KR101680014B1 - 김치로부터 분리한 염증성 장 질환 치료 효과를 갖는 유산균 - Google Patents

김치로부터 분리한 염증성 장 질환 치료 효과를 갖는 유산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 락토바실러스 쿠르바투스 균주, 이를 포함하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물, 생균제 조성물, 및 상기 균주를 이용한 종균김치의 제조방법 및 상기 제조방법에 따른 기능성 김치에 관한 것으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 염증성 장 질환 치료 효과를 가지므로 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있으며, 장 점착능이 우수하여 생균활성제(프로바이오틱스)로 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 김치 제조에 있어 종균으로 사용함으로써 기능성 김치를 제공할 수 있다.

Description

김치로부터 분리한 염증성 장 질환 치료 효과를 갖는 유산균{Lactic acid bacterium isolated from Kimchi for treating inflammatory bowel disease and uses thereof}
본 발명은 염증성 장 질환 치료 효과를 갖는 신규 락토바실러스 쿠르바투스 균주, 이를 포함하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물, 생균활성제, 염증성 장 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물, 발효용 스타터(Starter), 발효식품용 종균 조성물, 염증성 장 질환 개선 또는 예방용 발효식품, 상기 균주를 이용한 종균김치의 제조방법 및 상기 제조방법에 따른 기능성 김치에 관한 것이다.
만성염증성 장 질환은 소화관에 생기는 심각한 만성 염증으로서 크론병과 궤양성 대장염 등이 있으며, 병의 증상과 경과 및 치료방법 등이 비슷한 질환이다. 염증을 가라앉히기 위한 여러 가지의 약이 개발되어 사용되었으나, 아직까지 뚜렷한 치료 효과를 보이는 약물은 개발되지 않은 실정이다. 만성 염증성 장 질환이 지속될 경우 암을 유발할 수 있으며, 장내 만성 염증성 질환을 일으키는 인자로는 세균이나 바이러스에 장내 감염으로 인한 다양한 염증물질 생성 또는 장내 미생물총에 병원체로의 인식을 통한 염증성 싸이토카인 생성 및 항염증성 싸이토카인 분비 억제 등 수많은 물질이나 발병기전들이 관여하므로 현재까지 알려진 치료제(비특허문헌 1~3)의 효과가 제한적이며, 병변이 만성으로 진행되면 장 조직 괴사나 암으로의 진행 등 나타내는 기작들이 더 복잡해져 더 많은 물질들이 관여하기 때문에 대부분의 만성 염증성 장 질환 치료제에 내성을 가지게 된다.
이에 부작용이 없으면서, 만성 염증성 장 질환에 천연 유래 물질을 통한 개선효과가 우수한 소재를 개발하고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 있으며, 그 중 하나가 유산균 생균제(probiotics)이다. 프로바이오틱스 유산균은 생균 자체를 이용하기 때문에 경구 섭취 시 인체 내의 가혹한 환경, 즉 pH가 3 이하로 내려가는 산성환경과 위장과 소장에서 분비되는 소화효소 및 담즙산에 의해 생육이 저해되어 대장에 도달하는 생균수가 감소뿐만 아니라 장내 정착률이 저하된다는 문제점이 지적되고 있다(비특허문헌 4~5).
Strober W, Fuss I, Mannon P. The fundamental basis of inflammatory bowel disease. J Clin Invest 2007;117:514-521. Baumgart DC, Sandborn WJ. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet 2007;369:1641-1657. Garcia-Bosch O, Ricart E, Panes J. Review article: stem cell therapies for inflammatory bowel disease - efficacy and safety. Aliment Pharmacol Ther2010;32:939-952. Salminen S., Isolaui E. and Ouwehand A. C. 1998. Clinical application of probiotic bacteria. Int. Dairy J. 8: 563-572 김진욱, 정종근, 주치인, 이재화. 2005. Probiotics의 최근 연구동향. 신라대학교 자연과학연구소, 자연과학논문집, 14: 35-38
이에, 본 발명자들은 기능성 김치를 제조하기 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 김치로부터 분리한 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(Lactobacillus curvatus WiKiM38, 수탁번호 KFCC11667P) 균주가 염증성 장 질환 치료 효과 및 장 점착능을 확인하고, 김치의 제조방법에 있어서 상기 균주를 스타터로서 첨가하여 상기 제조방법에 따른 김치가 기존의 김치와 비교하여 김치품질 유지 기한 연장 효과가 있으며, 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주가 7~10 log CFU/mL로 존재하여 프로바이오틱스(생균활성제)로의 가능성을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(Lactobacillus curvatus WiKiM38, 수탁번호 KFCC11667P) 균주, 상기 균주를 포함하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물, 생균활성제, 염증성 장 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물, 발효용 스타터(Starter), 발효식품용 종균 조성물, 염증성 장 질환 개선 또는 예방용 발효식품, 상기 균주를 이용한 종균김치의 제조방법 및 상기 제조방법에 따른 기능성 김치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KFCC11667P의 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(Lactobacillus curvatus WiKiM38) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)를 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효용 스타터(Starter)를 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주를 포함하는 발효식품용 종균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발효용 스타터 또는 상기 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 것을 특징으로 하는 염증성 장 질환 개선 또는 예방용 발효식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 김치 양념소에 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물을 첨가하는 단계를 포함하는, 종균김치의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따른 종균김치를 제공한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 배양물이란 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 상기 특정 미생물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다. 이러한 측면에서, 배양액이란 액체배지에 특정 미생물을 접종하여 배양한 것을 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서, 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것 또는 제거한 것을 의미한다.
상기 배양배지란 동물세포나 식물세포 또는 세균 따위를 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체 또는 액체를 의미한다. 상기 배지는 배양대상 즉, 배양체가 되는 미생물이나 세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로, 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 불리우며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 생균활성제 또는 프로바이오틱스(probiotics)이란 사람과 가축의 장내 미생물 균총의 개선으로 건강에 유익한 효능을 갖는 생균제재 또는 장내 미생물 균형을 증진시킴으로써 숙주동물에 유익한 효과를 주는 살아 있는 미생물 제제를 의미한다. 미생물이 생균활성제로 기능하기 위해서는, 위장을 통과하는 과정에도 일정 균수가 생존하여야 하므로, 내산성 및 내담즙성이 있어야 하고, 장내 생존력이 좋아 섭취 후 일정기간 그 활성이 유지될 수 있어야 한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 발효용 스타터(stater)란 발효에 관여하는 김치 유산균 등의 세균 등을 포함하는 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 상기 발효용 스타터는 발효식품 등의 생산 시 첨가하여 발효식품에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 발효용 스타터를 사용하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절하거나, 발효의 속도 또는 단계를 조절할 수 있으며, 특정한 목적을 달성한 발효 식품을 제조할 수 있다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 종균이란 발효에 이용되는 미생물로서, 발효를 위하여 기질 또는 식품에 접종되는 미생물을 의미하고, 종균 조성물이란 발효를 개시하는데 필요한 하나 이상의 접종균체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 의미한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하고, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공규, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으며 본 발명에서 발효식품, 기능성 식품 및 가공식품을 포함하는 것을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 발효식품이란 유산균, 구체적으로, 김치 유산균, 더욱 구체적으로 락토바실러스 플란타륨 등의 미생물이나 효소 등 미생물을 한가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다.
이하, 본 발명의 구성을 상세하게 설명한다.
본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(Lactobacillus curvatus WiKiM38, 수탁번호 KFCC11667P) 균주에 관한 것이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주는 전통발효식품 유래의 락토바실러스 쿠르바투스 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주를 김치에서 분리, 동정하기는 하였으나, 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예를 통해 김치로부터 분리한 항염증성 싸이토카인 IL-10 생성이 우수한 유산균 균주를 미생물 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석한 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 상기 핵산서열은 NCBI GenBank(http://www.ncbi.nin.gov)에서 제공하는 블라스트 서치 프로그램(blast search program)을 통해 상동성(homology)을 확인해 본 결과, 락토바실러스 쿠르바투스 표준균주 DSM 20019와 99.5% 동일함을 확인할 수 있었다.
따라서, SEQ ID NO: 1의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38((Lactobacillus curvatus WiKiM38)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2016년 6월 16일자로 기탁하였다(수탁번호 KFCC11667P).
본 발명의 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38은 그람양성균이며, 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이고, 간균의 형태를 취하고 있다. 또한, 항염증성 싸이토카인 IL-10 생성이 우수하며, 염증성 장 질환 치료 효과가 우수한 것을 확인하였다.
상기 염증성 장 질환은 소화관에 생기는 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 심각한 만성 염증으로서, 구체적으로 크론병, 궤양성 대장염 등을 들 수 있다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물을 포함한다.
본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 균주를 106 내지 1012 cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함한다. 상기 유산균 균주들은 유산균을 위한 일반적인 배양 방법으로 성장되고, 원심분리와 같은 분리 과정으로 회수되며, 건조, 예컨대, 동결건조에 의해 생균제 형태로 제조하여 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제와 함께 제형화되어 조제될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 유산균들과 적절한 담체, 부형제, 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐 또는 액상의 형태로 제형화 될 수 있다. 본 발명의 조성물은 장내 또는 경구 투여용 제품으로 제형화될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 공지의 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복되어 제품화될 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 부형제는 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 글루코오스 등과 같은 설탕 및 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 부분적으로 전젤란틴화된 전분 등의 전분을 포함한다. 바인더는 덱스트린, 소듐알지네이트, 카라지난, 구아검, 아카시아, 아가 등의 폴라사카라이드, 트라가칸트, 젤라틴, 글루텐 등의 천연-발생 거대분자 물질, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스소듐 등의 셀룰로오스 유도체 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 비닐아세테이트 수지 등의 고분자를 포함한다. 분해제로는 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 저치환 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 및 소듐카복시메틸 전분, 히드록시프로필 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분 및 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 윤활제의 예들은 활석, 스테아르산, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 콜로이드성 실리카, 히드로스실리콘 다이옥사이드, 다양한 종류의 왁스 및 히드로게네이티드 오일 등을 포함한다. 코팅제로는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-클로로트리메틸암모늄에틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸셀룰로오스 등의 수불용성 중합체, 메타크릴산-에틸아크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스아세테이트석시네이트 등의 장성 중합체 및 메틸셀룰로오스, 히드록시 프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 중합체를 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에서 유효성분인 상기 유산균 균주들의 투여량은 치료나 예방의 목적, 치료 또는 예방하려는 환자의 종류, 환자의 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인 환자의 경우, 1×106 이상의 생균, 바람직하게는 1×108 내지 1 ×1012의 생균이 필요에 따라 한번 또는 나눠서 투여될 수 있다.
본 발명은, 또한 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)를 제공한다.
본 발명에서 생균활성제란 사람과 가축의 장내 미생물 균총의 개선으로 건강에 유익한 효능을 갖는 생균제재를 의미한다. 미생물이 생균활성제로 기능하기 위해서는, 장내 생존력이 좋아 섭취 후 일정기간 그 활성이 유지되어야 한다. 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 생균 및 사균에서 우수한 염증성 장 질환 치료 효과뿐만 아니라, 전통발효식품인 김치에서 유래된 GRAS(generally recognized as safe)균주로 안전한 균이므로, 생균활성제로 기능하기 위한 조건을 모두 만족한다.
상기 생균활성제에 포함되는 유효성분의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 전제 생균활성제을 기준으로 0.01 중량부 내지 99 중량부, 더욱 바람직하게는 0.1 중량부 내지 90 중량부일 수 있다. 상기 생균활성제에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 생균활성제는 염증성 장 질환 치료 효과와, 우수한 장 점착능을 가지므로, 인체 의약품인 정장제나 유산균제제, 사료첨가제 및 건강식품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품은 장내 항염증 소재로 가능성을 제시하고, 염증성 장질환 개선 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스 이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음 료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기의 유효성분은 식품류, 음료, 건강음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류의 제조 시 원료 물질에 첨가되거나 조리된 식품에 적절히 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조첨가제와 함께 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 활성성분의 양은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 90 중량%로 가할 수 있으며, 음료의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 g 내지 20 g, 바람직하게는 0.5 g 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.
상기 식품은 일 예로 발효식품, 건강식품 또는 음료일 수 있다.
본 발명에서 발효식품이란 유산균이나 효모 등 미생물을 한 가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젖갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함되며, 일 예로는 김치일 수 있다.
또한, 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 발효식품용 종균으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 김치의 종균으로 사용될 수 있다. 이때 종균의 사용량은 발효식품의 종류 및 종균의 종류에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다. 바람직하기로는 식품 주재료 100 중량을 기준으로 0.0001 내지 0.01 중량부(습윤 중량부)로 접종하는 것이다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 염증성 장 질환 예방 또는 개선능을 갖는 식품을 의미한다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고 주류, 청량음료, 물시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되며 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료란 유산균을 배양하여 유산발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 발효용 스타터(Starter), 바람직하게는 김치 발효용 스타터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주를 포함하는 발효식품용 종균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발효용 스타터 또는 상기 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 것을 특징으로 하는 발효식품을 제공한다. 상기 발효식품은 염증성 장 질환 개선 또는 예방용 발효식품일 수 있으며, 바람직하게는 염증성 장 질환 개선 또는 예방용 김치일 수 있다.
상기 발효용 스타터를 발효식품의 생산 시 첨가하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 발효용 스타터에 포함된 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절할 수 있고, 상기 스타터의 첨가량 또는 초기 균수에 의하여 발효의 속도를 조절할 수 있다.
또한, 상기 발효용 스타터를 김치에 사용하는 경우, 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 염증성 장 질환 예방 또는 개선 효과를 가지므로, 상기 균주를 이용하여 김치를 제조하는 경우, 상기 김치 또는 상기 김치의 가공식품을 섭취하는 경우, 장내에서 염증성 장 질환을 예방 또는 개선할 수 있고, 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 안전성이 인정되는 GRAS 미생물이면서도 항생제 내성을 가지고 있지 않은 안전한 균주이므로, 결과적으로 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주를 이용하여 제조된 김치 또는 이를 이용한 음식을 섭취할 경우 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않고 안전성에서도 문제되지 않으면서도, 이를 섭취한 인체에서 염증성 장 질환을 개선 또는 예방할 수 있을 것으로 평가되어서, 본 발명의 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주를 이용하여 제조된 김치 및 상기 김치를 식재료로 사용하는 식품 산업 분야의 발전에 기여할 수 있을 것으로 평가된다.
상기 발효용 스타터에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주를 포함하는 발효식품용 종균 조성물에 관한 것이다.
상기 종균 조성물을 발효식품의 생산 시 첨가하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 종균 조성물에 포함된 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절할 수 있고, 상기 종균 조성물의 첨가량 또는 초기 균수에 의하여 발효의 속도를 조절할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 종균 조성물을 김치의 제조에 사용하는 경우, 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주에 의해 상기 김치는 염증성 장 질환 예방 또는 개선 효과를 가질 수 있으므로, 김치 또는 김치로부터 제조되는 가공식품을 이용하는 식품 산업 분야의 발전에 기여할 수 있다.
상기 종균 조성물에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 발효식품에 관한 것이다.
상기 발효식품은 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물에 포함된 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상에 의하여 품질을 일정하게 조절될 수 있다.
상기 발효식품은 채소 발효식품 또는 식물성 발효식품일 수 있고, 바람직하게는 김치일 수 있다. 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 채소 발효식품 또는 식물성 발효식품, 일 예로 김치 또는 김치를 재료로 하는 가공식품의 경우, 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주에 의하여, 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주의 생존 여부에 관계없이 염증성 장 질환 예방 또는 개선 효과를 가지고, 김치 또는 김치 가공식품의 보존성이 향상될 수 있으므로, 식품의 기능성 및 안전성이 보장될 수 있다.
상기 발효식품은 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균을 첨가하는 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있으며, 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조하는 것 외에는 다른 성분을 첨가하여 제조하는데 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발효식품에는 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 식품 기재를 100 중량부로 0.0001 중량부 내지 20 중량부로 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 김치의 제조 시 스타터로 사용될 수 있으며, 이를 이용하는 경우 김치의 숙성을 일정하게 도와주면서 잘 숙성된 김치의 맛을 장기간 유지할 수 있을 뿐만 아니라 김치 내 염증성 잘 질환 예방 또는 치료 효과를 가지도록 도와준다.
본 발명에 있어서, 상기 스타터는 액상 제제, 분말 제제 등으로 제형화할 수 있으며, 예를 들면 분말 제제로 사용할 수 있다. 분말 제제는 배양된 균주를 원심분리 등의 방법으로 수집하여 동결 건조시켜 수득할 수 있다. 스타터 균주를 발효식품에 첨가하는 경우, 균 배양액에서 분리한 젖은 형태의 균체를 첨가하는 것이 일반적이지만 액상 제형은 보관이 어렵고 유통 중 품질 유지가 어려워 이를 상품으로 유통시키기 어려운 단점이 있다. 반면에, 분말 제제는 공급, 품질 유지 및 사용이 용이하다는 장점이 있다. 상기 스타터는 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주 뿐만 아니라, 콩가루, 탈지유(skim milk), 아미노산류, 당류, 당알코올류, 전분 등 통상적으로 스타터에 첨가되는 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 김치 제조시, 김치 양념소에 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주를 첨가하는 단계를 포함하는, 기능성 김치의 제조방법을 제공한다.
상기 김치의 제조방법에 있어서, 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 균주 자체로 첨가되거나 배양물로 첨가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 김치라 함은 통상의 김치의 주재료에 양념을 첨가하여 제조되는 당해 분야에서 일반적으로 알려진 것을 통칭하는 것이다. 상기 김치의 주재료와 양념은 제조하고자 하는 김치의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 김치의 주재료는 배추, 무, 갓 또는 열무 등일 수 있고, 양념은 파, 마늘, 생강, 액젓, 설탕, 소금, 고춧가루 등과 같은 재료를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 주재료에 양념이 더해져 제조되는 김치는 배추김치, 갓김치, 무김치, 깍두기 등일 수 있으나, 상기와 같이 김치의 종류를 한정하는 것은 아니다. 즉, 본 발명에 따른 김치의 제조방법은 당해 분야에서 통상적으로 알려진 방법에 의해 제조되는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 김치 양념소는 통상적으로 사용되는 재료를 포함하는 김치 양념소라면 모두 적용할 수 있는 것으로, 포함되는 재료에 제한이 있는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 한 구체예에서, 김치의 제조시 김치의 주 재료를 배추로 한정하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 김치의 주 재료는 통상적으로 사용되는 모든 것을 포함할 수 있다.
상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주를 김치의 제조에 사용할 경우, 균주가 첨가되지 않은 김치와 비교하여 산도가 증가하여 발효 지연 효과 및 김치 내 미생물 환경에서 우점함으로써 김치 발효에 있어 종균으로 사용 가능하다.
구체적으로, 하기 실시예에서는 김치 제조시 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주를 접종한 김치와 그렇지 않은 김치를 비교한 결과, 상기 균주는 균주를 접종한 김치에서 우점종(dominant species)으로서 발효를 주도하여 산도 값이 낮아지므로 발효지연 효과가 있는 것으로 확인하였다. 이러한 결과를 통해 김치 제조 시 상기 균주를 첨가하면 김치의 숙성 초기부터 상기 균주가 발효주도균으로 존재함으로써 김치 내의 위생성 및 품질균일화 등을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 발효지연 효과를 나타내기 위해 김치 양념소에 분말 제제 또는 액상 제제로 첨가될 수 있다. 상기 균주가 분말 제제로 포함되는 경우, 상기 균주는 김치 양념소 중량 대비 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있고, 배양물과 같은 액상 제제로 포함되는 경우, 김치 양념소 중량 대비 접종 초기 균수 기준으로 104 CFU/g 내지 1010 CFU/g가 되도록 첨가할 수 있고, 바람직하게는 105 CFU/g 내지 109 CFU/g, 107 CFU/g 내지 108 CFU/g가 되도록 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법으로 김치를 제조할 경우, 앞서 설명한 김치 양념소를 김치의 주 재료인 배추, 무 등에 버무려 통상적인 김치의 제조방법을 통해 기능성 종균김치를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 종균김치를 제공한다.
본 발명에 따른 김치는 6±0.5℃의 온도 조건에서 28일 동안 발효시킨 경우, 6±0.5℃에서 28일 동안 발효시킨 김치의 pH는 4.2 내지 4.4이고, 산도는 0.85 내지 0.90%일 수 있고, 상기 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주의 우점율은 85% 이상일 수 있다.
상기 김치 내에서 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주가 우점종으로서 존재하므로 김치 발효에 있어 종균으로 사용 가능하다.
본 발명에 따른 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 염증성 장 질환 치료 효과를 가지므로 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있으며, 장 점착능이 우수하여 생균제(프로바이오틱스)로 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 김치 제조에 있어 종균으로 사용함으로써 기능성 김치를 제공할 수 있다.
도 1은 김치로부터 분리된 유산균주들의 항염증성 싸이토카인 생성량을 나타낸 것이다.
도 2는 다양한 MOI와 시간에 따른 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38의 싸이토카인 생성능 비교한 것이다[A: IL-6, B: TNF-α, C: IL-10].
도 3은 수지상 세포에서 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주에 의한 NF-Kb 및 MAPKs의 활성 효과를 나타낸 것이다[A: western blot, B: IκB-α 분해 정도, C: p65의 인산화 정도, D: ERK의 인산화 정도, E: 억제제 분석].
도 4는 염증성 장 질환 모델에서 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주 투여에 따른 체중 및 생존율 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 염증성 장 질환 모델에서 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주 투여에 따른 대장 길이를 나타낸 것이다.
도 6은 염증성 장 질환 모델에서 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주의 투여에 따른 대장 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 염증성 장 질환 모델에서 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주의 질병활성도 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 락토바실러스 람노수스 GG (KCTC 5033) 균주와 본 발명의 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주의 Caco-2 세포주에서의 장 점착율을 나타낸 것이다.
도 9는 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주가 첨가된 김치와 첨가되지 않은 김치의 저장기간에 따른 pH 및 산도 변화를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주의 분리
1-1. 유산균주의 분리 및 동정
전국 6개 지역(경기도, 강원도, 충청도, 전라도, 경상도 및 제주도)에서 담금 직후의 다양한 김치(배추김치, 무김치, 물김치, 기타 등등) 115종을 수집하였으며, 수집된 김치는 6±0.5 ℃의 조건에서 0주부터 5주까지 저장하면서 유산균 분리를 위한 김치시료로 사용하였다. 상기 김치 500g을 핸드 블렌더(hand blender; Hanil Co, Korea)로 마쇄하여 멸균거즈로 거른 김치액에 멸균수를 추가하여 적정배율로 희석하여, 탄산칼슘(CaCO3)이 2% 첨가된 MRS 배지(Difco Co., France)에 도말하고, 30 ℃에서 2일간 배양한 다음, 투명환을 형성한 균주를 분리하였다. 상기 분리된 균주에 대해 그람양성(Gram strain kit, BD Co., USA)과 카탈라제 테스트(Biomerieux Co., France)를 수행한 결과, 그람양성이고, 카탈라제 음성인 집락을 유산균으로 잠정적으로 확인하였다. 상기 분리된 유산균주들은 MRS 액체배지에 접종한 후, 30℃에서 24시간 동안 배양하여 글리세롤이 25%(v/v)가 되게 첨가하여 글리세롤 stock을 만들어 -70℃에서 보관하며 사용하였다.
분리된 유산균주들은 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.
분리 균주 WiKiM38은 순수 분리한 후 MRS plate 상태로 냉장택배를 이용하여 마크로젠(서울)에 의뢰하여 primer로 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', SEQ ID NO: 2)와 92R(5'-GGA TACCTTGTTACGACTT-3', SEQ ID NO: 3)의 universal primer set를 사용하여 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하였다.
그 결과, 상기 분리 균주 WiKiM38의 16S rRNA로 총 1,530 bp의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 하기에 SEQ ID NO: 1로 나타내었다.
Figure 112016064554139-pat00001
상기 수행한 염기서열을 기초로 염기서열의 상동성 검사는 GeneBank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast program(http://www.ncbi.nlm.nhi.gov)에 의해 실행하였다. 그 결과, 락토바실러스 쿠르바투스 표준균주 DSM 20019(Lactobacillus curvatus type strain DSM 20019)와 99.5%의 상동성을 나타내는 것을 통해 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus)로 최종 동정하였다.
1-2 시약 및 유산균 준비
Ultrapure LPS(Escherichia coli O111:B4)는 Invivogen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였고, Dextran sodium sulphate는 Sigma(Mr ~40,000, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
김치에서 분리한 유산균들은 5 mL의 Lactobacilli MRS (BD Biosciences,San Jose, CA, USA) 액체배지에 단일 콜로니를 취하여 접종한 뒤, 30℃에서 24시간 진탕 배양하였다. 대수증식기의 균을 사용하기 위해 위의 배양액을 1:5로 희석하여 30에서 2시간 진탕 배양하였다. 배양한 균은 원심분리 후 인산완충식염수(PBS)를 사용하여 균질화시켜 600 nm의 파장에서 109 CFU/mL을 나타내는 OD(optical density)=0.6으로 정량한 후 사용하였다. 정량한 균을 95℃로 10분간 중탕하여 heat-killed bacteria를 이용하여 생체외 실험에 사용하였다.
1-3 수지상세포 분리 및 처치
특정 병원체가 없는 야생형(Wild type) 7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 Koatech (평택, 경기도, 대한민국)에서 구입하고 전남대학교 동물 사육실에 수용하여 표준 고형사료를 임의로 공급하며 사육하였다.
수지상세포 분리를 위하여 야생형 마우스에 대퇴골 및 경골에서 분리한 골수세포에 RPMI-1640 배지에 GM-CSF (20 ng/ml)를 첨가한 배지에 배양하여 분리 후 3일과 6일째에 GM-CSF가 첨가된 배지를 추가하였다. 총 분리 후 9일째에 cell-culture dish에 붙지 않은 세포만 분리하여 48 well plates에 2×105/well이 되게 준비하여 싸이토카인을 측정하였으며, 6 well plates에는 2×106/well이 되게 준비하여 western blot을 진행하였다. 각 실험의 유산균들은 heat-killed 박테리아들을 이용하였으며, 다양한 농도를 3, 6, 12 그리고 24 시간 동안 처리하였다. 이와 같은 세포들에 LPS(100 ng/ml)로 동일한 시간 동안 처리하여 상층액을 얻어 DuoSet ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 사용하여 싸이토카인(IL-6, TNF-α, IL-10)을 측정하였다.
1-4 항염증성 싸이토카인 (IL-10) 생성 우수 균주 선발
김치로부터 분리된 유산균주 Leucnostoc mesenteroides 2종, Weissella korenesis 2종, Lactobacillus curvatus 1종을 수지상세포에 MOI(Multiplicity of infection)=10으로 감염시킨 후 24시간 후에 상층액을 걷어 대표적인 항염증성 싸이토카인인 IL-10의 수치를 측정하였다. 측정 결과(도 1), 2종의 Leu. mesenteroides는 수지상세포에서 IL-10을 거의 생성하지 못하였고, 2종의 W. koreensis는 약 1 ng/mL 정도의 IL-10을 생성하였다. L. mesenteroides 및 W. koreensis와 동일한 MOI에서 L. curvatus는 훨씬 높은 수준(약 2 ng/mL)의 IL-10을 생성하였다.
항염증성 싸이토카인(IL-10) 생성이 우수하여 선발된 균주인 L. curvatus는 L. curvatus WiKim38로 명명하였고, 한국미생물보존센터에 2016년 6월 16일자로 기탁하여, 수탁번호 KFCC11667P를 부여받았다.
1-5 다양한 MOI와 시간에 따른 L. curvatus WiKim38의 싸이토카인 생성능 비교
상기 예에서 항염증성 싸이토카인 IL-10 생성능이 우수한 L. curvatus WiKim38을 수지상 세포에 다양한 MOI(1(1:1), 5(1:5), 10(1:10))로 24시간 감염시킨 후, 염증 유도인자로 잘 알려진 LPS와 염증성 싸이토카인인 IL-6와 TNF-α 및 항염증성 싸이토카인인 IL-10의 생성 패턴을 비교하였다.
실험 결과, 100 ng/ml의 농도로 처치한 LPS는 높은 수준의 IL-6 및 TNF-α 생성을 유도하였는데, 이 수치는 L. curvatus WiKim38 MOI=5 또는 MOI=10으로 처치된 세포에서와 유사하였다 (도 2의 A와 B). 주목할 것은 이러한 농도에서 L. curvatus WiKim38가 염증 유도인자인 LPS에 비해 유의적으로 높은 수준의 IL-10을 생성하는 것을 확인하였다 (도 2의 C).
[ 실시예 2] 수지상세포에서 L. curvatus WiKim38에 의한 NF - kB 및 MAPKs 활성 평가
2-1 수지상세포에서 L. curvatus WiKim38에 의한 NF - kB 및 MAPKs 활성 평가
상기 방법으로 준비한 세포를 1% Nodidet-P40이 첨가된 세포용해용액으로 용해하였으며, 용액 속엔 프로테아제 억제제(complete Mini EDTA-free, Roche, Mannheim, Germany), 포스파타자에 억제제(Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 그리고 2 mM dithiothreitol이 첨가되었다. Western blot 분석은 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 이용하여 프로테인을 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 electro-blotting을 이용하여 이동시킨 후, membrane에 정상과 인산화된 IκB-α, pp65 (cell signaling), and ERK (Santa Cruz biotechnology) 1차 항체를 4에서 하룻밤 붙인 후, 각 항체에 맞는 2차 항체를 붙여 chemiluminescence reagent (Intron Biotechnology, Seongnam,Korea)를 이용하여 밴드를 확인하였다. 밴드의 세기를 측정하기 위하여 ImageJ version 1.44 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) 프로그램을 이용하였으며, β-actin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 1차 항체는 준비한 샘플의 프로테인에 정확한 동일량을 비교하기 위하여 사용되었다.
기존 연구에서 NF-kB는 수지상 세포에서 IL-10을 생성하는데 가장 중요한 전사인자로 알려져 있으며, MAPKs의 하나인 ERK 또한 수지상 세포에서 IL-10을 생성하는데 관여하는 효과인자로 알려져 있다.
따라서, 본 발명에서는 L. curvatus WiKim38가 수지상 세포에서 IL-10을 생성하는 세포신호기전을 규명하고자 Western blot법을 수행하였다. 실험결과, 수지상 세포에서 L. curvatus WiKim38는 LPS와 마찬가지로 IκB-α의 분해와 p65의 인산화를 유도하였다 (도 3의 A). 이러한 밴드의 세기는 정량화하여 도 3의 B-D에 나타내었다.
2-2 수지상세포에서 L. curvatus WiKim38에 의한 IL-10 생성에 미치는 NF - kB 및 MAPKs의 역할
수지상세포에서 IL-10의 생성은 NF-κB 및 ERK의 활성에 의해 유도되는데, 도 1과 2를 통해 L. curvatus WiKim38는 수지상세포에서 IL-10을 생성하는데 있어 탁월한 효과를 지니고 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에서는 수지상세포에서 실제 L. curvatus WiKim38에 의한 IL-10의 생성에 관여하는 NF-kB 및 ERK의 직접적인 영향을 규명하기 위해 inhibitor assay를 수행하였다.
PD98059 (ERK 억제제)는 Calbiochem (LaJolla, CA, USA)에서 구입하였으며, Bay 11-7082 (NF-κB 억제제)는 Biomol (Plymouth Meeting, PA, USA)에서 구입하였다. 수지상 세포에 각각의 억제제들은 감염 2시간 전에 전처리하였다(20 μM PD98059, 10 μM Bay 11-7082). 이 후, L. curvatus는 MOI=5로 감염시켰으며, LPS는 100 ng/ml 농도로 처리한 후 24시간 후에 상층액을 걷어, IL-6, TNF-α, and IL-10 의 농도를 ELISA를 통해 측정하였다.
도 3의 E에서 보는 바와 같이, L. curvatus WiKim38에 의한 IL-10 생성은 NF-kB 및 ERK inhibitor에 의해 억제된다는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 볼 때, 수지상세포에서 L. curvatus WiKim38는 NF-?B와 ERK 활성을 통해 IL-10의 생성을 유도하는 것으로 여겨진다.
[ 실시예 3] 염증성 장 질환모델에서 L. curvatus WiKim38에 의한 질환 개선 효과
3-1 염증성 장 질환모델에서 L. curvatus 투여에 따른 사망률 변화
상기 방법과 같이 실험동물은 특정 병원체가 없는 야생형(Wild type) 7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, 도 4의 A와 같이 DSS(Dextran sodium sulphate)를 멸균한 용수에 2% 농도로 하여 5일간 자율 급수하여 궤양성 대장염을 유발하고 그 이후는 멸균한 용수를 제공하여 사망률을 분석하였다. 유산균을 투여하지 않은 대조군의 염증성 장 질환 모델은 DSS 투여 후 약 5일 후부터 급속한 체중 감소를 보였고, 8일째부터 9일째에 이르기까지 사망률을 보였으나(도 4의 B와 C), L. curvatus WiKim38을 투여한 군에서는 9일째, 10일째에 약간의 사망률을 보였으나 전체적으로 약 60%의 생존률을 보임으로써 염증성 장 질환 모델에 개선 효과를 보였다(도 4의 B와 C).
3-2 염증성 장 질환 모델에서 L. curvatus WiKim38 투여에 따른 대장 길이 및 조직소견 변화
상기 예에서 DSS를 이용한 염증성 장 질환 모델에 L. curvatus WiKim38를 투여함에 따른 개선 효과를 분석하였다. 염증성 장 질환을 유도한 마우스의 조직학적 분석을 위해 대장의 40-70 mm 조직을 10% formalin 배지를 이용하여 고정한 후 병리조직학적 관찰을 진행하였다. 조직은 alcohol과 xylene을 이용한 processing 과정을 거친 후 paraffin을 이용하여 paraffin block을 만든 후, 2 μm 두께로 절편을 만들어 hematoxylin and eosin 용액을 이용하여 염색하여 초미세현미경을 통하여 관찰하였다. 그 결과, DSS 처치 시 짧아지는 대장 길이가 L. curvatus WiKim38를 투여함에 따라 정상군과 비슷하게 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 5의 A와 B).
위 동일한 샘플을 파라핀 포매하여 H&E 염색을 한 후 병리조직학적 분석을 수행하였다. 실험결과, L. curvatus WiKim38 단독 투여만으로는 조직학적 변화 없이 대조군과 유사하였다(도 6). 그러나 DSS 처리군은 장점막 및 점막하 조직에 호중구를 주로 하는 중등도의 염증세포 침윤이 관찰되었으며, 점막하 조직의 부종이 심한 것을 확인하였다(도 5). 그러나 L. curvatus WiKim38를 투여해 준 그룹에서는 염증세포의 침윤이 경도로 줄어들었으며, 점막하 조직의 부종은 거의 관찰되지 않았다(도 6).
3-3 염증성 장 질환 모델에서 L. curvatus WiKim38 투여에 따른 질병활성도 개선 효과
DSS 처리 시 대장 내 투과성 증대로 장내 미생물이 복강 내로 유입하여 염증 반응을 유발한다고 알려져 있다. 이와 같이 유도된 장 질환 모델에 김치에서 분리한 L. curvatus WiKim38를 투여함에 따라 개선되는 효과를 질병활성도로 분석하여 나타내었다. 질병활성도는 각각의 지표들을 합산하여 더한 값을 나타내었으며, 각각의 값들은 아래와 같다.
Figure 112016064554139-pat00002
실험 결과, 각각의 지표들이 L. curvatus WiKim38를 투여함에 따라 회복되는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중 혈변과 일반적인 활동성에 가장 좋은 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다(도 7).
< 실시예 4> L. curvatus WiKim38의 프로바이오틱스로서의 장 점착능 측정
인체 소장 상피세포주(Caco-2)는 생물자원센터(KCTC, HC2001)에서 분양받았으며, 20% FBS(fetal bovine serum), 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 MEM(Gibco BRL, USA)에서 배양하여 12 well plates (BD science, USA)에 well당 105 cells/mL로 분주하여 실험을 실시하였다. 실험에 사용할 L. curvatus WiKim38은 PBS로 2회 세척하여 108 CFU/mL-109 CFU/ml로 조정하여 각 well에 접종하여 5% CO2 존재 하에 2시간 배양하였다. 배양이 완료된 후, 부착되지 않은 유산균의 제거와 세척에 따른 부착능력을 확인하기 위해 PBS 버퍼를 사용하여 6회 세척을 실시하였다. 세척이 완료된 후 0.2% trypsin-EDTA를 분주하여 부착되어 있는 세포를 떼어내고 peptone수를 이용하여 연속희석법으로 MRS(Difco, USA) 고체배지에 도말하고 30℃에서 48시간 배양하여 균수를 측정하였다. 대조구로 Lactobacillus rhamnosus GG (KCTC 5033)균을 사용하여 부착능을 비교하였다.
도 8에서 Caco-2 세포주에서의 장 점착율을 측정한 결과, L. curvatus WiKim38은 81.2%로 대조구로 사용한 Lactobacillus rhamnosus GG(KCTC 5033)의 82.77%와 유사한 값을 나타내어 장 점착능이 뛰어났음 확인하였다.
[실시예 5] L. curvatus WiKim38을 종균으로 사용한 김치의 발효특성
상기 균주 L. curvatus WiKim38을 프로바이오틱스 식품으로서의 가능성을 확인하기 위하여 유산균 발효식품인 김치에 적용하였다.
5-1 균주 준비 및 종균 김치 제조
상기 균주 L. curvatus WiKim38을 MRS 액체배지에서 24시간 본 배양한 후 원심분리(10,000×g, 10분)하여 얻은 균체를 멸균수로 2회 세척하여 김치용 종균으로 사용하였다. 배추는 4등분하여 천일염(Shinan, Korea) 염수 16.7%(w/v)에서 5~7시간 실내온도에서 절임하고 흐르는 물에 3회 세척하여 4℃에서 12시간 탈수하였다. 준비된 절임배추와 부재료는 하기 표 1의 배합비로 잘 혼합하여 김치를 제조하였다. 즉, 표 1의 배합비로 제조한 김치양념에 상기 방법으로 준비한 L. curvatus WiKiM38를 김치 1g당 107 CFU가 되도록 첨가하여, 절임배추와 혼합하여 종균김치를 제조하였다. 대조구로는 상기 L. curvatus WiKiM38을 첨가한 것을 제외하고는 모든 조건을 동일조건으로 제조된 김치를 사용하였다. 상기 제조된 김치들은 500g씩 pouch pack(polyethylene resin)에 담아 6±0.5℃에서 28일간 저장하면서 7일 간격으로 수득하여, 핸드블렌더로 2분간 마쇄한 후, 멸균거즈로 여과한 김치액을 제조하여, 발효특성을 분석하는데 사용하였다.
Figure 112016064554139-pat00003
5-2 김치의 pH 및 산도 분석
김치의 pH는 pH meter(Orion 3-star, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였고, 산도는 AOAC법에 의하여 김치액 10 mL를 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.3이 될 때까지의 NaOH 용액의 소비량으로 정의하였으며, 이것을 젖산함량으로 환산하여 총 산 함량으로 표시하였다.
[수학식 1]
총 산 함량(%) = 0.1 N NaOH 용액의 소비량(mL) × 0.1 N NaOH 용액의 factor × 0.1 N NaOH 용액의 1 mL에 상당하는 유기산 계수(젖산의 경우 0.009)
도 9와 같이, 대조군(종균비첨가김치)의 6±0.5℃에서 pH 및 산도는 발효 28일에 pH 4.21, 산도 0.98%를 나타낸 반면, L. curvatus WiKim38을 종균으로 첨가한 김치의 pH 및 산도는 pH 4.35, 산도 0.87%로 종균비첨가 김치에 비해 발효지연 효과가 있는 것으로 나타났다.
5-3 김치 내 유산균 수 및 종균 우점율 분석
김치에 첨가한 유산균 L. curvatus WiKim38의 김치 내 미생물환경에서 차지하는 우점율을 확인하기 위해 2% CaCO3-MRS 고체배지에서 형성된 유산균 colony의 형태 관찰 및 그람 염색하여 광학현미경으로 선별한 후 16S rRNA sequence 비교를 통하여 유산균 중 첨가한 L. curvatus WiKim38의 점유율을 측정하였다(표 2).
하기 표 2는 상기 L. curvatus WiKim38을 종균으로 사용하여 제조한 김치와 종균을 사용하지 않은 대조군(종균비첨가 김치)의 유산균 및 종균 점유율을 측정한 결과이다. L. curvatus WiKim38을 종균으로 사용하여 제조한 김치 내 미생물환경에서 총 균 수 및 유산균 수는 저장 0일에 7.32 log CFU/mL, 7.15 log CFU/mL이었고, 발효 28일에 9.35 log CFU/mL, 9.29 log CFU/mL를 나타내었다. 김치 내 유산균 중 종균으로 사용한 L. curvatus WiKim38의 우점율은 발효 0일에 95.45%에서 발효 28일까지 98.7%를 유지하는 것으로 나타났다.
김치 항목 6±0.5, 발효기간(일), (단위: log CFU/mL)
0 7 14 21 28
종균
비첨가김치 		총균 4.15±0.21 6.45±0.24 8.69±0.23 9.13±0.15 8.99±0.20
유산균 3.99±0.45 6.14±0.19 8.57±0.35 9.07±0.22 8.95±0.16
WiKim38-
종균김치 		총균 7.32±0.15 8.51±0.15 9.22±0.15 9.34±0.25 9.29±0.33
유산균 7.15±0.09 8.49±0.07 9.17±0.33 9.34±0.17 9.27±0.27
우점율(%) 95.45±3.42 97.66±1.15 94.92±1.25 86.80±3.43 98.7±3.41
평균±표준편차로 표시
김치종균으로 사용한 L. curvatus WiKim38은 김치의 발효지연 효과가 있었으며, 김치 내 미생물환경에서 우점함으로써 김치발효에 있어 종균으로 사용 가능함을 보여주었다. 또한, 식품의약품안전처에서 권고하는 프로바이오틱스 균수 섭취는 하루 1억~100억 CFU으로, L. curvatus WiKim38을 종균으로 사용하여 김치 제조 시 7 log CFU/mL~9 log CFU//mL로 김치 내에 존재함으로 일상적인 식사에서 김치섭취만으로도 장 염증질환 개선효능을 지니는 유산균을 섭취할 수 있어 프로바이오틱스식품으로의 가능성을 제시할 수 있는 결과이다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국내)
수탁번호 : KFCC11667P
수탁일자 : 20160616
<110> Korea Food Research Institute <120> Lactic acid bacterium isolated from Kimchi for treating inflammatory bowel disease and uses thereof <130> P16R10C1099 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1530 <212> DNA <213> Lactobacillus curvatus WiKiM38 <400> 1 gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgaacgcac tctcgttaga 60 ttgaagaagc ttgcttctga ttgataacat ttgagtgagt ggcggacggg tgagtaacac 120 gtgggtaacc tgccctaaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcataa 180 aacctagcac cgcatggtgc aaggttgaaa gatggtttcg gctatcactt taggatggac 240 ccgcggtgca ttagttagtt ggtgaggtaa aggctcacca agaccgtgat gcatagccga 300 cctgagaggg taatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 360 gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag 420 aaggttttcg gatcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaac gtatttgata gtaactgatc 480 aggtagtgac ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 540 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggtttct 600 taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt 660 gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa 720 gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg 780 ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctaggtgt 840 tggagggttt ccgcccttca gtgccgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 900 cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 960 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatccttt gaccactcta 1020 gagatagagc tttcccttcg gggacaaagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattact agttgccagc 1140 atttagttgg gcactctagt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg 1200 tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg 1260 agtcgcgaga ccgcgaggtt tagctaatct cttaaaacca ttctcagttc ggattgtagg 1320 ctgcaactcg cctacatgaa gccggaatcg ctagtaatcg cggatcacat gcgcgggggg 1380 aaaaacgttt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc 1440 aaagccggtg aggtaacctt cgggagccag ccgtctaagg tgggacagat gattagggtg 1500 aatctagagg ggataagccc gcagaaaaaa 1530 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> 27F primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 92R primer <400> 3 ggataccttg ttacgactt 19

Claims (18)

  1. 수탁번호 KFCC11667P의 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(Lactobacillus curvatus WiKiM38) 균주.
  2. 제 1 항에 있어서,
    염증성 장 질환 예방 또는 치료 효과를 갖는 균주.
  3. 제 1 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 1로 표시되는 균주.
  4. 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 조성물은 항염증성 싸이토카인인 IL-10 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 염증성 장 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염인 조성물.
  7. 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics).
  8. 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  9. 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 김치 발효용 스타터(Starter).
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 9 항의 김치 발효용 스타터를 첨가하여 제조된 것을 특징으로 하는 염증성 장 질환 개선 또는 예방용 김치.
  13. 삭제
  14. 김치 양념소에 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38(수탁번호 KFCC11667P) 균주 또는 이의 배양물을 첨가하는 단계
    를 포함하는, 종균김치의 제조방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주는 접종 초기 균수 기준으로 유산균 수가 104 CFU/g 내지 1010 CFU/g가 되도록 첨가되는 것인 종균김치의 제조방법.
  16. 제 14 항의 제조방법에 따른 종균김치.
  17. 제 16 항에 있어서,
    6±0.5℃에서 28일 동안 발효시킨 김치의 pH는 4.2 내지 4.4이고, 산도는 0.85 내지 0.90%인 김치.
  18. 제 16 항에 있어서,
    6±0.5℃에서 28일 동안 발효시킨 김치 내 락토바실러스 쿠르바투스 WiKiM38 균주의 우점율은 85% 이상인 김치.
KR1020160084199A 2016-07-04 2016-07-04 김치로부터 분리한 염증성 장 질환 치료 효과를 갖는 유산균 KR101680014B1 (ko)

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