KR102229553B1 - 신규한 락토바실러스 파라카세이 ml7 균주 및 이를 이용한 김치 제조방법 - Google Patents

신규한 락토바실러스 파라카세이 ml7 균주 및 이를 이용한 김치 제조방법 Download PDF

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양은주
이창곤
김숙정
선유경
서예슬
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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주 또는 이의 배양액을 이용한 김치 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 내산성, 내염성 및 내담즙성이 우수할 뿐만 아니라 항산화 활성, 항암 활성 및 항균 활성이 우수한 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 및 이의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 내산성이 우수하여 김치의 발효 숙성기간 동안 우점종으로 증식하며, 내염성 및 내담즙성이 우수하고, 발효기간 동안 김치의 조직 연화가 거의 진행되지 않아 아삭하고 풍미가 우수한 김치를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 정장제, 생균제, 식품첨가제 및 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있고, 특히 김치 발효를 위한 스타터로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 녹차 및 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주를 이용하여 제조된 녹차김치는 녹차의 기능성을 최대화하면서도 기호성을 충족시킬 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주 및 이를 이용한 김치 제조방법{A Novel Lactobacillus paracasei ML7 and methods for preparing kimch using the same}
본 발명은 신규한 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주 또는 이의 배양액을 이용한 김치 제조방법에 관한 것이다.
우리나라는 국민소득의 증대, 이로 인한 사회, 문화적인 생활양식의 변화와 더불어, 김치의 소비 패턴이 각 가정에서 직접 제조하여 섭취하는 형태로부터 제품화된 김치를 구입하여 섭취하는 소비 형태로 점차 바뀌어 가고 있다. 이로 인해, 김치는 확고한 내수 시장을 확보하고 있으며, 독특한 풍미와 탁월한 항암 효과 등이 국제사회에 알려지면서 국제시장에서도 점차 자리를 잡아가고 있다.
이러한 김치는 배추, 무 등의 신선한 야채 원료와 각종 젓갈류 및 향신료 등을 혼합하여 제조되는 우리나라 고유의 종합발효식품으로서, 채소류에 자생하는 각종 젖산 미생물에 의해 각종 저분자 물질이 생성됨으로 유기산을 비롯한 여러 가지 영양 성분이 다량 함유되어 있으며 독특한 맛과 향기를 갖고 있는 것이 특징이다. 김치의 종류는 첨가 재료 및 제조 방법에 따라 매우 다양하여 약 180 여종에 이르며 일반적으로 김치 제조에는 고춧가루, 마늘, 생강, 부추 등의 부재료가 첨가되는데 이들이 김치 발효에 관여하는 미생물의 생육에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
최근에는 김치의 수송 및 유통과정에서 발생되는 산패를 방지하고 저장기간을 연장시키기 위한 연구가 다양하게 이루어지고 있는데, 인공 식품 보존제의 유해성에 민감한 소비자들의 성향을 고려할 때 천연 첨가물에 의해 숙성된 김치의 산패를 지연시키는 방법이 요구되고 있다.
한편, 최근 보고되고 있는 연구 결과에 따르면, 많은 유럽 국가 중 일부 국가에서 암의 발생 수치가 현저하게 낮은 국가들이 있었는데, 이들 국가의 공통점을 보면 일반적으로 발효식품들을 많이 섭취하는 국가들이었으며, 특히 핀란드, 불가리아의 경우 요구르트 등 발표식품의 섭취가 많기 때문에 암 발생률이 현저하게 낮아진다는 보고가 있었다.
또한, 우리나라의 경우도 대표적인 젖산균 발효 식품인 김치를 국민의 대부분이 섭취하고 있어 다른 나라에 비해 암 발생율이 낮은 것으로 보고된 바 있으며, 이러한 김치에는 류코노스톡, 락토바실러스, 스트렙토코커스, 페디오코커스 등과 같은 젖산균이 함유되어 있다. 이러한 유익한 젖산균은 장내 pH를 낮춰 유해 미생물 및 병원성 미생물의 성장을 억제하는 정장 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있고, 발암성 전구물질을 발암성 물질로 전환시키는 효소들의 활성을 억제하는 효과가 있다는 사실도 보고되고 있다.
따라서 최근에는 이러한 젖산균을 이용하여 기호도가 높으면서도 생체 유용한 기능을 갖는 기능성 김치를 개발하려는 연구가 시도되고 있다.
김치의 품질 및 관능을 향상시키고 김치의 발효 상태를 조절할 수 있는 신규한 유산균 균주를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 김치로부터 내산성, 내염성, 내담즙성이 우수할 뿐만 아니라 항산화 활성, 항암 활성 및 항균 활성이 우수한 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주를 새로이 분리 및 동정하는데 성공하였으며, 상기 균주의 발효제품에 대한 응용 가능성을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다. 특히, 상기 균주를 이용하여 김치를 제조하는 경우에는 장기간 보존하여도 아삭한 식감을 유지하며 풍미가 향상되며 기호도가 높은 김치를 제조할 수 있는 것을 구체적으로 확인하였다.
KR 10-1580732 B KR 10-2019-0023505 A
본 발명의 목적은 내산성, 내염성, 내담즙성이 우수할 뿐만 아니라 항산화 활성, 항암 활성 및 항균 활성이 우수한 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P]를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 또는 이의 배양액을 이용한 김치 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 녹차, 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 또는 이의 배양액을 이용한 녹차김치 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P]를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 또는 이의 배양액을 소금에 절인 김치용 채소 및 양념과 혼합하여 김치를 제조하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계로부터 제조된 김치를 발효시키는 단계;를 포함하는 김치 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 녹차, 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 또는 이의 배양액을 소금에 절인 김치용 채소 및 양념과 혼합하여 김치를 제조하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계로부터 제조된 김치를 발효시키는 단계;를 포함하는 녹차김치 제조방법을 제공한다.
본 발명은 내산성, 내염성 및 내담즙성이 우수할 뿐만 아니라 항산화 활성, 항암 활성 및 항균 활성이 우수한 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 및 이의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 내산성이 우수하여 김치의 발효 숙성기간 동안 우점종으로 증식하며, 내염성 및 내담즙성이 우수하고, 발효기간 동안 김치의 조직 연화가 거의 진행되지 않아 아삭하고 풍미가 우수한 김치를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 정장제, 생균제, 식품첨가제 및 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있고, 특히 김치 발효를 위한 스타터로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 녹차 및 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주를 이용하여 제조된 녹차김치는 녹차의 기능성을 최대화하면서도 기호성을 충족시킬 수 있다.
도 1은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주(KCCM12594P)의 균체 형태학적 특징을 나타내는 사진이다.
도 2는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주의 서열목록을 나타낸 것이다.
도 3은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주의 용혈성시험 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주의 생육곡선을 나타내는 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주의 pH 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주의 염 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주에 인공위액 및/또는 인공담즙을 처리한 후의 생존력을 나타내는 그래프이다.
도 8은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주의 지시균(그람양성균, 그람음성균, 곰팡이 및 효모균)에 대한 항균 활성을 나타내는 사진이다.
도 9는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주의 Bacillus cereus(세균) 및 Penicillium roqueforti(진균)에 대한 생균시간에 따른 항균활성을 나타내는 그래프이다.
도 10은 대조군 및 실시예에서 제조된 김치에 대하여 관능평가를 실시한 결과를 나타내는 그림이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P]에 관한 것이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P]는 전통발효식품 유래의 락토바실러스 파라카세이 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주를 김치에서 분리, 동정하기는 하였으나, 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예를 통해 김치로부터 분리한 ML7 균주는 미생물 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 서열번호 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 상기 핵산서열은 NCBI GenBank(http://www.ncbi.nin.gov)에서 제공하는 블라스트 서치 프로그램(blast search program)을 통해 상동성(homology)을 확인해 본 결과, 락토바실러스 파라카세이 JCM 8130 표준균주와 99% 동일함을 확인할 수 있었다.
따라서, 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 락토바실러스 파라카세이 ML7(Lactobacillus pracasei ML7)로 명명하였으며, 한국종균협회(KCCM)에 2019년 10월 2일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM12594P).
본 발명의 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 그람양성균이며, 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이고, 단간균의 형태를 취하고 있다.
본 발명의 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 용혈성이 없고, 암 발생에 관여하는 유해효소를 생성하지 않으며, pH 및 염 안정성이 매우 높고, 장내 생존성이 매우 높다. 또한, 상기 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 항산화 활성, 항암 활성 및 항균 활성이 매우 높아 발효식품의 제조에 매우 유용하다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 락토바실러스 파라카세이 ML7(Lactobacillus pracasei ML7) 균주를 포함하는 유산균 스타터(starter)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "스타터(starter)"란 식품의 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제로, 발효식품 제조 시 첨가함으로써 숙성된 식품에서 지배적으로 생장하는 미생물을 말한다. 본 발명에 있어서, 스타터란 발효식품의 맛을 일정하게 조절하고 우수한 관능미를 제공하는 미생물, 즉 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주를 필수적으로 포함하는 제제를 의미한다.
한 구체예에서, 상기 유산균 스타터는 발효식품의 제조를 위해 사용될 수 있다. 상기 발효식품으로는 김치, 치즈 등의 발효식품이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 김치의 제조시 유산균 스타터로 사용될 수 있으며, 이를 이용하는 경우 김치의 숙성을 일정하게 도와주면서 잘 숙성된 김치의 맛을 장기간 유지할 수 있을 뿐만 아니라 김치의 아삭한 식감을 유지하도록 도와준다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 스타터는 액상 제제, 분말 제제 등으로 제형화할 수 있으며, 예를 들면 분말 제제로 사용할 수 있다. 분말 제제는 배양된 균주를 원심분리 등의 방법으로 수집하여 동결 건조시켜 수득할 수 있다. 스타터 균주를 발효식품에 첨가하는 경우, 균 배양액에서 분리한 젖은 형태의 균체를 첨가하는 것이 일반적이지만 액상 제형은 보관이 어렵고 유통 중 품질 유지가 어려워 이를 상품으로 유통시키기 어려운 단점이 있다. 반면에, 분말 제제는 공급, 품질 유지 및 사용이 용이하다는 장점이 있다. 상기 스타터는 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주뿐만 아니라, 콩가루, 탈지유(skim milk), 아미노산류, 당류, 당알코올류, 전분 등 통상적으로 스타터에 첨가되는 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 a) 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 또는 이의 배양액을 소금에 절인 김치용 채소 및 양념과 혼합하여 김치를 제조하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계로부터 제조된 김치를 발효시키는 단계;를 포함하는 김치 제조방법에 관한 것이다.
상기 김치 제조방법에 있어서, 상기 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 균주 자체로 첨가되거나 배양액으로 첨가될 수 있다. 상기 배양액은 균주를 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 농축한 농축액 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 김치라 함은 통상의 김치의 주재료에 양념을 첨가하여 제조되는 당해 분야에서 일반적으로 알려진 것을 통칭하는 것이다. 상기 김치의 주재료와 양념은 제조하고자 하는 김치의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 김치의 주재료는 배추, 무, 갓 또는 열무 등일 수 있고, 양념은 파, 마늘, 생강, 액젓, 설탕, 소금, 고춧가루 등과 같은 재료를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 주재료에 양념이 더해져 제조되는 김치는 배추김치, 갓김치, 무김치, 깍두기 등일 수 있으나, 상기와 같이 김치의 종류를 한정하는 것은 아니다. 즉, 본 발명에 따른 김치의 제조방법은 당해 분야에서 통상적으로 알려진 방법에 의해 제조되는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 김치 양념은 통상적으로 사용되는 재료를 포함하는 김치 양념이라면 모두 적용할 수 있는 것으로, 포함되는 재료에 제한이 있는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 한 구체예에서, 김치의 제조시 김치의 주 재료를 배추로 한정하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 김치의 주 재료는 통상적으로 사용되는 모든 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 김치 제조방법에 있어서, 상기 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 접종 초기 균수를 기준으로 유산균 수가 김치 kg 당 1×105 내지 1×1011 cfu가 되도록 첨가할 수 있고, 바람직하게는 1×106 내지 1×1010 cfu, 더욱 바람직하게는 1×107 내지 1×109 cfu, 더욱 바람직하게는 1×108 내지 1×109 cfu가 되도록 첨가할 수 있다.
상기 균수가 상기 하한치 미만인 경우에는 본 발명에서 기대하는 효과를 얻기가 힘들어질 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 김치 발효가 너무 빨리 진행되는 문제가 발생할 수 있다.
상기 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주를 김치의 제조에 사용할 경우, 상기 균주가 첨가되지 않은 김치와 비교하여 탄산미 및 관능미가 우수할 뿐만 아니라 아삭한 식감이 증대된 김치를 제조할 수 있다.
구체적으로, 하기 실시예에서는 김치 제조시 상기 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주를 접종한 김치와 그렇지 않은 김치를 비교한 결과, 상기 균주는 균주를 접종한 김치에서 우점종(dominant species)으로서 발효를 주도하면서 아삭한 식감을 증대시키는 것을 확인하였다. 또한, 김치 제조시 상기 균주를 첨가하면 김치의 숙성 초기부터 상기 균주가 발효주도균으로 존재함으로써 김치 내의 항산화 효과, 항균 효과 및 항암 효과를 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 우수한 관능미와 아삭한 식감 증대 효과를 나타내기 위해 김치 양념에 분말 제제 또는 액상 제제로 첨가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 a) 녹차, 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 또는 이의 배양액을 소금에 절인 김치용 채소 및 양념과 혼합하여 김치를 제조하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계로부터 제조된 김치를 발효시키는 단계;를 포함하는 녹차김치 제조방법에 관한 것이다.
상기 녹차는 김치 전체 중량에 대하여 0.1 내지 2.0 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 1.0 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.3 중량%로 첨가될 수 있다.
상기 녹차를 상기 상한치를 초과하여 첨가하는 경우에는 녹차 특유의 쓴 맛 및 떫은맛으로 인해 김치의 맛을 저하시키게 되며, 상기 하한치 미만으로 첨가하는 경우에는 녹차를 첨가함으로 인한 효과가 미미할 수 있다.
본 발명에 따른 김치 제조방법에 있어서, 상기 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주는 접종 초기 균수를 기준으로 유산균 수가 김치 kg 당 1×105 내지 1×1011 cfu가 되도록 첨가할 수 있고, 바람직하게는 1×106 내지 1×1010 cfu, 더욱 바람직하게는 1×107 내지 1×109 cfu, 더욱 바람직하게는 1×108 내지 1×109 cfu가 되도록 첨가할 수 있다.
상기 a) 단계의 녹차, 및 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주 또는 이의 배양액은 상기 녹차를 우린 물에 상기 균주 또는 이의 배양액을 첨가하여 발효시킨 녹차 발효물의 형태로 첨가할 수 있다.
상기 녹차를 우린 물은 멸균수 100 중량부에 살균 처리한 녹차 분말을 25 내지 45 중량부로 첨가하여 우린 것일 수 있다. 상기 녹차의 발효는 27 내지 35 ℃에서 28 내지 30 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 김치 제조방법에 있어서, 녹차를 첨가할 때에 녹차를 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주 또는 이의 배양액으로 발효시킨 녹차 발효물의 형태로 첨가하는 경우에는 상기 녹차 및 ML7 균주를 각각 첨가하여 제조한 김치와 비교하여 감칠맛이 더욱 증대되며, 녹차의 쓴 맛 및 떫은맛이 전혀 나지 않아 기호도가 더욱 높은 김치를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법으로 녹차김치를 제조할 경우, 녹차의 기능성은 그대로 함유하면서 녹차 특유의 쓴 맛 및 떫은맛이 전혀 나지 않을 뿐만 아니라 탄산미, 감칠맛이 더욱 증대되고 아삭한 식감이 더욱 증대된 김치를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 방법에 따라 제조되어, 상기 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 김치를 제공한다.
상기 김치는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주를 김치 kg 당 1×105 내지 1×1011 cfu, 바람직하게는 1×106 내지 1×1010 cfu, 더욱 바람직하게는 1×107 내지 1×109 cfu, 더욱 바람직하게는 1×108 내지 1×109 cfu로 포함하는 김치일 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1: 신균주의 분리 및 동정
1-1. 김치로부터 유산균의 분리
통상적인 김치의 제조방법으로 제조된 여러 종류의 김치(배추김치, 무김치, 열무김치, 파김치, 기타 등등)를 수집하여 유산균 분리 김치 시료로 사용하였다. 상기 김치 시료를 채취하여, 0.85% 식염수로 10배 희석하고, 이를 0.1㎖씩 MRS 아가 배지에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 30℃의 항온 배양기에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 30℃에서 2일 동안 배양하여 유산균 콜로니들을 분리하였다.
상기 유산균 콜로니들을 이용하여 다양한 김치 발효실험을 수행하였으며, 이로 인해 기능적으로, 관능적으로 우수한 균주를 선정하였고, 김치로부터 유산균을 분리 동정하는 방법에 따라 상기 균주를 분리하였다.
1-2. 분리한 균주의 분자생물학적 동정
실시예 1-1에서 분리한 균주의 분자생물학적 특징을 조사하기 위해 균주 배양액으로부터 염색체 DNA를 분리한 후, 상기 염색체 DNA는 미생물 동정을 위하여 16s rRNA gene의 전체 염기서열 분석을 수행하였다. 상기 동정한 균주는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 균주인 것으로 조사되었고, 상기 동정한 균주의 염기서열(16s rRNA 서열)을 서열번호 1에 나타내었다.
상기 균주를 GenBank에 등록된 다른 균주들과 염기서열을 비교한 결과 표준균주인 Lactobacillus paracasei JCM 8130 표준균주와 99%의 상동성을 나타내었으며, 서열번호 1과 100% 상동성을 갖는 균주는 기존에 존재하지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 이들 균주들을 2019년 10월 2일자로 한국종균협회(KCCM)에 기탁하여 하기와 같은 수탁번호를 부여받았다.
락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) - 수탁번호 KCCM12594P(일명 "ML7"라고 명명함)
1-3. 형태학적 특성
ML7 균주의 형태학적 특성에 대한 분석은 상기 균주의 콜로니의 모양 및 색을 관찰하고, 상기 균주를 그람염색(Gram stain kit, BD Co., USA)한 후에 광학현미경으로 모양을 관찰하였으며, 그 결과를 도 1 및 하기 표 1에 나타내었다.
특성 ML7 균주
그람염색(Gram-strain) 여부 +(양성)
콜로니 형태 단간균&구형
콜로니 표면 매끈함
콜로니 색 연한 아이보리색
콜로니 불투명도 불투명함
표 1에 나타낸 바와 같이, 분리 균주인 ML7 균주는 그람양성 균주이고, 광학현미경 관찰 결과 단간균 형태이며, 콜로니 색깔이 연한 아이보리색을 나타내는 것을 확인하였다.
1-4. 생화학적 특성 - 당대사능 분석 결과
ML7 균주의 생화학적 특성에 대한 분석을 API 50 CHL kit(BioMerieux, France)을 이용하여 당 대사능을 검토하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
구체적으로는, ML7 균주를 5 mL의 MRS 액체배지에 계대배양하여 30℃에서 24시간 배양한 후 배양액 1 mL을 13,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 걷어내고 세포 펠렛만 회수하여 PBS(phosphate buffered saline, 0.1M, pH 7.0)로 2회 세척한 뒤 실험에 사용하였다. PBS와 McFarland 스탠다드를 이용하여 2와 같은 탁도로 맞추어 현탁액을 제조하였고, API 50 CHL 배지에 현탁한 균주 배양액 1 ㎖을 첨가 후 혼합하여, API 50 CH 스트립에 120㎕씩 분주하고, 미네랄 오일(mineral oil)로 튜브 당 2~3방울씩 첨가하여 30℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양한 후 각각의 당 발효패턴을 비교하였다. 당 발효 패턴은 튜브의 색 변화를 확인하여 양성 및 음성으로 판독하였다.
당 대사능 당 대사능 당 대사능
글리세롤 - 만니톨 + D-라피노즈 -
에리쓰리톨 - 솔비톨 + 아미돈 -
D-아라비노즈 - α-메틸-D-만노시드 - 글리코겐 -
L-아라비노즈 - α-메틸-D-글루코시드 - 자일리톨 -
리보오즈 + N-아세틸-글루코사민 + β-겐티오비오즈 +
D-자일로즈 - 아미그달린 + D-튜라노즈 +
L-자일로즈 - 알부틴 + D-리조즈 -
아도니톨 + 에스큘린 + D-타가토즈 +
β-메틸-자일로시드 - 살리신 + D-퓨코즈 -
갈락토즈 + 셀로비즈 + L-퓨코즈 -
D-글루코즈 + 말토즈 + D-아라비톨 -
D-프룩토즈 + 락토즈 - L-아라비톨 -
D-만노즈 + 멜리비오즈 - 글루코네이트 +
L-솔보즈 - 사카로즈 + 2-케토-글루코네이트 -
람노즈 - 트레할로즈 + 5-케토-글루코네이트 -
둘시톨 - 이눌린 -
이노시톨 - 멜레지토즈 -
시험예 1: ML7 균주의 특성 분석
1-1. 균주 안정성 분석
1) 용혈성 검사 : 용혈성 없음
용혈성 여부는 용혈성시험 배지를 이용한 클리어존(clear zone)을 확인하여 이루어졌다. blood agar 배지에 ML7 균주를 스트레킹하고 24시간 배양 후 클리어존을 확인하여 도 3에 나타내었다. 도 3은 ML7 균주의 용혈성시험 결과를 나타내는 사진이다.
도 3을 살펴보면, ML7 균주는 용혈성 능력이 없음을 확인할 수 있었다. 한편, 양성대조군으로서 바실러스 세레우스(bacillus cereus) 균주가 사용되었는데, 상기 바실러스 세레우스 균주는 용혈성 능력이 있는 것을 확인할 수 있다.
2) 인체 유해효소 생성 여부(암 발생 관련) : 유해효소 음성
ML7 균주가 암 형성에 관여할 수 있는 유해 효소를 생성하는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, API ZYM kit(bioMeriux Co., France)를 이용하여 유해 효소 생성 여부를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구체적으로, ML7 균주를 MRS 고체 배지에서 배양한 후 균체를 회수하여 0.85% NaCl 용액에 현탁해 5~6 Macfarland 스탠다드로 조정하였다. API ZYM kit의 각 각두(cupule)에 현탁액을 분주하고 30℃에서 4시간 배양한 후에 ZYM-A 및 ZYM-B 시약을 한 방울씩 떨어뜨려 색깔의 변화를 관찰함으로써, 효소 활성 정도를 조사하였다.
효소 ML7
Control -
Alkaline phosphate -
Esterase(C4) -
Esterase lipase(C8) -
Lipase(C14) -
Leucine arylamidase +
Valine arylamidase +
Crystine arylamidase -
Trypsin -
α-Chymotrypsin -
Acid phosphatase -
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase +
α-Galactosidase -
β-Galactosidase -
β-Glucuronidase -
α-Glucosidase +
β-Glucosidase -
N-Acetyl-β-glucosaminidase -
α-Mannosidase -
α-Fucosidase -
표 3을 살펴보면, ML7 균주는 β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 및 β-글루코시다아제(β-Glucosidase)와 같은 암 형성에 관여할 수 있는 효소를 생성하지 않는 것으로 분석되었다.
1-2. 생육 곡선
ML7 균주의 생장특성을 확인하기 위해 균주의 증식정도를 생균수와 pH 변화로 나타내고자 하였다.
이를 위하여, ML7 균주를 MRS 액체배지에 접종한 후, 30 ℃에서 72 시간 동안 정치배양하면서 시간별 배양액을 멸균식염수를 이용하여 10-fold 씩 희석하고, 희색액 100μL를 MRS 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지를 30℃에서 24시간 배양한 후 집락수를 측정하여 Log cfu/mL로 계산하여 생육곡선을 작성하였으며, pH의 변화는 pH meter(Orion 3 Star, Thermo Scientific)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) ML7 균주의 생육곡선을 나타내는 그래프이다.
도 4를 살펴보면, ML7 균주의 생육은 배양 직후부터 12 시간 사이에 대수증식기를 보였으며, 8시간 이후에는 완만한 증가세로 정체기에 있음을 확인할 수 있었다. 또한, pH의 변화는 ML7 균주의 증식곡선에 비례하여 배양 직후부터 12 시간 사이에 급격한 저하를 보였고, 이때 pH 3~4 수준으로 김치 제조에 적용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
1-3. 산업적 안정성 : pH 및 염 안정성
1) pH 안정성 : pH 3~9 범위에서 생육 안정성 확인
ML7 균주에 대하여 여러 pH 조건에서 안정성 실험을 진행한 후, 실험 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 ML7 균주의 pH 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 5를 살펴보면, ML7 균주는 pH 3~9 범위에서 생육 안정성을 나타내는 것을 알 수 있다.
2) 염 안정성 : NaCl 2~15% 범위에서 생육 안정성 확인
ML7 균주에 대하여 여러 염 농도 조건에서 안정성 실험을 진행한 후, 실험 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 ML7 균주의 염 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 6을 살펴보면, ML7 균주는 NaCl 2~15%(w/w) 범위에서 생육 안정성을 나타내는 것을 알 수 있다.
1-4. 건강기능성 평가(in vitro)
1) ML7 균주의 소화액 내성 평가(장내 생존성 평가)
ML7 균주의 소화액 내성(장내 생존성)을 평가하기 위하여 ML7 균주에 인공위액 및/또는 인공담즙을 처리한 후의 생존력을 확인하고자 하였다.
이때, 인공위액 처리군은 ML7 균주를 pH 2.5로 조정한 MRS 배지 10 mL에 접종한 것이고, 인공담즙 처리군은 ML7 균주를 옥스갈(oxgall)로 0.3(v/v)로 조정한 MRS 배지 10 mL에 접종한 것이며, 인공위액 및 인공담즙 처리군은 ML7 균주를 pH 2.5로 조정한 조정한 MRS 배지 10 mL에 접종하고 37℃에서 2시간 배양한 후 다시 옥스갈(oxgall)로 0.3(v/v)로 조정한 MRS 배지 10 mL에 접종한 것이다.
이후, 37℃에서 2시간 배양하면서 상기 균주의 생육을 관찰하고 도 7에 나타내었다.
도 7을 살펴보면, 본 발명에 따른 ML7 균주는 인공위액 및/또는 인공담즙을 처리한 후에도 생존력이 매우 우수하여 장내 생존성이 높은 것을 확인할 수 있다.
2) ML7 균주 배양액의 항산화 활성
ML7 균주의 항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl, Sigma-aldrich, MO, USA)의 방법에 따라 실험하였다. 구체적으로 ML7 균주를 MRS 아가 배지에 획선 도말한 후 30℃ 배양기에서 48시간 배양하였으며 단일 콜로니를 5 ml MRS 브로스에 접종하여 30℃에서 24시간 정치배양하였다. 배양액 1 ml을 1.7 ml 튜브에 취한 후 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 100 μM DPPH 메탄올 용액 9.5 mL에 0.5 mL의 배양 상등액을 첨가한 후 반응 산물은 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(TECAN)로 517nm에서 흡광도를 측정하여 아래 식에 따라 항산화 활성을 측정하였다. 대조군으로는 0.1 mg/mL의 아스코르브산 용액을 이용하였다.
[식 1]
DPPH 라디칼 소거능(%) = 100 - [(샘플의 흡광도/대조구의 흡광도) × 100]
구분 ML7 균주 배양액 아스코르브산 용액(0.1 mg/mL)
DPPH 라디칼 소거능(%) 72.88±0.51 62.57±1.25
표 4를 살펴보면, ML7 균주 배양액의 항산화 활성이 매우 높은 것을 확인할 수 있다.
3) ML7 균주의 암세포 성장 억제 효과
ML7 균주가 다양한 암세포주에서 항암 효능을 나타내는지 여부를 확인하기 위해서, 인간 유래 암 세포주를 이용하여 MTT assay를 시행하였다. MTT assay에 사용된 암 세포주로는 위암(AGS) 및 대장암(HT-29)으로 총 2종의 암 종을 이용하여 실험하였다.
구체적으로, ML7 균주를 배양 후 8,000 ×g 5분 원심분리하여 배양 상등액(cell-free extract)을 시험용액으로 사용하였다.
이후, 암 세포주를 96-well plate에 1~5×103 cells/well이 되도록 분주하고 24시간 후 상기 ML7 균주의 배양 상등액(cell-free extract)을 각각 10 ㎕/mL, 20 ㎕/mL, 40 ㎕/mL 및 80 ㎕/mL 농도로 첨가하여 72시간 배양한 다음, 각각의 well에 MTT (3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue) 시약을 처리하여 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 살아있는 세포의 미토콘드리아에 반응하여 노란색인 MTT가 보라색으로 변하는 과정을 거쳤다. 이후 MTT가 들어간 배양액은 모두 제거하고 100 ㎕의 DMSO를 각 well에 첨가하여 보라색의 농도를 Microplate reader 장비를 사용하여 540nm 흡광도에서 측정하였다. ML7 균주의 암세포에 대한 증식 억제율(세포독성)은 대조군(무처리구)의 흡광도와 비교하여 계산하였고 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
배양 상등액(cell-free extract) 농도(㎕/mL) 암세포 증식 억제율(%)
위암 세포(AGS) 대장암 세포(HT-29)
10 31.20±6.51 1.13±7.48
20 33.21±4.83 4.61±4.81
40 37.84±6.57 8.76±5.35
80 82.91±3.50 79.35±5.56
표 5를 살펴보면, 본 발명의 ML7 균주는 위암 세포 및 대장암 세포를 포함하는 다양한 암 세포주에서 우수한 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.
1-5. ML7 균주의 항균 활성
ML7 균주의 식품 유해 균주 및 식중독 균에 대한 생육 저해 활성을 확인하고자 하였다.
1) 생균 어세이
항균 활성 측정은 dual culture overlay assay 방법을 이용하여 다음과 같이 시행하였다. 24시간 동안 배양한 ML7 균주의 배양액 10 μl를 피펫을 이용하여 MRS 고체배지의 중앙에 3 cm 길이로 그어주었다. 지시균 중 세균은 LB, 곰팡이는 potato dextrose soft agar(0.7% agar) 10 ml에 106 cfu를 첨가하여 ML7이 접종된 MRS 고체 배지에 부어주었다. ML7과 지시균이 접종된 평판배지들은 30℃에서 24~48 시간 배양하여 형성되는 지시균 생육 저해환의 형성 유무 및/또는 크기를 관찰하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 ML7 균주의 지시균(그람양성균, 그람음성균, 곰팡이 및 효모균)에 대한 항균 활성을 나타내는 사진이다.
도 8을 살펴보면 다양한 균주에 대하여 항균 활성을 나타내며, 특히 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus ATCC 10240), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCCM 11204), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC 1621), 대장균(Escherichia coli KCTC 12119 및 Escherichia coli O157 ATCC 43895), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica subsp. enterica KCTC 2515), 슈도모나스 에루시노사(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) 및 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans KCTC 16316)에서 높은 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
2) 배양 농축 상등액 2-fold dilution assay
ML7 균주를 100 ml MRS 배지에서 24시간 배양한 다음 원심분리(8,000 rpm, 15분, 4℃)하고 멤브레인 필터(0.45 ㎛, Dismic, Advantec)로 여과한 후 제균한 상등액을 동결건조 하였다. 동결건조한 상등액을 멸균수 20 ml에 녹여 조항균 물질을 제조한 후 2-fold 희석하여 항균 활성 평가에 사용하였다. 항균 활성을 위한 지시균은 1×106 cfu/ml로 희석하여 세균은 LB 고체배지에, 곰팡이는 PDA 고체배지에 100 μl를 도말하고, 지시균이 도말된 배지 위에 2배씩 순차적으로 희석된 조항균물질을 10 μl씩 loading하여 세균은 37℃, 곰팡이는 30℃에서 배양하면서 생육저해 여부를 관찰하였다. 항균 활성 역가는 항균 물질을 순차적으로 2배씩 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역수를 취하고, 이 값에 1 ㎖에 대한 환산계수를 곱하여 AU/㎖로 나타내었다.
균주 분류 항균력(AU/mL)
Micrococcus luteus ATCC 10240 그람양성 세균 800
Enterococcus faecalis ATCC 19433 그람양성 세균 200
Bacillus cereus KCCM 11204 그람양성 세균 3200
Listeria monocytogenes KCTC 40307 그람양성 세균 200
Staphylococcus aureus KCTC 1621 그람양성 세균 1600
Escherichia coli KCTC 12119 그람음성 세균 1600
Escherichia coli O157 ATCC 43895 그람음성 세균 1600
Salmonella enterica subsp. enterica KCTC 2515 그람음성 세균 3200
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 그람음성 세균 3200
Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans KCTC 16316 곰팡이 400
Aspergillus Flavus ATCC 9643 곰팡이 400
Penicillium roqueforti ATCC 10110 곰팡이 400
Pichia membranifaciens ATCC 22687 효모균 200
Candida albicans ATCC 11006 효모균 200
Kluyveromyces fragilis KCTC 7156 효모균 100
상기 표 6을 살펴보면, ML7 균주는 다양한 그람 양성균, 그람 음성균, 곰팡이 및 효모균에 대하여 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
3) 생육에 따른 항세균 및 항진균 활성
ML7 균주의 생장에 따른 항세균 및 항진균 활성을 확인하고자 하였다.
도 9는 ML7 균주의 Bacillus cereus(세균) 및 Penicillium roqueforti(진균)에 대한 생균시간에 따른 항균활성을 나타내는 그래프이다.
도 9를 살펴보면, ML7 균주가 생육함에 따라 항세균 활성 및 항진균 활성이 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있다.
4) ML7 균주가 생산하는 항균성 물질의 특성(효소 및 열처리 안정성)
ML7 균주에 함유된 항균 물질의 효소처리 안정성 및 열처리 안정성을 확인하고자 하였다.
항균 활성 실험의 방법으로 준비된 조항균 물질에 대한 열처리 및 효소처리가 지시균(B. cereus 및 P. roquefortii)에 대한 항균활성에 미치는 영향을 2-fold dilution assay로 조사하여 그 결과를 다음 표 7에 각각 나타내었다. 그 결과, ML7 균주가 생산하는 항균성 물질이 열 안정성 및 효소 안정성이 있는 것을 확인하였다.
효소처리 잔존 항균력(AU/mL) 열처리 잔존 항균력(AU/mL)
B. cereus P. roquefortii B. cereus P. roquefortii
대조군(무처리) 3200 400 30 ℃, 24 시간 3200 400
프로티나아제 K 3200 400 50 ℃, 24 시간 3200 400
프로테아제 3200 400 70 ℃, 24 시간 3200 400
프로나아제 E 3200 400 100 ℃, 30 분 3200 400
트립신 3200 400 121 ℃, 15 분 3200 400
키모트립신 3200 400
아밀라아제 3200 400
리파아제 3200 400
실시예 2: ML7 균주를 이용한 김치의 제조
2-1. 균주의 준비
상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 유산균을 평판배지에 도말하여 48시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하여 단일 콜로니를 분리하였다. 분리한 콜로니를 채취하여 액체 MRS 배지에 첨가하고, 37 ℃, 80rpm 조건에서 24시간 동안 배양하여 ML7 유산균을 활성화시켰다.
2-2. 절인배추
배추 무게의 2배의 해당하는 물에 8%의 소금을 계랑하여 첨가하였는데, 이때 사용된 소금은 간수를 뺀 천일염으로 소금의 1/3은 배추의 줄기 사이에 켜켜이 뿌리고 2/3은 물에 녹여 염수를 준비하였다. 준비한 염수에 배추를 2절하여 15시간 동안 절였고. 15시간 후 배추를 건져 흐르는 물에 4회 세척하고, 세척한 배추를 4시간동안 탈수시켰다.
2-3. 김치 양념의 제조
김치 양념은 하기 표 8과 같이 준비하고 제조하였으며, 죽염을 첨가하여 최종 염도를 2.2%로 조절하였다.
재료 중량비(%) 비고
무 36 채썰기
고춧가루 10.9 -
마늘 5.5 분쇄
생강 1.8 분쇄
양파 3.6 분쇄
배 7.2 분쇄
쪽파 7.2 채썰기
대파 3.6 채썰기
멸치액젓 7.2 -
새우젓 3.6 -
찹쌀풀 8.8 -
표고가루 0.4 -
매실액 3.6 -
설탕 0.6 -
합계 100 -
2-4. 균주의 첨가
상기 2-1에서 준비한 유산균 스타터를 3000rpm에서 10분간 원심분리하고 액체배지를 제거하여 생성된 펠렛을 생리식염수로 2회 세척(washing)한 후 상기 김치 양념에 첨가한 후 혼합하였다. 상기 ML7 유산균을 김치 1 kg당 109 CFU로 조절하여 첨가하였다.
2-5. 김치의 제조
상기 제조한 김치 양념을 상기 절인배추에 버무려 김치를 제조하였다. 이때, 김치 양념은 절인배추 100 중량부에 대하여 50 중량부로 첨가하였다.
2-6. 김치의 발효
상기 제조한 김치를 10 ℃에서 7일 동안 1차 발효한 후, 1 ℃에서 84일 동안 2차 발효를 실시하였다.
대조군 : ML7 균주 무첨가 김치의 제조
실시예 2와 동일하게 실시하되, 김치 제조 과정에서 ML7 균주를 첨가하지 않고 김치를 제조하였다.
시험예 2: ML7 균주를 이용하여 발효한 김치의 특성 분석
2-1. 김치의 경도
대조군 및 실시예에서 제조된 김치에 대하여, 발효기간이 경과함에 따른 경도를 측정하여 하기 표 9 나타내었다.
경도 측정은 김치의 겉잎으로부터 안쪽 3번째 잎의 아래로부터 3 ㎝ 위쪽 부분과 배추 길이의 1/2 위치 부분을 3 ㎝×3 ㎝ 크기로 잘라 시료로 사용하였다.
그리고, 물성 측정기(TA-XT plus texture analyzer, Stable Micro Systems Ltd, UK)를 사용하여 경도(hardness)를 측정하였고, 분석 조건은 probe는 stainless steel rod(diameter 50 mm), target mode는 distance 10 mm, pre-test speed 2.0 mm/sec, test speed 1.0 mm/sec)로 조절하였다. 모든 시료는 총 3회 반복 측정하였다.
구분 발효 기간 경과에 따른 김치의 경도(g/㎠)
1차 발효(10 ℃) 2차 발효(1 ℃)
0일 7일 28일 56일 84일
대조군 11270±1215 8883±874 8754±615 8332±900 7787±959
실시예 2 11852±1481 8904±562 8834±982 8547±233 8107±789
표 9를 살펴보면, 발효가 진행됨에 따라 실시예 2에 따른 김치의 경도가 더욱 높아 아삭한 식감이 더욱 우수한 것을 확인할 수 있다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 ML7 균주의 경우 김치의 아삭함을 오래 동안 유지시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
2-2. 발효에 따른 김치 미생물 균총 및 종균 우점율 분석
대조군 및 실시예에서 제조된 김치에 대하여, 발효기간이 경과함에 따른 미생물 균총 및 종균 우점율을 측정하여 하기 표 10에 나타내었다.
총균수의 측정은 평판계수법(plate count technique)을 이용하여 측정하였는데, 상기 대조군 및 실시예 2에서 제조한 각 김치를 착즙하여 얻은 김치액을 멸균한 증류수로 단계별로 희석하여, 미리 가열 용해하고 냉각한 플레이트 카운트 아가(plate count agar; Difco, Detroit, MI, USA)에 0.1mL 씩 분주하여 도말하였다. 37ㅀC에서 36 시간 동안 배양기에서 호기 배양하고, 배양된 균의 colony 수를 계수하여 생성 콜로니 개수(colony forming units per gram, CFU/ml)의 로그값으로 나타내었다.
또한, 유산균 수의 측정은 총균수 측정과 동일한 방법으로 Lactobacillus 선택용 배지(LBS medium)에 Pediococcus의 생육을 억제하기 위하여 아세트산과 소듐 아세테이트를 첨가한 modified LBS agar medium(m-LBS medium)을 사용하여 30ㅀC에서 2일간 평판 배양하여 나타난 colony수를 계수하였다.
또한, 효모균 수의 측정은 총균수 측정과 동일한 방법으로 PDA(potato dextrose agar)배지를 사용하여 37ㅀC에서 36 시간 동안 배양한 후 배양된 균의 colony 수를 계수하였다.
또한, 우점율(％)은 총 유산균 균수 중 ML7 균주(평판 배양시 나타나는 락토바실러스 속 균주 중 ML7 균주와 형태학적 타입이 일치하는 균)의 균수의 비율로 계산하였다(식 2).
[식 2]
우점율(%) = {(실시예 2 김치의 ML7 균주의 수 / 실시예 2 김치의 총 유산균의 수)} × 100
구분 발효 기간 경과에 따른 김치의 균수(log CFU/ml)
1차 발효(10 ℃) 2차 발효(1 ℃)
0일 7일 28일 56일 84일
대조군 총균 5.3±0.2 8.3±0.3 9.2±0.1 8.4±0.2 8.4±0.2
유산균 5.2±0.3 8.2±0.4 8.9±0.3 8.3±0.1 7.8±0.2
효모 1.3±0.1 2.3±0.2 4.5±0.5 4.2±0.3 3.6±0.4
실시예 2 총균 7.7±0.1 9.1±0.2 9.1±0.2 9.4±0.3 8.7±0.1
유산균 7.4±0.2 8.8±0.2 8.8±0.4 9.2±0.1 8.3±0.2
효모 0.1±0.4 2.5±0.1 3.2±0.2 3.7±0.2 4.3±0.3
ML7의 우점율(%) 98.6 90.0 95.5 97.6 98.8
표 10에 나타낸 바와 같이, 총균수는 제조 당일에는 실시예의 김치에서 높은 것으로 나타났으나, 발효가 진행되면서 대조군 김치와 비슷한 수준이 되는 것을 확인되었다.
또한, 김치의 총유산균수 측정 결과, 실시예에 따른 김치가 대조군 김치에 비해 유산균수가 높은 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 ML7 균주를 첨가하여 제조한 김치의 경우 유산균이 많이 함유되어 있어, 김치의 맛과 기능성에 바람직한 영향을 미칠 것으로 판단된다.
또한, 본 발명의 ML7 균주를 첨가하여 제조한 김치의 경우 제조 직후부터 저장하는 기간 내내 락토바실러스 파라카세이 ML7 균주가 안정적으로 우점함을 확인할 수 있었다.
2-3. 김치의 관능평가
대조군 및 실시예에서 제조된 김치에 대하여, 관능평가를 실시하여 도 10에 나타내었다.
상기 관능평가를 위하여 김치 맛 평가 전문가 10명을 패널로 구성하였고, 5점 척도법(강도: 1. 매우 나쁨; 2. 나쁨; 3. 보통; 4. 좋음; 5. 매우 좋음)에 준하여 평가를 실시하였다. 이때 통계처리는 SPSS 12.0 통계 프로그램을 사용하고 다중범위 검정(DMR-test; Duncan multiple range test)으로 유의수준 p<0.05에서 유의성을 검증하였다.
도 10을 살펴보면, 실시예 2에 따라 제조된 김치(starter kimchi)는 대조군김치(control kimchi)에 비해 탄산미(Carbonated flavor)가 매우 우수하고, 향미(Flavor)와 조직감(Texture)이 우수한 것을 알 수 있다.
시험예 3: 녹차의 발효 특성
녹차에는 데아닌과 카테킨 그리고 카페인 함량이 높으며 칼륨을 비롯한 각종 미네랄이 풍부히 함유되어 있고 비타민C를 비롯하여 토코페롤, 베타카로틴 등 여러 가지 비타민류도 다량 함유되어 있어 여러 가지 생리활성을 나타내게 된다. 녹차의 대표적인 효능인 항산화 효과는 녹차의 주요 성분인 카테킨류에 의해서 나타나는 효과로 알려져 있고 항암작용과 혈중콜레스테롤 저하 작용에도 효과적이며, 당뇨완화 및 충치예방에도 효과를 보인다는 연구결과가 보고되었다. 이와 같이 녹차는 단순히 향기만 느끼는 차가 아니며, 콜레스테롤을 낮춰주고, 지방을 분해하며, 면역력을 증강시키는 등 강한 약리작용을 하는 효능이 있어서 건강차, 다이어트차로서 강하게 인식되고 있다.
이와 같이 유용한 생리활성을 나타내는 녹차를 김치에 적용하여 김치의 효능을 더욱 강화하고자 하는 시도가 많았지만 녹차를 첨가하여 김치를 제조하는 경우 녹차의 쓴맛으로 인해 김치 맛이 저감되는 문제점이 있었다.
이에 따라, 녹차를 유산균으로 발효시키는 경우 녹차의 쓴 맛이 저감되는지를 확인하고자 하였다.
이를 위하여, ML7 균주, 김치로부터 분리된 자체 보유 유산균(ML17; 락토바실러스 커바터스(Lactobacillus curvatus); 수탁번호: KCCM 11306P), 및 한국생명공학연구원 생명자원센터에서 분양받은 류코노스톡 메센테로이데스 및 락토바실러스 플란타룸을 이용하였다. 분양받은 균주는 Leu. mesenteroides KCTC 13374와 Lb. plantarum subsp. plantarum KCTC 3093이었다.
이를 위하여 녹차 분말 2 %(w/v) 수용액 40 ml에 각각의 균주 배양액(1×109 cfu/ml) 0.4 ml를 접종한 후 24시간 동안 배양하여 녹차 발효액을 준비하였다. 상기 녹차 발효액을 원심분리한 후 회수한 상등액에 대하여 관능평가, 유산균수 및 카테킨 함량을 측정하여 하기 표 11에 나타내었다. 하기 표 11에서, 대조군으로는 발효하지 않은 녹차 분말 수용액을 이용하였다.
관능평가를 위하여 맛 평가 전문가 10명을 패널로 구성하였고, 5점 척도법(강도: 1. 매우 나쁨; 2. 나쁨; 3. 보통; 4. 좋음; 5. 매우 좋음)에 준하여 평가를 실시하였다. 이때 통계처리는 SPSS 12.0 통계 프로그램을 사용하고 다중범위 검정(DMR-test; Duncan multiple range test)으로 유의수준 p<0.05에서 유의성을 검증하였다.
구분 관능평가 유산균수
(cfu/mL)		 카테킨 함량
(mg/mL)
신맛 쓴맛 떫은맛 종합기호도
대조군 3.1 1.6 1.7 2.1 - 0.98
ML7 발효 3.0 4.3 4.5 4.2 2×109 1.01
ML17 발효 2.8 2.4 4.0 3.2 2×106 0.97
류코노스톡 메센테로이데스 3.0 2.2 3.4 3.3 2×107 0.96
락토바실러스 플란타룸 2.7 2.8 2.5 2.8 2×107 0.95
상기 표 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ML7 균주를 이용하여 발효한 녹차 발효물의 경우 다른 유산균으로 발효한 녹차 발효물에 비해 녹차 특유의 쓴 맛이 현저히 저감되는 것을 확인하였다.
시험예 4: ML7 균주 발효에 따른 녹차 발효액의 쓴 맛 강도 평가
녹차를 본 발명의 ML7 균주로 발효시킨 녹차 발효액의 쓴 맛 강도를 더욱 정확히 평가하고자 하였다.
쓴 맛 강도를 평가하기 위한 표준 시료로 카페인을 준비하였으며, 카페인을 농도별로 12점 척도로 준비하였고, 이를 하기 표 12에 나타내었다.
카페인 농도(%) 쓴맛 강도(점)
0.05 3
0.10 6
0.15 9
0.20 12
또한, 녹차 분말 1 %(w/v) 및 2 %(w/v) 수용액에 ML7 균주 배양액을 1%(1×107 cfu/ml)로 접종한 후 24시간 동안 배양하여 녹차 발효액을 준비하였다. 상기 녹차 발효액을 원심분리한 후 회수한 상등액에 대하여 관능평가를 실시하여 하기 표 13에 나타내었다. 하기 표 13에서, 대조군으로는 발효하지 않은 녹차 분말 수용액을 이용하였다.
관능평가를 위하여 맛 평가 전문가 10명을 패널로 구성하였고, 12점 척도법(강도: 1. 매우 나쁨; 12. 매우 좋음)에 준하여 평가를 실시하였다. 이때 통계처리는 SPSS 12.0 통계 프로그램을 사용하고 다중범위 검정(DMR-test; Duncan multiple range test)으로 유의수준 p<0.05에서 유의성을 검증하였다.
평가 시료 쓴맛 강도(점)
1 % 대조군 5.4
발효액 1.5
2 % 대조군 11.6
발효액 4.8
상기 표 13을 살펴보면, ML7 균주로 발효한 녹차 발효액은 대조군과 동일한 농도에서 쓴 맛 강도가 현저히 낮은 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 ML7 균주는 녹차 특유의 쓴맛을 현저히 저감시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 녹차 및 ML7 균주를 이용한 녹차김치의 제조
실시예 2와 동일한 방법으로 실시하되, 2-4.의 균주 첨가 단계에서 ML7 균주와 함께 김치 총중량에 대하여 0.2 중량%의 녹차 분말을 첨가하여 녹차김치를 제조하였다.
실시예 4: 녹차 발효물을 이용한 녹차김치의 제조
실시예 2와 동일한 방법으로 실시하되, 2-4.의 균주 첨가 단계에서 균주를 첨가하는 대신, 김치 총중량에 대하여 0.83 중량%의 녹차 발효물을 첨가하여 녹차김치를 제조하였다.
상기 녹차 발효물은 ① 녹차분말 24 g을 100 ℃에서 30분 동안 살균처리(이상 발효 방지 목적)하는 단계; ② 상기 살균처리한 녹차 분말에 멸균수 72 g을 첨가하고 혼합하여 페이스트 제형으로 제조하는 단계; ③ ML7 균주를 액체 MRS 배지에 첨가하고 30 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 ML7 균주 배양액(109 cfu/ml)을 제조하는 단계; ④ 상기 ②에서 얻은 혼합액에 ③에서 얻은 ML7 균주 배양액 5 mL를 첨가하여 30 ℃에서 24 시간 동안 발효하는 단계;를 수행하여 제조하였다.
비교예 1: 녹차 분말을 이용한 녹차김치의 제조
실시예 2와 동일한 방법으로 실시하되, 2-4.의 균주 첨가 단계에서 ML7 균주를 첨가하는 대신, 김치 총중량에 대하여 0.2 중량%의 녹차 분말을 첨가하여 녹차김치를 제조하였다.
비교예 2: 녹차 추출물을 이용한 녹차김치의 제조
실시예 2와 동일한 방법으로 실시하되, 2-4.의 균주 첨가 단계에서 ML7 균주를 첨가하는 대신, 김치 총중량에 대하여 1 중량%의 녹차 열수 추출물을 첨가하여 녹차김치를 제조하였다.
비교예 3: 멸균 처리한 녹차 발효물을 이용한 녹차김치의 제조
실시예 4와 동일한 방법으로 실시하되, 녹차 발효물을 멸균처리한 후에 첨가하여 녹차김치를 제조하였다.
상기 멸균처리는 녹차 발효물을 100 ℃에서 30분 동안 처리하였다.
상기 실시예 3 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 김치의 제조방법을 하기 표 14에 간단히 정리하여 나타내었다.
구분 비고
대조군 일반 김치
실시예 3 김치 제조시 녹차 및 ML7 균주를 각각 첨가
실시예 4 김치 제조시 녹차를 ML7 균주로 발효시킨 녹차 발효물을 첨가
비교예 1 김치 제조시 녹차 분말 첨가
비교예 2 김치 제조시 녹차 열수 추출물 첨가
비교예 3 김치 제조시 녹차를 ML7 균주로 발효시킨 녹차 발효물을 멸균처리한 후 첨가
시험예 5: 녹차 및 ML7 균주를 이용한 녹차김치의 특성 분석
대조군, 실시예 3 내지 4 및 비교예 1 내지 4의 녹차김치들은 4 ℃에서 4주 동안 발효한 후에 품질 특성을 비교 분석하였다.
5-1. 녹차김치의 품질 특성 분석
대조군, 실시예 3 내지 4 및 비교예 1 내지 4에서 제조한 각각의 녹차김치 시료를 이용하여 pH, 산도(%), 경도(g/㎠), 강도(g/㎠), 유산균수(cfu/mL) 및 효모균수(cfu/mL)를 측정하여 하기 표 15에 나타내었다.
구분 pH 산도(%) 경도(g/㎠) 강도(g/㎠) 유산균
(cfu/mL)		 효모
(cfu/mL)
대조군 4.23 0.72 4,582 2,812 4×109 2×105
실시예 3 4.26 0.75 5,707 3,589 3×1010 5×105
실시예 4 4.26 0.75 6,113 3,889 3×1010 3×105
비교예 1 4.36 0.74 4,668 2,907 6×109 1×105
비교예 2 4.30 0.73 4,826 3,004 5×109 2×105
비교예 3 4.19 0.70 4,581 3,109 6×109 2×105
상기 표 15를 살펴보면, 각 시료 간에 김치의 이화학적 품질은 큰 차이가 없었으나, 실시예 3 및 4의 녹차김치의 경우 아삭한 식감과 관련된 경도 및 강도가 유의하게 높은 값을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
5-2. 녹차김치의 관능평가
대조군, 실시예 3 내지 4 및 비교예 1 내지 4에서 제조한 각각의 녹차김치 시료에 대하여 관능평가를 실시하여 하기 표 16에 나타내었다.
관능평가를 위하여 김치 맛 평가 전문가 10명을 패널로 구성하였고, 9점 척도법(강도: 1. 매우 나쁨; 5. 보통; 9. 매우 좋음)에 준하여 평가를 실시하였다. 이때 통계처리는 SPSS 12.0 통계 프로그램을 사용하고 다중범위 검정(DMR-test; Duncan multiple range test)으로 유의수준 p<0.05에서 유의성을 검증하였다.
구분 외관 군덕내 신맛 탄산미 감칠맛 조직감 짠맛 쓴맛 떫은맛
(녹차)		 종합
기호도
대조군 6.7 6.5 6.2 6.2 6.2 6.3 7.2 6.8 7.0 6.5
실시예 3 7.3 6.7 7.5 7.8 7.2 7.2 7.7 7.0 7.2 7.7
실시예 4 7.1 6.7 7.7 7.8 7.8 8.1 7.6 7.3 7.5 8.1
비교예 1 7.0 6.7 6.5 6.3 6.3 6.3 7.2 5.7 5.5 5.7
비교예 2 6.7 6.7 6.7 6.3 6.5 6.5 7.2 6.5 6.2 6.8
비교예 3 6.7 6.7 6.7 6.5 6.8 6.2 7.3 6.5 6.0 6.8
상기 표 16을 살펴보면, 녹차를 첨가한 김치(비교예)는 녹차의 향과 미세한 떫은 맛이 느껴지기 때문에 일반 김치(대조군)보다 낮은 기호도를 나타내었다.
비교예 3(멸균 발효녹차 김치)의 경우에는 비교예 1에 비해서는 전체적으로 기호도가 높지만 대조군 김치에 비해서는 기호도가 유의하게 증가하지 않았다.
한편, 실시예 3 및 4의 녹차김치의 경우에는 탄산미, 부드러운 신맛, 조직감이 우수하였으며, 녹차 특유의 향과 맛이 거의 느껴지지 않아 기호도가 높았다.
이러한 결과로부터 ML7 균주가 생균 상태로 김치에 첨가되었을 때에 김치의 관능적 특성에 대하여 유리한 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
특히, 실시예 4의 녹차김치는 식감이 가장 아삭하고, 녹차 특유의 쓴 맛과 떫은맛이 거의 느껴지지 않아 기호도가 가장 높은 것으로 나타났다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
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Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. a) 녹차를 우린 물에 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus pracasei) ML7 균주[수탁번호 : KCCM12594P] 또는 이의 배양액을 첨가하여 발효시킨 녹차 발효물을 소금에 절인 김치용 채소 및 양념과 혼합하여 김치를 제조하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계로부터 제조된 김치를 발효시키는 단계;를 포함하는 녹차김치 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 녹차는 김치 전체 중량에 대하여 0.1 내지 2.0 중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 녹차김치 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 균주는 김치 kg 당 1×108 내지 1×109 cfu로 첨가하여 혼합하는 것을 특징으로 하는 녹차김치 제조방법.
  7. 삭제
  8. 제4항에 있어서,
    상기 녹차를 우린 물은 멸균수 100 중량부에 살균 처리한 녹차 분말을 25 내지 45 중량부로 첨가하여 우린 것을 특징으로 하는 녹차김치 제조방법.
  9. 제4항에 있어서,
    상기 a) 단계의 발효는 27 내지 35 ℃에서 28 내지 30 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 녹차김치 제조방법.
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CN116948916A (zh) * 2023-08-11 2023-10-27 四川大学 一种干酪乳杆菌及其应用

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