JP7267536B2 - 乳酸醗酵ニンジンの製造方法 - Google Patents
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本発明は、機能性乳酸菌で乳酸醗酵させる工程を含む、自然免疫活性化増強作用等の機能性を有する乳酸醗酵ニンジンの製造方法に関する。
醗酵食品とは食品に微生物を増殖させて加工した食品であり、その技術はすでに有史以前に存在している。醗酵することで食品はより栄養素が豊富になり、体内への吸収率が向上し、健康に資すると考えられている。
乳酸菌は食品の醗酵に寄与する細菌であり、ヨーグルト等の乳製品、キムチ、漬物、ピクルス等に、伝統的に利用されている。
乳酸菌は食品の醗酵に寄与する細菌であり、ヨーグルト等の乳製品、キムチ、漬物、ピクルス等に、伝統的に利用されている。
これまでに、本発明者らにより、新規の機能性乳酸菌が同定されており（特許文献１～３、８、非特許文献１）、これらの乳酸菌を用いた機能性食品の開発が望まれている。
一方、これまでに、本発明者らにより、カイコを使用して、自然免疫活性化作用を簡便に測定できる方法が開発されている（特許文献４等）。
また、本発明者により、カイコを利用した、血糖降下作用を有する物質の評価方法が開発されている（特許文献５、６等）
また、本発明者により、自然免疫機構のみを有する生物を利用した、獲得免疫機構を有する生物に対する病原微生物感染のモデルが開発されている（特許文献７等）。
また、本発明者により、カイコを利用した、血糖降下作用を有する物質の評価方法が開発されている（特許文献５、６等）
また、本発明者により、自然免疫機構のみを有する生物を利用した、獲得免疫機構を有する生物に対する病原微生物感染のモデルが開発されている（特許文献７等）。
自然免疫機構の異常は、様々な疾患を引き起こす原因となり、従って、このような自然免疫機構を所望に調節することが可能な、優れた自然免疫を活性化させる等の機能性食品の開発が望まれている。
また、糖尿病は、患者数も多く様々な他の疾患を引き起こす原因ともなり、従って、血糖値を下げることが可能な優れた機能性食品の開発が望まれている。
また、感染症は多岐に亘る疾患であり、感染症予防若しくは治療作用を有する優れた機能性食品の開発が望まれている。
また、糖尿病は、患者数も多く様々な他の疾患を引き起こす原因ともなり、従って、血糖値を下げることが可能な優れた機能性食品の開発が望まれている。
また、感染症は多岐に亘る疾患であり、感染症予防若しくは治療作用を有する優れた機能性食品の開発が望まれている。
K.Sekimizu et al, Drug Discoveries & Therapeutics. 2016; 10(1): 49-56.
本発明の課題は、機能性乳酸菌による乳酸醗酵によって機能性を有する乳酸醗酵食品を製造する方法、及び、該製造方法で製造された乳酸醗酵食品を提供することにある。
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、特定の機能性乳酸菌を用いてニンジンを乳酸醗酵させることにより、特定の機能性を付与した新規の食品が得られることを見出した。
また、醗酵させていないニンジンには含まれない新しい化合物が醗酵により得られ、該化合物を含有している乳酸醗酵ニンジンが得られることを見出した。また、該乳酸醗酵によって、ニンジンに含まれるビタミンＡ及びビタミンＢの含有量に変化がないことを見出した。
また、醗酵させていないニンジンには含まれない新しい化合物が醗酵により得られ、該化合物を含有している乳酸醗酵ニンジンが得られることを見出した。また、該乳酸醗酵によって、ニンジンに含まれるビタミンＡ及びビタミンＢの含有量に変化がないことを見出した。
更に、乳酸醗酵によって美味しくなり、また醗酵前の形状がほとんど保たれ、美味しいと共に外観的にも優れた乳酸醗酵ニンジンが得られることを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ニンジンを機能性乳酸菌により醗酵させることを特徴とする乳酸醗酵ニンジンの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記機能性乳酸菌が、自然免疫活性化作用を有する乳酸菌、血糖降下作用を有する乳酸菌、又は、感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌である前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記機能性乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌であって自然免疫活性化作用又は感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌である前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記機能性乳酸菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌であって血糖降下作用を有する乳酸菌である前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記機能性乳酸菌が、ワイセラ・ヘレニカ（Weissella hellenica）に属する乳酸菌であって感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌である前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記機能性乳酸菌が、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）に属する乳酸菌であって感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌である前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、上記乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用した後、醗酵したニンジンを真空パックする工程を含むことを特徴とする真空パックされた乳酸醗酵ニンジンの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、ニンジンを機能性乳酸菌により醗酵させて得られる乳酸醗酵食品であって、前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用して製造されたものであることを特徴とする、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品、血糖降下用乳酸醗酵食品、及び、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品を提供するものである。
本発明によれば、特定の機能性乳酸菌で乳酸醗酵させることにより、該機能性乳酸菌の有する機能性が付与され、ニンジンの有効成分であるビタミンＡ及びビタミンＢの含有量に変化がなく、食感が保持され、外観や形状が保持されると共に美味しい乳酸醗酵ニンジンを製造することができる。すなわち、美味しく食べることができ、自然免疫を活性化させたり、特定の疾患（症状）の予防や治療に効果があったりして、健康食品や一般食品として極めて優れている。
しかも、これらの効果は、他の野菜に比較してニンジンで特に顕著である。例えば、カブ、ダイコン、ゴーヤ、玄米、カボチャ、サツマイモ等の「他の野菜」を用いて、それぞれの乳酸菌によってそれぞれの機能性が付与されて醗酵野菜になるまでニンジン同様に乳酸醗酵を進ませたところ（すなわち、ニンジン以外の野菜で検討した結果）、ニンジンと比較して、噛んでも歯ごたえがなくなって食感が悪くなったり、味が不味くなったり、形状が崩れて外観上の変化が生じ調理加工性に劣ったりした（実施例参照）。
すなわち、乳酸醗酵の対象野菜として、ニンジンは極めて優れていた。
すなわち、乳酸醗酵の対象野菜として、ニンジンは極めて優れていた。
更に、該乳酸醗酵ニンジンにおいては、乳酸菌によるニンジンの醗酵により、醗酵前には検出されなかったニンジン特有の「乳酸以外の物質」が検出されており、該物質が旨味を現出している可能性がある。
前記背景技術に記載した特許文献４～７等に記載された評価方法によって、本発明における特定の乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）には、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、又は、感染症予防若しくは治療作用が認められており、更に、本発明の乳酸醗酵ニンジンの製造方法によって製造されたものには、上記特定の乳酸菌が含有されていることが本願実施例で確かめられている。
従って、本発明の（自然免疫活性化増強用等と言ったように）用途が限定された乳酸醗酵ニンジンは、動植物自体でないことは勿論のこと、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、又は、感染症予防若しくは治療作用があることは明らかである。
従って、本発明の「食品としての新規の用途品」である、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品（ニンジン）、血糖降下用乳酸醗酵食品（ニンジン）、又は、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品（ニンジン）は新規性のあるものである。
従って、本発明の（自然免疫活性化増強用等と言ったように）用途が限定された乳酸醗酵ニンジンは、動植物自体でないことは勿論のこと、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、又は、感染症予防若しくは治療作用があることは明らかである。
従って、本発明の「食品としての新規の用途品」である、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品（ニンジン）、血糖降下用乳酸醗酵食品（ニンジン）、又は、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品（ニンジン）は新規性のあるものである。
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
本発明の乳酸醗酵ニンジンの製造方法は、ニンジンを機能性乳酸菌により醗酵させることを特徴とする。
上記機能性乳酸菌は、特に限定されないが、例えば、自然免疫活性化作用を有する乳酸菌、血糖降下作用を有する乳酸菌、感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌等が挙げられる。該機能性乳酸菌は、１つ又は複数の作用を有していてもよい。
上記機能性乳酸菌は、特に限定されないが、例えば、自然免疫活性化作用を有する乳酸菌、血糖降下作用を有する乳酸菌、感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌等が挙げられる。該機能性乳酸菌は、１つ又は複数の作用を有していてもよい。
上記機能性乳酸菌として、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌（以下、「乳酸菌１１／１９－Ｂ１」ということがある）が挙げられる。
乳酸菌１１／１９－Ｂ１についての詳細な内容は特許文献１及び非特許文献１に記載されており、乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体に、それぞれ、自然免疫活性化作用、感染症予防若しくは治療作用を有することが立証されている。
乳酸菌１１／１９－Ｂ１についての詳細な内容は特許文献１及び非特許文献１に記載されており、乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体に、それぞれ、自然免疫活性化作用、感染症予防若しくは治療作用を有することが立証されている。
乳酸菌１１／１９－Ｂ１は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国内寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０１６９４（国内寄託日：２０１３年８月２０日）として受託された微生物である。
乳酸菌１１／１９－Ｂ１は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１３年８月２０日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１４年１０月１５日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４」を受けているものである。
乳酸菌１１／１９－Ｂ１は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１３年８月２０日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１４年１０月１５日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４」を受けているものである。
また、上記機能性乳酸菌として、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０２３０９であるエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌（以下、「乳酸菌０８３１－０７」ということがある）が挙げられる。
乳酸菌０８３１－０７についての詳細な内容は特許文献３及び特許文献８に記載されており、乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体に、血糖降下作用を有することが立証されている。
乳酸菌０８３１－０７についての詳細な内容は特許文献３及び特許文献８に記載されており、乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体に、血糖降下作用を有することが立証されている。
乳酸菌０８３１－０７は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国内寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２３０９（国内寄託日：２０１６年７月２６日）として受託された微生物である。
乳酸菌０８３１－０７は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１６年７月２６日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１７年５月１６日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３０９」を受けているものである。
乳酸菌０８３１－０７は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１６年７月２６日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１７年５月１６日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３０９」を受けているものである。
また、上記機能性乳酸菌として、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ Ｐ－０２７１０であるワイセラ（Weissella）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌（以下、「乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２」ということがある）が挙げられる。
乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２についての詳細な内容は特願２０１８－１３５４６１、及び、本願明細書（実施例４～９等）に記載されており、乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体に、感染症予防若しくは治療作用を有することが立証されている（又は、ことを立証した）。
乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２についての詳細な内容は特願２０１８－１３５４６１、及び、本願明細書（実施例４～９等）に記載されており、乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体に、感染症予防若しくは治療作用を有することが立証されている（又は、ことを立証した）。
乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国内寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２７１０（国内寄託日（受領日）：２０１８年５月１４日）として受託された微生物である。
また、上記機能性乳酸菌として、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０２００５であるラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌（以下、「乳酸菌＃１１－１」ということがある）が挙げられる。
乳酸菌０８３１－０７についての詳細な内容は特許文献２に記載されており、乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体に、感染症予防若しくは治療作用を有することが立証されている。
乳酸菌０８３１－０７についての詳細な内容は特許文献２に記載されており、乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体に、感染症予防若しくは治療作用を有することが立証されている。
乳酸菌＃１１－１は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国内寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２００５（国内寄託日：２０１５年２月５日）として受託された微生物である。
乳酸菌＃１１－１は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１５年２月５日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１６年１月２８日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ－０２００５」を受けているものである。
乳酸菌＃１１－１は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１５年２月５日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１６年１月２８日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ－０２００５」を受けているものである。
上記ニンジンの品種は特に限定されず、食用として知られているニンジンならば何れのニンジンでも用いることができる。
乳酸醗酵させるときは、１本のニンジンを乳酸醗酵させてもよいし、複数本のニンジンを同時に乳酸醗酵させてもよい。複数本のニンジンを同時に乳酸醗酵させる際は、同じ品種であってもよいし、異なる品種であってもよい。
乳酸醗酵させるときは、１本のニンジンを乳酸醗酵させてもよいし、複数本のニンジンを同時に乳酸醗酵させてもよい。複数本のニンジンを同時に乳酸醗酵させる際は、同じ品種であってもよいし、異なる品種であってもよい。
乳酸醗酵ニンジンの食感が保持できる、味が美味しい、処理工程の手間が省ける等の点で、粉砕、細断、又はすり潰し処理をしていないニンジンを用いることが好ましい。
乳酸醗酵させる際のニンジンの大きさは、特に限定されず、カットせずにそのまま乳酸醗酵させてもよいし、所望の大きさにカットしてから乳酸醗酵させてもよい。また、面取りをしてもよいし、立方体、直方体、球体、楕円球体等にカットしてもよい。
乳酸醗酵させる際のニンジンの大きさは、特に限定されず、カットせずにそのまま乳酸醗酵させてもよいし、所望の大きさにカットしてから乳酸醗酵させてもよい。また、面取りをしてもよいし、立方体、直方体、球体、楕円球体等にカットしてもよい。
所望の大きさにカットする場合、乳酸醗酵前のニンジンと同等の硬さが維持される、食感が楽しめる、美味しさが保たれる等の点で、カット後の大きさは１ｃｍ３以上５００ｃｍ３以下が好ましく。２ｃｍ３以上２５０ｃｍ３以下がより好ましく、５ｃｍ３以上１００ｃｍ３以下が特に好ましい。
該ニンジンは皮がついたまま乳酸醗酵させてもよいし、皮を取り除いてから乳酸醗酵させてもよい。
該ニンジンは皮がついたまま乳酸醗酵させてもよいし、皮を取り除いてから乳酸醗酵させてもよい。
乳酸醗酵させる際の温度、ｐＨ、時間等の条件は、使用する乳酸菌に応じて適宜選択することができる。
例えば、上記乳酸菌１１／１９－Ｂ１、乳酸菌０８３１－０７、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２、乳酸菌＃１１－１等を含め、機能性乳酸菌を用いる場合、温度は２５～３７℃が好ましい。醗酵初期のｐＨは７付近に保つことが好ましい。醗酵時間は、乳酸醗酵前のニンジンとほぼ同等の硬さが維持される、食感を楽しめる等の点で、６～６０時間が好ましく、８～４８時間がより好ましく、１２～３６時間が特に好ましい。
例えば、上記乳酸菌１１／１９－Ｂ１、乳酸菌０８３１－０７、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２、乳酸菌＃１１－１等を含め、機能性乳酸菌を用いる場合、温度は２５～３７℃が好ましい。醗酵初期のｐＨは７付近に保つことが好ましい。醗酵時間は、乳酸醗酵前のニンジンとほぼ同等の硬さが維持される、食感を楽しめる等の点で、６～６０時間が好ましく、８～４８時間がより好ましく、１２～３６時間が特に好ましい。
本発明において、ニンジンに付着している雑菌等を除去することができる等の点で、ニンジンを醗酵させる前に、該ニンジンを滅菌する工程を行うことが好ましい。滅菌手段等は、特に限定されないが、例えば、オートクレーブによる滅菌；スチームコンベクションオーブン等のオーブンを用いた滅菌；紫外線、Ｘ線、γ線等の短波長の電磁波照射による滅菌等が挙げられる。
滅菌温度は、滅菌方法に応じて適宜選択することができるが、１００℃～１４０℃が好ましく、１１０℃～１３０℃がより好ましく、１１５℃～１２５℃が特に好ましい。
滅菌時間は、滅菌方法に応じて適宜選択することができるが、４分～４０分が好ましく、７分～３０分がより好ましく、１０分～２０分が特に好ましい。
滅菌時間は、滅菌方法に応じて適宜選択することができるが、４分～４０分が好ましく、７分～３０分がより好ましく、１０分～２０分が特に好ましい。
また、本発明の乳酸醗酵ニンジンの製造方法は、必要に応じて上記した工程以外の「他の工程」を含んでいてもよい。
本発明によって得られる乳酸醗酵ニンジンは機能性を有する。該機能性は乳酸醗酵の際に使用する乳酸菌によって付与される。
該機能性は、特に限定されないが、具体的には、例えば、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、感染症予防若しくは治療作用（感染症予防作用と感染症治療作用）等が挙げられる。
該乳酸醗酵ニンジンは、上記のうち１つの作用を有していてもよいし、複数の作用を有していてもよい。また、自然免疫を活性化させることによって（自然免疫活性化作用を有することによって）、感染症予防若しくは治療作用を有するものも含まれる。
該機能性は、特に限定されないが、具体的には、例えば、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、感染症予防若しくは治療作用（感染症予防作用と感染症治療作用）等が挙げられる。
該乳酸醗酵ニンジンは、上記のうち１つの作用を有していてもよいし、複数の作用を有していてもよい。また、自然免疫を活性化させることによって（自然免疫活性化作用を有することによって）、感染症予防若しくは治療作用を有するものも含まれる。
本発明は、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌１１／１９－Ｂ１で醗酵させる乳酸醗酵ニンジンの製造方法であることが好ましく、更に、自然免疫活性化作用又は感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌１１／１９－Ｂ１で醗酵させる乳酸醗酵ニンジンの製造方法であることが特に好ましい。
乳酸菌１１／１９－Ｂ１に、自然免疫活性化作用があることは、特許文献１で立証されており、感染症予防若しくは治療作用があることは、非特許文献１で立証されている。
そして、該乳酸菌で醗酵させて乳酸醗酵ニンジンには、該乳酸菌が含有されていることが本発明の実施例で確かめられているので、該乳酸醗酵ニンジンには、自然免疫活性化作用、及び、感染症予防若しくは治療作用があることは立証されている。
そして、該乳酸菌で醗酵させて乳酸醗酵ニンジンには、該乳酸菌が含有されていることが本発明の実施例で確かめられているので、該乳酸醗酵ニンジンには、自然免疫活性化作用、及び、感染症予防若しくは治療作用があることは立証されている。
乳酸菌１１／１９－Ｂ１は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌であるので、本発明は、該種まで一般化できて、従って、本発明は、前記機能性乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌であって自然免疫活性化作用を有する乳酸菌である前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法でもある。
本発明は、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０２３０９であるエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌であって血糖降下作用を有する乳酸菌０８３１－０７で醗酵させる乳酸醗酵ニンジンの製造方法であることが好ましく、更に、血糖降下作用を有する乳酸菌０８３１－０７で醗酵させる乳酸醗酵ニンジンの製造方法であることが特に好ましい。
乳酸菌０８３１－０７に、血糖降下作用があることは、特許文献３及び特許文献８で立証されている。
そして、該乳酸菌で醗酵させて乳酸醗酵ニンジンには、該乳酸菌が含有されていることが本発明の実施例で確かめられているので、該乳酸醗酵ニンジンには、血糖降下作用があることは立証されている。
そして、該乳酸菌で醗酵させて乳酸醗酵ニンジンには、該乳酸菌が含有されていることが本発明の実施例で確かめられているので、該乳酸醗酵ニンジンには、血糖降下作用があることは立証されている。
乳酸菌０８３１－０７は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌であるので、本発明は、該種まで一般化できて、従って、本発明は、前記機能性乳酸菌が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌であって血糖降下作用を有する乳酸菌である前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法でもある。
本発明は、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ－０２７１０であるワイセラ（Weissella）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌であって感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２で醗酵させる乳酸醗酵ニンジンの製造方法であることが好ましく、感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２で醗酵させる乳酸醗酵ニンジンの製造方法であることが特に好ましい。
乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２に、感染症予防若しくは治療作用があることは、本願実施例で立証されている。
そして、該乳酸菌で醗酵させて乳酸醗酵ニンジンには、該乳酸菌が含有されていることが本発明の実施例で確かめられているので、該乳酸醗酵ニンジンには、感染症予防若しくは治療作用があることは立証されている。
そして、該乳酸菌で醗酵させて乳酸醗酵ニンジンには、該乳酸菌が含有されていることが本発明の実施例で確かめられているので、該乳酸醗酵ニンジンには、感染症予防若しくは治療作用があることは立証されている。
乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２は、ワイセラ・ヘレニカ（Weissella hellenica）に属する乳酸菌であるので、本発明は、該種まで一般化できて、従って、本発明は、前記機能性乳酸菌が、ワイセラ・ヘレニカ（Weissella hellenica）に属する乳酸菌であって感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌である前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法でもある。
本発明は、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０２００５であるラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌であって感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌＃１１－１で醗酵させる乳酸醗酵ニンジンの製造方法であることが好ましく、感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌＃１１－１で醗酵させる乳酸醗酵ニンジンの製造方法であることが特に好ましい。
乳酸菌＃１１－１に、感染症予防若しくは治療作用があることは、特許文献２で立証されている。
そして、該乳酸菌で醗酵させて乳酸醗酵ニンジンには、該乳酸菌が含有されていることが本発明の実施例で確かめられているので、該乳酸醗酵ニンジンには、感染症予防若しくは治療作用があることは立証されている。
そして、該乳酸菌で醗酵させて乳酸醗酵ニンジンには、該乳酸菌が含有されていることが本発明の実施例で確かめられているので、該乳酸醗酵ニンジンには、感染症予防若しくは治療作用があることは立証されている。
乳酸菌＃１１－１は、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）に属する乳酸菌であるので、本発明は、該種まで一般化できて、従って、本発明は、前記機能性乳酸菌が、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）に属する乳酸菌であって感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌である前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法でもある。
本発明によって得られる乳酸醗酵ニンジンは、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵ニンジン、血糖降下用乳酸醗酵ニンジン、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵ニンジンであることが好ましい。
また、本発明は、ニンジンを機能性乳酸菌により醗酵させて得られる乳酸醗酵食品であって、前記の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用して製造されたものであることを特徴とする、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品、血糖降下用乳酸醗酵食品、及び、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品でもある。該食品には、前記の乳酸醗酵ニンジン、そのジュース、スムージー、粉砕物、加熱物、冷凍物等も含まれる。
一般に、乳酸菌で醗酵させたものには、該乳酸菌が産生した乳酸以外にも種々の化合物が含有されている。そのことは、本願発明の実施例でも確かめられている。そして、それら乳酸菌の産生物と原料である野菜との組み合わせで独特の味を醸し出していると考えられる。しかも、該乳酸菌やその産生物が、前記した自然免疫活性化作用、血糖降下作用、感染症予防若しくは治療作用をもたらしていると考えられる。
しかしながら、該独特の味の旨味成分や上記作用をもたらす化学物質等を直接同定することも、得られた乳酸醗酵ニンジンを食感・旨味等を示すパラメーター等で直接特定することは、不可能であるか又はおよそ実際的でない。
従って、本発明の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用して製造された乳酸醗酵ニンジンや、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品、血糖降下用乳酸醗酵食品、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品乳酸醗酵食品は製造方法で特定するしかない。
従って、本発明の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用して製造された乳酸醗酵ニンジンや、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品、血糖降下用乳酸醗酵食品、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品乳酸醗酵食品は製造方法で特定するしかない。
本発明によって得られる乳酸醗酵ニンジン、乳酸醗酵食品は、そのまま食してもよいし、加工して食してもよい。ニンジンの形状のまま食してもよいし、球形、楕円球形、直方体、立方体等に成形してもよい。
加工方法は目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ミキサー等を用いてすり潰すことにより、ジュースやスープ等として食してもよいし、加熱や冷凍して食してもよい。
加工方法は目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ミキサー等を用いてすり潰すことにより、ジュースやスープ等として食してもよいし、加熱や冷凍して食してもよい。
また、本発明の真空パックされた乳酸醗酵ニンジンの製造方法は、上記乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用した後、醗酵したニンジンを真空パックする工程を含むことを特徴とする。該醗酵されたニンジンの形状が保たれるので、真空パックすることが好ましい。
醗酵させたニンジンを真空パックする手段等は、特に限定されず、公知の方法・装置等を用いて行うことができる。
該真空パックされた乳酸醗酵ニンジンは、常温保存してもよいし、冷凍保存してもよいし、冷蔵保存してもよい。
該真空パックされた乳酸醗酵ニンジンは、常温保存してもよいし、冷凍保存してもよいし、冷蔵保存してもよい。
後述する本実施例により、ニンジンを機能性乳酸菌により醗酵させることにより、醗酵させていないニンジンには含まれない新しい化合物が確認された。また、乳酸醗酵前後でビタミンＡ及びＢの含有量に変化はなかった。よって、特定の機能性乳酸菌によるニンジンの乳酸醗酵によって、ビタミンＡ及びＢは失われることなく、該新しい化合物が合成されることにより、ニンジンに機能性が付与されていると考えられる。
本発明によって得られる「自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品（ニンジン）、血糖降下用乳酸醗酵食品（ニンジン）、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品乳酸醗酵食品（ニンジン）」は、当然に動植物自体ではないので、用途限定記載することによって、該用途に限定されて新規性を有する。
本発明によって得られる「自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品（ニンジン）、血糖降下用乳酸醗酵食品（ニンジン）、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品乳酸醗酵食品（ニンジン）」は、当然に動植物自体ではないので、用途限定記載することによって、該用途に限定されて新規性を有する。
以下、実施例及び評価例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。
実施例１等において使用する「１１／１９－Ｂ１」は、キウイフルーツから分離されたものである。ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌１１／１９－Ｂ１として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に寄託されている（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０１６９４、国内寄託日：２０１３年８月２０日）。
「１１／１９－Ｂ１」は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１３年８月２０日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１４年１０月１５日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４」を受けているものである。
「１１／１９－Ｂ１」は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１３年８月２０日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１４年１０月１５日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４」を受けているものである。
実施例１
＜乳酸醗酵時の経時的生菌数の測定＞
１０本の遠沈管（５０ｍＬ）に、それぞれ、皮と両端を除去しカットしたニンジン１５ｇと純水２ｍＬを入れ、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分）を行った。０．９％ＮａＣｌ ６ｍＬに乳酸菌１１／１９－Ｂ１（グリセロールストック）２４μＬを懸濁し、０．５ｍＬずつニンジンの入った１０本の遠沈管に添加した。ニンジン全体に菌液が行き渡るように万遍無く混ぜた後、３０℃で培養した。
０、３、６、９、１２、２４、２７、３０、３３、３６時間の計１０回、乳酸菌１１／１９－Ｂ１を添加し培養したニンジンに、１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌを加え、全液を回収した。回収した液を０．９％ＮａＣｌで１０３～１０７倍に希釈して１００μＬをＢＨＩ寒天培地で培養することで、生菌数を調べた。
また、対数増殖期の生菌数増加率から、加熱滅菌ニンジンでの乳酸菌の倍加時間を求めた。
＜乳酸醗酵時の経時的生菌数の測定＞
１０本の遠沈管（５０ｍＬ）に、それぞれ、皮と両端を除去しカットしたニンジン１５ｇと純水２ｍＬを入れ、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分）を行った。０．９％ＮａＣｌ ６ｍＬに乳酸菌１１／１９－Ｂ１（グリセロールストック）２４μＬを懸濁し、０．５ｍＬずつニンジンの入った１０本の遠沈管に添加した。ニンジン全体に菌液が行き渡るように万遍無く混ぜた後、３０℃で培養した。
０、３、６、９、１２、２４、２７、３０、３３、３６時間の計１０回、乳酸菌１１／１９－Ｂ１を添加し培養したニンジンに、１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌを加え、全液を回収した。回収した液を０．９％ＮａＣｌで１０３～１０７倍に希釈して１００μＬをＢＨＩ寒天培地で培養することで、生菌数を調べた。
また、対数増殖期の生菌数増加率から、加熱滅菌ニンジンでの乳酸菌の倍加時間を求めた。
結果を図１及び２に示す。乳酸菌添加前のニンジンと、乳酸菌添加後、３０℃で２日間インキュベーションしたニンジンの外観上の変化はほとんどなかった（図１）。また、乳酸醗酵後の容器の底に浸出した液に白濁が見られた。
乳酸醗酵前及び乳酸菌非添加でインキュベーション（３０℃）したニンジンの浸出液はｐＨ６を示したのに対し、乳酸醗酵後のニンジンの浸出液はｐＨ３を示した。
乳酸醗酵前及び乳酸菌非添加でインキュベーション（３０℃）したニンジンの浸出液はｐＨ６を示したのに対し、乳酸醗酵後のニンジンの浸出液はｐＨ３を示した。
図２は加熱滅菌したニンジンに乳酸菌を添加し、３０℃で培養した時の時間と生菌数の関係を示したグラフである。
培養前の加熱滅菌済ニンジン液中の生菌数は４．５×１０５細胞/ｍＬであった。１２時間後の生菌数は１．６×１０１０細胞/ｍＬであり、培養前と比較して３６，０００倍に増加した。対数増殖期における倍加時間は２４分であった。
倍加時間は２４分であることから、ニンジンには栄養培地と同程度の乳酸菌１１／１９－Ｂ１の増殖に必要な栄養素が存在していると示唆された。
培養前の加熱滅菌済ニンジン液中の生菌数は４．５×１０５細胞/ｍＬであった。１２時間後の生菌数は１．６×１０１０細胞/ｍＬであり、培養前と比較して３６，０００倍に増加した。対数増殖期における倍加時間は２４分であった。
倍加時間は２４分であることから、ニンジンには栄養培地と同程度の乳酸菌１１／１９－Ｂ１の増殖に必要な栄養素が存在していると示唆された。
実施例２
＜乳酸醗酵前後のビタミン含有量の測定＞
オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）又はスチームコンベクション処理（８５℃、２分）による滅菌処理をしたニンジンに、乳酸菌１１／１９－Ｂ１を添加して３０℃で１日間乳酸醗酵した。
そして、滅菌処理前のニンジン、滅菌処理直後のニンジン、及び、滅菌処理後に乳酸醗酵させたニンジンについてそれぞれ、ビタミンＡ及びＢの含有量を測定した。
＜乳酸醗酵前後のビタミン含有量の測定＞
オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）又はスチームコンベクション処理（８５℃、２分）による滅菌処理をしたニンジンに、乳酸菌１１／１９－Ｂ１を添加して３０℃で１日間乳酸醗酵した。
そして、滅菌処理前のニンジン、滅菌処理直後のニンジン、及び、滅菌処理後に乳酸醗酵させたニンジンについてそれぞれ、ビタミンＡ及びＢの含有量を測定した。
測定結果を表１に示す。表１中の数値の単位は、μｇ／１００ｇである。
表１に示すように、滅菌方法（オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）又はスチームコンベクション処理（８５℃、２分））によって、ニンジンのビタミンＡ及びＢの含有量は、変化しなかった。また、ニンジンを乳酸菌で１日醗酵させても、ビタミンＡ及びＢの含有量に大きな変化は見られなかった（表１）。
よって、滅菌処理及び乳酸醗酵により、ニンジンの有効成分であるビタミンＡ及びＢが失われないことが分かった。
よって、滅菌処理及び乳酸醗酵により、ニンジンの有効成分であるビタミンＡ及びＢが失われないことが分かった。
実施例３
＜乳酸醗酵ニンジン中の化合物の検出＞
１０本の遠沈管（５０ｍＬ）に、それぞれ、皮と両端を除去したニンジン１５ｇと純水２ｍＬを入れ、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分）を行った。乳酸菌１１／１９－Ｂ１のグリセロールストックをエーゼで、ＭＲＳ寒天培地に塗布し、３０℃で４８時間嫌気培養を行った。コロニーをかきとり、０．９％ＮａＣｌ ５ｍＬに懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。
＜乳酸醗酵ニンジン中の化合物の検出＞
１０本の遠沈管（５０ｍＬ）に、それぞれ、皮と両端を除去したニンジン１５ｇと純水２ｍＬを入れ、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分）を行った。乳酸菌１１／１９－Ｂ１のグリセロールストックをエーゼで、ＭＲＳ寒天培地に塗布し、３０℃で４８時間嫌気培養を行った。コロニーをかきとり、０．９％ＮａＣｌ ５ｍＬに懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。
加熱滅菌したニンジンを遠沈管５本に入れ、上記の調製した乳酸菌の懸濁液を１ｍＬ、ニンジンの表面に滴下した。残りの遠沈管５本は、コントロールとして０．９％ＮａＣｌを各１ｍＬずつ加え、３０℃で２日間培養した。培養後、ｐＨ測定、濁度の観察、各サンプルをＢＨＩ寒天培地で培養することで、乳酸醗酵しているか否かを判定した。
また、ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、メタノールの５種の有機溶媒をそれぞれ、乳酸菌を添加したニンジンと、乳酸菌を添加していないニンジンの入っている遠沈管に２０ｍＬずつ加え、スパーテルで細かく粉砕し、室温で１週間抽出した。
有機溶媒を加えた１０本の遠沈管を８，０００ｒｐｍ、５分遠心し、３層に分かれた３層中一番上の層を別の滅菌遠沈管（５０ｍＬ）に回収した。回収した各有機溶媒ニンジン抽出液を８，０００ｒｐｍ、１０分遠心し、上清を除去し、２００ｍＬのナスフラスコに移して、エバポレーターで乾固させた。
有機溶媒を加えた１０本の遠沈管を８，０００ｒｐｍ、５分遠心し、３層に分かれた３層中一番上の層を別の滅菌遠沈管（５０ｍＬ）に回収した。回収した各有機溶媒ニンジン抽出液を８，０００ｒｐｍ、１０分遠心し、上清を除去し、２００ｍＬのナスフラスコに移して、エバポレーターで乾固させた。
ニンジンの各有機溶媒抽出乾固物に５０％アセトニトリルを２ｍＬ入れ、ソニケーションし、２ｍＬチューブに回収した。その後１５ｋｒｐｍで５分遠心し、下層部分を回収した。０．４５μｍフィルトレーションを行った後、ＨＰＬＣ分析を行い、ニンジンを乳酸醗酵させることにより新しく化合物が合成されているか否かを判定した。
結果を図３～１２に示す。乳酸醗酵ニンジンの各抽出画分において、乳酸菌非添加のコントロールと比較して、新たなピークが検出された（図４、６、８、１０、１２の矢印で示したピーク）。
特に、乳酸菌１１／１９－Ｂ１で醗酵させたニンジンのヘキサン抽出画分のＨＰＬＣ分析は、乳酸菌非添加のコントロールと比較して、リテンションタイム３．６～２１．９分の間に１８個の新たなピークがみられた（図４）。
特に、乳酸菌１１／１９－Ｂ１で醗酵させたニンジンのヘキサン抽出画分のＨＰＬＣ分析は、乳酸菌非添加のコントロールと比較して、リテンションタイム３．６～２１．９分の間に１８個の新たなピークがみられた（図４）。
よって、ニンジンを乳酸菌１１／１９－Ｂ１等の機能性乳酸菌により乳酸醗酵させることにより新しい物質が生産され、該新しい物質により、機能性が付与され、更に美味しい乳酸醗酵ニンジンが製造されることが示唆された。
評価例１
＜乳酸醗酵野菜の形状及び味の比較＞
乳酸菌１１／１９－Ｂ１を用いて、表２に示される野菜を３０℃で１日間乳酸醗酵させることにより得られる乳酸醗酵野菜を５人のパネラーに食してもらい、その形状や味を評価した。結果を表２に示す。
＜乳酸醗酵野菜の形状及び味の比較＞
乳酸菌１１／１９－Ｂ１を用いて、表２に示される野菜を３０℃で１日間乳酸醗酵させることにより得られる乳酸醗酵野菜を５人のパネラーに食してもらい、その形状や味を評価した。結果を表２に示す。
表２中の評価項目の判定基準は以下のとおりである。
＜食感の評価基準＞
○：乳酸醗酵後も食感があり、噛むと歯応えがあった。
×：乳酸醗酵により食感が失われており、噛んでも歯応えがなかった。
○：乳酸醗酵後も食感があり、噛むと歯応えがあった。
×：乳酸醗酵により食感が失われており、噛んでも歯応えがなかった。
＜味の評価基準＞
○：５人中３人以上がおいしいと回答した。
×：５人中２人以下がおいしいと回答した。
○：５人中３人以上がおいしいと回答した。
×：５人中２人以下がおいしいと回答した。
＜形状の評価基準＞
○：乳酸醗酵後も外観上の変化はほとんどなく、調理加工性にも優れる。
×：乳酸醗酵により形状が崩れ、調理加工性に劣る。
○：乳酸醗酵後も外観上の変化はほとんどなく、調理加工性にも優れる。
×：乳酸醗酵により形状が崩れ、調理加工性に劣る。
＜総合評価＞
Ａ：「食感」、「味」、「形状」の項目何れも評価が○であり、乳酸醗酵食品として優れている。
Ｂ：「食感」、「味」、「形状」の項目のうち少なくとも１つが×であり、乳酸醗酵食品として適さない。
Ａ：「食感」、「味」、「形状」の項目何れも評価が○であり、乳酸醗酵食品として優れている。
Ｂ：「食感」、「味」、「形状」の項目のうち少なくとも１つが×であり、乳酸醗酵食品として適さない。
乳酸菌１１／１９－Ｂ１で醗酵させたニンジンは、「食感」、「味」、「形状」の項目何れもで評価が「○」で、総合評価が「Ａ」であり、乳酸醗酵食品として優れていることが分かった。
一方、その他の野菜（カブ、ダイコン、ゴーヤ、玄米）は、乳酸醗酵により大きく形状が崩れてしまい、調理加工性に劣っていた。
一方、その他の野菜（カブ、ダイコン、ゴーヤ、玄米）は、乳酸醗酵により大きく形状が崩れてしまい、調理加工性に劣っていた。
実施例４
＜乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の感染症予防若しくは治療作用＞
乳酸菌１１／１９－Ｂ１、乳酸菌０８３１－０７、及び、乳酸菌＃１１－１については、前記した通り、本願発明者らによって、それぞれの乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体の、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、感染症予防若しくは治療作用、と言った機能が確かめられており（立証されており）、前記した公知文献（特許文献と非特許文献）にそれらが記載されている。
しかし、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２については、機能性が記載された公開公報、国際公開公報、学術文献等が発行されていないので、以下に、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２が感染症予防若しくは治療作用を有することを示す。
＜乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の感染症予防若しくは治療作用＞
乳酸菌１１／１９－Ｂ１、乳酸菌０８３１－０７、及び、乳酸菌＃１１－１については、前記した通り、本願発明者らによって、それぞれの乳酸菌（生菌、死菌、産生物を含む）自体の、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、感染症予防若しくは治療作用、と言った機能が確かめられており（立証されており）、前記した公知文献（特許文献と非特許文献）にそれらが記載されている。
しかし、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２については、機能性が記載された公開公報、国際公開公報、学術文献等が発行されていないので、以下に、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２が感染症予防若しくは治療作用を有することを示す。
乳酸菌のフルグロース８０μＬを、カイコ人工餌１ｇと混ぜ、１日間カイコに給餌した。その後、緑膿菌ＰＡＯ１株の一晩培養液を生理食塩水で１０－６倍に希釈し、該希釈液５０μＬをカイコに血中注射し、経時的なカイコの生存個体数の減少を観察した。
生存していたカイコは、例えば図１４（Ａ）のようであり、死亡していたカイコは、例えば図１４（Ｂ）のようであった。カイコの生存率の推移の結果を図１３に示す。
生存していたカイコは、例えば図１４（Ａ）のようであり、死亡していたカイコは、例えば図１４（Ｂ）のようであった。カイコの生存率の推移の結果を図１３に示す。
図１３に示すように、試験した何れの乳酸菌も、生理食塩水によるコントロールに比べて延命効果を示した。その中で特に、「乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２」（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２７１０）を経口投与したカイコは、緑膿菌注射後１１５時間においても、大多数が生存していた。図１３では、「乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２」は、脚注に、「０９１６－４－２（Ｎｏ．１８）Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｈｅｌｌｅｎｉｃａ ０９１６－４－２」と記載されている。
すなわち、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の感染症予防若しくは治療作用は他の乳酸菌に比べて顕著に高かった。
すなわち、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の感染症予防若しくは治療作用は他の乳酸菌に比べて顕著に高かった。
実施例５
乳酸菌１２４株の中から、ワイセラ属ヘレニカ種に属する乳酸菌４種について、実施例４において、試験試料を乳酸菌ではなく乳酸菌培養上清の６７％エチルアルコール可溶性画分とし、緑膿菌ＰＡＯ１株の一晩培養液を生理食塩水で１０－６倍に希釈した以外は実施例４と同様にして、経時的なカイコの生存個体数の減少を観察し、１～３日後の生存を確認した。
乳酸菌１２４株の中から、ワイセラ属ヘレニカ種に属する乳酸菌４種について、実施例４において、試験試料を乳酸菌ではなく乳酸菌培養上清の６７％エチルアルコール可溶性画分とし、緑膿菌ＰＡＯ１株の一晩培養液を生理食塩水で１０－６倍に希釈した以外は実施例４と同様にして、経時的なカイコの生存個体数の減少を観察し、１～３日後の生存を確認した。
その結果、ワイセラ属ヘレニカ種に属する実験した乳酸菌４種を与えた場合は全て、カイコは３４時間生存していた。
一方、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌である乳酸菌１１／１９－Ｂ１は、感染症予防若しくは治療作用を示したが、ワイセラ属ヘレニカ種に属さないその他の乳酸菌は、総じて感染症予防若しくは治療作用を示さなかったか若しくは低かった。
ワイセラ・ヘレニカ種に属する乳酸菌は、他の属に属する乳酸菌や、ワイセラ属に属するがヘレニカ種に属さない乳酸菌に比べて高い緑膿菌耐性付与活性を有していた。
一方、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌である乳酸菌１１／１９－Ｂ１は、感染症予防若しくは治療作用を示したが、ワイセラ属ヘレニカ種に属さないその他の乳酸菌は、総じて感染症予防若しくは治療作用を示さなかったか若しくは低かった。
ワイセラ・ヘレニカ種に属する乳酸菌は、他の属に属する乳酸菌や、ワイセラ属に属するがヘレニカ種に属さない乳酸菌に比べて高い緑膿菌耐性付与活性を有していた。
実施例６
乳酸菌をＭＲＳ液体培地で２日間培養し、カイコの人工餌６ｇと混ぜ、５齢カイコ６匹に与えた。２１時間後、１０－５倍に生理食塩水で希釈した緑膿菌の菌液をカイコの血液内に注射し、５１時間後のカイコの生存数を調べた。結果を表３に示す。
乳酸菌をＭＲＳ液体培地で２日間培養し、カイコの人工餌６ｇと混ぜ、５齢カイコ６匹に与えた。２１時間後、１０－５倍に生理食塩水で希釈した緑膿菌の菌液をカイコの血液内に注射し、５１時間後のカイコの生存数を調べた。結果を表３に示す。
その結果、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２７１０）を給餌したカイコは、緑膿菌注射５１時間後に半数が生存したが、「ワイセラ属ではあるが他の種の菌」を給餌したカイコでは生存が認められなかった。特に、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の予防・治療効果は特異的に高かった。
実施例７
乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清をカイコの人工餌に混ぜ、１日間経口摂取させても、生菌と同様に、カイコに緑膿菌感染に対する抵抗性が付与された。
また、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清には、緑膿菌の増殖を阻害する活性は認められなかった。すなわち、これは抗菌物質ではないことが分かった。
乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清をカイコの人工餌に混ぜ、１日間経口摂取させても、生菌と同様に、カイコに緑膿菌感染に対する抵抗性が付与された。
また、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清には、緑膿菌の増殖を阻害する活性は認められなかった。すなわち、これは抗菌物質ではないことが分かった。
更に、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清を緑膿菌と同時にカイコに投与した場合には、緑膿菌感染に対する抵抗性付与は認められなかった。すなわち、緑膿菌感染に対する抵抗性付与には、乳酸菌の培養上清（由来物）前投与が必要であることが分かった。
また、この前投与から緑膿菌の投与までの時間を２日以上にすると、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清の活性は失われた。従って、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清に含まれる活性成分はカイコの体内から消失し、その活性が失われたと考えられる
これらの結果は、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清（に含まれる活性成分）の作用は、緑膿菌に対する直接の効果ではなく、宿主の免疫系を介していることを示唆している。
また、この前投与から緑膿菌の投与までの時間を２日以上にすると、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清の活性は失われた。従って、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清に含まれる活性成分はカイコの体内から消失し、その活性が失われたと考えられる
これらの結果は、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清（に含まれる活性成分）の作用は、緑膿菌に対する直接の効果ではなく、宿主の免疫系を介していることを示唆している。
実施例８
５齢カイコに、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清のエタノール分画を染み込ませた１ｇの人工餌１ｇを与えた。１７時間後、表４に示した菌液５０μＬをカイコの血液内に注射した。
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）については、一晩培養液を１０－６倍に希釈して使用し、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）については、菌の一晩培養液５ｍＬを遠心（８０００ｒｐｍ、５分間）して菌を集め、５ｍＬの生理食塩水に懸濁して使用した。
その後、カイコの生存数を継時的に観察した。結果を表４に示す。
５齢カイコに、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清のエタノール分画を染み込ませた１ｇの人工餌１ｇを与えた。１７時間後、表４に示した菌液５０μＬをカイコの血液内に注射した。
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）については、一晩培養液を１０－６倍に希釈して使用し、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）については、菌の一晩培養液５ｍＬを遠心（８０００ｒｐｍ、５分間）して菌を集め、５ｍＬの生理食塩水に懸濁して使用した。
その後、カイコの生存数を継時的に観察した。結果を表４に示す。
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1株）、及び、２つの肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae 8140,8705）株は、カイコを２２時間以内に殺傷したが、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養物・培養上清（からの抽出物）は治療効果を示した。また、緑膿菌による感染だけでなく、肺炎桿菌による感染に対しても治療効果を示した。
実施例９
実施例８において、菌を多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）に代えて同様に評価した。
乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清（に含まれる活性成分）は、臨床分離されたＭＤＲＰに対しても効果を示した。
ヒト臨床において、ＭＤＲＰと呼ばれる多剤耐性緑膿菌が問題となっているが、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２は、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）に対しても有効であり、院内感染対策等に対しても有効であることが示唆された。
実施例８において、菌を多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）に代えて同様に評価した。
乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２の培養上清（に含まれる活性成分）は、臨床分離されたＭＤＲＰに対しても効果を示した。
ヒト臨床において、ＭＤＲＰと呼ばれる多剤耐性緑膿菌が問題となっているが、乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２は、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）に対しても有効であり、院内感染対策等に対しても有効であることが示唆された。
評価例２
＜乳酸醗酵による他の野菜とニンジンとの比較＞
ニンジン２００ｇ、カブ１５０ｇ、カボチャ１５０ｇ、サツマイモ１２０ｇを、それぞれ、１２１℃１５分、高圧滅菌し、乳酸菌１１／１９－Ｂ１懸濁液３０μＬを添加し、３０℃で１日間乳酸醗酵させることにより、それぞれの乳酸醗酵野菜を得た。
上記３種の乳酸醗酵野菜を、評価例１と同様に評価した。ニンジンとカブは評価例１でも評価したが、再度、新たに乳酸醗酵させて評価した。
＜乳酸醗酵による他の野菜とニンジンとの比較＞
ニンジン２００ｇ、カブ１５０ｇ、カボチャ１５０ｇ、サツマイモ１２０ｇを、それぞれ、１２１℃１５分、高圧滅菌し、乳酸菌１１／１９－Ｂ１懸濁液３０μＬを添加し、３０℃で１日間乳酸醗酵させることにより、それぞれの乳酸醗酵野菜を得た。
上記３種の乳酸醗酵野菜を、評価例１と同様に評価した。ニンジンとカブは評価例１でも評価したが、再度、新たに乳酸醗酵させて評価した。
ニンジンとカブは、評価例１の再現ができた。
カボチャ、サツマイモは、食感、味、形状について、ニンジンより、歯ごたえがなく食感が悪くなったり、不味くなったり、形状が崩れ易くなったりして、評価例１と同様の基準で総合評価は「Ｂ」であった。
評価例１、２より、乳酸醗酵の対象野菜として、ニンジンは、種々の性質（評価項目）で特異的に極めて優れていた。
カボチャ、サツマイモは、食感、味、形状について、ニンジンより、歯ごたえがなく食感が悪くなったり、不味くなったり、形状が崩れ易くなったりして、評価例１と同様の基準で総合評価は「Ｂ」であった。
評価例１、２より、乳酸醗酵の対象野菜として、ニンジンは、種々の性質（評価項目）で特異的に極めて優れていた。
評価例３
＜乳酸菌を変化させたときの乳酸醗酵ニンジンの評価＞
乳酸菌１１／１９－Ｂ１（ラクトコッカス・ラクティス Lactococcus lactis）
乳酸菌０８３１－０７（エンテロコッカス・フェカリス Enterococcus faecalis）
乳酸菌＃１１－１（ラクトバチルス・パラプランタラム Lactobacillus paraplantarum）乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２（ワイセラ・ヘレニカ Weissella hellenica）
上記乳酸菌の懸濁液を調製した。
＜乳酸菌を変化させたときの乳酸醗酵ニンジンの評価＞
乳酸菌１１／１９－Ｂ１（ラクトコッカス・ラクティス Lactococcus lactis）
乳酸菌０８３１－０７（エンテロコッカス・フェカリス Enterococcus faecalis）
乳酸菌＃１１－１（ラクトバチルス・パラプランタラム Lactobacillus paraplantarum）乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２（ワイセラ・ヘレニカ Weissella hellenica）
上記乳酸菌の懸濁液を調製した。
上記乳酸菌の懸濁液を、１２１℃２０分間、高圧滅菌したニンジンに添加し、３０℃で２日間乳酸醗酵させることにより乳酸醗酵ニンジンを得た。対照として、生理食塩水を高圧滅菌したニンジンに添加して同様に３０℃で２日間経過させた。
得られた乳酸醗酵ニンジンの写真を図１５に示す。
（ａ）生理食塩水、（ｂ）乳酸菌１１／１９－Ｂ１、（ｃ）乳酸菌０８３１－０７、（ｄ）乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２、でそれぞれ醗酵させた乳酸醗酵ニンジンである（乳酸菌＃１１－１は図示せず）。
（ａ）生理食塩水、（ｂ）乳酸菌１１／１９－Ｂ１、（ｃ）乳酸菌０８３１－０７、（ｄ）乳酸菌Ｗｈ０９１６－４－２、でそれぞれ醗酵させた乳酸醗酵ニンジンである（乳酸菌＃１１－１は図示せず）。
対照とした（ａ）生理食塩水以外は、何れも、評価例１と評価例２で「乳酸菌１１／１９－Ｂ１を使用してニンジンを醗酵させた乳酸醗酵ニンジン」と同様の評価結果が得られた。すなわち、適度な歯ごたえがあり食感が良好で、美味しく、形状が崩れ難く外観上の変化はほとんどなく、調理加工性にも優れており、評価例１と同様の基準で総合評価は全て「Ａ」であった。乳酸菌１１／１９－Ｂ１以外の乳酸菌でも、実施例３で示したように、醗酵後に未知の物質が生成している可能性がある。
一方、（ａ）生理食塩水は、原料である生のニンジンその物の性質を有しており、歯ごたえがあり過ぎ、味も特に美味しくなっていなかった。
一方、（ａ）生理食塩水は、原料である生のニンジンその物の性質を有しており、歯ごたえがあり過ぎ、味も特に美味しくなっていなかった。
評価例４
＜ＢＨＩプレートによる乳酸醗酵ニンジンに含有される乳酸菌の検査＞
評価例３で得られた乳酸醗酵ニンジンには、使用した乳酸菌が含有されていることをＢＨＩプレートによって検査した。
すなわち、ＢＨＩプレートの右側に醗酵に用いた乳酸菌を、左側に乳酸醗酵ニンジンから採取したサンプルを広げた。図１６にその結果を示す。図１６の（ａ）～（ｄ）の乳酸菌（又は生理食塩水）は、評価例３の（ａ）～（ｄ）の乳酸菌（又は生理食塩水）とそれぞれ同一である。
具体的には、上記（ｂ）～（ｄ）については、醗酵操作後のニンジン周囲の液体、約１μＬを滅菌したエーゼで採取し、ＢＨＩプレートの半分の、写真で見て左側に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。プレート半分の、写真でみて右側には、醗酵に用いた乳酸菌をコントロールとして培養した。
＜ＢＨＩプレートによる乳酸醗酵ニンジンに含有される乳酸菌の検査＞
評価例３で得られた乳酸醗酵ニンジンには、使用した乳酸菌が含有されていることをＢＨＩプレートによって検査した。
すなわち、ＢＨＩプレートの右側に醗酵に用いた乳酸菌を、左側に乳酸醗酵ニンジンから採取したサンプルを広げた。図１６にその結果を示す。図１６の（ａ）～（ｄ）の乳酸菌（又は生理食塩水）は、評価例３の（ａ）～（ｄ）の乳酸菌（又は生理食塩水）とそれぞれ同一である。
具体的には、上記（ｂ）～（ｄ）については、醗酵操作後のニンジン周囲の液体、約１μＬを滅菌したエーゼで採取し、ＢＨＩプレートの半分の、写真で見て左側に塗布し、３７℃にて２４時間培養した。プレート半分の、写真でみて右側には、醗酵に用いた乳酸菌をコントロールとして培養した。
醗酵に用いた乳酸菌が純培養されていることが確認された（図１６のシャーレの左半分参照）。
（ａ）生理食塩水の場合には、プレートの左右両側に醗酵操作後のニンジン周囲の液体サンプル２つを用意し、それぞれ別々に塗布した。結果として、ニンジン由来、又は、環境からの雑菌の混入がないことが確認された。
（ａ）生理食塩水の場合には、プレートの左右両側に醗酵操作後のニンジン周囲の液体サンプル２つを用意し、それぞれ別々に塗布した。結果として、ニンジン由来、又は、環境からの雑菌の混入がないことが確認された。
対照の（ａ）生理食塩水以外は、何れも増殖が認められた（図１６のシャーレの左半分参照）と言うことは、各乳酸菌の生菌が、乳酸醗酵ニンジンに含有されていることを示している。よって、乳酸醗酵ニンジンには、生菌、死菌、産生物が含有されていることは明らかである。
前記した通り、それぞれの乳酸菌には、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、又は、感染症予防若しくは治療作用があることが確かめられているので、本発明の乳酸醗酵ニンジンにも該作用・機能・効果があることは明らかである。従って、前記した乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用して製造された物（乳酸醗酵ニンジン）は、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品、血糖降下用乳酸醗酵食品、及び、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品の用途に有用であることが確かめられた。
前記した通り、それぞれの乳酸菌には、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、又は、感染症予防若しくは治療作用があることが確かめられているので、本発明の乳酸醗酵ニンジンにも該作用・機能・効果があることは明らかである。従って、前記した乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用して製造された物（乳酸醗酵ニンジン）は、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品、血糖降下用乳酸醗酵食品、及び、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品の用途に有用であることが確かめられた。
本発明の製造方法により得られた乳酸醗酵ニンジンは、自然免疫活性化作用、血糖降下作用、感染症予防若しくは治療作用等の機能性を有する。よって、本発明の製造方法を利用して、機能性が高い飲食品を提供することができ、一般食品業界、健康食品業界、医薬品業界、飲食品製造・提供サービス業界等で広く利用可能である。
ＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４
ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３０９
ＮＩＴＥ Ｐ－０２７１０
ＮＩＴＥ ＢＰ－０２００５
ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３０９
ＮＩＴＥ Ｐ－０２７１０
ＮＩＴＥ ＢＰ－０２００５
Claims (5)
- ニンジンを機能性乳酸菌により醗酵させる乳酸醗酵ニンジンの製造方法であって、
該ニンジンを醗酵させる前に、該ニンジンを滅菌する工程を含み、
前記機能性乳酸菌が、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０１６９４であるラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌、又は、
受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０２３０９であるエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌、又は、
受託番号がＮＩＴＥ Ｐ－０２７１０であるワイセラ・ヘレニカ（Weissella hellenica）に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌、又は、
受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０２００５であるラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌、であることを特徴とする乳酸醗酵ニンジンの製造方法。 - 前記機能性乳酸菌が、自然免疫活性化作用を有する乳酸菌、血糖降下作用を有する乳酸菌、又は、感染症予防若しくは治療作用を有する乳酸菌である請求項１に記載の乳酸醗酵ニンジンの製造方法。
- 前記乳酸醗酵ニンジンが、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵ニンジン、血糖降下用乳酸醗酵ニンジン、及び、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵ニンジンからなる群より選ばれる少なくとも１つの乳酸醗酵ニンジンである請求項１又は請求項２に記載の乳酸醗酵ニンジンの製造方法。
- 請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用した後、醗酵したニンジンを真空パックする工程を含むことを特徴とする真空パックされた乳酸醗酵ニンジンの製造方法。
- ニンジンを前記機能性乳酸菌により醗酵させて得られる乳酸醗酵食品であって、請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の乳酸醗酵ニンジンの製造方法を使用して製造されたものであることを特徴とする、自然免疫活性化増強用乳酸醗酵食品、血糖降下用乳酸醗酵食品、又は、感染症予防若しくは治療用乳酸醗酵食品。
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