와 혈압강하 및 긴장완화 기능을 갖는 가바를 첨가하여 맛과 기능성이 향상된 김치의 제조방법에 관한 것이다.
한국특허등록번호 10-1485182(병원성 세균의 생육을 억제하는 김치에서 분리한 신규락토바실러스 플란타륨 및 이의 용도)는 병원성 세균의 생육을 저해하고 내산성, 내염성, 내답즙성및 항생제 내성이 우수한 락토바실러스 플란타륨 DSR 330 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타륨 DSR 330 또는 이의 배양물은 정장용, 생균제, 사료용, 식품첨가용, 항균용, 약학적 조성물 및 발효식품에 유용하게 이용될 수 있다.
한국특허등록번호 10-1329644는 야채와 물을 혼합한 혼합액에 유산균 스타터를 접종하여 발효시키는 단계; 및 상기 발효를 마친 발효액에서 야채를 건져내어, 당 및 식초를 포함하는 절임액과 혼합하는 단계;를 포함하는 야채 절임 식품의 제조방법에 관한 것으로, 야채 절임을 통해 유산균 섭취, 이미, 이취를 낮추면서 시원한 탄산미와 부드러운 신맛을 부여하면서도 저장성이 뛰어나다. 그 밖에 한국특허등록번호 10-1370942(신규 바실러스 서브틸리스)는 신규한 바실러스 서브틸리스 CJMPB957(KCCM11271P) 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제와, 이를 활용하여 가축의 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
한국특허등록번호 10-1394348(대사질환 또는 염증질환 치료 및 예방 효과가 있는 락토바실러스 플란타륨 DSR920 및 이의 용도)는 지방세포의 분화를 억제시켜 지방 조직의 비대화를 억제하는 동시에, 염증성 사이토카인을 억제시켜 지방 조직의 만성적인 염증 반응으로 초래되는 인슐린 저항성을 개선시켜 비만 치료와 예방에 도움을 주고 궁극적으로 대사증후군 질환의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있는 신규 락토바실러스 플란타륨 DSR920 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다. 한국특허등록번호 10-1369219(항균용 유산균 사균체 및 이의 제조방법)은 유산균 발효액을 틴달화시킨 후 발효여액과 균체포함액으로 분리하고, 균체포함액에 대해 동결건조를 수행하고, 발효여액에 대해 유동층건조 또는 동결건조를 수행한 후, 상기 건조 처리된 균체와 발효여액을 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항균용 유산균 사균체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 그러나 이들 종래기술은 본 발명과 기술적구성이 다른 것이다.
본 발명은 세균에 대한 항균성 이외에 식품 유해 진균인 효모나 곰팡이에 대한 항균력이 있는 유산균을 분리하는 데 있다. 또한 그 균주 및 배양물을 천연 보존재로 식품에 적용하여 상미기간을 늘리면서 유통기한을 연장하는 데 있다. 본 발명은 그 밖에 약학 조성물, 식품 또는 기능성식품 조성물로 건강증진에 이용될 수 있도록 하는데 있다.
본 발명자들은 김치에서 항균성 및 항진균성 유산균을 분리하던 중, 병원성 세균 및 곰팡이균을 억제하고 내산성, 내염성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 김치 유산균을 분리 및 동정하여 최초로 개시한다. 본 발명의 균주는 김치로부터 유산균을 분리하는 단계와, 상기의 분리된 유산균 중에서 유해미생물의 생육을 억제하는 유산균을 분리하는 단계와, 분리된 유산균의 항균 및 항진균력을 확인 실험하는 단계와, 상기의 분리 선별된 유산균을 분리 동정하는 단계로 구성된다. 또한 본 발명의 균주의 균학적 특성을 확인하기 위하여 내담즙성 테스트와 내산성 테스트 및 내항생제 테스트하는 단계를 포함한다.
본 발명의 유산균은 사람, 가축 및 물고기의 체내 활성을 증진시키기 위하여 정장용, 생균제, 항균용, 사료용, 식품첨가용 또는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 균주의 배양물, 세포벽 분쇄물 분획, 생균, 사균, 여과 또는 원심분리한 건조균주를 제거한 여액 등의 유효성분, 부형제 또는 담체를 추가하여 조성물로 포함할 수 있다. 조성물 중에서 유산균의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.
상기에서 약학적 조성물은 병원성 세균으로 알려진 스타필로코코스 에우리우스, 대장균, 바실러스 세레우스, 살모넬라 타이피뮤림(S.typimurium), 살모넬라 콜레라수이스, 여시니아 엔테로콜리티카(Y.enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(L.monocytogenes) 등이 일으키는 질병 및 감염증의 예방에 유산균주와 그의 유효성분에 부형제 또는 담체를 추가하여 조성물로 포함할 수 있다. 그 밖에도 식중독, 피부의 화농·중이염·방광염 등 화농성 질환에도 약학적 조성물이 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물, 정장용 또는 생균용 조성물, 항균용 조성물은 동 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 타블렛, 트로키(troche), 캡슐, 엘릭실(elixir), 시럽, 산제, 현탁제 또는 과립제 등으로 만들어 이용될 수 있다. 담체는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용하여 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
사료용 조성물은 본 발명의 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 균주를 발효시켜 그 균체 및 배양물을 발효사료나 배합사료로 펠렛형이나 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. 또한 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 균주 및 배양물은 김치, 음료, 이유식, 유제품 등의 식품첨가제나 발효식품용 스타터로 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 균주 및 배양물을 절인 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 대파, 무채, 설탕 등의 김치 양념들을 혼합한 후, 김치 전체 중량에 대하여 0.1 ~ 5중량% 로 첨가하여 김치를 담그면 아주 우수한 맛의 김치를 만들 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 균주의 배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용하며, 배양은 통상의 미생물 배양 조건으로 가능하며, 28 ℃ 내지 37 ℃에서 18 시간 내지 48 시간 정도 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과 과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15은 김치에서 분리한 유산균으로서, 김치에 생육가능한 병원성 미생물, 곰팡이, 효모 등의 진균에 대하여도 항균활성을 나타내어 발효에 의해 고유한 풍미의 김치 맛을 낼 수 있다. 또한 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 균주, 배양액 및 조항진균물질은 김치스타터, 식품, 사료 및 화장료 등에 첨가하여 생물학적 보존제 및 병원성 세균으로 인한 감염증의 치료 및 예방에 효과적이다
도 1은 본 발명의 칸디다 알비칸스에 대한 항균 활성 결과 사진이다.
본 발명의 균주는 김치로부터 유산균을 분리하는 단계와, 상기의 분리된 유산균 중에서 유해미생물의 생육을 억제하는 유산균을 분리하는 단계와, 분리된 유산균의 항균 및 항진균력을 확인 실험하는 단계와, 상기의 분리 선별된 유산균을 분리 동정하는 단계로 구성된다. 또한 본 발명의 균주의 균학적 특성을 확인하기 위하여 내담즙성 테스트와 내산성 테스트 및 내항생제 테스트하는 단계를 포함한다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>; 김치로부터 유산균 분리
통상적인 김치 제조방법으로 제조된 김치 20 종을 선택하고, 상기 김치를 유산균 분리 김치시료로 사용하였다. 상기 김치시료를 채취하여, 0.85% 식염수로 10 배 희석하고, 이를 0.1㎖씩 MRS 아가 배지에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 37℃의 항온 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 37℃ 에서 1일 동안 배양하여 유산균 콜로니를 분리하였다.
< 실시예2 >; 유해미생물 생육을 억제하는 유산균 분리
실시예 1에서 분리된 수백개의 유산균들 중에서 병원성세균의 생육을 저해하는 유산균을 선발하기 위하여, 콜로니들은 MRS 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 24 시간 배양한 후, 원심 분리하여 유산균 배양액을 얻었다.
유해미생물로 효모 칸디다 알비칸스(Candida albicans KCTC 17485) 1종, 곰팡이 Fusarium oxysproum KCTC11554 1종, 병원성미생물 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCCM12142), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus auerus KCCM11335), 대장균(E. coli KCCM11234) 3종을 뉴트리언트 액체배지에 3차 계대 배양 한 후, 뉴트리언트 아가배 지에 1 % 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조하였다. YPD 액체배지에 3차 계대한 변패 효모를 YPD 아가배지에 1 % 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조하였다. PDA 배지에 상기에 추출한 포자를 1 % 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조 하였다.
여기에 코크보어러로 직경 9 mm의 구멍을 뚫고 상기와 같이 분리한 각각의 유산균 배양 상등액 100 ㎕를 적하시켰다. 37 ℃에서 24 시간, 효모는 25 ~ 30 ℃, 48시간, 곰팡이 25~30 ℃, 48 시간 이상 동안 배양 후 생성된 억제 환의 직경을 측정하였다. 억제 환을 형성하는 유산균 중 가장 우수한 균주를 선발하고 최종적으로 유해 미생물의 생육을 가장 우수하게 억제하는 균주 L1(락토바실러스 플란타륨 DSR KF15)를 선별하였다. 선별된 유해 미생물의 생육을 억제하는 균주는 하기 표 1과 같았다.
지시균주 분리유산균
L1 L2
Candida albicans KCTC 17485(효모) 11 -
Fusarium oxysproum KCTC11554(곰팡이) 12 -
Bacillus cereus KCCM12142(세균) 40 30
Staphylococcus auerus KCCM11335(세균) 35 20
E. coli KCCM11234(세균) 39 15
상기의 결과로부터 유산균 L1은 다른 유산균과 달리 병원성 유해 미생물 억제 뿐만 아니라, 효모와 곰팡이에서도 항균 활성을 나타내었다.
< 실시예3 >; 항균, 항진균력 확인 실험
상기의 실시예에서 선별된 유산균 L1의 항균, 항진균력을 확인하고 다른 유산균과 항균력을 비교하기 위하여 균주 배양 배지는 효모(YPD), 곰팡이(PDA), 세균(NA)을 사용하였다. 사용된 시험균주인 효모, 곰팡이 및 세균은 하기 표 2와 같았다.
구분 균주명

곰팡이
Fusarium oxysproum KCTC11554
Fusarium oxysproum KCTC16909
Aspergillus flavus KCTC16682
Aspergillus niger KCTC16683
효모 Candida albicans KCTC 17485
Pichia membranifaciens


병원성미생물
Bacillus cereus KCCM11774
Staphylococcus auerus KCCM11335
E. coli KCCM11234
Listeria monocytogenes KCCM40307
Salmonella typhimurium KCTC2057
Spttreococcus mutans KCTC3065
< 병원성세균 항균력 시험>
상기 L1의 항균력 테스트를 위해 MRS 액체배지에 3 차 계대 배양하고, 뉴트리언트 아가배지(Nutrient agar)에 병원성세균 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCCM11774), 스타필로코커스 아우레우스(Staplyococcus aureus KCCM 11335), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes KCCM40307), 대장균(E.coli KCCM11234), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium KCTC2057), Streptococcus mutans KCTC3065를 각각 1 % 씩 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조하였다. 여기에 코크보어러로 직경 9 mm의 구멍을 뚫고 5배 농축한 L1의 배양 상등액을 100 ㎕ 적하 시켜 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 억제 환의 크기를 측정하였다.
< 항효모 시험>
상기 L1의 항효모 테스트를 위해 준비한 효모 Candida albicans KCTC 17485, Pichia membranifaciens를 YPD 액체배지에 3차 계대배양하고, YPD 아가배지에 1 %를 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조하였다. 여기에 코크보어러로 직경 9 mm의 구멍을 뚫고 5배 농축한 LAB1의 배양 상등액 100 ㎕를 적하시켜 25 ℃에서 48 시간 동안 배양하여 억제 환의 크기를 측정하여 표 3에 기재하였다.
< 항곰팡이 시험>
상기 L1의 항곰팡이 테스트를 위해 PDA 배지에 준비한 곰팡이 Fusarium oxysproum KCTC11554, Fusarium oxysproum KCTC16909, Aspergillus flavus KCTC16682, Aspergillus niger KCTC16683를 접종하여 상기의 방법으로 포자를 준비한다. 추출한 포자를 1 % 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조 하였다. 여기에 코크보어러로 직경 9 mm의 구멍을 뚫고 5배 농축한 L1의 배양 상등액 100 ㎕를 적하시켜 25 ℃에서 48 시간 이상 배양하여 억제 환의 크기를 측정하였다. 항균력 시험의 결과는 하기 표 3에 기재하였다.
구분 L1 LF CCM12116 LF KCT1048
Fusarium oxysproum KCTC11554 15 0 0
Fusarium oxysproum KCTC16909 15 0 0
Aspergillus flavus KCTC16682 13 0 0
Aspergillus niger KCTC16683 12 0 0
Candida albicans KCTC 17485 10 0 0
Pichia membranifaciens 10 0 0
Bacillus cereus KCCM11774 40 30 38
Staphylococcus auerus KCCM11335 38 35 35
E. coli KCCM11234 39 33 38
Listeria monocytogenes KCCM40307 35 30 35
Salmonella typhimurium KCTC2057 33 12 35
Streptococcus mutans KCTC3065 35 18 35
선별된 유산균 L1은 동일 종의 유산균들과 비교하여 효모, 곰팡이 등에 항균력을 나타내었고, 항균 스펙트럼이 넓은 것을 확인하였다.
< 시험예 1>; 내담즙성 테스트
상기와 같이 김치에서 분리한 유산균의 내담즙성을 확인하기 위하여 실시예 1 내지 3에서 분리된 L1과 락토바실러스 플란타륨 KCCM12116, 락토바실러스 플란타륨 KCTC1048을 옥스갈(oxgall)로 0.3%, 0.5%, 1%, 2 %, 3%로 조정한 MRS 액체배지 10 ㎖에 각각 접종하였다. 이후, 37 ℃에서 2 시간 배양하면서 상기 인공 담즙 농도에서의 균주의 생육을 관찰하였다. 내담즙성 시험 결과는 하기 표 4와 같았다.
생존율(%)/Oxgall농도(%) 0.3 0.5 1 2 3
L 1 100 100 100 100 100
락토바실러스 플란타륨 KCCM12116 95 85 50 48 40
락토바실러스 플란타륨 KCTC1048 100 90 70 60 55
상기의 결과로부터 L1 은 옥스갈 농도 0.3-1%에서도 생존율이 100%이고, 옥스갈 농도 3%에서도 98%의 생존율을 나타낸다.
< 시험예 2>; 내산성 테스트
김치 분리 유산균의 내산성을 확인하기 위하여 상기 실시예 1 내지 3에서 분리된 L1과 락토바실러스 플란타륨 KCCM12116, 락토바실러스 플란타륨 KCTC1048을 염산을 이용하여 pH 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5로 조정한 MRS 액체배지 10 ㎖에 각각 접종하였다. 이후, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하면서 생균수를 조사하였다. 내산성 시험 결과는 하기 표 5와 같다.
생존율(%)/pH 2.5 3.0 3.5 4.0
L 1 88 93 96 100
락토바실러스 플란타륨 KCCM12116 56 66 80 95
락토바실러스 플란타륨 KCTC1048 55 75 90 100
상기의 결과로부터 L1 은 pH 2.5 ~ 5에서 생육이 활발하고, 특히 pH 2.5에서도 85 % 이상 생존하며, pH 3에서 약 90 % 이상의 생존율을 나타내어 내산성이 강한 것으로 나타났다.
< 시험예 3>; 내항생제 테스트
김치에서 분리한 유산균의 항생제에 대한 내성을 확인하기 위하여 상기 실시예 1 내지 2에서 분리된 L1 유산균을 MRS 고체배지에 접종하고, 항생제가 포함된 필터(직경 6mm)를 올려놓고 24시간 배양하여 항생제에 의한 형성된 억제 환의 크기를 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 6과 같았으며 단위는 mm(밀리미터)이다.
항생제 L1 LF KCCM12116
테트라사이클린(30㎕) 15 21
에리트로마이신(15㎕) 16 22
앰피실린(10㎕) 13 20
페니실린(10IU/IE/UI) 18 19
세파로신(30㎕) 20 22
상기의 결과로부터 L1은 다양한 항생제에 대해 내성을 보여 항생제와 함께 정장용, 생균제, 사료용, 식품첨가용, 항균용, 약학적 조성물 및 발효식품에 사용하더라도 그 활성이 유지되어 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
< 실험예 >; 선별된 유산균 동정
1) 버지스의 분류 세균학 매뉴얼
상기 실시예 1 내지 3에서 선별된 유산균에서 단일 콜로니로 분리한 후, 버지스의 분류 세균학 매뉴얼(Bergy's manual of systematic bacteriology)에 준하여 형태학적 및 생화학적 특성을 조사하였고, 그람 염색을 수행하였다. 균주의 동경 결과는 하기 표 7과 같다.
특성 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15
그람(Gram) +
콜로니 형태(Colony form) 막대형(Rod)
콜로니 색깔(Colony color) 노란색
운동성(Motility) -
카탈라제(Catalase) -
발효형태 호모
포자(Spore) -
16 ℃ 에서 생육 +
NaCl 4 %에서 생육 +
상기와 같이 분리된 균주는 그람 양성 균주이며 간균의 형태를 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
2) API 시스템을 이용한 분석
이후, 상기 균주는 API 시스템(API system; La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 우선, 멸균 백금이로 균 콜로니를 각각 취한 후 멸균 증류수 2 ㎖에 부유시켰다. 다시 상기 균액을 멸균 증류수 5 ㎖에 API 50CH 키트(BioMerieux, France)에서 제공되는 맥팔란드 표준 용액 No.2(MccFaland Standard Solution No.2)의 농도로 균액을 부유시켰다. 상기 부유액을 API 50CH 키트의 액체배지에 첨가하여 균질화시킨 후, API 50CH 키트의 50개 각 튜브에 200 ㎕씩 접종하였다. 미네랄 오일로 튜브 위를 엎어준 후, 30 ℃에서 48 시간 동안 배양시켰다. 상기 배양액을 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정하였다.
그 결과, 상기 실시예 1 내지 3에서 선별된 DSR KF 15 유산균은 하기 표 8의 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는 락토바실러스 속에 속하는 균주인 것으로 판명되었다.
대조군 - D-만노즈 + 살리신 + 켄티오비오즈 +
글리세롤 - L-솔보즈 - 셀로비즈 + D-튜라노즈 -
에리쓰리톨 - 람노즈 + 말토즈 + D-리조즈 -
D-아리비노즈 - 둘시톨 - 락토즈 + D-타가토즈 -
L-아라비노즈 + 이노시톨 - 멜리비오즈 + D-퓨코즈 -
리보오즈 + 만니톨 + 사카로즈 + L-퓨코즈 -
D-자일로즈 - 솔비톨 + 트레할로즈 + D-아라비톨 -
L-자일로스 - D-만노시드 - 이눌린 + L-아라비톨 -
아도니톨 - D-글루코시드 - 멜레지토즈 + 글루코네이트 -
자일로시드 - 글루코사민 + D-라피노즈 + 2-세토-글루코네이트 +
갈락토즈 + 아미그달린 + 아미돈 - 5-세토-글루코네이트 -
D-글루코즈 + 알부틴 + 글리코겐 - - -
유산균은 위와같은 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는 락토바실러스 속에 속하는 균주인 것으로 판명되었다.
3) 16S rDNA 염기서열 분석
상기 선별된 유산균의 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 본 발명자들은 L1 유산균을 "락토바실러스 플란타륨 DSR KF15"으로 명명하고 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2015.19.15에 기탁번호 KCCM11772P로 하였다. 상기 염기서열 분석의 결과는 하기 기재된 식별항목 [서열목록 자유텍스트]에 나타낸 바와 같다.
< 적용예 >; 유산균을 이용한 김치 제조
배추의 염도가 2.1-2.3%의 절인 배추 100 중량부에 대하여 고춧가루 3 중량부, 마늘 2.4 중량부, 생강 0.6 중량부, 대파 2.4 중량부, 무채 10.9 중량부, 설탕 0.6 중량부를 섞어 김치 양념을 혼합한 후, 스타터로 본 발명의 유산균을 김치 전체 중량에 대하여 1 중량%를 첨가하였고, 대조군은 스타터를 첨가하지 않았다. 절인배추에 켜켜이 김치속을 넣고 김치를 담근후, 5℃에서 1, 2, 4 주일 동안 숙성시켰다. 2주일간 숙성시킨 김치의 산도를 측정한 결과 0.6%이었고, 무첨가(대조군)는 0.7%로서, 대조군 김치에 비해 산도가 비교적 낮아 김치발효 후반부에 산도를 서서히 증가시켜 적숙기를 연장함으로서 김치 품질을 향상 시킬 수 있다는 것을 알 수 있다. 김치의 산도와 유산균수를 측정한 결과는 하기 표 9와 같다.
구분 본발명 대조군
산도(%) 0.6 0.7
유산균수(log cfu/ml) 9.55 8.51
김치의 유산균을 측정한 바, 본 발명의 스타터로 시용한 김치의 유산균 수는 9.55(log cfu/ml)이고, 무첨가(대조군)은 8.51(log cfu/ml)로 나타나게 되어 본 발명의 유산균은 김치 스타터로서 우수함을 알 수 있다.
< 시험예 >; 관능 검사
본 발명의 스타터로 유산균을 사용한 것과, 스타터를 사용하지 않은 김치를 대상으로 조직감, 숙성도, 전체적인맛, 냄새, 기호도를 대상으로 5점척도법(5점; 아주우수, 4점; 우수, 3점; 보통, 2점이하; 미흡)으로 평가하여 아래의 표 10에 나타냈다. Panel은 식품에 조예가 깊은 대학생, 직장인 및 주부를 대상(20대, 30대, 40대, 50대 남녀 8명)으로 선발하였다. 관능검사의 결과는 하기 표 10과 같다.
Figure pat00001
상기의 결과로부터 숙성기간이 길어질수록 전체적으로 품질은 떨어지는 것으로 나타났다. 그러나 본 발명의 유산균을 스타터로 사용한 김치는 대조군에 비하여 산패 속도가 지연되고, 유산균수가 증식되어 맛있는 상미기간이 오래동안 유지될 수 있다는 것을 알 수 있다.
< 제조예 1> 사료용 조성물
본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 유산균 2.0 중량부, 글루코스, 1.0 중량부, 펩톤 1.0 중량부, 효모추출물 0.2 중량부, 제이인산 0.05 중량부, 황산마그네슘 및 0.05 중량부 및 시스테인이 함유된 배지에 접종하여 37 ℃에서 2일 동안 호기적으로 배양하였다. 각 균주의 배양액과 부형제 탈지강을 1:1의 중량비로 단순 혼합한 후 40 ℃ 이하에서 건조시켰으며, 건조된 혼합물을 분쇄하여 사료용 조성물을 제조하였다. 이때 제조된 사료용 조성물은 본 발명의 유산균이 1×109cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
< 제조예 2> 생균제 조성물
본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 유산균 2.0 중량부, 글루코스, 1.0 중량부, 펩톤, 1.0 중량부, 효모추출물, 0.2 중량부, 제이인산, 0.05 중량부, 황산마그네슘 및 0.05 중량부 및 시스테인이 함유된 배지에 접종하여 37 ℃에서 2 일 동안 호기적으로 배양하였다. 탈지강, 대두박, 옥분 및 당밀이 각각 3:1:1:1의 중량비로 혼합되어 들어 있는 고체 배양기에 상기 각 균주의 배양액을 10 중량%로 접종한 후, 여기에 물을 45 내지 60 중량%로 첨가하였다. 이를 40 ℃에서 3 일 동안 교반시키면서 혐기적으로 고체발효를 수행하여 생균제 조성물을 제조하였으며, 이때 제조된 생균제 조성물은 본 발명의 유산균이 1×109cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
< 제조예 3> 식품첨가용 조성물
본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15 유산균 2.0 중량부, 글루코스 1.0 중량부, 펩톤 1.0 중량부, 효모추출물 0.2 중량부, 제이인산 및 0.05 중량부, 황산마그네슘 0.05 중량부 및 시스테인 등이 함유된 배지에 접종하여 37 ℃에서 2 일간 호기적으로 배양하였다. 분유 또는 탈지유 및 전분 또는 유당을 1:1 중량비로 혼합한 혼합물에 상기 배양액을 60 중량%로 첨가한 후, 이를 -70℃ 이하에서 급속 냉동시킨 후, -60 ℃에서 36 시간 동안 동결 건조시켜 식품첨가용 조성물을 제조하였다. 이때, 동결건조시 수분 증발 효율을 높이기 위한 열판의 온도는 30 ℃로 하였으며, 이때 제조된 식품첨가용 조성물은 본 발명의 유산균이 1×109cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
< 제조예 4> 약학적 조성물
상기 제조예 1, 2 및 3에서 얻어진 생균 조성물 분말을 각각 통상적인 방법에 따라 정제, 환제 및 캡슐제로 성형하여 약학조성물로 제조하였으며, 이때 제조된 조성물은 본 발명의 유산균이 1×109cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
본 발명의 균주 및 그 배양물은 천연 보존재로 식품에 적용하여 유통기한 연장의 효과를 제공할 수 있다. 또한 정장용, 생균제, 사료용, 항균용 등의 약학 조성물 및 식품 조성물로 제공되므로 산업상 이용가능성이 있다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11772P 20150918
Figure pat00002

Claims (8)

  1. 신선유지를 위한 항균 및 항진균 활성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15(KCCM11772P) 균주
  2. 제 1항에 있어서, 균주는 병원성세균의 활성을 억제시키는 것을 추가로 포함하는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15(KCCM11772P) 균주
  3. 제 1항에 있어서, 균주는 항균, 항진균 및 병원성세균의 생육을 억제하고 pH 2.5~4에서 내산성, NaCl 2~12 %에서 내염성, 옥스갈 0.3~3 %에서 내담즙성 및 항생제 내성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF 15(KFCC11393P)의 균주
  4. 제 1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15(KCCM11772P) 균주 또는 그 배양물이 포함되어 유해 미생물의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 항균용 및 항진균용 조성물.
  5. 제 1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15(KCCM11772P) 균주 또는 그 배양물이 포함되어 유해 미생물의 감염증 치료용 또는 예방용 약학적 조성물.
  6. 제1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15(KCCM11772P) 균주 또는 그 배양물을 함유하는 식품조성물.
  7. 제1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15(KCCM11772P) 균주 또는 그 배양물을 함유하는 생균제 조성물.
  8. 제1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR KF15(KCCM11772P) 균주 또는 그 배양물을 함유하는 정장용 조성물.
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