KR101580732B1

KR101580732B1 - 신규한 스타터 균주 및 이를 이용한 김치를 포함하는 기능성 발효식품의 제조방법

Info

Publication number: KR101580732B1
Application number: KR1020140011377A
Authority: KR
Inventors: 박건영; 봉연주; 정지강; 김희영; 임수복; 최메이지; 이가영; 이경희
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2015-12-28
Also published as: KR20140098708A

Abstract

본 발명은 신규한 스타터 균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 신규한 균주는 항산화 활성 및 항비만 활성이 우수하고 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라, 이를 스타터 균주로 사용하여 발효식품을 제조할 경우, 제조된 식품의 관능미 및 품질이 우수하고, 식품 내 함유된 유산균수를 증가시키는 효과가 있어, 정장제, 생균제, 식품첨가제 및 항암제의 용도로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

신규한 스타터 균주 및 이를 이용한 김치를 포함하는 기능성 발효식품의 제조방법{Novel starter strain and method functional fermentation foods containing kimchi use thereof}

여러 가지 사망원인 중 암에 의한 사망자의 증가가 두드러지고 있는데, 이의 가장 큰 원인은 식이변화를 들 수 있고, 그 중에서도 육식의 비중이 높아지고 상대적으로 채식의 비중이 낮아지는 것을 들 수 있다.

또한, 고지방, 고단백 식이는 담즙과 콜레스테롤의 대사에 변화를 가져올 뿐만 아니라 이들의 대사물로부터 발암인자를 생산해내는 박테리아의 대사활동을 강화시키는 것으로 알려져 있고, 육류의 섭취가 늘어나면 장내 pH의 변화로 인해 유해 세균들의 생장을 높이게 되고 발암에 관련된 효소인 베타-글루쿠로니다제, 베타-글루코시다제, 아조레턱타제, 니트로레덕타제, 트립토판나제 등을 유도하는 것으로도 알려져 있다. 그리고 상대적으로 식이 섬유소의 섭취가 줄어들게 됨으로써 이러한 유해 세균들의 배출이 원활하지 못하게 되어 장내 질병을 유발하고 더 나아가 암과 같은 심각한 상황까지 이르게 한다.

한편, 최근 보고되고 있는 연구 결과에 따르면, 많은 유럽 국가 중 일부 국가에서 암의 발생 수치가 현저하게 낮은 국가들이 있었는데, 이들 국가의 공통점을 보면 일반적으로 발효식품들을 많이 섭취하는 국가들이었으며, 특히 핀란드, 불가리아의 경우 요구르트 등 발표식품의 섭취가 많기 때문에 암 발생률이 현저하게 낮아진다는 보고가 있었다.

또한, 우리나라의 경우도 대표적인 젖산균 발효 식품인 김치를 국민의 대부분이 섭취하고 있어 다른 나라에 비해 암 발생율이 낮은 것으로 보고된 바 있으며,이러한 김치에는 류코노스톡, 락토바실러스, 스트렙토코커스, 페디오코커스 등과 같은 젖산균이 함유되어 있다. 이러한 유익한 젖산균은 장내 pH를 낮춰 유해 미생물 및 병원성 미생물의 성장을 억제하는 정장 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있고, 발암성 전구물질을 발암성 물질로 전환시키는 효소들의 활성을 억제하는 효과가 있다는 사실도 보고되고 있다.

비만(肥滿, obesity) 또는 비만증이란 사람의 몸무게가 지나치게 나가는 것을 통틀어 부르는 낱말로서 병리학적으로는 세계 보건 기구 (WHO)에서 정한 체질량 지수(BMI: Body Mass Index)가 30 이상인 경우에 비만증이라고 일컫는다. 비만은 그 자체로는 문제가 되지 않는다. 그러나 문제는 비만으로부터 야기될 수 있는 사회적 장애와, 과다한 지방으로 생기는 2차적인 합병증이다. 비만은 고지혈증, 고혈압, 동맥경화, 당뇨병, 지방간, 관절 이상의 발생비율을 현저하게 증가시킨다.

비만의 원인은 다인성으로 이해되고 있으며, 과도한 지방 조직의 존재하는 경우는 영양의 이용율과 에너지 소비의 불균형으로 초래되는 것이 가장 큰 원인이 된다. 중추 신경계 (CNS)는 에너지 균형을 제어하고, 동물의 대사 상태에 적절한 다양한 행동, 자율신경 및 내분비 활성을 조정하게 되며, 항비만제의 주된 조절 작용점이 된다.

따라서 최근에는 이러한 젖산균을 이용하여 생체 유용한 기능을 갖는 기능성발효식품을 개발하려는 연구가 시도되고 있다.

대한민국 특허출원 2007-0030016

이에 본 발명자들은 김치를 포함하는 발효식품의 제조 시 스타터 균주로 사용할 경우, 항산화 활성, 항비만 활성 및 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라 관능미가 우수한 기능성 발효식품을 제조할 수 있는 신규한 유산균을 분리 및 동정한 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 발효 식품의 스타터로 사용할 수 있는 신규한 균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신균주를 포함하는 발효식품 제조를 위한 스타터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 스타터를 이용하여 발효식품을제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 발효식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 신균주 또는 이의 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물 또는 프로바이오틱스, 또는 상기 프로바이오틱스를 포함하는 유산균 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 신균주 또는 이의 배양물을 함유하는 비만 또는 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 절인배추 100에 대해 고춧가루 3.0~4.0중량부, 마늘 1.0~2.0중량부, 생강 0.3~10중량부, 젓갈 2.0~2.5중량부, 무 10~15중량부, 설탕 0.5~1.5중량부, 파 1.5~2.5중량부 및 배 2.0~3.5중량부를 포함하는 항암활성 또는 항비만활성을 갖는 김치를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 절인배추 100에 대해 고춧가루 2.0~3.0중량부, 마늘 2.5~3.5중량부, 생강 0.3~10중량부, 무 8~15중량부, 설탕 0.5~1.5중량부, 파 1.5~2.5중량부, 녹차 6.0~8.5중량부, 산초 0.5~1.5중량부, 배 2.0~3.5중량부, 버섯다시마물 25~45중량부 및 겨우살이 추출물 0.025~0.075중량부를 포함하는 항암활성 또는 항비만활성을 갖는 김치.

나아가 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 신균주로부터 프로바이오틱스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 신균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P)를 제공한다.

또한 본 발명은 신균주인 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P)를 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 및 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 발효식품 제조를 위한 스타터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 스타터는 분말형태일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 스타터를 이용하여 발효식품을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효식품은 김치, 오이, 무, 당근, 양파, 마늘, 고추 또는 갓일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효식품은 녹차를 더욱 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 발효식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효식품은 항산화 활성, 항비만 활성 및 항암 활성을 갖는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 또는 이의 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 또는 이의 배양물을 함유하는 프로바이오틱스(probiotics)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 프로바이오틱스(probiotics)를 유효성분으로 포함하는 유산균 제제를 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 함유하는 비만 또는 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 녹차를 더욱 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 결장암일 수 있다.

또한 본 발명은 절인배추 100에 대해 고춧가루 3.0~4.0중량부, 마늘 1.0~2.0중량부, 생강 0.3~10중량부, 젓갈 2.0~2.5중량부, 무 10~15중량부, 설탕 0.5~1.5중량부, 파 1.5~2.5중량부 및 배 2.0~3.5중량부를 포함하는 항암활성 또는 항비만활성을 갖는 김치를 제공한다.

또한 본 발명은 절인배추 100에 대해 고춧가루 2.0~3.0중량부, 마늘 2.5~3.5중량부, 생강 0.3~10중량부, 무 8~15중량부, 설탕 0.5~1.5중량부, 파 1.5~2.5중량부, 녹차 6.0~8.5중량부, 산초 0.5~1.5중량부, 배 2.0~3.5중량부, 버섯다시마물 25~45중량부 및 겨우살이 추출물 0.025~0.075중량부를 포함하는 항암활성 또는 항비만활성을 갖는 김치를 제공한다.

나아가 본 발명은, 상기 본 발명에 따른 신균주를 배양하는 단계; 및 배양한 상기 균주가 생산하는 프로바이오틱스를 수득하는 단계를 포함하는 프로바이오틱스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 신규한 균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P)는 항산화 활성이 우수하고 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라, 이를 스타터 균주로 사용하여 발효식품을 제조할 경우, 제조된 식품의 관능미 및 품질이 우수하고, 식품 내 함유된 유산균수를 증가시키는 효과가 있어, 정장제, 생균제, 식품첨가제 및 항암제의 용도로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 각각의 스타터 균주를 사용하여 제조된 김치를 대상으로 저장 시간 별 김치의 pH 변화를 측정한 것을 그래프로 나타낸 것으로서, K-Standard 는 스타터 균주를 첨가하지 않고 제조된 김치를 나타낸 것이며, 도 1을 포함한 모든 도면에서 각 처리군에 대한 표기 사항이 의미하는 바는 다음과 같다.
“K - LP PNU” : Lactobacillus plantarum PNU을 스타터로 첨가하여 제조한 김치
“K - LP 3099”: Lactobacillus plantarum 3099을 스타터로 첨가하여 제조한 김치
“K - LM PNU” : Leuconostoc mesenteroides을 스타터로 첨가하여 제조한 김치
“K - LP PNU/LM PNU” : Lactobacillus plantarum PNU와 Leuconostoc mesenteroides을 혼합하여 스타터로 첨가하여 제조한 김치
“K - LP 3099/LM PNU” : Lactobacillus plantarum 3099와 Leuconostoc mesenteroides을 혼합하여 스타터로 첨가하여 제조한 김치
“K- Standard” : 스타터를 첨가하지 않고 제조한 김치(대조군)
도 2는 각각의 스타터 균주를 사용하여 제조된 항암스타터김치를 대상으로 저장 시간 별 산도의 변화를 측정한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 각각의 스타터 균주를 사용하여 제조된 항암스타터김치를 대상으로 저장 시간 별 탄력성의 변화를 측정한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 각각의 스타터 균주를 사용하여 제조된 항암스타터김치의 관능미를 각 항목당 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치 내에 함유된 총 균수를 저장 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치 내에 함유된 젖산균 중 락토바실러스 속 균수를 저장 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치 내에 함유된 젖산균 중 류코노스톡 속 균수를 저장 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치의 메탄올 추출물을 대장암 세포주인 HT-29 세포에 처리한 후, 염증 관련 유전자인 iNOS 유전자의 발현 억제 정도를 RT-PCR을 수행하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치의 메탄올 추출물을 대장암 세포주인 HT-29 세포에 처리한 후, 염증 관련 유전자인 COX-2 유전자의 발현 억제 정도를 RT-PCR을 수행하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치의 항암 활성을 확인하기 위해 마우스 동물모델을 대상으로 한 실험진행 일정을 나타낸 것이다.
도 12는 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치를 섭취하게 한 후, 마우스 동물모델을 대상으로 대장을 적출한 후, 종양 수를 측정하여 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치에 의해 지방세포 분화를 저해하는 정도를 알아보기 위하여 Oil-red O 염색을 한 후 염색된 세포를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 14는 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 항암스타터김치가 지방세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 처리된 지방세포의 크기 및 수를 계측한 결과이다.
도 15는 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 pH 및 산도를 측정하기 위해 pH 메터로 측정한 결과이다.
도 16은 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 총균 및 유산균 수를 평판계수법(plate count technique)을 이용하여 측정한 결과이다.
도 17은 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 관능성을 평가한 결과이다.
도 18은 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과이다.
도 19는 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 항암효과를 확인하기 위해 HT-29 인체 대장암 세포배양에서 효과를 측정한 결과이다.
도 20은 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 항비만효과를 확인하기 위해 Oil-red O 염색법을 이용하여 3T3-L1 지방세포의 크기를 측정한 결과이다.
도 21은 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 항비만효과를 확인하기 위해 트리글리세라이드(triglyceride)의 축적을 저해하는 효과를 측정한 결과이다.
도 22는 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 항비만 효과를 확인하기 위해 C57BL/6J 마우스에서 동물실험을 진행한 결과로서, C57BL/6J 마우스의 체중을 측정한 결과이다.
도 23은 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 항비만 효과를 확인하기 위해 C57BL/6J 마우스에서 지방세포를 적출하여 지방무게를 측정한 결과이다.
도 24는 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 항비만 효과를 확인하기 위해 혈청에서 TC, TG, LDL, glucose의 농도를 측정한 결과이다.
도 25는 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 항비만 효과를 확인하기 위해 혈청에서 adiponectin과 Leptin을 측정한 결과이다.
도 26은 산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 항비만 효과를 확인하기 위해 간 조직에서 SREBP-1c, C/EBPα 및 PPARγ의 mRNA를 분석한 결과이다.

본 발명은 발효식품 제조시 사용할 수 있는 스타터 균주로서 신균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P)를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 제공하는 신균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 균주는 발효식품의 제조시 스타터로 사용할 경우, 발효 초기부터 유산균이 풍부하여 숙성 과정에서 발효가 적절하게 일어나도록 하는 효과를 갖는다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 대표적인 발효식품 중 하나인 김치의 제조에 본 발명의 상기 균주를 스타터로 사용한 결과, 제조된 김치의 pH의 감소 속도와 산도 증가 속도가 스타터를 사용하지 않은 군 및 다른 종류의 스타터를 사용한 군에 비해 발효가 빠르게 진행되는 것으로 나타났다(도 1 및 도 2 참조). 뿐만 아니라, 이렇게 빠른 발효 과정에도 불구하고 본 발명의 스타터 균주로 제조된 김치의 경우 다른 군들에 비해 탄력성이 우수하고, 관능미가 우수한 것으로 나타났다(도 3 및 도 4 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 상기 균주들을 발효식품의 제조에 스타터로 사용하여 발효시킬 경우, 관능미가 개선된 우수한 품질의 식품을 제조할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

참고로 본 발명에서 용어 “스타터(starter)"란 식품의 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제로, 발효식품 제조 시 첨가함으로써 숙성된 식품에서 지배적으로 생장하는 미생물을 말하며, 본 발명의 목적상 스타터란, 발효 식품의 맛을 일정하게 조절하게 할 뿐만 아니라 우수한 관능미를 가질 수 있도록 제공하는 미생물, 즉, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P)를 필수적으로 포함하는 제제를 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 스타터는 액상 제제, 분말 제제 등으로 제형화 할 수 있으며, 바람직하게는 분말제제로 사용할 수 있다. 이는 스타터 미생물 균주를 발효 식품에 첨가하는 경우 균 배양액에서 분리한 젖은 형태의 균체를 첨가하는 것이 일반적이지만 액상 제형은 보관이 어렵고 유통 중 품질유지가 어려워 이를 상품으로 유통시키기 어려운 단점이 있으나, 분말 제제는 공급, 품질 유지 및 사용이 용이하다는 장점이 있다. 따라서 이러한 분말 제제는 배양된 각각의 균주를 원심분리 등의 방법으로 수집하여 동결 건조시켜 수득할 수 있다.

또한, 본 발명에서 제공하는 신균주는 이를 이용하여 제조된 발효식품 내에서 체내 유용한 유산균의 수를 증가시키는 활성을 갖는 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 김치 내에서 유산균으로 알려진 락토바실러스 속 균주와 류코노스톡속 균주의 총수가 대조군에 비해 유의적으로 증가한 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 신균주는 정장용 조성물의 용도로도 유용하게 사용할 수 있는 특징이 있다.

나아가 본 발명에 따른 상기 신균주는 우수한 항산화 활성을 갖는 특징이 있는데, 즉 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 신균주를 사용하여 제조된 김치 추출물이 다른 종류의 스타터 균주 및 스타터 균주를 사용하지 않고 제조된 김치 추출물 보다 DPPH 라디칼 및 히드록실 라디칼 소거 활성이 우수한 것으로 나타났다(도 8 및 표 1 참조).

일반적으로 활성산소는 호기성 생물이 이용하는 산소분자가 산화과정에 이용되면서 여러 대사과정에서 생성되어 조직을 공격하고 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소를 말하는 것으로서, 혈액순환 장애, 환경오염, 스트레스 등이 원인으로 추정된다. 수퍼옥시드음이온, 과산화효소, 히드록실라디칼, 일중항산소등이 활성산소종에 포함되며, 이중 히드록실 라디칼은 화학적 반응이 크며 생체 내의 산화원인이 되어 DNA에 손상을 주거나 돌연변이를 유발하는 물질로 알려져 있다.

따라서 이들 활성산소를 소거하는 물질의 경우, 활성 산소로 인해 유발되는 각종 질환을 예방 및 치료할 수 있는 의약품의 소재로 개발될 수 있다.

이러한 점에서 볼 때 본 발명에서 동정한 신균주는 활성산소 소거능이 우수하여 상기 신균주를 식품의 제조에 사용할 경우, 항산화 활성이 우수한 발효식품을 제조할 수 있다.

또한 본 발명에서 제공하는 상기 신균주는 우수한 항암 활성을 갖는 특징이 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 신균주를 이용하여 제조된 김치 추출물을 인간 결장암 세포주에 농도별로 처리한 결과, 처리 농도에 비례하여 암 세포의 성장이 저해되는 것으로 나타났고(표 2 참조), 나아가 염증 관련 유전자인 iNOS 및 COX-2의 유전자 발현도 저해하는 것으로 나타났다(도 9 및 도 10 참조).

참고로 염증은 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어목적으로 나타나는 상처나 질병에 반응하는 인체의 면역 반응으로, 자외선이나 활성산소, 스트레스 등이 염증성 인자를 활성화시켜 각종 질병 및 피부의 노화를 일으킨다.

염증의 특징 중 하나는 프로스타글란딘을 생성하는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase; COX) 및 류코트리엔(leukotriene)을 생성하는 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase) 경로에 의해 대사되는 아라키돈산(arachidonic acid)의 산소첨가반응의 증가이다. 프로스타글란딘 및 류코트리엔은 염증의 매개체이다. 따라서 COX 또는 리폭시게나제 활성 억제는 큰 관심사이다. COX 효소는 COX-1 및 COX-2의 2개의 형태가 있으며 COX-2가 염증 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다.

따라서 COX-2 효소를 억제하는 것이 비가역적인 COX-1 억제와 관련된 부작용 없이 염증을 감소시킬 수 있는 효과적인 방법일 수 있다[Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2003 Nov;69(5):329-37, Neurosurgery. 2005 Mar;56(3):590-604].

또한, 다른 하나의 강력한 염증 매개물인 나이트릭옥사이드(Nitric Oxide; NO)는 NO 합성 효소인 나이트릭옥사이드신타제(Nitric Oxide synthase; NOS)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 생성되며 UV와 같은 스트레스나 엔도톡신, 사이토카인에 의해 많은 타입의 세포에서 발생된다. 이러한 염증 자극들은 세포내의 유도성 NOS(inducible NOS; iNOS)의 발현을 증가시킴으로 NO를 발생시키고 대식세포를 활성화시켜 염증 반응을 일으키며 이러한 염증 반응은 암의 진행을 가속화 시킨다.

이러한 점에서 볼 때 본 발명은 본 발명에서 분리 및 동정한 상기 신균주들을 스타터로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법을 제공할 수 있으며, 이러한 방법으로 제조된 발효식품은 항산화 활성, 항비만 활성 및 항암 활성을 가지고 있는 기능성 식품일 수 있다.

본 발명에서 상기 발효식품은 이에 제한되지는 않으나, 김치, 오이, 무, 당근, 양파, 마늘, 고추 또는 갓 일 수 있다.

따라서 본 발명의 신균주는 인간 및 동물의 건강증진을 위한 용도, 즉 정장용 조성물, 생균제(프로바이오틱스) 조성물 또는 유산균 제제로 사용될 수 있다. 상기 조성물 또는 제제는 본 발명의 신균주의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)등을 포함한다. 조성물 내 신균주의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 또는 이의 배양물을 함유하는 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 신균주 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식, 유제품 등의 식품에 대한 식품첨가제로 사용될 수 있으며, 본 발명의 신균주를 이용한 발효식품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 발효식품 중 하나인 김치를 제조하는데 사용할 수 있는데, 바람직하게는 소금으로 절인 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 대파, 무채, 설탕과 같은 일반적인 김치 양념들을 혼합한 후, 본 발명의 신균주를 첨가하여 김치를 제조할 수 있다. 상기 본 발명의 신균주의 첨가량은 김치 1g에 대하여 10⁶ CFU 로 첨가하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명은 비만 및 비만 관련 용태, 장애, 및 질환의 제어, 치료 및 예방에 유용한 방법 및 조성물을 제공하며, 2가지 이상의 항비만제를 비만 및 비만 관련 용태, 장애 및 질환을 제어, 치료 및 예방하는데 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 일실시예로서 투여 대상에서 영양의 이용율을 감소시켜 비만을 예방 또는 치료하는 효과를 발생시킨다. 또한 체중을 감소시키는 효과와 다른 항비만제와 병용투여하는 경우 상승적인 항비만 효과를 유도할 수 있다.

일 실시예에서, 이러한 방법은 비만, 비만 관련 장애, 비만 관련 질환, 비만 관련 용태, 당뇨병, 인슐린 저항성 증후군, 지방이영양증, 비알콜성 지방간염, 심혈관 질환, 다낭성 난소 증후군, 대사 증후군을 앓고 있거나 체중을 줄이려는 욕구가 있는 대상에게 지시된다.

일 실시예에서, 항비만제들의 조합 투여는 동시 투여, 공동 투여, 또는 순차적 투여일 수 있다.

또한 본 발명은 비만 및 비만 관련 용태, 장애 및 질환의 치료, 및 이러한 용태의 치료에 유용한 약제의 제조를 위한 본 발명의 항비만제 및 조성물의 용도에 관한 것이다.

나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 신균주를 배양하는 단계; 및 배양한 상기 균주가 생산하는 프로바이오틱스를 수득하는 단계를 포함하는 프로바이오틱스를 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

신균주의 분리 및 동정

<1-1> 균주의 분리

김치즙을 멸균 증류수에 희석하여 MRS 배지에 배양하여 배양된 유산균을 분리 동정하였는데, 1개의 균주(일명 ‘LP PNU’)는 전라북도 전주에서 김치 전문인에 의해 제조된 맛있는 김치에서 유산균을 분리 동정하는 방법에 의해 분리하였고, 다른 1개의 균주(일명 ‘LM PNU’)는 부산대학교 박건영 교수님 연구실의 항암 레시피로 조제된 김치에서 분리 및 동정하였다.

<1-2> 분리한 균주의 분자생물학적 동정

실시예 <1-1>에서 분리한 2개 균주의 분자생물학적 특징을 조사하기 위해 균주 배양액으로부터 Chromosomal DNA를 분리한 후, 유니버설 프라이머인 27F와 1492R 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하였고, 이렇게 얻어진 염색체 DNA는 미생물 동정을 위하여 16s rRNA gene의 전체 염기서열 분석을 수행하였다.

그 결과, 동정한 균주 중 하나의 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 속하는 균주인 것으로 나타났으며, 다른 균주는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)에 속하는 균주인 것으로 조사되었고, 상기 동정한 균주들의 염기서열(16s rRNA 서열)을 서열번호 1(락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P)) 및 서열번호 2(류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P))에 각각 나타내었으며, 이러한 염기서열을 갖는 균주는 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 이들 균주들을 2013년 1월 22일자로 한국종균협회(KCCM)에 기탁하여 하기와 같은 각각의 기탁번호를 부여받았다.

(1) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)PNU - 기탁번호 KCCM11352P(일명 "LP PNU”라고 명명함)

(2) 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)PNU - 기탁번호 KCCM11353P(일명 "LM PNU" 이라고 명명함)

< 실시예 2>

본 발명에서 분리 및 동정한 균주를 이용한 김치의 제조

<2-1> 스타터의 준비

상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 2개의 유산균을 각각 평판배지에 도말하여 48시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하여 단일 콜로니를 분리하였다. 분리한 콜로니를 채취하여 액체 MRS 배지에 37℃, 80rpm 조건에서 24시간 동안 배양하여 유산균을 활성화시켰다.

<2-2> 스타터의 첨가

각 유산균을 김치 1g당 10⁶ CFU으로 조절하여 첨가하였다. 준비한 유산균 스타터를 3000rpm에서 10분간 원심분리하고 액체배지를 제거하여 생성된 펠렛을 생리식염수로 2회 세척(washing)하여 양념소에 첨가하였다. 김치 1g당 10⁶ CFU에 해당하는 유산균을 첨가하기 위하여 김치 1kg당 10⁸ CFU 으로 조절한 유산균을 첨가하였다.

<2-3> 절임배추

배추 무게의 2배의 해당하는 물에 10%의 소금을 계랑하여 첨가하였는데, 이때 사용된 소금은 간수를 뺀 천일염으로 소금의 1/3은 배추의 줄기 사이에 켜켜이 뿌리고 2/3은 물에 녹여 염수를 준비하였다. 준비한 염수에 배추를 2절하여 10시간 동안 절였고. 10시간 후 배추를 건져 흐르는 물에 3회 세척하고, 세척한 배추를 3시간동안 탈수시켰다.

<2-4> 항암스타터김치 제조

본 발명자들은 상기 실시예 1이 스타터를 이용하여 항암효과가 있는 김치를 개발하였으며, 본 발명에서 이하 “항암스타터김치”라고 한다.

항암스타터김치란 부산대학교 항암김치에 실시예 1의 스타터를 이용하여 제조한 김치를 의미하는 것으로서, “K - LP PNU” : Lactobacillus plantarum PNU을 스타터로 첨가하여 제조한 김치로서 이하의 김치를 포함한다.

“K - LP 3099”: Lactobacillus plantarum 3099을 스타터로 첨가하여 제조한 김치

“K - LM PNU” : Leuconostoc mesenteroides을 스타터로 첨가하여 제조한 김치

“K - LP PNU/LM PNU” : Lactobacillus plantarum PNU와 Leuconostoc mesenteroides을 혼합하여 스타터로 첨가하여 제조한 김치

“K - LP 3099/LM PNU” : Lactobacillus plantarum 3099와 Leuconostoc mesenteroides을 혼합하여 스타터로 첨가하여 제조한 김치

항암스타터김치는 부산대학교의 항암김치 레시피를 사용하여 김치를 제조하였다. 항암김치는 절인배추 100(중량g)에 대해 고춧가루 2.5g, 마늘 2.8g 생강 0.6g 무 11g, 설탕 1g, 파 2g, 갓 7.5g, 산초 0.1g, 배 2.8g, 버섯다시마물 32.8g, 겨우살이 추출물 0.05g의 비율로 혼합하여 양념을 만들었다. 무와 파, 배는 3-4cm 길이로 채썰고 무채에 고춧가루 갠 것을 넣어 버무린 다음 나머지 양념을 넣어 죽염을 첨가하여 최종 염도를 2.2%로 조절하였고 혼합한 양념소를 배추에 버무려 김치를 제조하였다.

부산대학교의 항암김치 레시피를 사용하여 김치를 제조하였다. 항암김치는 절인배추 100(중량g)에 대해 고춧가루 2.5g, 마늘 2.8g 생강 0.6g 무 11g, 설탕 1g, 파 2g, 갓 7.5g, 산초 0.1g, 배 2.8g, 버섯다시마물 32.8g, 겨우살이 추출물 0.05g의 비율로 혼합하여 양념을 만들었다. 무와 파, 배는 3-4cm 길이로 채썰고 무채에 고춧가루 갠 것을 넣어 버무린 다음 나머지 양념을 넣어 죽염을 첨가하여 최종 염도를 2.2%로 조절하였고 혼합한 양념소를 배추에 버무려 김치를 제조하였다.

이상과 같은 김치 제조과정에서 대조군으로는 스타터 균주로 알려진 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3099 균주를 스타터 균주로 사용한 군 및 스타터 균주를 첨가하지 않은 군을 사용하였고 그 외 다른 방법은 상기 기술된 방법과 동일한 과정으로 김치를 제조하였다.

<2-5> 부산대학교 표준화김치 ( SK ) 제조

부산대학교 표준화김치(SK)란 일반 배추와 부산대학교 표준화 레시피를 이용하여 제조한 김치를 의미한다.

본 발명자들은 부산대학교 표준김치(SK)를 제조하기 위해 절인배추 100g에 대해 고춧가루 3.5g, 마늘 1.4g, 생강 0.6g, 젓갈 2.2g, 무 13g, 설탕 1g, 파 2g의 중량비율로 혼합하여 양념소를 만들었다. 무와 파, 배는 3-4cm 길이로 채썰고 무채에 고춧가루 갠 것을 넣어 버무린 다음 나머지 양념을 넣어 제간수 천일염을 첨가하여 최종 염도를 2.5 중량%로 조절하였고 혼합한 양념소를 배추에 버무려 김치를 제조하였다.

<2-6> 항암녹차김치 ( AK ) 제조

항암녹차김치(AK)란 유기농 배추와 부산대학교 항암김치에 레시피에 녹차를 첨가하여 제조한 김치를 의미한다.

본 발명자들은 항암녹차김치를 제조하기 위해 절인 배추 100g에 대해 고춧가루 2.5g, 마늘 2.8g, 생강 0.6g, 무 11g, 설탕 1g, 파 2g, 녹차 7.5g, 산초 0.1g, 배 2.8g, 버섯·다시마물 32.8g, 겨우살이 추출물 0.05g의 중량비율로 혼합하여 양념소를 만들었다. 무와 파, 배는 3-4cm 길이로 채썰고 무채에 고춧가루 갠 것을 넣어 버무린 다음 나머지 양념을 넣어 죽염을 첨가하여 최종 염도를 2.2 중량%로 조절하였고 혼합한 양념소를 배추에 버무려 김치를 제조하였다.

<2-7> 항암녹차스타터김치 ( AKS ) 제조

항암녹차스타터김치(AKS)란 항암녹차김치에 유산균 스타터를 첨가하여 제조한 김치를 의미한다.

본 발명자들은 항암녹차김치를 제조하기 위해 두 가지 starter를 1:1의 비율로 혼합하여 첨가한 김치(AKS)가 제조되었다. 이때, 유산균 starter는 106 CFU/g의 농도로 조절하여 양념소에 첨가하였으며 이를 배추에 버무려 김치를 제조하였다.

Starter로 이용한 유산균은 Lactobacillus plantarum PNU(KCCM 11352P)와 Leuconostoc mesenteroides PNU(KCCM 11353P)로 각각 전라북도 전주지역 김치 제조 전문인에 의해 제조된 김치와 부산대학교 김치연구소의 항암김치 레시피로 조제 된 김치에서 분리·동정하였다. 분리 및 동정한 유산균을 각각 MRS(de Man, Rogosa andSharpe, Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) 고체평판배지에 도말하여 37°C 배양기에서 48시간 배양하며 단일 콜로니로 계대배양하며 실험에 사용하였다. 각 균주는 MRS(Difco Laboratories Inc.) 액체배지에 37°C 조건에서 24시간 동안 배양하여 활성화시킨 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 배지를 제거하고, 생성된 pellet은 생리식염수로 2회 세척하여 김치 제조 시 양념소에 starter로 첨가하였다.

< 실시예 3>

항암스타터김치의 pH 및 산도 측정

본 발명자들은 본 발명의 실시예 2에 따른 항암스타터김치의 pH 및 산도를 측정하기 위해 하기와 같은 실험을 실시하였다.

<3-1> 항암스타터김치의 pH 및 산도 측정

상기 항암스타터김치를 포함하는 실시예 <2-4>에서 제조된 각각의 김치들을 대상으로 김치의 pH 및 산도를 측정하였다. pH는 실온에서 pH meter(M220, Corming, MA, USA)로 측정하였고, 산도는 AOAC 표준시험법에 따라 김치 즙을 20배 희석하여 이 시료에 0.1N NaOH를 가하여 pH 8.4가 될 때까지 소비된 0.1N NaOH mL 수로 측정하였다. 적정한 값은 젖산(lactic acid)의 함량 %(중량 %)로 환산하여 나타내었으며, 그 수식을 하기에 기재된 바와 같다.

산도( acidity %)=

[( mL of 0.1 N NaOH × normality of NaOH ×0.09)/ 시료의 중량(g)]×100

그 결과, 스타터를 첨가하여 발효시킨 항암스타터김치가 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 pH의 감소 속도가 더 빠르게 나타나는 것으로 확인되었고(도 1 참조), 산도의 증가도 스타터를 첨가한 항암스타터김치가 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 속도가 빠르게 나타나 발효가 빨리 진행되는 것으로 나타났다(도 2 참조).

이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명에서 규명한 신균주가 발효식품의 제조 과정에서 발효의 진행을 빠르게 진행시켜 발효 시간을 단축시킬 수 있는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

<3-2> 항암녹차스타터김치 ( AK )의 pH 및 산도 측정

실시예 <2-6> 및 <2-7> 에서 제조한 항암녹차김치(AK), 항암녹차스타터김치의 pH 및 산도를 측정하기 위해 상기 3-1과 같은 방법으로 측정하였으며, 5℃에서 5주 동안, 실시예 <2-5>, <2-6> 및 <2-7> 에서 제조한 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK), 항암녹차스타터김치(AKS) 3종류 김치의 pH 및 산도 변화를 측정하였다.

pH에 대한 실험결과는 도 15 좌측 그래프에 나타내었으며, SK의 pH는 1주까지는 증가하였으나, 1주 이후로 지속적으로 감소하였으며, AK는 2주까지 지속적으로 증가후에 감소하였고, 다시 4주 후에 증가하는 모습을 보였다. AKS는 2주까지 감소한 후에 정상상태를 유지하는 것으로 나타났다.

산도에 대한 실험결과실험결과는 도 15 우측 그래프에 나타내었으며, SK의 산도는 실험개시 후에 지속적으로 증가하였으며, AK는 1주 후에 감소하였다가 2주부터 다시 지속적으로 증가하였으며, AKS는 1주 이후에 지속적으로 증가한 후 2주부터 약간 감소 후 증가하는 모습을 보였다.

< 실시예 4>

항암스타터김치의 탄력성 측정

또한, 본 발명자들은 상기 실시예 <2-4>에서 제조한 항암스타터김치를 대상으로, 김치 조직의 탄성을 조사하였는데, 탄성 정도는 rheometer(CR-100, Sun Scientific Co., Japan)을 이용하여 측정하였다. 탄력성 측정에 사용된 시료는 김치 밑동으로부터 5cm 아래의 두께가 0.5cm가 되는 부분을 3 cm × 4 cm의 크기로 썰어 사용하였고, 각 시료마다 5회 반복 측정하여 이 값의 평균값을 구하였다.

탄력성 측정 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 각 김치별 탄성 정도는 서로 유의적인 차이는 없었으나 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 스타터를 첨가한 김치가 빨리 숙성한 것에 비해 탄력성의 감소가 적어 조직의 물러짐이 감소한 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 신균주의 경우 발효 식품의 탄력성을 좋은 상태로 오래 동안 유지시킬 수 있어 보다 식감이 좋은 식품을 제조할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

<5-1> 항암스타터김치의 관능 평가

항암스타터김치의 관능성을 평가하기 위해 실시예 <2-4>의 방법으로 제조한 김치들의 관능 평가를 실시하였다.

김치의 관능 평가는 반복된 램덤화 완전 블록 계획(replicated randomized complete block design)에 따라서 훈련된 15명의 관능요원이 평가하였다. 평가 내용은 정량적 묘사분석 방법(quantitative descriptive analysis)을 사용하여 주관적 항목으로 종합적 외관(overall appearance), 종합적 평가(overall acceptability), 냄새(smell), 조직감(texture)을 평가하고, 객관적 항목으로 미각적 지각인 짠맛(salty flavor), 쓴맛(bitter flavor), 신맛(sour flavor), 군덕맛(mold flavor), 탄산맛(refresh flavor)을 평가하였다. 그 정도는 1에 가까울수록 감지 불가능한 것으로 평가하였고, 9에 가까울수록 극도로 강하게 감지하는 것으로 나타내었다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 스타터를 첨가한 항암스타터김치가 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 종합적 평가와 조직감이 더 높은 점수로 평가되었다.

<5-2> 항암녹차김치의 관능 평가

항암항암김치의 관능성을 평가하기 위해 실시예 <2-5>, <2-6> 및 <2-7> 에서 제조한 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK), 항암녹차스타터김치의 관능 평가를 실시하였다.

반복된 램덤화 완전 블록 계획(replicated randomized complete block design)에 따라서 훈련된 10명의 관능요원이 평가하였으며, 평가 내용 상기 실시예 <5-1>과 같이 평가하였다.

평가 결과는 도 17에 나타내었으며, 스타터를 첨가한 항암녹차스타터김치(AKS)에서 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 종합적 평가와 조직감이 긍정적으로 평가되었다. 또한 표준김치에서 레시피를 달리하여 유기농배추를 이용한 김치에서 종합적 평가가 높았다.

따라서 항암녹차스타터김치(AKS)의 관능성이 매우 뛰어난 것을 알 수 있었으며, 스타터를 처리하는 것이 김치의 관능성 면에서 유리하다는 것을 확인하였다.

< 실시예 6>

<6-1> 항암스타터김치의 총균 및 젖산균 수 측정

본 발명자들은 실시예 <2-4>의 방법으로 제조된 김치의 총균 및 젖산균의 수를 측정하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

총균수의 측정은 평판계수법(plate count technique)을 이용하여 측정하였는데, 상기 실시예 2-4에서 제조한 각 김치를 착즙하여 얻은 김치액을 멸균한 증류수로 단계별로 희석하여, 미리 가열 용해하고 냉각한 플레이트 카운트 아가(plate count agar; Difco, Detroit, MI, USA)에 0.1mL 씩 분주하여 도말하였다. 37°C에서 24-48시간 동안 배양기에서 호기 배양하고, 배양된 균의 colony 수를 계수하여 생성 콜로니 개수(colony forming units per gram, CFU/g)로 총균수를 측정하였다.

또한, 젖산균수의 측정은 총균수 측정과 동일한 방법으로 Leuconostoc sp.는 Leuconostoc 선택배지로 페닐에틸 알콜(phenylethyl alcohol)과 수크로스를 첨가한 PES medium(phenylethyl alcohol sucrose agar medium)를 사용하여 20°C에서 3-4일간 평판 배양하였다. 또한, Lactobacillus sp. 는 Lactobacillus 선택용 배지(LBS medium)에 Pediococcus의 생육을 억제하기 위하여 아세트산과 소듐 아세테이트를 첨가한 modified LBS agar medium(m-LBS medium)을 사용하여 37°C에서 3-4일간 평판 배양하여 나타난 colony수를 계수하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 총균수는 모두 발효 6일차에서 10⁸ CFU/g로 상승한 것으로 나타났고, 스타터를 첨가한 김치와 첨가하지 않은 김치가 비슷한 양상으로 변화하는 것을 알 수 있었다. 또한, 스타터를 첨가하지 않은 김치는 제조 즉시에는 가장 낮은 총균수를 보였으나 이후 스타터를 첨가한 김치와 비슷하게 성장하여 빠른 증가율을 보였다.

또한, 김치의 신맛과 시원한 탄산맛을 내는 숙성에 관여하는 젖산균인 Lactobacillus sp. 및 Leuconostoc sp.의 경우, 김치가 숙성되면서 균수가 증가하는 것으로 나타났다(도 6 및 도 7 참조).

특히, 젖산균수의 측정 결과, 발효 4일차에 Lactobacillus sp.의 수는 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 스타터를 첨가한 김치에서 10배 가량 높게 함유되어 있는 것으로 나타났으며, Leuconostoc sp.의 수는 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 10²배 이상 많이 함유되어 있다는 것이 나타나, 궁극적으로 본 발명에서 규명한 신균주의 사용으로 김치의 맛과 기능성을 개선시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

<6-2> 항암녹차김치 ( AK ) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 총균 및 젖산균 수 측정

상기 실시예 <2-5>, <2-6> 및 <2-7> 에서 제조한 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK), 항암녹차스타터김치의 종균 및 유산균 수를 측정하기 위해 상기 실시예 <6-1>의 방법과 같이 실험을 실시하였다.

도 16에 나타낸 것과 같이 총균수는 제조 당일에는 항암녹차스타터김치(AKS)에서 높은 것으로 나타났으나 발효가 진행되면서 다른 김치와 비슷한 수준으로 확인되었다. 특히 발효 3주와 4주차에 표준김치(SK)나 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 총균수가 낮은 것으로 나타났다.

김치의 총유산균수 측정 결과 항암녹차스타터김치(AKS)에서는 제조일부터 발효 5주차까지 가장 높은 유산균수를 보였다. 따라서 김치 제조시에 starter를 첨가하면 김치에 유산균이 많이 함유되어 있다는 것이 나타나 김치의 맛과 기능성에 바람직한 영향을 미칠 것으로 사료된다.

< 실시예 7>

본 발명에서 분리 및 동정한 신균주의 항산화 활성 분석

<7-1> DPPH 라디칼 소거능 분석

상기 실시예 <2-4>에서 제조한 항암스타터김치들을 대상으로 착즙하여 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 5%, 2% 농도로 각각 희석한 후 다음의 실험에 사용하였다. 김치착즙 시료 100 μL와 1.5 × 10⁴ M DPPH (1,1-diphenyl-2-pic rylhydrazul) 메탄올 용액 100 μL 를 96-well plate에 혼합하여 빛이 차단된 상태에서 30분간 방치 한 후 분광광도계(UV.VIS Spectrophotometer, Jasco, Japan)을 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 이때 스타터 균주를 첨가하지 않은 대조군과 스타터 균주를 첨가한 실험군과의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다. 한편, DPPH는 free radical을 가지고 있어 항산화 능력이 있는 물질과 반응하게 되면 안정한 형태로 돌아가면서 흡광도가 감소하게 된다.

측정 결과, 다른 종류의 스타터를 첨가한 김치와 스타터를 첨가하지 않은 김치의 DPPH radical 소거 효과는 K - LP PNU의 경우 60.63%, K - LP 3099는 61.45%, K - LM PNU는 59.91%, K - LP PNU/LM PNU는 54.53%, K - LP 3099/LM PNU는 51.32%의 DPPH 소거능을 보인 반면, 스타터를 첨가하지 않은 김치(도면에서 K - Standard의 막대 그래프)는 35%의 DPPH 소거능만을 보여 스타터를 첨가한 항암스타터김치가 유의적으로 높은 항산화 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었으며, 특히 LP PNU를 스타터로 첨가한 항암스타터김치가 다른 김치에 비해 유의적으로 높은 DPPH 라디칼 소거능을 가지고 있었고, 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 약 1.7배 정도 높은 효과가 있음을 알 수 있었다(도 8 참조). 나아가 본 발명에서 분리 및 동정한 2가지 균주를 혼합하여 사용하는 경우 단독 균주 사용에 비해서는 라디칼 소거능이 조금 감소하긴 하였으나, 스타터를 첨가하지 않은 군에 비해 유의적으로 라디칼 소거능이 있는 것으로 확인됨에 따라 상기 균주를 혼합하여 사용할 수도 있다는 것을 알 수 있었다.

<7-2> 항암스타터김치의 히드록시 라디칼 소거능 분석

항암스타터김치의 히드록시 라디칼 소거능을 분석하기 위해 실시예 2-4에서 제조한 김치들에 대해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

400 μM FeCl3, 400 μM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), 400 μM ascorbic acid, 6 mM deoxyribose, 20 mM phosphate buffer(pH 7.4)와 상기 실시예 <7-1>에서 사용한 농도별 시료용액을 각각 0.2 mL씩 혼합하여 1.4 mL 반응 용액을 만든 다음, 3 mM H₂O₂ 0.2 mL 첨가하여 Fenton 반응에 따라 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 혼합액에 2.8% trichloroacetic acid(TCA) 1.0 mL와 1.0% thiobarbituric acid(TBA) 1.0 mL를 첨가하여 끓는 물에서 20분간 반응시킨 후 냉각시켜 540 nm에서 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

히드록시 라디칼 소거능 (%)=(1- 실험군흡광도 / 대조군흡광도 ) x 100

참고로, 히드록시 라디칼(Hydroxyl radical)은 활성산소 중에서 화학적으로 반응성이 가장 크며 생체내의 산화원인이 되며 DNA 손상을 주거나 돌연변이를 유발하는 물질로 알려져 있다. 첨가한 스타터 종류에 따른 김치의 히드록시 라디칼 소거효과를 측정한 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

^a-cDuncan’s 다중 범위 테스트에 의해 p<0.05 인 것을 유의미한 것으로 본다.

이러한 결과를 통해, 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 스타터를 첨가한 김치에서 과산화수소 소거능이 유의적으로 높게 나타났고, LP PNU를 스타터로 하여 제조한 김치가 다른 김치에 비해 높은 소거 효과를 갖는 것으로 나타났다.

< 실시예 8>

본 발명에서 분리 및 동정한 신균주의 항암 활성 분석

상기 실시예 1에서 분리한 본 발명의 2개의 신균주가 항암 활성을 갖는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

(1) 사용시약 및 기기

세포배양을 위해 RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS), 0.05% trypsin-0.02% EDTA 및 penicillin-streptomycin(100 units/mL)은 GIBCO사(USA)로부터 구입하여 사용하였고, 세포배양은 CO₂ incubator(Forma, model MCO 96, Japan)를 사용하였다.

(2) 세포주( Cell line )와 세포의 배양

HT-29 인체 결장암세포(HT-29 human colon carcinoma cell)는 한국세포주은행(서울의대)으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 100 units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2-3회 refeeding하고 6-7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6-7일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계대배양시 각각의 passage number로 기록하였고 passage number가 10회 이상일 때는 새로운 암세포를 액체질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.

(3) MTT assay

배양된 암세포를 96well plate에 well당 2×10⁴ cells/mL이 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 96 well plate의 배지를 제거하고, 상기 실시예 <7-1>에서 수득한 김치 착즙액(시료)와 김치의 메탄올 추출물을 농도별로 희석하여 100 μL씩 첨가한 다음, 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 48시간 후 시료를 제거한 다음 phosphate buffered saline(PBS)에 5 mg/mL의 농도로 제조한 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT) 용액과 배지를 혼합하여 100 μL를 첨가하여 동일한 배양 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 이때 생성된 포르마잔 결정은 DMSO에 녹여 ELISA reader(model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

^a-d는 Duncan’s 다중 범위 테스트를 통해 유의적인 차이가 있음을 나타낸 것이다. (p<0.05)

분석 결과, 각기 다른 종류의 스타터를 첨가한 김치와 스타터를 첨가하지 않은 김치로부터 수득한 착즙액 및 김치 메탄올 추출물을 농도에 따라 in vitro HT-29 인체 결장암세포에 처리한 결과, 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 스타터를 첨가한 김치가 유의적으로 높은 암세포 성장 저해율을 나타내었으며 여러 스타터 첨가 김치 중에 본 발명의 신균주인 LP PNU 균주는 가장 높은 암세포 성장 저해율을 나타내었다.

< 실시예 9>

본 발명에서 분리 동정한 신균주의 염증 관련 유전자 발현 억제 효과 분석

나아가 본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 신균주가 암 세포에서 발현되고 있는 염증 관련 유전자의 발현을 억제하는 활성이 있는지 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 유전자 발현은 ExiCycler((Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)으로 측정하였는데, 이를 위해 배양한 암세포를 6well plate에 well당 2×10⁶ cells/mL이 되도록 분주하고 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후 배지를 제거하고, 새 배지에 김치의 메탄올 추출물을 5 mg/mL 농도로 첨가한 다음, 동일한 조건에서 48시간 배양하였다. 48시간 후 PBS로 1회 세척한 다음 trizol로 6 well plate에 부착된 cell을 모아 1,200 rpm에서 3분간 원심분리한 다음 cell을 모아 RT-PCR을 수행하여 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현을 측정하였다.

그 결과, 염증유발 단백질로 알려진 iNOS과 COX-2의 유전자 발현은 스타터 균주를 사용한 김치의 경우, 스타터 균주를 사용하지 않은 대조군에 배해 iNOS와 COX-2의 발현이 억제되는 것으로 나타났는데, 특히 본 발명의 LP PNU 균주는 이들 단백질의 발현을 가장 효과적으로 억제시키는 활성이 있는 것으로 나타났다(도 9 및 도 10 참조).

< 실시예 10>

항암스타터김치의 대장암 예방 효과 분석

실시예 <2-4>의 방법으로 제조한 김치들을 Balb/c 마우스(mouse)에 투여하여 항암스타터김치의 항암효과를 분석하였다.

통상적으로 대장암에 대한 실험에 이용되는 실험방법으로 Balb/c mouse 6주령을 윤리적으로 이용하여 스타터 첨가 김치의 대장암의 예방효과를 실험하였다. 즉, 이를 위해 실험 시작일에 AOM을 투여하고 2주 후에 2% DSS를 1주일간 음수로 자유 섭취하도록 하였다. 또한 2주간 휴식기를 가진 후에 1주간 DSS를 자유섭취한 후 다시 2주간의 휴식기를 가지도록 하였다. 이후 실시예 <2-4>의 방법으로 제조한 김치 시료는 DSS를 처음 투여하는 시점(실험 시작 2주 후)부터 실험 시작 6주까지 경구투여하였다. 이상과 같은 마우스 모델을 대상으로 진행한 상기 실험 진행 모델은 도 11에 나타내었다.

분석 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 대장암을 유도시킨 동물의 대장을 적출한 후 대장의 tumor 수를 관찰한 결과, 스타터를 첨가한 김치가 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 종양의 발생 수가 적었고, 특히 본 발명의 신균주인 LP PNU를 첨가한 김치에서 유의적으로 종양의 생성수가 낮은 것을 관찰되었다. 또한 LM PNU과 함께 LP PNU를 첨가한 경우 LM PNU과 LP 3099를 첨가하였을 때보다 종양의 발생이 적은 것으로 나타났다.

< 실시예 11>

항암스타터김치의 항비만 효과 분석

본 발명자들은 실시예 <2-4>의 방법으로 제조된 각각의 김치가 항비만 활성을 가지는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 10% BCS를 첨가한 DMEM으로 Mouse 3T3-L1 지방선구세포(pre-adipocyte)를 37℃ 5% 탄산가스로 충진된 배양기에 넣었으며, 포화상태에 이른 것을 확인한 다음 IBMX(0.5mM)와 덱사메타손(dexamethasone, 1.25mM), 인슐린(insulin, 4mg/mL), 10% FBS를 첨가한 DMEM(분화배지)으로 교체해 2일간 배양하였다. 이후에는 10% FBS만 첨가한 DMEM을 사용해 2일 간격으로 교체하며 배양하였으며, 분화배지를 첨가해 분화 유도를 시작한 지 8일차에 각 김치의 메탄올 추출물을 첨가하였으며, 이후 24시간을 추가로 배양하였다.

본 발명자들은 상기와 같이 배양한 지방세포를 Oil-red O 염색법을 실시해 지질의 축적을 조사하였다. 배양액을 흡인해 낸 후 PBS로 3회 세척하고 3.8% 포름알데히드(formaldehyde)로 4시간 이상 고정하였으며, 이후 PBS로 3회 세척하고 미리 조제된 Oil-red O 염색약으로 1시간 염색을 실시하였다. 염색된 세포를 현미경으로 관찰하며 촬영한 후 이소프로판올(isopropanol)로 30분간 탈염을 실시하고 염색약을 회수해 540nm의 파장을 조사해 OD값을 측정하였다. 또한 Oil-red O로 염색하여 1시간 내에 지방세포를 촬영하였다.

그 결과, 스타터를 첨가하지 않은 NK군에 비해 스타터를 첨가한 LP전주군, LM전주군, LP+LM 혼합군에서 지방구의 크기 및 수가 감소하여 항 비만 효과가 좋음을 알 수 있었고, 이들 각각을 비교하였을 때는 LP전주군은 0.45, LM전주군은 0.52로 대조군의 0.53과 비교하였을 때, LP전주군에서 대조군과 유의적인 차이를 보였다. 또한, 혼합 스타터를 첨가한 LP+LM 군은 0.32로 대조군(control)과 비교하였을 때 항 비만 효과가 가장 좋음을 알 수 있었다(도 13 및 14 참조).

< 실시예 12>

항암녹차김치 ( AK ), 항암녹차스타터김치(AKS)의 In vitro 항산화효과

상기 실시예 <2-6> 및 <2-7>에서 제조한 김치의 항산화 효과를 확인하기 위해 DPPH radical 소거능을 갖는지 다음과 같은 실험을 실시하였다.

실시예 <2-5>, <2-6> 및 <2-7> 에서 제조한 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK), 항암녹차스타터김치(AKS)를 동결건조하여 파우더로 만든 후 이 파우더를 20배의 메탄올로 추출하여 얻은 메탄올 추출물을 실험에 이용하였다. 김치 시료 100 μL와 1.5 × 104 M DPPH (1,1-diphenyl-2-pic rylhydrazul) methanol solution 100 μL 를 96-well plate에 혼합하여 빛을 차단하여 30분간 방치 한 후 분광광도계(UV.VIS Spectrophotometer, Jasco, Japan)을 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료를 첨가한 실험군과의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다. DPPH는 free radical을 가지고 있어 항산화 능력이 있는 물질과 반응하게 되면 안정한 형태로 돌아가면서 흡광도가 감소하게 된다.

실험결과는 도 18에 나타내었으며, 3가지 김치의 DPPH radical 소거 효과를 측정한 결과, SK는 64%의 항산화효과를 보인 반면 AK는 70%, AK-S는 76%의 높은 항산화효과를 보였다. 이를 통해 스타터를 첨가하면 유의적으로 항산화 효과가 증진된다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 13>

항암녹차김치 ( AK ) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 In vitro 항암 효과 실험

상기 실시예 <2-6> 및 <2-7>에서 제조한 김치의 항암효과를 확인하기 위해 대장암 세포에서 다음과 같은 실험을 실시하였다.

<13-1> HT -29 인체 대장암 세포배양

HT-29 인체 결장암세포(HT-29 human colon carcinoma cell)는 한국세포주은행(서울의대)으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 100units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2-3회 refeeding하고 6-7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6-7일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계대배양시 각각의 passage number로 기록하였고 passage number가 10회 이상일 때는 새로운 암세포를 액체질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.

<13-2> MTT assay

배양된 암세포를 96well plate에 well당 2×10⁴ cells/mL이 되도록 분주하고 24시간 배양하였다. 96 well plate의 배지를 제거하고, 시료를 농도별로 희석하여 100 μL씩 첨가한 다음, 37°C, 5% CO₂ incubator에서 48시간 배양하였다. 48시간 후 시료를 제거한 다음 phosphate buffered saline(PBS)에 5 mg/mL의 농도로 제조한 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT) 용액과 배지를 혼합하여 100μL를 첨가하여 동일한 배양 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 이때 생성된 formazan 결정을 DMSO에 녹여 ELISA reader(model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과는 도 19에 나타내었으며, 실시예 <2-5>, <2-6> 및 <2-7> 에서 제조한 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK), 항암녹차스타터김치(AKS)의 메탄올 추출물을 HT-29 인체 결장암세포에서의 성장 억제 효과를 관찰한 결과, 가장 높은 암세포 성장 저해 효과를 보인 것은 AKS이었다. AKS는 57.6%의 암세포 성장 저해 효과를 보였으며 AK(46.4%) 보다 높아 김치 제조시에 첨가된 starter가 항암효과를 증진시키는 것을 확인하였다. 반면 표준김치는 37.9%로 가장 낮은 암세포 성장 저해 효과를 보였다.

< 실시예 14>

항암녹차김치 ( AK ) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 In vitro 항비만 효과 실험

본 발명자들은 실시예 <2-6> 및 <2-7>에서 제조한 김치의 항비만 효과를 확인하기 위해 3T3-L1 지방세포에서 실험을 실시하였다.

<14-1> 3 T3 - L1 지방세포 배양

10% BCS를 첨가한 DMEM으로 Mouse 3T3-L1 pre-adipocyte를 37℃ 5% 탄산가스로 충진된 배양기에 넣었으며, 포화상태에 이른 것을 확인한 다음 IBMX(0.5mM)와 dexamethasone(1.25mM), insulin (4mg/mL), 10% FBS를 첨가한 DMEM(분화배지)으로 교체해 2일간 배양하였다. 이후에는 10% FBS만 첨가한 DMEM을 사용해 2일 간격으로 교체하며 배양하였다. 분화배지를 첨가해 분화 유도를 시작한 지 8일차에 각 김치의 메탄올 추출물을 첨가하였으며, 이후 24시간을 추가로 배양하였다.

<14-2> Oil - red O 염색법 및 지방세포 크기 계측

배양한 지방세포를 Oil-red O 염색법을 실시해 지질이 축적을 조사하였다. 배양액을 흡인해 낸 후 PBS로 3회 세척하고 3.8% formaldehyde로 4시간 이상 고정하였다. 이후 PBS로 3회 세척하고 미리 조제된 Oil-red O 염색약으로 1시간 염색을 실시하였다. 염색된 세포를 현미경으로 관찰하며 촬영한 후 isopropanol로 30분간 탈염을 실시하고 염색약을 회수해 540nm의 파장을 조사해 OD값을 측정하였다. 또한 Oil-red O로 염색하여 1시간 내에 지방세포를 촬영하였다.

실험 결과는 도 20 및 도 21에 나타내었으며, 실시예 <2-5>, <2-6> 및 <2-7> 에서 제조한 부산대학교 표준화김치(SK), 항암녹차김치(AK), 항암녹차스타터김치(AKS)를 사용하였으며, 실험결과 SK, AK, AKS를 처리한 실험군에서 미처리군인 control 보다 지방구의 크기 및 수가 감소함을 확인하였다. 김치 간 효과를 비교하였을 때, SK 보다 AK 및 AKS 처리구에서 그 효과가 높았으며 특히 AKS 처리구에서 가장 높은 효과가 나타났다(도 20 참조). OD값 측정 결과 SK는 control에 비해 약 29.6%, Ak는 43.6%, AKS는 48.6%의 억제 효과를 보여 AKS 처리구에서 가장 지방의 축적이 적은 것을 확인하였다(도 21 참조).

< 실시예 15>

항암녹차김치 ( AK ) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 동물실험

본 발명자들은 실시예 2-6 및 2-7에서 제조한 김치의 항비만 효과를 확인하기 위해 C57BL/6J 마우스 모델에서 다음과 같은 실험을 실시하였다.

<15-1> 실험동물 및 실험군의 설정

실험동물은 6주령의 C57BL/6계 수컷 마우스를 샘타코에서 구매하여 1주간 적응시킨 후 체중이 평균 21.5±0.52 g 정도 되는 것을 본 실험에 사용하였다. 실험군의 설정은 일반식이(AIN-93G)를 섭취한 정상대조군(STD군), 45% HFD(high fat diet)가 함유된 고지방식이를 섭취한 비만대조군(HFD군), 45% HFD와 일반김치 추출물이 3% 함유된 식이를 섭취한 HFD+NK군, 45% HFD와 항비만 및 항암 기능성을 가지는 김치(AK) 추출물이 3% 함유된 식이를 섭취한 HFD+AK군, 45% HFD와 AK에 starter를 첨가한 김치(AKS) 추출물이 3% 함유된 식이를 섭취한 HFD+AKS군으로 총 5군으로 나누어 각 군당 마리수를 8마리씩 배정하였고 8주동안 실험하였다.

<15-2> 식이 공급

일반식이는 AIN-93G를, 고지방식이는 AIN-93G에 HFD를 45% 함유한 식이를 사용하였다. 김치 추출물은 각 3%를 첨가하여 자유섭취하도록 하였다. 각 실험동물에게 제공한 사료의 성분함량은 표 3과 같다.

<15-3> 체중 변화

실험동물의 체중은 4일마다 1회 일정시간에 동일한 저울로 측정하였다. 8주 동안 실험동물의 체중을 측정한 결과는 도 22와 같이 HFD군이 STD군과 비교해 체중이 유의하게 높게 측정되어 비만의 유발을 확인할 수 있었다. 실험시작 후 8일째부터 비만유발군과 유발하지 않은 군간 유의적인 차이가 나타났으며 이후 지속적으로 유의적인 차이를 보였다(p<0.05). 8주간 가장 높은 체중을 보인 것은 비만유발군인 HFD군이었으며, STD군, HFD+AK군, HFD+AKS군 간에는 유의적인 차이가 없이 다른 군과 비교하여 낮은 체중이 낮았다. 이로써 AK 및 AKS를 섭취에 따른 체중 증가 억제를 확인하였다.

<15-4> 지방의 무게

실험결과는 도 23에 나타내었으며, 각 군별로 해부한 실험동물의 부고환 지방(epididymal fat) 및 신장 주위 지방(perirenal fat)을 적출하여 무게를 측정한 결과 STD를 섭취한 군에 비하여 HFD를 섭취한 군에서 유의적으로 지방 조직의 무게가 증가하여 HFD 섭취에 의한 비만의 유도를 확인하였다(p<0.05). 3가지 김치 섭취군에서 모두 HFD군에 비하여 유의적으로 부고환 지방 및 신장 주위 지방의 무게가 감소하여 김치가 지방을 감소시키는 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 일반김치를 섭취한 HFD+NK군에 비해 HFD+AK 및 HFD+AKS군에서 지방 축적이 낮았고 특히 HFD+AKS군에서 가장 지방 축적이 작아 김치에 starter 첨가에 따른 항비만 효과의 증진을 확인하였다.

<15-5> 혈청 분석

각 실험군별로 모은 혈액을 3000 rpm에서 15분간 원심분리해서 혈청을 분리한 후, 분리된 혈청 중에서 총콜레스테롤(Total Cholesterol : TC), 총글리세롤(Total Glycerol : TG), LDL(low density lipoprotein), 글루코스(glucose) 등의 수준을 측정하기 위해서 혈청 분석 Kits (Asan Pharm, Seoul, South Korea)를 사용하였다. HDL은 HDL=[TC-(HDL+TG/5)]에 따라 계산하였다.

혈청 중 leptin 및 adiponectin은 R & D System 사(R&D Systems, Minnesota, USA)의 ELISA kit을 이용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 분석하였다.

혈청을 분석한 실험결과는 도 24 및 도 25에 나타내었으며, 혈청에서 TC, TG, LDL, glucose의 농도는 정상대조군(STD)군과 비교하여 고지방식(HFD)군에서 유의적으로 증가되어 HFD 섭취로 인한 비만이 유발됨을 확인하였다. TC, TG, LDL, glucose 모두에서 김치 투여에 따라 HFD군과 비교하여 유의적으로 감소됨을 확인하였고 그 효과는 SK보다 AK, AKS에서 높았다. 특히 HFD+AKS군은 HFD군과 비교하여 TG의 농도를 50% 이상 감소시키는 효과가 있는 것을 확인하였다. 조직세포에 존재하는 과잉의 콜레스테롤을 제거하는 기능이 있는 HDL은 HFD+AK군과 HFD+AKS군에서 STD군과 비슷하게 높은 것으로 나타났으며 HFD+AKS군에서 더 효과가 높았다(도 24 참조).

지방세포에서 분비되는 adiponectin은 지방대사와 인슐린 민감성을 증가시키며 비만, 제2형 당뇨병 및 인슐린저항성이 심할수록 감소되고, 혈관 내피세포에 대해 항 염증작용을 함으로써 대사질환과 심혈관질환에 중요한 인자로 작용한다. Leptin 역시 지방세포에서 분비되어 주로 식욕조절과 포만감을 느끼게 하는 호르몬으로서 인슐린저항성과도 관련이 있으나 체지방량과 체중 증가와 관련이 큰 것으로 알려지고 있는데, leptin 농도의 증가는 혈관 기능의 손상과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다.

마우스의 혈청을 이용하여 adiponectin과 leptin의 분비량을 측정한 결과 모든 김치 투여군에서 adiponectin이 증가하고, leptin이 감소하여 김치가 비만을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인하였다. 김치 투여군 중 특히 HFD+AKS군은 adiponectin의 농도가 높고, leptin의 농도가 낮은 것으로 나타나 비만을 억제하는 효과가 큰 것으로 나타났다(p<0.05)(도 25 참조).

< 실시예 16>

항암녹차김치 ( AK ) 및 항암녹차스타터김치(AKS)의 간 조직 mRNA 분석

본 발명자들은 실시예 2-6 및 2-7에서 제조한 김치의 항비만 효과를 확인하기 위해 간 조직에서의 mRNA 분석을 실시하였다.

각 실험군에서 실험동물의 간 조직을 임의로 선정하고, 이를 PBS로 세척하여 trizol을 이용하여 total RNA를 분리하였다. Oligo dT primer를 사용하면 분리한 RNA 중 mRNA가 모두 cDNA로 만들어지기 때문에 분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 μg의 RNA에서 mRNA에 상보적인 ss cDNA로 역전사 시켰다. 이 cDNA를 template로 사용하여 SREBP-1c, CEPB/α, PPARγ 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 특정 유전자 부위를 증폭하였다. 이때 internal control로 housekeeping 유전자인 β-actin을 사용하였다. 각 PCR 산물들을 2% agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma, USA)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.

중성지방의 형성은 SREBPs(sterol regulatory element binding proteins), C/EBPs (CCAAT/enhancer binding proteins), PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ)와 같은 여러 transcription factors에 의해 조절된다.

SREBPs는 인슐린의 역할을 매개하여 지방산과 콜레스테롤의 생합성 경로에 관련되는 효소를 활성화하여 간에서 지방산과 콜레스테롤 합성을 유도하는 중요한 전사활성인자이며 그 중 간조직에서 SREBP-1c의 발현이 우세한 것으로 알려져 있다. C/EBPα는 지방세포의 전사조절분자 중의 하나로 지방세포의 후기 분화과정에 주요 전사인자이다. 다양한 섬유아세포에서 과다 발현하게 되면 adipogenesis를 유도한다고 보고되어 있다. PPAR-γ는 preadipocyte에서 지방 세포로 분화되는 과정 중 지방생성의 관여에 가장 중요한 역할을 하며 특히 후기 분화의 주요 전사인자로 알려져 있다. 이들은 지방세포의 분화와 관련된 여러 가지 enzyme들의 발현에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며 인슐린에 의해 활성화되는 C/EBPs나 SREBPs와 함께 지방합성과 저장에 관여하는 효소들의 발현을 조절하는 역할을 한다.

실험결과는 도 26에 나타내었으며, 실험동물의 간조직을 이용하여 SREBP-1c, C/EBPα 및 PPARγ의 mRNA 발현을 측정한 결과 HFD군, HFD+NK, HFD+AK, HFD+AKS군에서 STD군 보다 그 발현이 증가하여 비만 유도에 따라 발현이 증가됨을 확인하였다. 그러나 김치시료를 혼합한 사료를 제공한 HFD+SK, HFD+AK, HFD+AKS군에서 그 발현이 감소됨을 확인하였다(p<0.05). 특히 SK, AK를 섭취한 실험군 보다 AKS를 섭취한 군에서 가장 그 발현이 낮아 비만 억제 효과가 큰 것으로 나타났다.

이상 본 발명의 실시예들을 통한 실험 결과를 토대로 볼 때, 본 발명에서 분리 및 동정한 신균주인 (1) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)PNU - 기탁번호 KCCM11352P(일명 "LP PNU”라고 명명함)과 (2) 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)PNU - 기탁번호 KCCM11353P(일명 "LM PNU" 이라고 명명함)는 우수한 항산화 활성, 항비만 활성 및 항암 활성 을 가지고 있을 뿐만 아니라, 발효 식품의 제조에 스타터로 사용할 경우, 상기와 같은 기능성 및 관능미가 우수한 발효 식품을 제조할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11352P

20130122

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11353P

20130122

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Pusan University <120> Novel starter strain and method functional fermentation foods containing kimchi use thereof <130> pn1301-011 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1409 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LP PNU strain 16s rRNA sequence <400> 1 tcgaacgaac tctggtattg attggtgctt gcatcatgat ttacatttga gtgagtggcg 60 aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc cagaagtggg ggataacacc tggaaacaga 120 tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca tggtccgagt ttgaaagatg gcttcggcta 180 tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag ctagatggtg gggtaacggc tcaccatggc 240 aatgatacgt agccgacctg agagggtaat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa 300 actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa 360 cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaaactct gttgttaaag aagaacatat 420 ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta tttaaccaga aagccacggc taactacgtg 480 ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg 540 agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc 600 ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat 660 gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct 720 gaggctcgaa agtatgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac 780 gatgaatgct aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca 840 ttccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 900 aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 960 tactatgcaa atctaagaga ttagacgttc ccttcgggga catggataca ggtggtgcat 1020 ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080 attatcagtt gccagcatta agttgggcac tctggtgaga ctgccggtga caaaccggag 1140 gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1200 aatggatggt acaacgagtt gcgaactcgc gagagtaagc taatctctta aagccattct 1260 cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga 1320 tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag 1380 agtttgtaac acccaaagtc ggtggggta 1409 <210> 2 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LM PNU strain 16s rRNA sequence <400> 2 tgcagtcgac gcacagcgaa aggtgcttgc acctttcaag tgagtggcga acgggtgagt 60 aacacgtgga caacctgcct caaggctggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg 120 aataaaactt agtgtcgcat gacacaaagt taaaaggcgc ttcggcgtca cctagagatg 180 gatccgcggt gcattagtta gttggtgggg taaaggccta ccaagacaat gatgcatagc 240 cgagttgaga gactgatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 300 gctgcagtag ggaatcttcc acaatgggcg aaagcctgat ggagcaacgc cgcgtgtgtg 360 atgaaggctt tcgggtcgta aagcactgtt gtatgggaag aacagctaga ataggaaatg 420 attttagttt gacggtacca taccagaaag ggacggctaa atacgtgcca gcagccgcgg 480 taatacgtat gtcccgagcg ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcagacggtt 540 tattaagtct gatgtgaaag cccggagctc aactccggaa tggcattgga aactggttaa 600 cttgagtgca gtagaggtaa gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg 660 gaagaacacc agtggcgaag gcggcttact ggactgcaac tgacgttgag gctcgaaagt 720 gtgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccacac cgtaaacgat gaacactagg 780 tgttaggagg tttccgcctc ttagtgccga agctaacgca ttaagtgttc cgcctgggga 840 gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cggtggagca 900 tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tttgaagctt 960 ttagagatag aagtgttctc ttcggagaca aagtgacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag 1020 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc 1080 cagcattcag atgggcactc tagcgagact gccggtgaca aaccggagga aggcggggac 1140 gacgtcagat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggcgtatac 1200 aacgagttgc caacccgcga gggtgagcta atctcttaaa gtacgtctca gttcggattg 1260 tagtctgcaa ctcgactaca tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc 1320 ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tttgtaatgc 1380 ccaaagccgg tggcctaacc tttaggaagg 1410

Claims

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P).
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P)을 포함하는 발효식품 제조를 위한 스타터.
제2항에 있어서,
상기 스타터는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) PNU (KCCM11353P)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발효식품 제조를 위한 스타터.
제2항에 있어서,
상기 스타터는 분말형태인 것을 특징으로 하는 스타터.
제2항의 스타터를 이용하여 발효식품을 제조하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 발효식품은 김치, 오이, 무, 당근, 양파, 마늘, 고추 또는 갓 인 것을 특징으로 하는 발효식품을 제조하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 방법은 녹차를 더 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 발효식품을 제조하는 방법.
제5항의 방법으로 제조된 발효식품.
제8항에 있어서,
상기 발효식품은 항산화 활성, 항비만 활성 및 항암 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 발효식품.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 이의 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 이의 배양물을 함유하는 프로바이오틱스(probiotics).
제11항의 프로바이오틱스(probiotics)를 유효성분으로 포함하는 유산균 제제.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 이의 배양물을 함유하는 비만 또는 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제13항에 있어서,
상기 조성물은 녹차를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제13항에 있어서,
상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P)을 포함하는 항암활성 또는 항비만활성을 갖는 김치로서,
상기 김치는 절인배추 100 중량부 대비 고춧가루 3.0~4.0중량부, 마늘 1.0~2.0중량부, 생강 0.3~10중량부, 젓갈 2.0~2.5중량부, 무 10~15중량부, 설탕 0.5~1.5중량부, 파 1.5~2.5중량부 및 배 2.0~3.5중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암활성 또는 항비만활성을 갖는 김치.
제1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P)을 포함하는 항암활성 또는 항비만활성을 갖는 김치로서,
상기 김치는 절인배추 100중량부 대비 고춧가루 2.0~3.0중량부, 마늘 2.5~3.5중량부, 생강 0.3~10중량부, 무 8~15중량부, 설탕 0.5~1.5중량부, 파 1.5~2.5중량부, 녹차 6.0~8.5중량부, 산초 0.5~1.5중량부, 배 2.0~3.5중량부, 버섯다시마물 25~45중량부 및 겨우살이 추출물 0.025~0.075중량부로 포함하는 항암활성 또는 항비만활성을 갖는 김치.
삭제
제1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 균주를 배양하는 단계; 및
배양한 상기 균주가 생산하는 프로바이오틱스를 수득하는 단계;를 포함하는 프로바이오틱스를 생산하는 방법.