JP5006198B2 - 病原菌の細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌、その処理物及びそれを含有する食品・医薬品組成物 - Google Patents

Description

本発明は、感染症の原因となる病原菌（例えば、大腸菌群細菌、サルモネラ菌、エルシニア菌など）の腸上皮細胞などの動物細胞への付着を阻害する効果を有するビフィズス菌とその処理物及び当該ビフィズス菌を含有する食品・医薬品組成物に関する。

感染症は、ヒトあるいは動物の体に侵入した病原菌が標的となる細胞に付着・定着もしくは侵入し、その後増殖することで引き起こされ、組織の破壊や、排出された毒素による生体炎症を伴う。
例えば、食水系感染症（食中毒）の主要な原因菌に下痢原生大腸菌がある。毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ，ＥＴＥＣ）は旅行者下痢症の原因菌としても知られ、病原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ，ＥＰＥＣ）はＥＴＥＣと共に、発展途上国における乳幼児下痢症の原因菌として知られている。また、細胞侵入性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ，ＥＩＥＣ）は赤痢菌と同様の病原性をもつ。近年大きな問題となっている、病原性大腸菌Ｏ１５７はベロ毒素産生性大腸菌である。また例えばサルモネラは下痢原生病原菌として知られているが、腸上皮から生体内に侵入し、単球や樹状細胞内に生残して持続感染することが知られている。

本発明者らは、感染成立の初期段階として原因菌が腸粘膜上皮細胞に付着することが不可欠である点に着目し、病原性大腸菌の細胞への付着阻害システムの開発を行い、ある種のラクトフェリン加水分解物から付着阻害能を有するペプチドを提供した（特許文献１）。また、同様の能力を有するフコシルオリゴ糖および硫酸化フコシルオリゴ糖を提供した（特許文献２）。

一方、乳酸菌の腸管感染症に対する効果に関してはいくつかの文献においてその効果を確認する報告がある。例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）の胃からの除菌に対して、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ ２７１６菌株（ＬＧ２１）およびラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｌａ１菌株で効果のあることが、臨床的に確認されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。

また、下痢症に関しては、旅行者下痢症、抗生物質下痢症やロタウィルス下痢症などに対して臨床試験で乳酸菌の予防治療効果がいくらかは認められている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。しかし、臨床的に明瞭な効果が確認された報告は未だ成されていない。

一方、腸管上皮細胞モデルを用いて、付着性の高いラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株をスクリーニングし、選抜された菌株を用いて病原菌の付着が阻害できたとする報告は多く見られる（例えば非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。

一方、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株の腸管上皮細胞モデルへの付着性を調べた報告はいくつかなされている（例えば、非特許文献１０、非特許文献１１）。しかし、開示されている菌株の付着阻害性については、ビフィズス菌を通常の増殖条件にて培養することによって産生される成分であり、７０時間以上培養することにより７０％以上の阻害率を得ることができると報告されている（例えば、非特許文献１２、特に図６−Ｂ）。
更に、非特許文献１３には、ヒト由来のビフィダム・ロンガムやビフィダム・インファンティス、ビフィダム・ブレベの新鮮分離株が、Ｃａｃｏ−２細胞やＨＴ−２９細胞への毒素原性大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム、及びエルシニア・シュードウベルキュロシスの接着をビフィズス菌の濃度依存性（１０^７〜１０^９ｃｆｕ／ｍｌ）に阻害することが示されている。

特開平１１−２９２７８９号公報 特開２００２−２２６４９６号公報 特開平６−３１５３７３号公報 特表２００２−５３７８６５号公報 特表２００２−５３７８６７号公報 ミケッティ等（Ｍｉｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．），Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，１９９９年，第６０巻，ｐ．２０３−２０９ サカモト等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００１年，第４７巻，ｐ．７０９−７１０ シミズ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００２年，第５０巻，ｐ．６１１−６１８ ロルフェ（Ｒｏｌｆｅ），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０００年，第１３０巻，ｐ．３９６Ｓ−４０２Ｓ レイド等（Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．），Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２００２年，第４巻，ｐ．３１９−３２４ サーレラ等（Ｓａａｒｅｌａ ｅｔ ａｌ．），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２年，第７８巻，ｐ．９９−１１７ ココニエール等（Ｃｏｃｏｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００年，第６６巻，ｐ．１１５２−１１５７ トドロキ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１年，第９１巻，ｐ．１５４−１５９ ホリエ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２年，第９２巻，ｐ．３９６−４０３ クロシアニ等（Ｃｒｏｃｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５年，第２１巻，ｐ．１４６−１４８ デル・レ等（Ｄｅｌ Ｒｅ ｅｔ ａｌ．），Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００年，第３１巻，ｐ．４３８−４４２ フジワラ等、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７年，第６３巻，ｐ．５０６−５１２ バーネット等（Ｂｅｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．），Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３年，第５９巻，ｐ．４１２１−４１２８

即ち、本発明が解決しようとする課題は、動物体内に侵入した大腸菌、サルモネラ菌、エルシニア菌などを初めとする病原菌が、動物細胞に付着・定着することを簡便な手段で阻害して、感染症の発症を予防することである。

本発明は、上記した課題を解決するためになされたものであり、本発明者等は腸管上皮細胞モデルとしてＣａｃｏ−２細胞およびＨＴ−２９細胞を用いて、主としてヒト糞便から分離されたビフィズス菌株について付着性の評価と病原菌に対する付着阻害活性を調べたところ、調査に用いたビフィズス菌は概ね病原菌の付着阻害活性を有しており、その中でもある特定のビフィズス菌において、特異的に病原菌の細胞付着阻害能が高いことを見出した。また、これらのビフィズス菌液を非増殖条件で静置したときに得られる上清中にも同様の病原菌の細胞付着阻害能を有する成分が検出されることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、病原菌の動物細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌に関する。

また、本発明はビフィズス菌に処理を施すことにより得られる、病原菌の動物細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌処理物に関する。

本発明においては、前記処理物はビフィズス菌を非増殖条件下で静置して得られる上清であることが好ましい。

また、本発明は、上記の上清より得られることを特徴とする付着阻害因子に関する。

また、本発明は、上記のビフィズス菌、ビフィズス菌処理物、及び付着阻害因子の少なくとも一つを有効成分として含み、病原菌の動物細胞への付着阻害能を有する食品・医薬品組成物に関する。

さらに、本発明は、病原菌の動物細胞への付着阻害剤の製造のための、上記のビフィズス菌、ビフィズス菌処理物、及び付着阻害因子の少なくとも一つの使用に関する。

本発明のビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・ビフィダムが好ましく、特にビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８からなる群から選ばれた少なくとも１つの菌株であることが好ましい。

本発明においては、前記病原菌としてはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、シゲラ・フレキスネル（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）からなる群から選ばれた少なくとも１種の病原菌があげられる。

本発明のビフィズス菌及び／またはビフィズス菌処理物とそれを含有する食品・医薬品組成物により、感染症の原因となる大腸菌などの病原菌が腸上皮細胞などの動物細胞に付着することを効果的に阻害する。
特に、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８等のビフィドバクテリウム・ビフィダムを用いた場合、非常に高い割合で病原菌が細胞へ付着することを阻害でき、その予防効果は絶大であることが分かった。

ビフィズス菌の保温上清の存在下におけるエルシニア菌の細胞への付着性の結果を示す棒グラフ。 化学処理による、ビフィズス菌保温上清の付着阻害活性への影響を示す棒グラフ。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。

本発明で用いるビフィズス菌としては、これらに限定されないが、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム等が挙げられる。
具体的には、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＥＰ１７５００１、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＥＰ１７５００２、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＥＰ１７５００３、ビフィドバクテリウム・ブレベＭＥＰ１７５００４、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＥＰ１７５００５などが挙げられ、好ましく用いられる。
この中で、特に好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダム菌株であり、さらに好ましくはビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８である。
これらの菌株については、単独あるいは２つ以上を組み合わせて使用することができる。

本発明で用いるビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４は下記の条件で国際寄託されている。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１２３
（４）識別のための表示：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＯＬＢ ６３７４
（５）寄託日：２００６年８月９日
なお、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４は、２００５年８月４日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２３にて寄託され、その後、上記の条件で国際寄託移管されている。

本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４は、以下の菌学的性質を有するものである。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４は、グラム陽性偏性嫌気性桿菌であり、菌形状は桿菌または分岐状の多形であり、芽胞の形成、運動性はない。ＢＬ寒天培地（栄研器材製）平板上で本菌を塗布し、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ・ケンキ（三菱ガス化学製）使用による嫌気状態にて３７℃、４８時間培養すると、不透明な円形半球状の光沢を有するコロニーを形成する。

本発明で用いるビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８は下記の条件で国際寄託されている。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−３１
（４）識別のための表示：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＯＬＢ ６３７８
（５）寄託日：２００６年１月１８日
なお、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８は、２００４年１０月２６日付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３１にて寄託され、その後、上記の条件で国際寄託移管されている。

本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８は、以下の菌学的性質を有するものである。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８は、グラム陽性偏性嫌気性桿菌であり、菌形状は桿菌または分岐状の多形であり、芽胞の形成、運動性はない。ＢＬ寒天培地（栄研器材製）平板上で本菌を塗布し、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ・ケンキ（三菱ガス化学製）使用による嫌気状態にて３７℃、４８時間培養すると、不透明な円形半球状の光沢を有するコロニーを形成する。

その他の株のうち、菌株名にＡＴＣＣと記載された菌株はアメリカンタイプセルカルチャーから入手した株、菌株名にＪＣＭと記載された菌株は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターの微生物材料開発室から入手した株、菌株名にＡＰＣＣと記載された菌株は青森県環境保健センターから入手した株、菌株名にＣＥＣＴと記載された菌株はＣｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ（バレンシア、スペイン）から入手した株、菌株名にＩＩＤと記載された菌株は東京大学医科学研究所微生物株保存施設から入手した株、シゲラ・フレキスネルＢＦＲ３６２４は国立感染研究所より入手した株、シゲラ・フレキスネル２４５７^Ｔは国立感染研究所より入手した基準株、および菌株名にＭＥＰと記載された菌株は明治乳業株式会社保有菌株である。

本発明のビフィズス菌液を非増殖条件下に保温すると病原菌の動物細胞への付着阻害能
を有する成分が培地中に検出される。本発明でいう「非増殖条件」とは通常の菌培養のための条件とは異なる条件であり、すなわち菌体を増やす目的の培養条件ではない。本発明はこれに限定されないが、例えば、ＲＰＭＩ培地中、室温にて、好気保温、あるいは同培地で３７℃、５〜１０％ＣＯ_２・９０〜９５％Ｏ_２条件下で、１０時間以下、好ましくは５時間以下保温する条件が挙げられる。

これらのビフィズス菌体を含む処理物であっても本発明の効果を呈する。ビフィズス菌処理物としては、例えば、上記ビフィズス菌の培養物、その濃縮物、ペースト状に加工したペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、菌体を媒体に分散させた液状物、希釈剤で希釈した希釈物、乾燥物をミルなどで破砕した破砕物などを用いることが出来る。

また特に、本発明におけるビフィズス菌処理物としては、上記ビフィズス菌を前記した非増殖条件下で静置したときに得られる上清が、同様の病原菌付着阻害能を有するために、好ましく用いることが出来る。

ここで、上記の上清に凍結乾燥などの処理を行うことにより、タンパク質やペプチドを病原菌の動物細胞への付着阻害作用を有する付着阻害因子として得ることが可能である。なお、上記の付着阻害因子を得る方法としては、タンパク質やペプチドを分離して回収するための常法を全て適用することが可能である。

本発明のビフィズス菌及び／又はその処理物は、そのまま、または殺菌後、破砕あるいは未粉砕した処理物として、単独または複数種の混合物として経口投与することができる。
本発明のビフィズス菌は、病原菌の細胞への付着阻害能を有する限り限定されず、変異株も本発明の範囲に包含される。この際の変異としては自然変異、放射線、化学物質等による人為的変異等が挙げられる。
本発明のビフィズス菌及び／又はその処理物は、生菌であっても死菌であってもよいが、好ましくは生菌である。

さらに本発明の食品組成物は、保健機能食品や病者用食品にも適用することができる。日本における保健機能食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として設けられたもので、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類の類型からなる。本発明のビフィズス菌及び／又はその処理物を含有する特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより各種の感染に対する予防および／または治療が可能となる。

具体的には、食品組成物として使用する場合には、各種飲食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等）にビフィズス菌及び／またはビフィズス菌処理物を添加し、これを摂取してもよい。本有効成分をそのまま使用したり、他の食品ないし食品成分と混合するなど、通常の食品組成物における常法にしたがって使用できる。また、その性状についても、通常用いられる飲食品の状態、例えば、固体状（粉末、顆粒状等）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよい。

その他の成分についても特に限定されないが、本発明のビフィズス菌及び／又はその処理物を含有する飲食物には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物；バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。糖類、加工澱粉（デキストリン、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。

本発明のビフィズス菌及び／又はその処理物を有効成分とする医薬組成物の投与量は、投与経路、ヒトを含む投与対象動物の年齢、体重、症状など、種々の要因を考慮して、適宜設定することができる。本発明はこれに限定されないが、好ましくは、有効成分として１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが適当である。しかしながら、長期間に亘って予防及び／又は治療の目的で摂取する場合には、上記範囲よりも少量であってもよいし、また、本有効成分は、安全性について問題がないので、上記範囲よりも多量に使用しても一向にさしつかえない。
なお、本発明の医薬組成物は、一日の投与量を１度ではなく、複数回に分けて投与することも可能である。
また、本発明のビフィズス菌及び／又はその処理物を含有する医薬組成物は、経口投与又は非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、坐薬、経皮等）のいずれでも投与できる。

本発明による医薬組成物の投与形態としては、例えば錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、溶液、シロップ剤、乳液等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬である本発明の菌体および／または処理物に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。

本発明のビフィズス菌及び／又はその処理物の量は、その目的、用途（食品組成物、予防剤、治療剤等の医薬品組成物）に応じて任意に定めることができ、本発明はこれに限定されないがその含量としては、全体量に対して通常、０．００１〜１００％（ｗ／ｗ）、特に０．１〜１００％（ｗ／ｗ）が好ましい。
また、本発明の医薬組成物の投与対象は、ヒトを含む哺乳動物であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。

本発明において、「動物細胞」とは培養細胞や腸、口腔内、気管などの上皮細胞、臓器の細胞などが挙げられる。

本発明において、付着阻害の対象となる病原菌としては、これには限定されないが、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、シゲラ・フレキスネル（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）等が挙げられる。

以下、本発明に関し実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

本実施例で用いたビフィズス菌株および病原菌株を表１及び表２に示す。

（使用した菌株の培養）
ビフィズス菌株は常法に基づきＧＡＭ寒天平板（日水製薬）上で３７℃４８時間、嫌気培養（三菱ガス化学、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ）した。病原菌のうち、ビブリオ菌株及びエルシニア菌株は１．５％の食塩を添加したハートインヒュージョン寒天培地（日水製薬）上で３０℃、１６時間好気培養した。エシェリキア・コリ菌株はＣＦＡ寒天培地上で３７℃、１６時間好気培養した。他の菌株は、ハートインヒュージョン寒天培地（日水製薬）上で３７℃、１６時間好気培養した。平板からそれぞれの菌を回収後、ＰＢＳで３回洗浄した。

（付着試験）
付着試験にはＣａｃｏ−２細胞または固定化したＣａｃｏ−２細胞を用いた。固定化Ｃａｃｏ−２細胞とは１４〜１５日間培養した細胞をメタノールで固定した細胞を指している。Ｃａｃｏ−２細胞（ＲＣＢ０９８８）は理研細胞開発銀行から入手し、２０％ウシ胎児血清と１％非必須アミノ酸を含むＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（シグマ社）で継代培養した。

付着試験には２０％ウシ胎児血清と１％非必須アミノ酸を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ、シグマ社）で１４〜１５日間培養した細胞を用いた。いずれの培地にも、抗生物質（２．５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン）を添加して培養した。培養は３７℃とした５％炭酸ガス培養器中で行ない、培地の交換は２日に一度行なった。付着試験用の細胞は２４穴マルチプレートで培養した。一部試験では細胞をマルチプレート中に置いた円形カバーガラス上に生育させ、グラム染色あるいはギムザ染色後、顕微鏡下で付着菌数を計数した。

ＰＢＳで洗浄後の菌体を非必須アミノ酸１％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び炭酸水素ナトリウム含有）に１．０×１０^９／ｍｌとなるように懸濁した。培養細胞は付着試験開始３０分前に、培地を除去し、Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液で２回洗浄後、非必須アミノ酸１％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した。この培地を除去後、培養細胞に菌懸濁液１ｍｌを添加して炭酸ガス培養器中で３７℃２時間培養した。培養終了後、付着していない菌体をＰＢＳで３回洗浄することにより除去した。付着菌数を生菌数として求めるために、細胞に１ｍｌの蒸留水を添加し、ピペッティングにより培養細胞を破裂させた。ウェル中の液を段階希釈し、希釈液１００μｌを１で述べた寒天培地に塗抹後、１で述べた培養条件で培養した。各菌株の付着試験には１回につき３ウェルを用いた。試験は異なる実験日に２〜３回実施して、再現性を確認した。

（付着阻害試験）
ＰＢＳで洗浄後の菌体を非必須アミノ酸１％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び炭酸水素ナトリウム含有）にビフィズス菌の場合１．０×１０^８／ｍｌ、５．０×１０^８／ｍｌおよび１．０×１０^９／ｍｌ、病原菌の場合５．０×１０^８／ｍｌとなるように懸濁した。培養細胞は付着試験開始３０分前に、培地を除去し、Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液で２回洗浄後、非必須アミノ酸１％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した。細胞からこの培地を除去後、ビフィズス菌懸濁液９００μｌを培養細胞に添加して炭酸ガス培養器中で３７℃１時間培養した。これに病原菌懸濁液１００μｌを添加後、さらに１時間培養した。付着していない菌体をＰＢＳで３回洗浄することにより除去した。次いでウェルに１ｍｌの蒸留水を添加した。ピペッティングにより培養細胞を破裂させた。ウェル中の液を段階希釈し、希釈液１００μｌを１で述べた寒天培地に塗抹後、１で述べた培養条件で培養した。但し、ビフィズス菌計数用のＧＡＭ寒天培地にはポリミキシンＢ硫酸塩を５μｇ／ｍｌ（＝約４０単位／ｍｌ）添加した。各菌株の付着試験には１回につき２ウェルを用いた。試験は異なる実験日に２〜３回実施して、再現性を確認した。

ビフィズス菌の保温上清を用いた付着阻害試験の場合は以下のように行った。ＰＢＳで洗浄後の菌体を非必須アミノ酸１％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び炭酸水素ナトリウム含有）に１．０×１０^８／ｍｌ、５．０×１０^８／ｍｌおよび１．０×１０^９／ｍｌとなるよう懸濁し、室温下に２時間保温した。保温後、０．２μｍのフィルターで除菌して保温上清を得た。固定化Ｃａｃｏ−２細胞に、保温上清９００μｌと病原菌懸濁液１００μｌを添加後、炭酸ガス培養器中で３７℃１時間培養した。以下、先述の方法で病原菌の付着菌数を計数した。

（化学処理保温上清についての付着試験）
ビフィズス菌保温上清をタンパク分解酵素（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｍｅｒｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）で３７℃、２時間、または０．００５％ＰＭＳＦで３７℃２時間、熱処理は１００℃、５分間、１００ｍＭ過ヨウ素酸処理は過ヨウ素酸とともに遮光下で３７℃、１時間、の各処理後、Ｃａｃｏ−２細胞への付着試験を行った。付着試験には固定化Ｃａｃｏ−２細胞を用い、付着菌数はグラム染色後、顕微鏡下で計数した。

総菌数として１．０×１０^９／ｍｌのビフィズス菌体をＣａｃｏ−２細胞に付加して付着性を調べたところ、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４が良好な付着性を示し、ビフィドバクテリウム・ブレベＭＥＰ１７５００４は、ＯＬＢ６３７４と比較して低付着性を示した（表３）。

ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、およびビフィドバクテリウム・ロンガムを用いて、サルモネラ・チフィムリウムＪＣＭ１６５２菌、ビブリオ・コレラＡＰＣＣ８４１１のＣａｃｏ−２細胞への付着に与える影響を調べた（表４）。

その結果、総菌数比でサルモネラ・チフィムリウムＪＣＮ１６５２の２〜２０倍（生菌数比では１／２〜５倍）のビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４を添加した場合、サルモネラ・チフィムリウムＪＣＭのＣａｃｏ−２細胞への付着を８８．２％阻害した（表４）。ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８を添加した場合には、８４．１％阻害した（表４）。総菌数比でビブリオ・コレラＡＰＣＣ８４１１の２〜２０倍（生菌数比では１／２〜５倍）のビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４を添加した場合、ビブリオ・コレラＡＰＣＣ８４１１のＣａｃｏ−２細胞への付着を９８％以上阻害した（表４）。また、総菌数比でシゲラ・フレキスネルＢＦＲ３６２４の２〜２０倍（生菌数比では１／２〜５倍）のビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４を添加した場合、シゲラ・フレキスネルＢＦＲ３６２４のＣａｃｏ−２細胞への付着を９０．９％以上阻害した（表４）。

Ｃａｃｏ−２細胞に良好な付着性を示したビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４と付着性の低いビフィドバクテリウム・ブレベＭＥＰ１７５００４のエルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１のＣａｃｏ−２細胞への付着に与える影響を調べた。

その結果、総菌数比でエルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１の２〜２０倍（生菌数比では１〜１０倍）のビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４を添加した場合、エルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１のＣａｃｏ−２細胞への付着を９９．５％以上阻害した（表５）。付着性の低いビフィドバクテリウム・ブレベＭＥＰ１７５００４もエルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１菌に対して、高い付着阻害効果を示した（表５）。

ビフィズス菌の保温上清による病原菌に対する付着阻害機構を知るために、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４の保温上清の存在下でエルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１の固定化Ｃａｃｏ−２細胞への付着性を調べた。その結果を図１に示す。図１から明らかに、ビフィズス菌体の添加をしなくても、保温上清のみの添加でも、エルシニア菌の付着が強く阻害された。

つぎに化学処理による、ビフィズス菌保温上清の付着阻害活性への影響を調べた結果を図２に示す。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４の化学処理した保温上清存在下における、エルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１の固定化Ｃａｃｏ−２細胞への付着阻害活性は、図２の結果から分かるように、過ヨウ素酸処理では消失せず、熱処理、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理、ＰＭＳＦ処理によって消失した。
（Ｃａｃｏ−２細胞表層蛋白質に結合する上清中蛋白質の検出）

Ｃａｃｏ−２細胞表層蛋白質に結合するビフィズス菌保温上清あるいはエルシニア菌体由来蛋白質の検討は以下のように行った。ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４を１×１０^７個／ｍｌとなるように懸濁した液から得られた上清を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥粉末を元の上清量の１／１０００量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル緩衝液に溶解し、１００℃で５分間加熱し、ＳＤＳ化タンパク質溶液を得た。

Ｃａｃｏ−２細胞からの表層蛋白質の抽出には、２４穴マルチプレートで１５日間培養したＣａｃｏ−２細胞に１ウエルあたり１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル緩衝液を添加し、ピペッティングによってＣａｃｏ−２細胞をウエルから剥離後、１００℃で５分間加熱することにより、Ｃａｃｏ−２細胞表層蛋白質のＳＤＳ化溶液を得た。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４上清蛋白質のビオチン標識には、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４を１×１０^９個／ｍｌとなるようにＰＢＳ（ｐＨ８．０）に懸濁し、懸濁液１ｍｌあたり５μｌのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）を添加して室温で３０分間緩く振とうした。次いで、菌体を５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）およびＰＢＳで洗浄後、菌を蒸留水上に１×１０^７個／ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液を室温で２時間静置した後、０．２０μｍのメンブレンフィルターでろ過して菌体を除き、回収した上清を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末を元の上清量の１／２０量の０．５％ＢＳＡ−０．０５％ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で溶解した。

Ｃａｃｏ−２細胞表層蛋白質のビオチン標識は以下のように行った。２４穴マルチプレートで１５日間培養したＣａｃｏ−２細胞をＰＢＳで洗浄し、１ウエルあたり１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ８．０）を添加した。次いで５μｌのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）を添加して室温で３０分間緩く振とうした。細胞を５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）およびＰＢＳで洗浄後、１ウエルあたり１ｍｌの蒸留水を添加し、細胞を破裂させた。６ウエル分から回収したこのＣａｃｏ−２液に３０ｍｇのｏｃｔｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅを添加し、４℃で一夜振とうした。その後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞片を除き、上清を得た。次にアミコンセントリプラスー１０（日本ミリポア、分画分子量１０，０００）を用いて、上清から脱塩し蛋白質を回収した。さらにＰＢＳによる洗浄を繰り返した後、非透過液量が３ｍｌになるまで濃縮した。非透過液に等量の１．０％ＢＳＡ−０．１％ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ８．０）を混合し，Ｃａｃｏ−２細胞ビオチン標識蛋白溶液とした。

エルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１菌体のビオチン標識には、当該菌濃度が１×１０^９個／ｍｌとなるようにＰＢＳ（ｐＨ８．０）に懸濁し、懸濁液１ｍｌあたり５μｌのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）を添加して室温で３０分間緩く振とうした。次いで、菌体を５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）およびＰＢＳで洗浄後、菌を０．５％ＢＳＡ−０．０５％ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳに１×１０^９個／ｍｌとなるように懸濁した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４上清蛋白質およびＣａｃｏ−２表層蛋白質の分離およびＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）への転写は以下のように行った。上述のようにＳＤＳ化した各蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した同一試料を２レーンに負荷して電気泳動後、一方のレーンはクマーシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ、Ｆｌｕｋａ）で蛋白染色を行い、もう一方の蛋白質をホライズブロット（アトーＡＥ６６７５）を用いてＰＶＤＦ膜へ転写した。

ＰＶＤＦ膜上での結合試験は以下のように行った。ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４上清蛋白質あるいはＣａｃｏ−２細胞蛋白質を転写したＰＶＤＦ膜を２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）−ＰＢＳで２時間ブロッキングした。次いで、ビオチン標識ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４上清蛋白質、ビオチン標識エルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１菌体あるいはビオチン標識Ｃａｃｏ−２細胞表層蛋白質を添加し、２時間室温で緩く振とうした。処理後のＰＶＤＦ膜を０．０５％ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で洗浄後、ストレプトアビジン−ＰＯＤコンジュゲイト溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１０，０００倍希釈液）を添加して、室温で２時間緩く振とうした。０．０５％ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で洗浄した後、コニカイムノステインＨＲＰ−１０００（コニカミノルタエムジー）によって結合部位にバンドを発色させた。

その結果、Ｃａｃｏ−２細胞表層蛋白質はビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４上清中の６６ｋＤａの蛋白質に結合した。また、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４上清中のタンパク質およびエルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１はともに、Ｃａｃｏ−２細胞表層蛋白質の３１．４および３４．９ｋＤａの蛋白質に結合した。

以上の結果から、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４によるエルシニア・エンテロコリチカＩＩ Ｄ９８１のＣａｃｏ−２細胞への付着阻害機構として、６６ｋＤａ蛋白質によるＣａｃｏ−２細胞表層に存在する３１．４および３４．９ｋＤａの蛋白質へのエルシニア・エンテロコリチカＩＩＤ９８１菌体の付着の拮抗阻害が関与する可能性が推定される。

本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。
なお、本出願は、２００５年８月２４日付けで出願された日本特許出願（特願２００５−２４３１４８）に基づいており、その全体が引用により援用される。
また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

本発明のビフィズス菌及び／またはビフィズス菌処理物とそれを含有する食品・医薬品組成物により、感染症の原因となる大腸菌などの病原菌が腸上皮細胞などの動物細胞に付着することを効果的に阻害することが可能となり、本発明は感染症予防に多大な貢献をすることができる。

Claims (6)

1. 病原菌の動物細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌であって、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８からなる群から選ばれた少なくとも１つの菌株であるビフィズス菌。
2. 前記病原菌がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、シゲラ・フレキスネル（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）からなる群から選ばれた少なくとも１種の病原菌であることを特徴とする請求項１に記載のビフィズス菌。
3. ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＯＬＢ６３７８からなる群から選ばれた少なくとも１つの菌株のビフィズス菌に処理を施すことにより得られる病原菌の動物細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌処理物であって、該ビフィズス菌液を非増殖条件下で静置して得られる上清であるビフィズス菌処理物。
4. 前記病原菌がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、シゲラ・フレキスネル（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）からなる群から選ばれた少なくとも１種の病原菌であることを特徴とする請求項３に記載のビフィズス菌処理物。
5. 請求項１または２に記載のビフィズス菌、及び請求項３または４に記載のビフィズス菌処理物の少なくとも一つを有効成分として含み、病原菌の動物細胞への付着阻害能を有する食品・医薬品組成物。
6. 病原菌の動物細胞への付着阻害剤の製造のための、請求項１または２に記載のビフィズス菌、及び請求項３または４に記載のビフィズス菌処理物の少なくとも一つの使用。

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