KR20070071911A - 신규한 락토바실러스 사케이 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 락토바실러스 사케이 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 내산성 및 내염성을 갖고 항균력이 우수한 온도 반응형 락토바실러스 사케이 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 유산균은 정장제, 생균제, 식품첨가제 및 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이는 김치 발효를 위한 스타터로 유용하게 사용될 수 있다.
락토바실러스 사케이 , 내산성, 내염성, 항균성, 김치스타터
Description
도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 IFT-002의 내산성을 조사한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 IFT-002의 내염성을 조사한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 IFT-002을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4 는 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 IFT-002 및 대조군 균주들의 4℃에서의 생육곡선이다.
도 5는 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 IFT-002 및 대조군 균주들의 20℃에서의 생육곡선이다.
도 6은 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 IFT-002으로 제조한 김치에서의 우점확인 변성 구배 겔 전기영동 사진이다.
레인 1:락토바실러스 브레비스 KCTC 3498( Lactobacillus brevis KCTC 3498)
레인 2:류코노스톡 락티스 KCTC 3528( Leuconostoc lactis KCTC 3528)
레인 3:류코노스톡 가스코미타툼 KCTC 3753( Leuconostoc gascomitatum KCTC 3753)
레인 4: 웨이셀라 파라메센테로이드 KCTC 3531(Weissella paramesenteroides KCTC 3531)
레인 5:락토바실러스 사케이 KCTC 3603(Lactobacillus sakei KCTC 3603)
레인 6: 류코노스톡 시트레움 KCTC 3526(Leuconostoc citreum KCTC 3526)
레인 7: 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3108( Lactobacillus plantarum KCTC 3108)
레인 8: 웨이셀라 콘푸사 KCTC 3746(Weissella confusa KCTC 3746)
레인 9: 락토코코스 락티스 KCTC3769(Lactococcus lactis KCTC3769)
레인 10: 류코노스톡 메센트로이드 ATCC12291(Leuconostoc mesenteriodes ATCC12291)
레인 11: IFT002 마커
레인 12: IFT002를 이용하여 제조한 김치
본 발명은 신규한 락토바실러스 사케이 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 내산성 및 내염성을 갖고 항균력이 우수한 온도 반응형 락토바실러스 사케이 및 이의 용도에 관한 것이다.
김치는 주원료인 절임 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 파 및 무 등을 혼합한 후, 제품의 보존성과 숙성도를 확보하기 위하여 저온에서 발효시킨 식품으로서, 우리나라 고유의 대표적인 전통발효식품이다. 1990년대까지만 해도 김치는 주로 가정에서 자체적으로 생산이 되어온 식품이었으나, 급속한 경제성장과 국민 소득의 증가, 산업구조 및 생활환경의 변화에 의하여 1990년대 이후 본격적으로 상품화되기 시작하였다. 최근에는 상품김치에 대한 인식의 개선과 함께 국내 수요량과 수출량이 꾸준히 증가하고 있는 추세에 있다. 그러나, 상품화되고 있는 김치의 경우 김치의 발효를 주도하고 김치 특유의 맛을 내는 자연발생적 균주들이 원재료의 산지, 계절, 발효 조건에 따라 달라지게 되어 상품김치의 품질이나 맛을 원하는 상태로 일정하게 유지하기가 대단히 어려웠다. 또한, 대부분 숙성된 상태에서 판매가 되기 때문에 맛이 쉽게 변질되는 문제점이 있었다. 따라서, 품질과 맛이 일정하면서도 우수한 상품김치에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 김치의 시원하고 깊은 맛을 내는 주된 요인은 김치의 발효 과정 중에는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)가 있으며 김치숙성 중반기에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)가 증가하는 것으로 나타나 김치의 맛에 많은 영향을 주는 것으로 밝혀지고 있다(So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci. Technol., 27(4):495-505, 1995; So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci. Technol., 27(4):506-515, 1995). 이러한 호기성 세균인 락토바실러스 사케이 는 김치 제조시 중기부터 생육을 시작하여 젖산, 기타 휘발성 대사산물을 생산하여 김치를 복합적이며 독특한 풍미를 지닌 상태로 발효시킨다. 김치가 발효됨에 따라 pH가 4.0-3.0으로 떨어지면서 산에 약한 류코노스톡 메센테로이드 균주의 수는 급격히 감소되고, 내산성 균주인 락토바실러스 플란타리움(Lactobacillus plantarium) 균주가 왕성히 증식하여 김치는 점차적으로 시어진다
최근에는 김치에서 유래되는 유산균을 분리한 후, 김치 제조시 스타터(starter)로 첨가함으로써 김치의 맛과 발효를 조절하려는 연구들이 많이 진행되고 있다. 즉, 대한민국 등록특허 제1989-4894호에 차아염소산나트륨과 락토바실러스 사케이 균주를 첨가하여 산패가 억제되고 보존성이 연장된 김치를 제조하는 방법이 개시된 바 있다. 또한 대한민국 등록특허 제0181009호에 류코노스톡 파라메센테로이드와 류코노스톡 메센테로이드 균주를 혼합 첨가함으로써 맛이 좋을 뿐만 아니라 락토바실러스 속 균주의 생육을 억제하여 산패가 지연되도록 한 김치의 제조방법이 개시된 바 있는 등 류코노스톡 메센테로이드를 이용하여 김치의 품질을 향상시키려는 연구가 계속 진행되었다. 또한 김치에 다양한 스타터가 시도 되고 있으며 류코노스톡이나 효모를 이용한 김치의 연구는 많으나 락토바실러스 속의 연구는 거의 보고된 바가 거의 없다.
김치의 품질을 향상시키고 김치의 발효 상태를 조절할 수 있는 특성을 가진 유산균 스타터에 대한 개발이 필요하며 기존의 유산균에 의해 유산, 에틸알콜 및 이산화탄소를 분비하는 헤테로발효를 하는 류코노스톡 속 뿐 아니라 다양한 스타터의 개발이 요구되어진다. 따라서 본 발명은 유산만을 분비하는 호모(homo)발효를 하는 락토바실러스속 유산균인 락토바실러스 사케이를 스타터로 사용하여 김치의 품질을 향상시키고 김치의 발효 상태를 조절할 수 있는 호모발효 유산균 스타터를 개발하기 위하여 김치에서 호모발효 유산균을 분리하여 내산성, 내염성 및 항균력이 우수한 유산균을 분리, 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 내산성, 내염성 및 항균력이 이 우수한 온도 반응형 유산균 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 pH 2-4에서 내산성 및 NaCl 1-5%에서 내염성을 갖는 온도 반응형 락토바실러스 사케이를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 함유하는 정장용, 생균제, 사료용 및 식품첨가용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 함유하는 발효제품을 제공한다.
아울러 본 발명은 상기 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 스타터로 이용하여 발효제품을 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 락토바실러스 사케이를 김치에 스타터로 사용할 수 있 도록 배양물을 제공한다.
나아가 본 발명은 상기 락토바실러스 사케이의 배양방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 락토바실러스 사케이는 내산성, 내염성 및 항균 활성을 가지며 온도 반응형 이라는 점에 특징이 있다. 특히, 김치에서 분리된 락토바실러스 사케이 IFT-002(KFCC-11360P)는 pH 2-4에서 내산성 및 NaCl 1-5%에서 내염성을 갖고 항균활성을 가지며 온도 반응형이라는 특징이 있다.
일반적인 락토바실러스 사케이 균주가 산성 조건, 특히 pH 4.0 이하에서 거의 생장하지 않는 것에 비하여, 본 발명의 유산균은 pH 2.0의 산성 조건에서도 활발하게 생육하여 강한 내산성을 가진다(표 3 참조). 이러한 본 발명의 유산균의 내산성 정도는 본 발명자들이 이전에 분리 동정한 또 다른 내산성 균주인 류코노스톡 메센테로이드 DRC 0211(KFCC-11318)(대한민국 공개특허 제2004-51564)에 비하여 더욱 뛰어나다.
또한 본 발명의 락토바실러스 사케이는 내산성이 뛰어날 뿐 아니라 NaCl 1-5%에서 내염성을 갖는 특징이 있다(도 2 참조). 특히 본 발명의 유산균은 NaCl 5%의 조건에서도 90% 이상의 생존율을 보이고 있어 종래 김치에서 분리된 다른 유산균에 비해 매우 뛰어난 내염성을 가진다(표 4 참조).
또한 본 발명의 락토바실러스 사케이는 항균력도 우수한 것으로 나타났다. 특히 본 발명의 유산균은 스타필로코코스 아우레우스(S.aureus), 대장균 O157:H7, 예르시니아 루케리(Yersinia ruckeri KCTC 12265), 스타필로코코스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis KCTC 3958)에 항균력이 있는 것으로 나타났다(표 5 참조).
아울러 본 발명의 락토바실러스 사케이는 온도 반응형 균주로서, 온도에 따른 생육 특성을 갖는다. 상기 '온도 반응형'이라 함은 종래 김치 스타터와 비교하여 4℃에서는 느린 속도로 생장하는 반면, 20℃에서는 빠른 속도로 생장하는 특성을 말한다(표 6, 표 7 참조). 상기와 같은 내산성, 내염성 및 항균력이 우수하며 온도 반응형 특징을 가지고 있는 락토바실러스 사케이는 본 발명에서 처음으로 제공되는 것이다.
따라서, 본 발명의 유산균은 인간 및 동물의 건강증진을 위한 용도, 즉 정장용, 생균제 또는 사료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 본 발명의 락토바실러스 사케이의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등을 포함한다. 조성물 내 락토바실러스 사케이의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사 용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 락토바실러스 사케이와 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 락토바실러스 사케이를 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식 등의 식품에 대한 식품첨가제로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 락토바실러스 사케이는 발효제품 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 상기 발효제품은 치즈, 김치, 발효생식제품 등을 포함한다. 본 발명의 락토바실러스 사케이 를 이용한 발효제품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨 대, 현미와 율무 등의 곡류 분말에 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 또는 이를 포함하는 2-3종의 혼합 유산균을 처리하여 적정 온도에서 발효시킨 후, 백태, 찹쌀, 수수 등의 다양한 농산물을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 발효 생식제품을 제조할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이는 김치를 제조하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는 소금으로 절인 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 대파, 무채, 설탕과 같은 일반적인 김치 양념들을 혼합한 후, 본 발명의 락토바실러스 사케이의 배양물을 첨가하여 김치를 제조할 수 있다. 상기 본 발명의 락토바실러스 사케이 의 배양물은 김치 전체 중량에 대하여 1-5 중량% 첨가하는 것이 바람직하며, 1 중량%로 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 락토바실러스 사케이는 뛰어난 내산성 및 내염성을 가질 뿐 아니라 항균력도 우수하며 다른 종래 김치 스타터 균주에 비해 온도에 민감한 특성을 가진다. 즉, 종래 김치 스타터 균주에 비해 4℃ 및 10℃에서는 느리게 생장하고, 20℃에서는 빠르게 생장한다. 따라서, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이를 스타터로 이용하여 김치를 제조하는 경우, 김치의 발효를 조절할 수 있다. 중온(20℃)에서의 김치의 숙성 기간을 단축시킬 수 있다. 또한 본 발명의 유산균은 김치 발효 과정 중에서도 오랫동안 생존할 수 있으므로, 본 발명의 유산균으로 제조된 김치는 숙성된 상태가 저온에서 장기간 유지되어 좋은 김치 맛을 오랫동안 유지할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 락토바실러스 사케이는 통상적인 락토바실러스 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예컨대, MRS(Man-Rogosa-Sharp) 배지 또는 배추즙 배지를 사용할 수 있다. 상기 배추즙배지는 배지는 절임배추를 분쇄하고 착즙한 후, 멸균하여 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 락토바실러스속 미생물의 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대, 20℃ 내지 40℃에서 14시간 내지 30시간 정도 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는 25℃에서 16시간 정도 배양하는 것이 바람직하다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
락토바실러스
사케이
IFT
-002 균주의 분리
<1-1> 김치로부터 유산균의 분리
통상적인 김치 제조방법으로 제조된 경기도 지방의 김치를 대상으로 관능평가를 실시하여 가장 맛이 좋은 것으로 평가되는 김치 20종을 선택하고, 상기 김치를 유산균 분리 김치시료로 사용하였다. 상기 김치시료를 0.85% 식염수로 10배 희석하였고, 0.1 ㎖씩 MRS 아가 배지(MRS 아가, 디프코(Difco.); 박토 펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈 80 1 g, 구연산 2 g, 제2 인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g, 아가 15 g/증류수 1 ℓ)플레이트에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 25℃의 항온 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 25℃에서 1일 동안 배양하여 총 200개의 유산균 콜로니를 분리하였다.
<1-2> 내산성 테스트
상기 실시예 <1-1>에서 분리된 유산균 콜로니들을 젖산(lactic acid)으로 pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0으로 조정한 MRS 브로스(MRS 브로스, Difco.; 박토 펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈 80 1 g, 구연산2 g, 제2인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g/증류수 1ℓ) 10 ㎖에 각각 접종하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양하면서 생균수를 조사하였다. 이후, 상기 pH 범위에서도 생육이 가장 활발한 내산성 균주를 선별하였다. 그 결과, 선별된 내산성 유산균 균주는 pH 2.0-4.0에서 생육이 활발하며, 특히 pH 2.0에서도 생존하며 , pH 2.5에서 약 50% 이상의 생존율을 나타내어 내산성이 강한 것으로 나타났다(도 1 참조).
<1-3> 내염성 테스트
또한, 상기 실시예 <1-1>에서 분리된 유산균 콜로니들을 NaCl로 1,2,3,4,5% 로 조정한 MRS 브로스 10 ㎖에 각각 접종하였다. 37℃에서 2시간 배양하면서 생균수를 관찰하여 상기 염농도에서도 생육이 활발한 내염성 균주를 선별하였다. 그 결과, 상기 실시예 <1-2>에서 뛰어난 내산성 균주로 선별된 유산균이 가장 우수한 내염성을 나타내는 것으로 확인되었다. 상기 유산균 균주는 NaCl 1~5%에서 생육이 활발하며, 특히 NaCl 5%에서도 90% 이상의 생존율을 나타내었다(도 2 참조).
<1-4> 선별된 유산균의 동정
a. 버지스의 분류 세균학 매뉴얼에 따른 분석
상기 실시예 <1-2> 및 <1-3>에서 선별된 유산균을 단일 콜로니로 분리한 후, 버지스의 분류 세균학 매뉴얼(Bergy's manual of systematic bacteriology)에 준하여 형태학적 및 생화학적 특성을 조사하였고, 그람 염색을 수행하였다. 그 결과, 상기 분리된 균주는 그람 양성 균주이며 간균의 형태를 갖고 있음을 확인할 수 있었다(표 1 및 도 3 참조).
| 특성 | 결과 |
| 그람(Gram) | + |
| 콜로니 형태(Colony form) | 구형(cocci) |
| 콜로니 색깔(Colony color) | 노란색(yellow) |
| 운동성(Motility) | - |
| 카탈라제(Catalase) | - |
| 발효형태 | 호모(Homo) |
| 포자(Spore) | - |
| 15℃에서 생육 | + |
| NaCl 4%에서 생육 | + |
b. API 시스템을 이용한 분석
이후, 상기 균주를 API 시스템(API system; La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 우선, 멸균 백금이로 균 콜로니를 취한 후 멸균 증류수 2 ㎖에 부유시켰다. 다시 상기 균액을 멸균 증류수 5 ㎖에 API 50CH 키트(BioMerieux, France)에서 제공되는 맥팔란드 표준 용액 No.2(MccFaland Standard Solution No.2)의 농도로 균액을 부유시켰다. 상기 부유액을 API 50CH 키트의 액체배지에 첨가하여 균질화시킨 후, API 50CH 키트의 50개 각 튜브에 200 ㎕씩 접종하였다. 미네랄 오일로 튜브 위를 엎어준 후, 30℃에서 48시간 동안 배양시켰다. 상기 배양액을 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정하였다. 그 결과, 상기 실시예 <1-2> 및 <1-3>을 통하여 선별된 유산균은 하기 표 2의 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는, 락토바실러스속에 속하는 균주인 것으로 판명되었다.
| 대조군 | - | D-만노즈 | + | 살리신 | + | 겐티오비오즈 | + |
| 글리세롤 | - | L-솔보즈 | - | 셀로비즈 | + | D-튜라노즈 | - |
| 에리쓰리톨 | - | 람노즈 | - | 말토즈 | + | D-리조즈 | - |
| D-아라비노즈 | - | 둘시톨 | - | 락토즈 | + | D-타가토즈 | - |
| L-아라비노즈 | + | 이노시톨 | - | 멜리비오즈 | + | D-퓨코즈 | - |
| 리보오즈 | + | 만니톨 | + | 사카로즈 | + | L-퓨코즈 | - |
| D-자일로즈 | + | 솔비톨 | - | 트레할로즈 | - | D-아라비톨 | - |
| L-자일로즈 | - | D-만노시드 | - | 이눌린 | - | L-아라비톨 | - |
| 아도니톨 | - | D-글루코시드 | + | 멜레지토즈 | + | 글루코네이트 | + |
| 자일로시드 | - | 글루코사민 | + | D-라피노즈 | _ | 2-세토-글루코네이트 | - |
| 갈락토즈 | + | 아미그달린 | + | 아미돈 | - | 5-세토-글루코네이트 | + |
| D-글루코즈 | + | 알부틴 | + | 글리코겐 | - | ||
| D-프록토즈 | + | 에스큘린 | + | 자일리톨 | + |
c. 16S rDNA 염기서열 분석
당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 상기 선별된 유산균의 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 상기 유산균의 16S rDNA 염기서열(서열번호 1)은 락토바실러스 사케이의 16S rDNA 염기서열과 99% 동일함을 확인할 수 있었다(결과 미도시).
따라서, 본 발명자들은 상기 유산균을 "락토바실러스 사케이 IFT-002"로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2005년 11월 23일자로 기탁하였다(기탁번호: KFCC-11360P).
<참조예>
상기 실시예 1의 방법으로 김치에서 분리된 총 200개의 유산균 콜로니 중에서 내산성과 내염성을 가지고 있는 균주를 선별하였고, 선별된 유산균을 단일 콜로니로 분리한 후, 상기 실시예 <1-4>의 버지스 분류 세균학 매뉴얼에 준하여 형태학적 및 생화학적 특성을 조사하였으며 API 시스템에 의한 분석 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 락토바실러스 사케이에 속하는 균주들을 동정하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 유산균을 "락토바실러스 사케이 IFT-237" 및 "락토바실러스 사케이 IFT-255"로 명명하였고, 이를 다음의 실시예와 실험예의 대조군으로 사용하였다.
<
실시예
2>
본 발명의 유산균의 내산성 정도 비교
본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002의 내산성 정도를 확인하기 위하여 대조군으로 김치에서 분리 동정된 균주인 락토바실러스 사케이 IFT-237 및 락토바실러스 사케이 IFT-255 균주를 사용하였다. 각 유산균을 젖산으로 pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0으로 조정한 MRS 브로스 10 ㎖에 각각 접종하였다. 37℃에서 2시간 배양하면서 생육유무를 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 균주 pH | 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 | 락토바실러스 사케이 IFT 237 | 락토바실러스 사케이 IFT 255 |
| 4.0 | + | + | + |
| 3.5 | + | + | + |
| 3.0 | + | + | + |
| 2.5 | + | - | - |
| 2.0 | + | - | - |
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002은 종래 류코노스톡 속 균주와 락토바실러스 사케이 IFT 237 및 락토바실러스 사케이 IFT 255 균주에 비하여 내산성이 현저히 강한 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
3>
본 발명의 유산균의 내염성 정도 비교
본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002의 내염성 정도를 비교하기 위하여 김치에서 분리된 락토바실러스 사케이 IFT 237 균주와 락토바실러스 사케이 IFT 255 균주를 사용하였다. 각 균주를 NaCl로 1, 2, 3, 4, 5% 로 조정한 MRS 브로쓰 10 ㎖에 각각 접종하였다. 이후, 25℃에서 72시간 배양하면서 생육유무를 관찰하여 생존율(%)을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 4 에 기재하였다.
| 균주 NaCl (%) | 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 | 락토바실러스 사케이 IFT-255(대조군) | 락토바실러스 사케이 IFT-237(대조군) |
| 생 존 율 (%) | |||
| 1.0 | 97.26 | 85.87 | 92.54 |
| 2.0 | 96.62 | 82 | 90.25 |
| 3.0 | 93.18 | 79.3 | 87.5 |
| 4.0 | 92.76 | 73.2 | 86.87 |
| 5.0 | 91.51 | 71.5 | 85.23 |
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002는 NaCl 5%에서도 90% 이상의 생존율을 보여 대조군 균주인 락토바실러스 사케이 IFT 255 및 락토바실러스 사케이 IFT 237 균주에 비하여 내염성이 현저히 강한 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
본 발명의 유산균 항균력 실험
본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002의 항균력을 알아보기 위하여 병원성균인 스타필로코코스 아우레우스 ATCC 25923(S.aureus ATCC 25923), 대장균 O157:H7 ATCC 43888(E.coli O157:H7 ATCC 43888), 바실러스 세레우스 KCCM 40133 (B.cereus KCCM 40133), 리스테리아 모노사이토게내스 KCTC 1014(L.monocytogenes KCTC 1014), 예르시니아 루케리(Yersinia ruckeri KCTC 12265), 스타필로코코스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis KCTC 3958)에 대해서 항균력을 테스트하였다. 대조군으로는 락토바실러스 사케이 IFT-255 균주를 사용하였다. 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002와 락토바실러스 사케이 IFT-255 균주를 MRS 브로스에서 20시간 동안 25℃에서 배양하였다. 배양액에 아세톤을 1:1로 처리하여 4℃에서 16시간 이상 정치 후 에바프레이터로 감압하여 아세톤을 증발시킨 후 항균력 테스트 샘플로 사용하였다.
각 병원성 균주들은 뉴트리언트 브로스(nutrient broth)에 3차 계대배양한 후 사용하였다. 각 병원성 균주들은 뉴트리언트 아가 배지에 1% 접종 후 디스크 페이퍼(disc paper) 방법에 의하여 항균력 실험을 하였으며, 플레이트에 생성된 생육 억제 환(clear zone) 사이즈를 측정하였다. 결과는 다음 표 5와 같다.
| 표지자 균주(Indicator strains) | 억제환(clear zone) | |
| 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 | 락토바실러스 사케이 IFT-255(대조군) | |
| 스타필로코코스 아우레우스 ATCC 25923 (S.aureus ATCC 25923) | 2 | 1.5 |
| 대장균 O157:H7 ATCC 43888 (E.coli O157:H7 ATCC 43888) | 1 | 1 |
| 바실러스 세레우스 KCCM 40133 (B.cereus KCCM 40133) | 3.5 | 4 |
| 리스테리아 모노사이토게내스 KCTC 1014 (L.monocytogenes KCTC 1014) | 9 | 4 |
| 예르시니아 루케리 (Yersinia ruckeri KCTC 12265) | 2.5 | 1 |
| 스타필로코코스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis KCTC 3958) | 11 | 7 |
상기 표 5에서 보는 바와 같이 본 발명의 신규 균주인 락토바실러스 사케이 IFT-002는 대조군인 락토바실러스 사케이 IFT-255에 비해 유해 병원성 세균들에 대해 생육 억제 활성이 우수한 균주인 것으로 확인되었다.
<실시예 5>
본 발명에 따른
유산균의 온도에
따른 생육 특성 분석
본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 균주를 배양하기 위한 천연배지를 제조하였다. 통상적인 방법에 따라 김치를 제조한 후, 24시간 동안 4℃에서 저온 숙성시켰다. 산도 0.25%, pH 5.84, 염도 2.3% 인 김치를 분쇄하고 착즙한 후 멸균하여 배지로 사용하였다. 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 균주와 대조군인 락토바실러스 사케이 IFT-237, 락토바실러스 사케이 IFT-255 및 류코노스톡 메센트로이드 DRC 0211 균주를 MRS 브로스 5 ㎖에 접종하고, 25℃에서 20시간 1차 전배양을 하였다. 이후, 상기 1차 전배양액을 상기 준비된 김치배지에 1.0%의 농도로 각각 접종하고, 25℃에서 20시간 동안 2차 전배양을 하였다. 상기 2차 전배양액을 다시 새로운 김치배지에 1.0%의 농도로 접종하여 25℃에서 20시간 동안 각각 본배양 하였다. 본 배양액을 다시 새로운 김치 배지에 1.0%의 농도로 접종하여 4℃ 및 20℃에서 각각 배양하면서 각 균주의 생육을 비교 관찰하였다.
4℃ 배양의 경우에는 5일 간격으로 15일 동안 균주의 생육을 관찰하여 생균수(log cfu/㎖)를 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 균주는 대조군 균주보다 4℃ 김치 배지에서 느린 속도로 생육하는 것으로 나타났다(도 4 참조).
20℃ 배양의 경우에는 6시간 간격으로 24시간 동안 균주의 생육을 관찰하여 생균수(log cfu/㎖)를 조사한 결과, 본 발명의 균주는 대조군 균주에 비해 더 빠른 생육 속도를 보였다(도 5 참조).
상기 결과들로부터 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 균주가 대조군 인 락토바실러스 사케이 IFT-237, 락토바실러스 사케이 IFT-255 및 류코노스톡 메센트로이드 DRC 0211 균주에 비해 4℃에서는 느리게 생장하고, 20℃에서는 빠르게 생장하는 온도 반응형 균주임을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 IFT-002 균주를 스타터로 이용하여 김치를 제조하는 경우, 중온(20℃)에서 숙성을 빨리 시킬 수 있으며, 그 숙성된 상태를 저온에서 장기간 유지시킬 수 있음을 나타내는 결과이다.
<실시예 6>
본 발명의 유산균을 이용한 김치의 제조
배추를 각각 소금으로 절여 배추의 염도가 2.3%가 되도록 하였다. 절인 배추(82.5중량%)에 고춧가루(2.5중량%), 마늘(2중량%), 생강(0.5중량%), 대파(2중량%), 무채(9중량%), 설탕(0.5중량%)의 김치 양념을 혼합하였다. 이후, 스타터로 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002을 김치 전체 중량에 대하여 1중량%(약 1×106 균주)로 첨가하였다. 이 때 양성 대조군에는 종래 김치에서 분리된 락토바실러스 사케이 IFT 237 균주를 첨가하였다. 또한 음성 대조군에는 스타터 유산균을 첨가하지 않았다. 이후, 제조된 각 김치를 20℃에서 20시간 동안 숙성시켰다.
<실험예 1>
제조된 김치의 산도 및 유산균 수 측정
<1-1> 산도 측정
상기 실시예 6에서 제조된 각 김치를 대상으로 산도를 측정하였다. 20℃에서 20시간 동안 숙성시킨 각 김치 100 g을 마쇄한 후 거즈로 여과하여 김치액을 제조하였다. 이후, 김치의 숙성된 상태를 비교하기 위하여 각 김치의 산도를 측정하였다. 산도는 NaCl 적정법을 이용하여 측정하였다. 각 김치로부터 김치즙액을 제조한 후, 김치즙액 5 ㎖의 pH를 측정하였다. 이후, 0.1N NaOH를 적정하여 pH 8.2 가 되는 시점의 0.1N NaOH의 첨가량을 계산하여 하기의 수학식 1로 산도(%)를 구하였다. 그 결과를 하기 표 6에 기재하였다.
*1N NaOH 인자 = 1
| 스타터로 첨가된 유산균 | 산도(%) |
| 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 | 0.42 |
| 락토바실러스 사케이 IFT237(양성 대조군) | 0.31 |
| 스타터 무첨가(음성 대조군) | 0.23 |
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002을 스타터로 첨가하여 제조된 김치의 산도가 가장 높은 것으로 나타났다. 상기 결과로부터 20℃에서 빠른 속도로 증식하는 특성을 갖는 본 발명의 유산균을 스타터로 이용하여 김치를 제조하는 경우, 중온에서 김치의 숙성 기간을 단축시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
<1-2> 김치의 유산균 수 측정
상기 실시예 6에서 제조된 각 김치의 유산균 수를 측정하였다. 20℃에서 20시간 동안 숙성시킨 각 김치를 0.85% 식염수로 10배 희석하였다. 총 유산균 수를 측정하기 위해서 MRS 아가 배지(MRS 아가, 디프코(Difco.); 박토 펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈 80 1 g, 구연산 2 g, 제2 인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g, 아가 15 g/증류수 1 ℓ) 플레이트에 김치 희석액 0.1 ㎖을 접종한 후, 유리막대로 도말하였다.
락토바실러스 속 균주의 측정을 위해서는 김치 희석액 0.1 ㎖씩을 m-LBS 아가 배지(트립톤 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈 80 1 g, 구연산 2 g, 제2 인산칼륨 6 g, 초산나트륨 35 g, 빙초산 2.5 ㎖, 황산망간 0.12 g, 황산마그네슘 0.57 g, 황산철 0.034 g/증류수 1ℓ) 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 류코노스톡 속 균수의 측정을 위해서는 김치 희석액 0.1 ㎖씩을 PES 아가 배지(트립톤 10 g, 효모추출물 0.5 g, 수크로스 20 g, 황산암모늄 2 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘 0.244 g, 페닐에틸 알콜 2.5 ㎖, 아가 15 g/증류수 1ℓ) 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 김치 희석액이 도말된 각 아가 플레이트를 25℃의 항온배양기에서 1일 동안 배양하였다. 생성된 집락의 수를 각각의 균수로 계수하였다.
| 스타터로 첨가된 유산균 ( log cfu / ml ) | 락토바실러스속 균주 | 류코노스톡 속 균주 | 총유산균수 |
| 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 | 7.59 | 6.58 | 8.54 |
| 락토바실러스 사케이 IFT237 (양성 대조군) | 7.48 | 6.16 | 8.45 |
| 스타터 무첨가(음성 대조군) | 6.58 | 6.24 | 7.83 |
상기 표 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치가 대조군 유산균을 첨가하여 제조된 김치에 비해 락토바실러스속 균주 및 류코노스 속 균주가 증가한 것을 확인할 수 있었다
<1-3> 김치의 유산균
우점확인
또한 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치 내에 본 발명의 균주가 우점 하는지 확인하기 위하여 변성 구배 겔 전기영동(Denturing gradient gel electrophoresis)방법 사용하였다. 변성 구배 겔 전기영동은 미생물을 분석하는 방법 중 한가지로 대표적인 미생물군의 핵산과 식품중에 들어있는 미생물군의 핵산을 동정한 후 비교하여 상기 식품 중에 어떤 균주가 우점하고 있는지 확인하는 방법이다. 상기 <실시예 6>에서 락토바실러스 사케이 IFT-002 균주를 사용하여 제조한 김치의 게놈(genomic) DNA를 추출하여 프라이머 338F(서열번호 2) 및 프라이머 518R(서열번호 3)을 사용하여 터치다운 PCR(touchdown-PCR)을 수행하였다. 즉 94℃에서 5분 예열을 하고 94℃에서 5분, 65℃에서 1분, 72℃에서 3분을 1 사이클로 하여 20 사이클을 돌리며 이때 한 사이클마다 65℃에서 0.5℃씩 온도를 내려준다. 그리고 94℃에서 5분, 55℃에서 1분, 72℃에서 3분 과정을 10 사이클 돌리고 마지막으로 72℃에서 10분간을 수행하여 증폭하였다.
프라이머 338F(서열번호 2)
5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG CGA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG -3
프라이머 518R(서열번호 3)
5'ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'
상기에서 수득한 PCR 증폭산물을 변성 구배 겔 전기영동(Denturing gradient gel electrophoresis)으로 분석하였다. 변성 구배 겔(Denturing gradient gel)은 7.5%의 폴리아크릴아마이드에 우레아와 포름아마이드를 변성제로 사용하여 20~50%까지 농도구배가 연속적으로 형성되도록 첨가하여 제작하였다. PCR 증폭산물은 20ul를 1X TAE 완충용액에서 60℃, 60V 로 14시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 1000X 사이버 그린(Syber Green)을 1X TAE 완충용액에 10000배 희석한 용액에 2시간 동안 염색한 후 이미지 분석기(Image analyzer)로 관찰한 결과 김치에서 락토바실러스 사케이 IFT-002 균주가 우점하는 것을 확인하였다(도 6 참조).
<실험예 2>
제조된 김치의 관능 검사
상기 실시예 6에서 제조된 각 김치의 관능검사를 수행하였다. 10℃에서 7일간 숙성시킨 각 김치에 대하여 훈련된 검사요원 10명에 의하여 관능검사를 수행하였다. 5점을 만점으로 기호도 척도법에 의해 실시하였으며, 유의성 검증은 t-test에 의해 실시하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
| 스타터로 첨가된 유산균 | 종합적인 맛 | 이미 | 외관 | 냄새 | 질감 |
| 본 발명의 락토바실러스 사케이 IFT-002 | 4.3 | 1.0 | 3.7 | 3.9 | 4.1 |
| 락토바실러스사케이 IFT 237 (대조군) | 3.1 | 1.5 | 2.5 | 2.8 | 3 |
| 스타터 무첨가(음성 대조군) | 2.8 | 2.0 | 2.1 | 2.5 | 2.8 |
그 결과, 상기 표 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 김치의 관능 특성이 대조군 유산균을 이용하여 제조된 김치에 비해 전반적으로 우수한 것으로 평가되었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규 락토바실러스 사케이는 내산성 및 내염성이 뛰어나고 항균력도 우수하며, 온도에 따른 생육특성을 갖는다. 따라서 본 발명의 유산균은 정장제, 생균제, 사료첨가제, 식품첨가제 및 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이를 스타터로 이용하여 김치를 제조하는 경우, 초기김치의 일반 세균수를 줄일 수 있으며 , 김치의 숙성기간을 단축시킬 뿐 아니라 그 숙성된 상태를 오랫동안 유지시킬 수 있다.
<110> DOOSAN CORPORATION
<120> Novel Lactobacillus sakei and use thereof
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 530
<212> DNA
<213> Lactobacillus sakei IFT-002
<220>
<221> gene
<222> (1)..(530)
<223> 16S rDNA
<400> 1
gcggagcncc gtnctcaaat acactgcagt ctaacgcacg tctcgtttag attgaaggag 60
cttgctcctg attgataaac atttgaagtg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta 120
acctgcccta aagtggggga taacatttgg aaacagatgc taataccgca taaaacctaa 180
caccgcatgg tgtagggttg aaagatggtt tcggctatca ctttaggatg gacccgcgga 240
tgcattagtt agttggtgag gtaaaggctc accaagaccg tgatgcatag ccgacctgag 300
agggtaatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 360
gggaatcttc cacacatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaacgaagg 420
ttttcggatc gtaaaactct gttgttcgga gaacgaatgt atctgatagt aactgatcag 480
gtagtgacgg tatccaacca gaaagccacg ggctaactac gtgccagcag 530
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 338F
<400> 2
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg cgacgggggg actcctacgg gaggcagcag 60
60
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 518R
<400> 3
attaccgcgg ctgctgg 17
Claims (11)
- pH 2-4에서 내산성 및 NaCl 1-5%에서 내염성을 갖고 항균 활성을 가지는 온도 반응형 락토바실러스 사케이.
- 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 사케이가 락토바실러스 사케이 IFT-002(기탁번호: KFCC-11360P)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이.
- 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 함유하는 정장용 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 함유하는 생균제 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 함유하는 사료용 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 함유하는 발효제품.
- 제7항에 있어서, 상기 발효제품은 김치인 것을 특징으로 하는 발효제품.
- 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 사케이 또는 이의 배양물을 스타터(starter)로 이용하여 발효제품을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 발효제품은 김치인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항의 락토바실러스 사케이를 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지에서 20-40℃, 14-30시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이의 배양방법.
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-
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