WO2007023912A1 - 病原菌の細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌、その処理物及びそれを含有する食品・医薬品組成物 - Google Patents

病原菌の細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌、その処理物及びそれを含有する食品・医薬品組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2007023912A1
WO2007023912A1 PCT/JP2006/316639 JP2006316639W WO2007023912A1 WO 2007023912 A1 WO2007023912 A1 WO 2007023912A1 JP 2006316639 W JP2006316639 W JP 2006316639W WO 2007023912 A1 WO2007023912 A1 WO 2007023912A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bifidobacteria
adhesion
cells
bifidobacterium
bifidum
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/316639
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takahiro Toba
Yaeko Katakawa
Masako Yajima
Masaki Terahara
Original Assignee
Meiji Dairies Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Dairies Corporation filed Critical Meiji Dairies Corporation
Priority to JP2007532178A priority Critical patent/JP5006198B2/ja
Publication of WO2007023912A1 publication Critical patent/WO2007023912A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Bifidobacteria capable of inhibiting the adhesion of pathogenic bacteria to cells, processed products thereof, and food / pharmaceutical compositions containing the same
  • the present invention relates to a bifidobacteria having an effect of inhibiting adhesion of pathogenic bacteria (for example, coliform bacteria, salmonella bacteria, and erucinia bacteria) that cause infectious diseases to animal cells such as intestinal epithelial cells.
  • pathogenic bacteria for example, coliform bacteria, salmonella bacteria, and erucinia bacteria
  • Infectious diseases are caused by pathogenic bacteria that have invaded the human or animal body adhere to, establish or invade target cells, and then proliferate, resulting in tissue destruction and biological inflammation due to excreted toxins.
  • pathogenic bacteria that have invaded the human or animal body adhere to, establish or invade target cells, and then proliferate, resulting in tissue destruction and biological inflammation due to excreted toxins.
  • the primary causative agent of food-borne infections is Escherichia coli diarrhea.
  • Enterotoxigenic E. coli ETEC is also known as the causative agent of traveler's diarrhea, and pathogenic E. coli, EPEC, together with ETEC, infant diarrhea in developing countries.
  • pathogenic E. coli EPEC
  • cell invasive E. coli EIEC
  • Pathogenic E. coli 0157 which has been a major problem in recent years, is a porcine toxin-producing E. coli.
  • Salmonella is known as a diarrhea protozoan pathogen, but it is known that it invades into the living body from the intestinal epithelium and survives in monocytes and rod-shaped cells and is persistently infected.
  • the present inventors have developed a system for inhibiting the attachment of pathogenic Escherichia coli to cells, focusing on the fact that causative bacteria adhere to intestinal mucosal epithelial cells as an initial stage of infection establishment.
  • a peptide having the ability to inhibit the adhesion of ratatopherin hydrolyzate to some kind has been provided (Patent Document 1).
  • fucosyl oligosaccharide and sulfated fucosyl oligosaccharide having the same ability were provided (Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 10 a component produced by culturing bifidobacteria under normal growth conditions, and an inhibition rate of 70% or more can be obtained by culturing for 70 hours or more.
  • Non-Patent Document 12 especially Fig. 6-B.
  • Non-Patent Document 13 includes human-derived bifidum longong and bifidum infants, fresh isolates of bifidum brebe, Cato-2 cells and HT-29 cells, and enterotoxigenic Escherichia coli, Salmonella typhimurium, In addition, it has been shown to inhibit the adhesion of Yersinia's Shuduberculosis in a Bifidobacterium concentration-dependent manner (10 7 to 10 9 cfuZml).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 11 292789
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-226496
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 6-315373
  • Patent Document 4 Japanese Translation of Special Publication 2002-537865
  • Patent Document 5 Special Table 2002-537867
  • Non-patent document 1 Michetti et al., Digestion, 1999, 60th, p. 203-209
  • Non-Patent Document 2 Sakamoto et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2001, 47th pp. 709-710
  • Non-Patent Document 3 Shimizu et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002, Vol. 50, p. 611 -618
  • Non-Patent Document 4 Rolf e, Journal of Nutrition, 2000, No. 130, p. 3 96S-402S
  • Non-Patent Document 5 Reid et al., Microbes and Infection, 2002, IV, p. 319-324
  • Non-Patent Document 6 Saarela et al., International Journal of Food
  • Patent Document 7 Cocooner et al., Applied and Environmental Microbiology, 2000, Vol. 66, p. 1152-1157
  • Non-Patent Document 8 Todoroki et al., Journal of Applied Microbiology, 2001, 91st pp. 154-159
  • Non-Patent Document 9 Holier et al., Journal of Applied Microbiology, 2002, 92nd pp. 396-403
  • Non-Patent Document 10 Crociani et al., Letters in Applied Microbiology, 1995, 21st pp. 146-148
  • Non-Patent Document 11 Denore et al., Letters in Applied Microbiolgy, 2000, 31st, p. 438-442
  • Non-Patent Document 12 Fujiwara et al., Applied Environmental Microbiology, 1997, 63rd pp. 506-512
  • Non-Patent Document 13 Bernet et al., Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59th, p. 4121-4128
  • the problem to be solved by the present invention is to prevent pathogens such as Escherichia coli, Salmonella, Yersinia and the like that have entered the animal body from adhering to and fixing on animal cells by a simple means. To prevent the development of infectious diseases.
  • the present invention has been made in order to solve the above-described problems, and the present inventors have been isolated mainly from human feces using Caco-2 cells and HT-29 cells as intestinal epithelial cell models.
  • the bifidobacteria used in the survey generally have adhesion-inhibiting activity against pathogenic bacteria.
  • specific bifidobacteria have specific activity. We found that the ability of pathogens to inhibit cell adhesion was high.
  • the inventors have found that a component having the ability to inhibit cell adhesion of similar pathogenic bacteria can also be detected in the supernatant obtained when these bifidobacterial liquids are allowed to stand under non-growth conditions, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to a bifidobacteria having an ability to inhibit the adhesion of pathogenic bacteria to animal cells.
  • the present invention also relates to a treated product of bifidobacteria that is obtained by treating bifidobacteria and has an ability to inhibit the adhesion of pathogenic bacteria to animal cells.
  • the treated product is preferably a supernatant obtained by allowing Bifidobacterium to stand under non-growth conditions.
  • the present invention also relates to an adhesion inhibitor characterized by being obtained from the above supernatant.
  • the present invention relates to a food / pharmaceutical composition
  • a food / pharmaceutical composition comprising at least one of the above-mentioned bifidobacteria, a treated product of bifidobacteria, and an adhesion inhibitor as an active ingredient, and having an ability to inhibit the adhesion of pathogenic bacteria to animal cells.
  • the present invention relates to the use of at least one of the above-mentioned bifidobacteria, bifidobacteria-treated products, and adhesion-inhibiting factors for the production of an inhibitor for the adhesion of pathogenic bacteria to animal cells.
  • the bifidobacteria of the present invention is preferably at least one strain selected from the group consisting of bifidobatterium 'bifidum OLB6374 and bifidobatterium' bifidum OLB6378. Preferably there is.
  • the pathogens include Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Vibrio cholera, Vibrio var Vifirio. vulnificus), Yersinia enterocolitica, and Shigella flexneri. At least one selected pathogen.
  • Bifidopacterum bifidum such as Bifido Batterium 'Bifidum OLB6374, Bifid Batterium' Bifidum O LB6378, etc.
  • Bifidopacterum bifidum such as Bifido Batterium 'Bifidum OLB6374, Bifid Batterium' Bifidum O LB6378, etc.
  • FIG. 1 A bar graph showing the results of adhesion of erucia bacteria to cells in the presence of a warm supernatant of bifidobacteria.
  • FIG. 2 A bar graph showing the effect of chemical treatment on the adhesion inhibitory activity of the bifidobacteria incubation supernatant.
  • the bifidobacteria used in the present invention are not limited to these, but include, but are not limited to, bifidobacteria 'Bifidum, bifidobatterium' longum, bifidobatterium 'breve, bifidobacterium' infantises and bifido Batterium 'Catenuratum', Bifido Batterium 'Adrecent Scent, Bifidobacterium' Shudulongum, etc.
  • Bifido Batterium 'Bifidum OLB6374, Bifid Batterium' Bifidum OLB6378, Bifid Batterium 'Bifidum MEP175001, Bifid Bacteria' Bifidum MEP175002, Bifid Batterium 'Bifidum MEP175003 , Bifido nocterium 'Breve MEP175004, Bifid Batterium' Longham MEP175005 etc. are preferably used.
  • Bifidobatterium bibidam strains particularly preferred are Bifidobatterium bibidam strains, and Bifidobatterium bifidum OLB6374 and Bifidobatterium bifidum OLB6 378 are more preferred.
  • strains can be used alone or in combination of two or more.
  • Bifido Batterium 'Bifidum OLB6374 used in the present invention is deposited internationally under the following conditions.
  • Bifido Batterium 'Bifidum OLB6374 of the present invention was deposited at the Patent Microorganism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation on August 4, 2005, under the accession number NI TE P-123. International deposits have been transferred under the above conditions.
  • Bifidobatterium bifidum OLB6374 of the present invention has the following mycological properties.
  • Bifidobatterium 'Bifidum OLB6374 is a Gram-positive obligate anaerobic gonococcus, and the bacterium is a gonococcus or a branched polymorph and has no spore formation or motility.
  • BL agar medium (Eiken Equipment Co., Ltd.) Apply this bacterium on a flat plate and incubate at 37 ° C for 48 hours under anaerobic condition using AnaeroPack ⁇ Kenki (Mitsubishi Gas Chemical). A glossy colony is formed.
  • Bifido Batterium 'Bifidum OLB6378 used in the present invention is deposited internationally under the following conditions.
  • Bifido Batterium 'Bifidum OLB6378 of the present invention was deposited with the Patent Microorganism Depositary of the National Institute of Technology and Evaluation on October 26, 2004 under the deposit number NITE P-31. International deposits have been transferred under the above conditions.
  • Bifidobatterium bifidum OLB6378 of the present invention has the following mycological properties.
  • Bifido Batterium 'Bifidum OLB6378 is a Gram-positive obligate anaerobic gonococcus, and the bacterium is a gonococcus or a branched polymorph and has no spore formation or motility.
  • BL agar medium (Eiken Equipment Co., Ltd.) Apply this bacterium on a flat plate and incubate at 37 ° C for 48 hours under anaerobic condition using AnaeroPack ⁇ Kenki (Mitsubishi Gas Chemical). A glossy colony is formed.
  • strains with ATCC as the strain name were obtained from American Type Cell Culture Co., Ltd.
  • strains with JCM as the strain name were the RIKEN Bioresources Strains that also acquired the Center's Microbial Materials Development Office
  • strains with the name APCC are strains obtained with the Aomori Environmental Health Center
  • strains with the name CECT are Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (Valencia, (Spain)
  • the strain with the name IID is the strain obtained from the University of Tokyo Institute of Medical Science
  • Microbial Stock Preservation Facility Shigura 'Flexnel BFR3624 is a strain obtained from the National Institute of Infectious Diseases
  • Shigura' Flexinel 2457 ⁇ is a reference strain obtained from the National Institute of Infectious Diseases
  • strains with ⁇ in the strain name are owned by Meiji Dairies.
  • the “non-growth condition” in the present invention is a condition different from the condition for normal bacterial culture, that is, not a culture condition for the purpose of increasing the number of bacterial cells.
  • the present invention is not limited to this, for example, in an RPMI medium at room temperature, an aerobic incubation, Or in the same medium at 37 ° C, 5-10% CO
  • treated bifidobacteria exhibits the effect of the present invention.
  • treated bifidobacteria include the above-mentioned culture of bifidobacteria, concentrates thereof, pasted products processed into pastes, spray-dried products, freeze-dried products, vacuum-dried products, drum-dried products, and bacterial cells dispersed in a medium. Liquids obtained by dilution, dilutions diluted with a diluent, and crushed products obtained by crushing dried products with a mill or the like can be used.
  • the supernatant obtained when the bifidobacteria is allowed to stand under the non-proliferation conditions described above has the same ability to inhibit the adhesion of pathogenic bacteria. It can be preferably used.
  • the bifidobacteria and sputum or processed product thereof of the present invention can be orally administered as it is or after sterilization, as a processed product that is crushed or unground, either alone or as a mixture of a plurality of types.
  • the bifidobacteria of the present invention is not limited as long as it has the ability to inhibit the attachment of pathogenic bacteria to cells, and mutant strains are also included in the scope of the present invention.
  • mutations at this time include natural mutations, radiation, and artificial mutations due to chemical substances.
  • the bifidobacteria and cocoons or processed products thereof of the present invention may be live or dead, but are preferably live.
  • the food composition of the present invention can be applied to health functional foods and foods for the sick.
  • the functional health food system in Japan is intended for not only regular foods but also foods in the form of tablets, capsules, etc., taking into account internal and external trends and consistency with the conventional special health food system. It consists of two types: food for specified health use (individual permission type) and functional food for nutrition (standard type). Directly ingested as special-purpose foods such as foods for specified health use or foods with functional nutrition containing the bifidobacteria and koji or processed product thereof This will prevent and / or treat various infections.
  • various foods and drinks milk, soft drinks, fermented milk, yogurt, cheese, bread, biscuits, crackers, pizza crusts, prepared milk powder, liquid foods, diseases Food for infants, infant milk powder, foods for lactating women, nutritional foods, etc.
  • the active ingredient can be used as it is, or can be used in accordance with conventional methods in ordinary food compositions such as mixing with other foods or food ingredients.
  • the state of the food or drink usually used, for example, solid (powder, granule, etc.), paste, liquid or suspension may be used.
  • ingredients are not particularly limited, but foods and drinks containing the bifidobacteria of the present invention and Z or processed products thereof include water, proteins, carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, organic acids. Organic bases, fruit juices, flavors and the like can be used as main components.
  • proteins include whole milk powder, skim milk powder, partially skim milk powder, casein, whey powder, whey protein, whey protein concentrate, whey protein isolate, a-force zein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, j8- Lactoglobulin, ⁇ -lactalbumin, ratatopherin, soy protein, chicken egg protein, meat protein and other animal and vegetable proteins; hydrolysates thereof; butter, milk minerals, cream, whey, non-protein nitrogen, sialic acid, phosphorus
  • milk-derived components such as lipids and lactose.
  • Examples include sugars, modified starches (dextrin, soluble starch, pre-taste starch, oxidized starch, starch ester, starch ether, etc.), dietary fiber, and the like.
  • lipids include animal oils such as lard, fish oil, etc., fractionated oils, hydrogenated oil, transesterified oil, etc .; palm oil, safflower oil, corn oil, rapeseed oil, coconut oil, fractionated from these And vegetable oils such as oil, hydrogenated oil and transesterified oil.
  • vitamins for example, vitamin ⁇ , carotene, vitamin ⁇ group, vitamin C, vitamin D group, vitamin E, vitamin K group, vitamin P, vitamin Q, niacin, nicotinic acid, pantothenic acid, piotin, inositol , Choline, folic acid and the like
  • minerals include calcium, potassium, magnesium, sodium, copper, iron, manganese, zinc, selenium and the like.
  • organic acid include malic acid, citrate, lactic acid, and tartaric acid.
  • the dosage of the pharmaceutical composition comprising the bifidobacteria of the present invention and Z or a processed product thereof as an active ingredient takes into consideration various factors such as the route of administration, the age, weight, and symptoms of animals to be administered including humans. And it can set suitably.
  • this invention is not limited to this, Preferably, 1-: LOOOmgZkgZday is suitable as an active ingredient.
  • the amount when ingested for the purpose of prevention and Z or treatment for a long period of time, the amount may be smaller than the above range, and the active ingredient has no safety problem. Even if it is used in a larger amount, there is no problem.
  • composition of the present invention can be administered in a plurality of divided doses, not once.
  • composition containing Bifidobacterium and Z or a processed product thereof of the present invention can be administered either by oral administration or parenteral administration (intramuscular, subcutaneous, intravenous, suppository, transdermal, etc.).
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition according to the present invention include oral administration such as tablets, coated tablets, capsules, granules, powders, solutions, syrups, and emulsions.
  • oral administration such as tablets, coated tablets, capsules, granules, powders, solutions, syrups, and emulsions.
  • These various preparations are prepared by adding the excipient, binder, disintegrant, lubricant, coloring agent, flavoring agent, solubilizing agent, suspension agent, etc. to the microbial cells and Z of the present invention or treated product according to a conventional method. It can be formulated using known adjuvants that can be usually used in the pharmaceutical preparation technical field such as pharmaceuticals and coating agents.
  • the amount of the bifidobacteria and Z or treated product thereof of the present invention can be arbitrarily determined according to the purpose and use (pharmaceutical composition such as food yarn and composition, preventive agent, therapeutic agent, etc.) Although the present invention is not limited to this, the content is usually preferably 0.001 to 100% (w Zw), particularly preferably 0.1 to 100% (WZW) based on the total amount.
  • the subject of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal including a human, but is preferably a human.
  • animal cells include cultured cells, epithelial cells such as intestine, oral cavity, trachea, organ cells and the like.
  • the pathogen that is the target of adhesion inhibition is not limited to this. , Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Yresinia enterocolitic, Yersinia enterocolitica (Shigella flexneri) and the like.
  • Tables 1 and 2 show the bifidobacterial strains and pathogenic strains used in this example.
  • the Bifidobacteria strain was anaerobically cultured (Mitsubishi Gas Chemical, AnaeroPack) at 37 ° C for 48 hours on a GAM agar plate (Nissui Pharmaceutical) according to a conventional method.
  • Vibrio and Elsica strains were aerobically cultured at 30 ° C for 16 hours on a heart-incubation agar medium (Nissui Pharmaceutical) supplemented with 1.5% sodium chloride.
  • the Escherichia coli strain was aerobically cultured at 37 ° C for 16 hours on a CFA agar medium.
  • Other strains were aerobically cultured at 37 ° C. for 16 hours on a heart-inhibition agar medium (Nissui Pharmaceutical). Each bacterium was collected from the plate and washed 3 times with PBS.
  • Caco-2 cells or fixed Caco-2 cells were used for the adhesion test.
  • Fixed ⁇ Ca. 0-2 cells refer to cells fixed with methanol for 14-15 days.
  • Caco-2 cells (RCB0988) were also obtained from RIKEN Cell Development Bank and subcultured with Minimum Essential Medium Eagle (Sigma) containing 20% urine fetal serum and 1% non-essential amino acids.
  • the cells after washing with PBS were suspended in RPMI-1640 medium (containing Sigma, 25 mM HEPES and sodium hydrogen carbonate) to 1.0 x 10 9 / ml with 1% non-essential amino acid. .
  • Cultured cells were removed 30 minutes before the start of the adhesion test, washed twice with Hank's balanced salt solution, and RPMI-1640 medium supplemented with 1% non-essential amino acid was added. After removing this medium, 1 ml of the bacterial suspension was added to the cultured cells and cultured in a carbon dioxide incubator for 2 hours at 37 ° C. After completion of the cultivation, non-adherent cells were removed by washing 3 times with PBS.
  • RPMI— 1640 medium (Sigma, 25 mM HEPES and sodium bicarbonate) for bifidobacteria 1. OX lo ml, 5.0 X 10 8 / ml And 1. OX loVml, in the case of pathogenic bacteria 5. Suspended to become OX 10 8 / ml. For cultured cells, 30 minutes before the start of the adhesion test, the medium was removed, washed twice with Hank's balanced salt solution, and RPMI-1640 medium supplemented with 1% non-essential amino acid was added.
  • Bifidobacterium suspension 9001 was added to the cultured cells and cultured in a carbon dioxide incubator for 1 hour at 37 ° C. To this, 100 1 of pathogen suspension was added, followed by further incubation for 1 hour. Non-adherent cells were removed by washing 3 times with PBS. Then 1 ml of distilled water was added to the well. The cultured cells were ruptured by pipetting. The solution in the well was serially diluted, and the diluted solution 1001 was smeared on the agar medium described in 1 and cultured under the culture conditions described in 1.
  • the incubation supernatant 900 / zl and the pathogen suspension 1001 were added, and then cultured in a carbon dioxide incubator for 1 hour at 37 ° C.
  • the number of pathogenic bacteria attached was counted by the method described above.
  • Bifidobacterium incubation supernatant is 37 ° C for 2 hours with protease (lmgZml) (Merck proteinase K) or 37 ° C for 2 hours with 0.005% PMSF, heat treatment is 100 ° C for 5 minutes, 1 OOmM periodate Acid treatment with periodic acid at 37 ° C for 1 hour in the dark, after each treatment, C aco— Adhesion test to 2 cells was performed. In the adhesion test, fixed Caco-2 cells were used, and the number of adhering bacteria was counted under a microscope after Gram staining.
  • Bifido / Cterium Bifidum OLB6374 15 (9.1 x 10 s )
  • the total number of added bacteria is 1 X 10 9 Zwell (cfu 7.9 X 10 5 ⁇ 4.1 X 10 8 Weru)
  • Adhesion rate number of adherents / number of added bacteria X 100
  • bifidobatterium bifidum OLB6374 is added to Shigella Flexinel BFR3624 2 to 20 times the total bacteria ratio (1Z2 to 5 times the live bacteria ratio), it is transferred to Caco 2 cells of Shigella Flexinel BFR3624. Was inhibited by more than 90.9% (Table 4).
  • Bifidobatterum bifidum OLB6374 which showed good adhesion to Caco 2 cells, and low-adhesive Bifidobatterum breve MEP175004 Yersinia enterocolitica IID981 to Caco-2 cells The effect on adhesion was investigated.
  • Fig. 2 shows the results of examining the effect of the chemical treatment on the adhesion inhibitory activity of the Bifidobacterium-incubated supernatant.
  • Bifidobacteria incubated supernatant that binds to Caco-2 cell surface protein! / was examined for proteins derived from Yersinia cells as follows.
  • the supernatant obtained by suspending bihuidbatterium 'Bifidum OLB6374 at 1 X 10 7 cells / ml was freeze-dried.
  • the obtained freeze-dried powder was dissolved in an SDS-PAGE sample buffer of 1/1000 volume of the original supernatant volume and heated at 100 ° C. for 5 minutes to obtain an SDS-modified protein solution.
  • the Bifido Batterium Bifidum OLB6374 was suspended in PBS (pH 8.0) at 1 ⁇ 10 9 cells / ml, and the suspension was suspended. 5 ⁇ l per ml of sulfo-NHS-biotin (Pierce) solution (25 mg / ml) was added and shaken gently at room temperature for 30 minutes.
  • the cells were washed with 50 mM Tris-HC1 buffer (pH 8.0) and PBS, and the cells were suspended in distilled water so that the concentration was IX 10 7 cells / ml.
  • the suspension was allowed to stand at room temperature for 2 hours, filtered through a 0.20 m membrane filter to remove the cells, and the collected supernatant was lyophilized.
  • the lyophilized powder was dissolved in 1/20 of 0.5% BSA-0.05% tween 20-PBS (pH 8.0) of the original supernatant.
  • Piotin labeling of Caco-2 cell surface protein was performed as follows. Caco-2 cells cultured for 15 days in a 24-well multiplate were washed with PBS, and 1 ml of PBS (pH 8.0) per well Added. Subsequently, 5 ⁇ l of sulfo-NHS-biotin (Pierce) solution (25 mg / ml) was added and shaken gently at room temperature for 30 minutes. After washing the cells with 50 mM Tris-HC1 buffer (pH 8.0) and PBS, 1 ml of distilled water was added per well to rupture the cells.
  • the binding test on the PVDF membrane was performed as follows. PVDF membrane transcribed with bifidobatterium 'Bifidum OL B6374 supernatant protein or Caco-2 cell protein was blocked with 2% BSA (Sigma) -PBS for 2 hours. Next, add piotin-labeled bifidobatterium bifium OLB6374 supernatant protein, piotin-labeled ercian enterocortica IID981 or piotin-labeled Caco-2 cell surface protein, and loosen for 2 hours at room temperature. Shake.
  • the treated PVDF membrane is washed with 0.05% tween 20-PBS (pH 8.0), and then added with streptavidin-POD conjugate solution (Roche Diagnostics, 10,000-fold diluted solution) for 2 hours at room temperature. Shake gently. After washing with 0.05% tween 20-PBS (pH 8.0), co-immunostin HRP- A band was developed at the binding site by 1000 (Co-force Minolta).
  • the Caco-2 cell surface protein bound to the 66 kDa protein in the supernatant of Bifidobacterium bifidum OLB6374.
  • pathogenic bacteria such as Escherichia coli causing infectious diseases adhere to animal cells such as intestinal epithelial cells. This can be effectively inhibited, and the present invention can greatly contribute to the prevention of infectious diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

　本発明は、感染症の原因となる大腸菌などの病原菌が腸上皮細胞などの動物細胞に付着することを効果的に阻害するビフィズス菌、そのビフィズス菌に特定の処理を施すことにより得られるビフィズス菌処理物、およびそのビフィズス菌及び／又はビフィズス菌処理物を有効成分として含む食品・医薬品組成物に関する。

Description

明 細 書
病原菌の細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌、その処理物及びそ れを含有する食品 ·医薬品組成物
技術分野
[0001] 本発明は、感染症の原因となる病原菌 (例えば、大腸菌群細菌、サルモネラ菌、ェ ルシニア菌など)の腸上皮細胞などの動物細胞への付着を阻害する効果を有するビ フィズス菌とその処理物及び当該ビフィズス菌を含有する食品 ·医薬品組成物に関 する。
背景技術
[0002] 感染症は、ヒトあるいは動物の体に侵入した病原菌が標的となる細胞に付着 ·定着 もしくは侵入し、その後増殖することで引き起こされ、組織の破壊や、排出された毒素 による生体炎症を伴う。
例えば、食水系感染症 (食中毒)の主要な原因菌に下痢原生大腸菌がある。毒素 原性大腸菌（enterotoxigenic E. coli, ETEC)は旅行者下痢症の原因菌とし ても知られ、病原性大腸菌（enteropathogenic E. coli, EPEC)は ETECと共 に、発展途上国における乳幼児下痢症の原因菌として知られている。また、細胞侵 入性大腸菌（enteroinvasive E. coli, EIEC)は赤痢菌と同様の病原性をもつ 。近年大きな問題となっている、病原性大腸菌 0157はべ口毒素産生性大腸菌であ る。また例えばサルモネラは下痢原生病原菌として知られているが、腸上皮から生体 内に侵入し、単球ゃ榭状細胞内に生残して持続感染することが知られている。
[0003] 本発明者らは、感染成立の初期段階として原因菌が腸粘膜上皮細胞に付着するこ とが不可欠である点に着目し、病原性大腸菌の細胞への付着阻害システムの開発を 行い、ある種のラタトフエリン加水分解物力 付着阻害能を有するペプチドを提供し た (特許文献 1)。また、同様の能力を有するフコシルオリゴ糖および硫酸ィ匕フコシル オリゴ糖を提供した (特許文献 2)。
[0004] 一方、乳酸菌の腸管感染症に対する効果に関しては 、くつかの文献にお!、てその 効果を確認する報告がある。例えば、ヘリコバクタ一'ピロリ菌（Helicobacter pylor i)の胃からの除菌に対して、ラクトバチルス'ガセリ（Lactobacillus gasseri) OLL 2716菌株（LG21)およびラクトバチルス ·ジョンソ - (Lactobacillus johnsonii) La 1菌株で効果のあることが、臨床的に確認されている（非特許文献 1、非特許文献 2、 非特許文献 3)。
[0005] また、下痢症に関しては、旅行者下痢症、抗生物質下痢症やロタウィルス下痢症な どに対して臨床試験で乳酸菌の予防治療効果力 ^、くらかは認められている（非特許 文献 4、非特許文献 5、非特許文献 6)。しかし、臨床的に明瞭な効果が確認された 報告は未だ成されて!/ヽな ヽ。
[0006] 一方、腸管上皮細胞モデルを用いて、付着性の高!ヽラタトバチルス (Lactobacilli! s)菌株をスクリーニングし、選抜された菌株を用いて病原菌の付着が阻害できたとす る報告は多く見られる (例えば非特許文献 7、非特許文献 8、非特許文献 9、特許文 献 3、特許文献 4、特許文献 5)。
[0007] 一方、ビフイドバタテリゥム（Bifidobacterium)菌株の腸管上皮細胞モデルへの付 着性を調べた報告はいくつ力なされている (例えば、非特許文献 10、非特許文献 11 ) oしかし、開示されている菌株の付着阻害性については、ビフィズス菌を通常の増 殖条件にて培養することによって産生される成分であり、 70時間以上培養することに より 70%以上の阻害率を得ることができると報告されている（例えば、非特許文献 12 、特に図 6— B)。
更に、非特許文献 13には、ヒト由来のビフィダム'ロンガムやビフィダム'インファン テイス、ビフィダム'ブレベの新鮮分離株力 Caco— 2細胞や HT—29細胞への毒素 原性大腸菌、サルモネラ'チフィムリウム、及びエルシニア'シユードゥベルキュロシス の接着をビフィズス菌の濃度依存性（107〜109cfuZml)に阻害することが示されて いる。
[0008] 特許文献 1 :特開平 11 292789号公報
特許文献 2：特開 2002 - 226496号公報
特許文献 3：特開平 6— 315373号公報
特許文献 4：特表 2002— 537865号公報
特許文献 5：特表 2002— 537867号公報 非特許文献 1 :ミケッティ等（Michetti et al. ) , Digestion, 1999年，第 60卷， p. 203- 209
非特許文献 2 :サカモト等， Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2001 年，第 47卷， p. 709- 710
非特許文献 3 :シミズ等， Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002年， 第 50卷， p. 611 -618
非特許文献 4:ロルフェ（Rolf e) , Journal of Nutrition, 2000年，第 130卷， p. 3 96S-402S
非特許文献 5：レイド等（Reid et al. ) , Microbes and Infection, 2002年，第 4卷， p. 319- 324
非特許文献 6 :サーレラ等（Saarela et al. ) , International Journal of Food
Microbiology, 2002年，第 78卷， p. 99— 117
特許文献 7 :ココ-エーノレ等 (Coconnier et al. ) , Applied and Environme ntal Microbiology, 2000年，第 66卷， p. 1152—1157
非特許文献 8 :トドロキ等、 Journal of Applied Microbiology, 2001年，第 91卷 , p. 154- 159
非特許文献 9 :ホリエ等、 Journal of Applied Microbiology, 2002年，第 92卷 , p. 396-403
非特許文献 10 :クロシア-等（Crociani et al. ) , Letters in Applied Microbi ology, 1995年，第 21卷， p. 146— 148
非特許文献 11 :デノレ 'レ等（Del Re et al. ) , Letters in Applied Microbiol ogy, 2000年，第 31卷， p. 438—442
非特許文献 12 :フジワラ等、 Applied Enviromental Microbiology, 1997年，第 63卷， p. 506- 512
非特許文献 13 :バーネット等（Bernet et al. ) , Applied and Environmental Microbiology, 1993年，第 59卷， p. 4121—4128
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0009] 即ち、本発明が解決しょうとする課題は、動物体内に侵入した大腸菌、サルモネラ 菌、エルシニア菌などを初めとする病原菌が、動物細胞に付着'定着することを簡便 な手段で阻害して、感染症の発症を予防することである。
[0010] 本発明は、上記した課題を解決するためになされたものであり、本発明者等は腸管 上皮細胞モデルとして Caco— 2細胞および HT— 29細胞を用いて、主としてヒト糞便 から分離されたビフィズス菌株について付着性の評価と病原菌に対する付着阻害活 性を調べたところ、調査に用いたビフィズス菌は概ね病原菌の付着阻害活性を有し ており、その中でもある特定のビフィズス菌において、特異的に病原菌の細胞付着阻 害能が高いことを見出した。また、これらのビフィズス菌液を非増殖条件で静置したと きに得られる上清中にも同様の病原菌の細胞付着阻害能を有する成分が検出され ることを見出し、本発明を完成した。
課題を解決するための手段
[0011] 即ち、本発明は、病原菌の動物細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌に関す る。
[0012] また、本発明はビフィズス菌に処理を施すことにより得られる、病原菌の動物細胞へ の付着阻害能を有するビフィズス菌処理物に関する。
[0013] 本発明にお 、ては、前記処理物はビフィズス菌を非増殖条件下で静置して得られ る上清であることが好まし 、。
[0014] また、本発明は、上記の上清より得られることを特徴とする付着阻害因子に関する。
[0015] また、本発明は、上記のビフィズス菌、ビフィズス菌処理物、及び付着阻害因子の 少なくとも一つを有効成分として含み、病原菌の動物細胞への付着阻害能を有する 食品 ·医薬品組成物に関する。
[0016] さらに、本発明は、病原菌の動物細胞への付着阻害剤の製造のための、上記のビ フィズス菌、ビフィズス菌処理物、及び付着阻害因子の少なくとも一つの使用に関す る。
[0017] 本発明のビフィズス菌としては、ビフイドバタテリゥム'ビフィダムが好ましぐ特にビフ イドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378か らなる群力も選ばれた少なくとも 1つの菌株であることが好ましい。 [0018] 本発明にお!/、ては、前記病原菌としてはェシエリキア 'コリ（Escherichia coli)、サ ルモネラ 'チフィムリウム（Salmonella Typhimurium)、ビブリオ'コレラ（Vibrio c holerae)、ビブリオ'バル-フィカス（Vibrio vulnificus)、エルシ-ァ 'ェンテロコリ チカ（Yersinia enterocolitica)、シゲラ ·フレキスネノレ (Shigella flexneri)からな る群力 選ばれた少なくとも 1種の病原菌があげられる。
発明の効果
[0019] 本発明のビフィズス菌及び Zまたはビフィズス菌処理物とそれを含有する食品 ·医 薬品組成物により、感染症の原因となる大腸菌などの病原菌が腸上皮細胞などの動 物細胞に付着することを効果的に阻害する。
特に、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム O LB6378等のビフイドパクテリゥム'ビフィダムを用いた場合、非常に高い割合で病原 菌が細胞へ付着することを阻害でき、その予防効果は絶大であることが分力つた。 図面の簡単な説明
[0020] [図 1]ビフィズス菌の保温上清の存在下におけるエルシ-ァ菌の細胞への付着性の 結果を示す棒グラフ。
[図 2]化学処理による、ビフィズス菌保温上清の付着阻害活性への影響を示す棒ダラ フ。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定さ れない。
[0022] 本発明で用いるビフィズス菌としては、これらに限定されないが、ビフイドバクテリウ ム'ビフィダム、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム、ビフイドバタテリゥム 'ブレベ、ビフイドバ クテリゥム 'インファンテイス、ビフイドバタテリゥム'カテヌラータム、ビフイドバタテリゥム 'アドレツセンテイス、ビフイドバクテリウム'シユードロンガム等が挙げられる。
具体的には、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374、ビフイドバタテリゥム 'ビフ ィダム OLB6378、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム MEP175001、ビフイドバクテリウ ム'ビフィダム MEP175002、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム MEP175003、ビフイド ノ クテリゥム'ブレべ MEP175004、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム MEP175005など が挙げられ、好ましく用いられる。
この中で、特に好ましくはビフイドバタテリゥム 'ビフイダム菌株であり、さらに好ましく はビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB6374、ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB6 378である。
これらの菌株については、単独あるいは 2つ以上を組み合わせて使用することがで きる。
[0023] 本発明で用いるビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374は下記の条件で国際寄 託されている。
(1) 寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センタ
(2) 連絡先： 292— 0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8
(3) 受託番号： NITE BP— 123
(4) 識別のための表示： Bifidobacterium bifidum OLB 6374
(5) 寄託日： 2006年 8月 9日
なお、本発明のビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374は、 2005年 8月 4日付け にて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号 NI TE P— 123にて寄託され、その後、上記の条件で国際寄託移管されている。
[0024] 本発明のビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB6374は、以下の菌学的性質を有す るものである。
[0025] ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374は、グラム陽性偏性嫌気性桿菌であり、 菌形状は桿菌または分岐状の多形であり、芽胞の形成、運動性はない。 BL寒天培 地 (栄研器材製)平板上で本菌を塗布し、 AnaeroPack ·ケンキ（三菱ガス化学製)使 用による嫌気状態にて 37°C、 48時間培養すると、不透明な円形半球状の光沢を有 するコロニーを形成する。
[0026] 本発明で用いるビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378は下記の条件で国際寄 託されている。
(1) 寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センタ (2) 連絡先： 292— 0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8
(3) 受託番号： NITE BP— 31
(4) 識別のための表示： Bifidobacterium bifidum OLB 6378
(5) 寄託日： 2006年 1月 18日
なお、本発明のビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378は、 2004年 10月 26日 付けにて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番 号 NITE P— 31にて寄託され、その後、上記の条件で国際寄託移管されている。
[0027] 本発明のビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB6378は、以下の菌学的性質を有す るものである。
[0028] ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378は、グラム陽性偏性嫌気性桿菌であり、 菌形状は桿菌または分岐状の多形であり、芽胞の形成、運動性はない。 BL寒天培 地 (栄研器材製)平板上で本菌を塗布し、 AnaeroPack ·ケンキ（三菱ガス化学製)使 用による嫌気状態にて 37°C、 48時間培養すると、不透明な円形半球状の光沢を有 するコロニーを形成する。
[0029] その他の株のうち、菌株名に ATCCと記載された菌株はアメリカンタイプセルカル チヤ一力 入手した株、菌株名に JCMと記載された菌株は独立行政法人理ィ匕学研 究所バイオリソースセンターの微生物材料開発室力も入手した株、菌株名に APCC と記載された菌株は青森県環境保健センター力 入手した株、菌株名に CECTと記 載された菌株は Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (バレンシア、スペイン )から入手した株、菌株名に IIDと記載された菌株は東京大学医科学研究所微生物 株保存施設カゝら入手した株、シグラ'フレキスネル BFR3624は国立感染研究所より 入手した株、シグラ'フレキスネル 2457τは国立感染研究所より入手した基準株、お よび菌株名に ΜΕΡと記載された菌株は明治乳業株式会社保有菌株である。
[0030] 本発明のビフィズス菌液を非増殖条件下に保温すると病原菌の動物細胞への付着 阻害能
を有する成分が培地中に検出される。本発明でいう「非増殖条件」とは通常の菌培養 のための条件とは異なる条件であり、すなわち菌体を増やす目的の培養条件ではな い。本発明はこれに限定されないが、例えば、 RPMI培地中、室温にて、好気保温、 あるいは同培地で 37°C、 5〜10%CO · 90〜95%Ο条件下で、 10時間以下、好ま
2 2
しくは 5時間以下保温する条件が挙げられる。
[0031] これらのビフィズス菌体を含む処理物であっても本発明の効果を呈する。ビフィズス 菌処理物としては、例えば、上記ビフィズス菌の培養物、その濃縮物、ペースト状に 加工したペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、菌体 を媒体に分散させた液状物、希釈剤で希釈した希釈物、乾燥物をミルなどで破砕し た破砕物などを用いることが出来る。
[0032] また特に、本発明におけるビフィズス菌処理物としては、上記ビフィズス菌を前記し た非増殖条件下で静置したときに得られる上清が、同様の病原菌付着阻害能を有す るために、好ましく用いることが出来る。
[0033] ここで、上記の上清に凍結乾燥などの処理を行うことにより、タンパク質やペプチド を病原菌の動物細胞への付着阻害作用を有する付着阻害因子として得ることが可 能である。なお、上記の付着阻害因子を得る方法としては、タンパク質やペプチドを 分離して回収するための常法を全て適用することが可能である。
[0034] 本発明のビフィズス菌及び Ζ又はその処理物は、そのまま、または殺菌後、破砕あ るいは未粉砕した処理物として、単独または複数種の混合物として経口投与すること ができる。
本発明のビフィズス菌は、病原菌の細胞への付着阻害能を有する限り限定されず、 変異株も本発明の範囲に包含される。この際の変異としては自然変異、放射線、化 学物質等による人為的変異等が挙げられる。
本発明のビフィズス菌及び Ζ又はその処理物は、生菌であっても死菌であってもよ いが、好ましくは生菌である。
[0035] さらに本発明の食品組成物は、保健機能食品や病者用食品にも適用することがで きる。 日本における保健機能食品制度は、内外の動向、従来力もの特定保健用食品 制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした 食品を対象として設けられたもので、特定保健用食品 (個別許可型)と栄養機能食品 (規格基準型）の 2種類の類型からなる。本発明のビフィズス菌及び Ζ又はその処理 物を含有する特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取 することにより各種の感染に対する予防および zまたは治療が可能となる。
[0036] 具体的には、食品組成物として使用する場合には、各種飲食品（牛乳、清涼飲料、 発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳 、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等）に ビフィズス菌及び zまたはビフィズス菌処理物を添カ卩し、これを摂取してもよい。本有 効成分をそのまま使用したり、他の食品ないし食品成分と混合するなど、通常の食品 組成物における常法にしたがって使用できる。また、その性状についても、通常用い られる飲食品の状態、例えば、固体状 (粉末、顆粒状等)、ペースト状、液状ないし懸 濁状のいずれでもよい。
[0037] その他の成分についても特に限定されないが、本発明のビフィズス菌及び Z又は その処理物を含有する飲食物には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラ ル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができ る。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホェ ィ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、 a—力 ゼイン、 β—カゼイン、 κ—カゼイン、 j8—ラクトグロブリン、 α—ラクトアルブミン、ラタ トフエリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、 これら加水分解物;バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シァ ル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。糖類、加工澱粉 (デキ ストリン、可溶性澱粉、プリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテ ル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの 分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂;パーム油、サフラワー油、コ ーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物 性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミン Α、カロチン類、ビタミ ン Β群、ビタミン C、ビタミン D群、ビタミン E、ビタミン K群、ビタミン P、ビタミン Q、ナイ ァシン、ニコチン酸、パントテン酸、ピオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げら れ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、 鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、ク ェン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、 2種以上を組み合わせて 使用することができ、合成品及び z又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。
[0038] 本発明のビフィズス菌及び Z又はその処理物を有効成分とする医薬組成物の投与 量は、投与経路、ヒトを含む投与対象動物の年齢、体重、症状など、種々の要因を考 慮して、適宜設定することができる。本発明はこれに限定されないが、好ましくは、有 効成分として 1〜： LOOOmgZkgZdayが適当である。しかしながら、長期間に亘つて 予防及び Z又は治療の目的で摂取する場合には、上記範囲よりも少量であってもよ いし、また、本有効成分は、安全性について問題がないので、上記範囲よりも多量に 使用しても一向にさしつかえない。
なお、本発明の医薬組成物は、一日の投与量を 1度ではなぐ複数回に分けて投 与することも可能である。
また、本発明のビフィズス菌及び Z又はその処理物を含有する医薬組成物は、経 口投与又は非経口投与 (筋肉内、皮下、静脈内、坐薬、経皮等)のいずれでも投与 できる。
[0039] 本発明による医薬組成物の投与形態としては、例えば錠剤、被覆錠剤、カプセル 剤、顆粒剤、散剤、溶液、シロップ剤、乳液等による経口投与をあげることができる。 これらの各種製剤は、常法に従って主薬である本発明の菌体および Zまたは処理物 に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、 コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を 用いて製剤化することができる。
[0040] 本発明のビフィズス菌及び Z又はその処理物の量は、その目的、用途 (食品糸且成 物、予防剤、治療剤等の医薬品組成物）に応じて任意に定めることができ、本発明は これに限定されないがその含量としては、全体量に対して通常、 0. 001-100% (w Zw)、特に 0. 1〜100% (WZW)が好ましい。
また、本発明の医薬組成物の投与対象は、ヒトを含む哺乳動物であれば特に限定 されないが、好ましくはヒトである。
[0041] 本発明において、「動物細胞」とは培養細胞や腸、口腔内、気管などの上皮細胞、 臓器の細胞などが挙げられる。
[0042] 本発明において、付着阻害の対象となる病原菌としては、これには限定されないが 、ェシエリキア'コリ（Escherichia coli)、サルモネラ 'チフィムリウム（Salmonella T yphimurium)、ビブリオ ·コレラ（Vibrio cholerae)、ビブリオ'バノレ-フィカス（Vibr io vulnificus)、エノレシ-ァ 'ェンテロコリチカ (Yersinia enterocolitica)、シグラ •フレキスネル（Shigella flexneri)等が挙げられる。
実施例
[0043] 以下、本発明に関し実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらにより限定される ものではない。
[0044] 本実施例で用いたビフィズス菌株および病原菌株を表 1及び表 2に示す。
[0045] [表 1]
ビフィズス菌種 菌株番号
ビフイド/くクテリウ厶 ロンガム MEP175005
ビフイド/くクテリゥム'ビフィダム MEP175001
ビフイド/くクテリウ厶'ビフィダム MEP175002
ビフイドバクテリウム'ビフィダム OLB6374
ビフイドパ^テリゥ厶'ビフィダム OLB6378
ビフイドパ、クテリウ厶'ビフィダム MEP175003
ビフイドバクテリウム'ブレべ MEP175004
ビフイドバクテリウム'インファンテイス MEP175006
ビフイドバクテリウム'インファンテイス MEP175007
[0046] [表 2] 病原菌 菌株番号
ェシェリキア · コリ ATCC 3 1 7 0 5 サルモネラ · チフィムリウム JCM 1 6 5 2
ビブリオ ' コレラ APCC 8 4 1 1 ビブリォ ·ノくノレニフィカス CECT 5 1 6 8 エルシニア ·ェンテロコリチカ I1D 9 8 1
シゲラ · フレキスネル BFR 3 6 2 4
シゲラ · フレキスネノレ 2 4 5 7 T
[0047] (使用した菌株の培養) ビフィズス菌株は常法に基づき GAM寒天平板（日水製薬)上で 37°C48時間、嫌 気培養（三菱ガス化学、 AnaeroPack)した。病原菌のうち、ビブリオ菌株及びエルシ -ァ菌株は 1. 5%の食塩を添カ卩したハートインヒユージョン寒天培地（日水製薬）上 で 30°C、 16時間好気培養した。ェシエリキア'コリ菌株は CFA寒天培地上で 37°C、 16時間好気培養した。他の菌株は、ハートインヒユージョン寒天培地（日水製薬)上 で 37°C、 16時間好気培養した。平板からそれぞれの菌を回収後、 PBSで 3回洗浄し た。
[0048] (付着試験）
付着試験には Caco— 2細胞または固定ィ匕した Caco— 2細胞を用いた。固定ィ匕 Ca 。0— 2細胞とは14〜15日間培養した細胞をメタノールで固定した細胞を指している 。 Caco— 2細胞 (RCB0988)は理研細胞開発銀行力も入手し、 20%ゥシ胎児血清 と 1%非必須アミノ酸を含む Minimum Essential Medium Eagle (シグマ社）で 継代培養した。
[0049] 付着試験には 20%ゥシ胎児血清と 1%非必須アミノ酸を含む Dulbecco' s Modif ied Eagle， s Medium (D - MEM、シグマ社）で 14〜 15日間培養した細胞を用 いた。いずれの培地にも、抗生物質（2. 5 gZmlアンフォテリシン B、 lOO ^ g/ml ストレプトマイシン、 100U/mlペニシリン）を添カ卩して培養した。培養は 37°Cとした 5 %炭酸ガス培養器中で行ない、培地の交換は 2日に一度行なった。付着試験用の 細胞は 24穴マルチプレートで培養した。一部試験では細胞をマルチプレート中に置 いた円形カバーガラス上に生育させ、グラム染色あるいはギムザ染色後、顕微鏡下 で付着菌数を計数した。
[0050] PBSで洗浄後の菌体を非必須アミノ酸 1%添加 RPMI— 1640培地（シグマ社、 25 mM HEPES及び炭酸水素ナトリウム含有）に 1. 0 X 109/mlとなるように懸濁した 。培養細胞は付着試験開始 30分前に、培地を除去し、 Hank' s平衡塩溶液で 2回洗 浄後、非必須アミノ酸 1%添加 RPMI— 1640培地を添加した。この培地を除去後、 培養細胞に菌懸濁液 lmlを添加して炭酸ガス培養器中で 37°C2時間培養した。培 養終了後、付着していない菌体を PBSで 3回洗浄することにより除去した。付着菌数 を生菌数として求めるために、細胞に lmlの蒸留水を添加し、ピペッティングにより培 養細胞を破裂させた。ゥエル中の液を段階希釈し、希釈液 100 1を 1で述べた寒天 培地に塗抹後、 1で述べた培養条件で培養した。各菌株の付着試験には 1回につき 3ゥエルを用いた。試験は異なる実験日に 2〜3回実施して、再現性を確認した。
[0051] (付着阻害試験）
PBSで洗浄後の菌体を非必須アミノ酸 1%添加 RPMI— 1640培地（シグマ社、 25 mM HEPES及び炭酸水素ナトリウム含有）にビフィズス菌の場合 1. OX lo ml, 5. 0 X 108/mlおよび 1. OX loVml,病原菌の場合 5. O X 108/mlとなるように 懸濁した。培養細胞は付着試験開始 30分前に、培地を除去し、 Hank' s平衡塩溶 液で 2回洗浄後、非必須アミノ酸 1%添加 RPMI— 1640培地を添加した。細胞力もこ の培地を除去後、ビフィズス菌懸濁液 900 1を培養細胞に添加して炭酸ガス培養器 中で 37°C1時間培養した。これに病原菌懸濁液 100 1を添加後、さらに 1時間培養 した。付着していない菌体を PBSで 3回洗浄することにより除去した。次いでゥエルに lmlの蒸留水を添加した。ピペッティングにより培養細胞を破裂させた。ゥエル中の液 を段階希釈し、希釈液 100 1を 1で述べた寒天培地に塗抹後、 1で述べた培養条件 で培養した。但し、ビフィズス菌計数用の GAM寒天培地にはポリミキシン B硫酸塩を 5 μ gZml(=約 40単位 Zml)添カ卩した。各菌株の付着試験には 1回につき 2ゥエル を用いた。試験は異なる実験日に 2〜3回実施して、再現性を確認した。
[0052] ビフィズス菌の保温上清を用いた付着阻害試験の場合は以下のように行った。 PB Sで洗浄後の菌体を非必須アミノ酸 1%添加 RPMI— 1640培地（シグマ社、 25mM HEPES及び炭酸水素ナトリウム含有）に 1. OX lo mU 5. 0 X 108/mlおよび 1. 0 X 109Zmlとなるよう懸濁し、室温下に 2時間保温した。保温後、 0. 2 mのフィ ルターで除菌して保温上清を得た。固定ィ匕 Caco— 2細胞に、保温上清 900 /z lと病 原菌懸濁液 100 1を添加後、炭酸ガス培養器中で 37°C1時間培養した。以下、先 述の方法で病原菌の付着菌数を計数した。
[0053] (化学処理保温上清についての付着試験）
ビフィズス菌保温上清をタンパク分解酵素（lmgZml) (Merck proteinase K) で 37°C、 2時間、または 0. 005%PMSFで 37°C2時間、熱処理は 100°C、 5分間、 1 OOmM過ヨウ素酸処理は過ヨウ素酸とともに遮光下で 37°C、 1時間、の各処理後、 C aco— 2細胞への付着試験を行った。付着試験には固定ィ匕 Caco— 2細胞を用い、付 着菌数はグラム染色後、顕微鏡下で計数した。
[表 3] 菌種 菌株番号 付着数％ (付着数 Zゥエル） ビフィズス菌
ビフイド/ クテリウム■ビフィダム OLB6374 15 (9.1 x 10s) ビフイドバクテリウム■ブレべ MEP175004 0.45 (5.4 X 105) 付加菌数は総菌数として 1 X 109Zゥエル（cfuとして 7.9 X 105~4.1 X 108 ゥェル)
付着率 =付着数/付加菌数 X 100
[0055] 総菌数として 1. 0 X lCTZmlのビフィズス菌体を Caco 2細胞に付カ卩して付着性 を調べたところ、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374が良好な付着性を示し、 ビフイドバクテリウム'ブレべ MEP175004は、 OLB6374と比較して低付着性を示し た (表 3)。
[0056] ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム、ビフイドバタテリゥム 'インファンテイス、およびビフィ ドバクテリゥム 'ロンガムを用いて、サルモネラ'チフィムリウム JCM1652菌、ビブリオ' コレラ APCC8411の Caco— 2細胞への付着に与える影響を調べた（表 4)。
[0057] その結果、総菌数比でサルモネラ'チフィムリウム JCN1652の 2〜20倍（生菌数比 では 1Z2〜5倍）のビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374を添カ卩した場合、サル モネラ'チフィムリウム JCMの Caco— 2細胞への付着を 88. 2%阻害した（表 4)。ビフ イドバタテリゥム.ビフィダム OLB6378を添加した場合には、 84. 1%阻害した (表 4) 。総菌数比でビブリオ ·コレラ APCC8411の 2〜 20倍（生菌数比では 1 Z2〜 5倍）の ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB6374を添カロした場合、ビブリオ'コレラ APCC8 411の Caco— 2細胞への付着を 98%以上阻害した (表 4)。また、総菌数比でシゲラ •フレキスネル BFR3624の 2〜20倍（生菌数比では 1Z2〜5倍）のビフイドバタテリ ゥム ·ビフィダム OLB6374を添カ卩した場合、シゲラ ·フレキスネル BFR3624の Caco 2細胞への付着を 90. 9%以上阻害した (表 4)。
[0058] [表 4] ビフィズス菌株 添加菌数（cfuZwell) 付着阻害率 (％)
(サルモネラ菌のみ） 0.00 0.00 ヒ'フイト'ハ'ク亍リウム -ビフイタ'ム OLB6374 2.0 X 109 88.2
ヒ'フイト ク亍リウム.ビフィダム OLB6378 2.0X 109 84.1
ビフィ卜' Λ "ク亍リウム■インファン イス MEP175006 2.0X 109 87.5
ビフイト 'Λ"ク亍リウム■インファンテイス ΜΕΡ175007 2.0 X 109 75.4
ビフイト '/ クテリゥム 'ロン力'ム ΜΕΡ 175005 2.0 X 109 78.5
(コレラ菌のみ） 0.00 0.00
1.0X 108 98.97
ヒ'フイト' / クテリウム 'ビフイダ厶 OLB6374 5.0 X 108 98.86
1.0X 109 98.58
(シゲラ菌のみ） 0.00 0.00
1.0X 108 91.86
ビフイト ク亍リウム-ビフィダム OLB6374 5.0 X 108 90.87
1.0X 109 91.59
[0059] Caco 2細胞に良好な付着性を示したビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB6374 と付着性の低 ヽビフイドバタテリゥム ·ブレべ MEP175004のエルシニア ·ェンテロコリ チカ IID981の Caco— 2細胞への付着に与える影響を調べた。
[0060] その結果、総菌数比でエルシ-ァ'ェンテロコリチカ IID981の 2〜20倍（生菌数比 では 1〜10倍）のビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374を添カ卩した場合、エルシ ユア.ェンテロコリチカ IID981の Caco— 2細胞への付着を 99.5%以上阻害した（表 5)。付着性の低!ヽビフイドバタテリゥム ·ブレべ MEP175004もエルシニア ·ェンテロ コリチカ IID981菌に対して、高い付着阻害効果を示した (表 5)。
[0061] [表 5] ビフィズス菌株 添加菌数 (cfuZwell) 付着阻害率 (％)
(エルシニア菌のみ） 0.00 0.00
1.0X 108 99.76
ヒ'フイト '/ ク亍リウム-ビフイタ'ム OLB6374 5.0 X 108 99.48
1.0 x109 99.77
1.0x10s 99.91
ヒ'フイト'/、'ク亍リウム 'レへ' MEP175004 5.0 X 108 99.85
1.0X 109 99.93 ビフィズス菌の保温上清による病原菌に対する付着阻害機構を知るために、ビフィ ドバクテリゥム ·ビフィダム OLB6374の保温上清の存在下でエルシニア ·ェンテロコリ チカ IID981の固定化 Caco— 2細胞への付着性を調べた。その結果を図 1に示す。 図 1から明らかに、ビフィズス菌体の添カ卩をしなくても、保温上清のみの添加でも、ェ ルシニア菌の付着が強く阻害された。
[0063] つぎに化学処理による、ビフィズス菌保温上清の付着阻害活性への影響を調べた 結果を図 2に示す。
[0064] ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374の化学処理した保温上清存在下におけ る、エルシ-ァ'ェンテロコリチカ IID981の固定化 Caco— 2細胞への付着阻害活性 は、図 2の結果力 分力るように、過ヨウ素酸処理では消失せず、熱処理、 proteinase K処理、 PMSF処理によって消失した。
(Caco-2細胞表層蛋白質に結合する上清中蛋白質の検出）
[0065] Caco-2細胞表層蛋白質に結合するビフィズス菌保温上清ある!/、はエルシニア菌体 由来蛋白質の検討は以下のように行った。ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374 を 1 X 107個/ mlとなるように懸濁した液力も得られた上清を凍結乾燥した。得られた凍 結乾燥粉末を元の上清量の 1/1000量の SDS-PAGE用のサンプル緩衝液に溶解し、 100°Cで 5分間加熱し、 SDS化タンパク質溶液を得た。
[0066] Caco-2細胞からの表層蛋白質の抽出には、 24穴マルチプレートで 15日間培養した Caco-2細胞に 1ゥエルあたり 100 μ 1の SDS-PAGE用のサンプル緩衝液を添カ卩し、ピ ペッティングによって Caco-2細胞をゥエルから剥離後、 100°Cで 5分間加熱することに より、 Caco- 2細胞表層蛋白質の SDS化溶液を得た。
[0067] ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374上清蛋白質のピオチン標識には、ビフイド バタテリゥム.ビフィダム OLB6374を 1 X 109個/ mlとなるように PBS(pH8.0)に懸濁し、懸 濁液 lmlあたり 5 μ 1の sulfo- NHS- biotin(Pierce)溶液 (25mg/ml)を添カ卩して室温で 30分 間緩く振とうした。次いで、菌体を 50mM- Tris- HC1緩衝液 (pH8.0)および PBSで洗浄 後、菌を蒸留水上に I X 107個/ mlとなるように懸濁した。この懸濁液を室温で 2時間 静置した後、 0.20 mのメンブレンフィルターでろ過して菌体を除き、回収した上清を 凍結乾燥した。凍結乾燥粉末を元の上清量の 1/20量の 0.5% BSA-0.05% tween 20-P BS (pH 8.0)で溶解した。
[0068] Caco-2細胞表層蛋白質のピオチン標識は以下のように行った。 24穴マルチプレー トで 15日間培養した Caco- 2細胞を PBSで洗浄し、 1ゥエルあたり 1 mlの PBS (pH 8.0) を添カ卩した。次いで 5 μ 1の sulfo- NHS- biotin(Pierce)溶液 (25mg/ml)を添カ卩して室温で 30分間緩く振とうした。細胞を 50mM- Tris- HC1緩衝液 (pH8.0)および PBSで洗浄後、 1 ゥエルあたり 1 mlの蒸留水を添カ卩し、細胞を破裂させた。 6ゥエル分から回収したこの Caco- 2液に 30 mgの octy卜 j8 - glucosideを添カ卩し、 4°Cで一夜振とうした。その後、 500 0 rpmで 10分間遠心分離して細胞片を除き、上清を得た。次にアミコンセントリプラス 一 10 (日本ミリポア、分画分子量 10,000)を用いて、上清力も脱塩し蛋白質を回収した 。さらに PBSによる洗浄を繰り返した後、非透過液量が 3 mlになるまで濃縮した。非透 過液に等量の 1.0% BSA-0.1% tween 20- PBS (pH8.0)を混合し， Caco- 2細胞ピオチン 標識蛋白溶液とした。
[0069] エルシ-ァ'ェンテロコリチカ IID981菌体のピオチン標識には、当該菌濃度が I X 10 9個/ mlとなるように PBS(pH8.0)に懸濁し、懸濁液 lmlあたり 5 μ 1の sulfo- NHS- biotin(Pi erce)溶液 (25mg/ml)を添カ卩して室温で 30分間緩く振とうした。次いで、菌体を 50mM- Tris- HC1緩衝液 (pH8.0)および PBSで洗浄後、菌を 0.5% BSA- 0.05% tween 20- PBSに 1 X 109個/ mlとなるように懸濁した。
[0070] SDS- PAGEによるビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374上清蛋白質および Caco- 2表層蛋白質の分離および PVDF膜 (Bio-Rad)への転写は以下のように行った。上述 のように SDS化した各蛋白質を SDS-PAGEにより分離した同一試料を 2レーンに負荷 して電気泳動後、一方のレーンはクマーシーブリリアントブルー R- 250 (CBB、 Fluka) で蛋白染色を行い、もう一方の蛋白質をホラィズブロット（アト一 AE6675)を用いて PV DF膜へ転写した。
[0071] PVDF膜上での結合試験は以下のように行った。ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OL B6374上清蛋白質あるいは Caco-2細胞蛋白質を転写した PVDF膜を 2% BSA (Sigma) -PBSで 2時間ブロッキングした。次!、で、ピオチン標識ビフイドバタテリゥム ·ビフイダ ム OLB6374上清蛋白質、ピオチン標識エルシ-ァ'ェンテロコリチカ IID981菌体ある いはピオチン標識 Caco-2細胞表層蛋白質を添加し、 2時間室温で緩く振とうした。処 理後の PVDF膜を 0.05% tween 20- PBS (pH 8.0)で洗浄後、ストレプトアビジン- PODコ ンジュゲイト溶液（Roche Diagnostics, 10, 000倍希釈液）を添カ卩して、室温で 2時間緩 く振とうした。 0.05% tween 20- PBS (pH 8.0)で洗浄した後、コ-カイムノスティン HRP- 1000 (コ-力ミノルタェムジ一）によって結合部位にバンドを発色させた。
[0072] その結果、 Caco-2細胞表層蛋白質はビフイドバクテリウム'ビフィダム OLB6374上清 中の 66 kDaの蛋白質に結合した。また、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374上 清中のタンパク質およびエルシニア ·ェンテロコリチカ IID981はともに、 Caco-2細胞表 層蛋白質の 31.4および 34.9 kDaの蛋白質に結合した。
[0073] 以上の結果から、ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB6374によるエルシニア ·ェンテ ロコリチカ II D981の Caco-2細胞への付着阻害機構として、 66 kDa蛋白質による Cac 0 -2細胞表層に存在する 31.4および 34.9 kDaの蛋白質へのエルシニア 'ェンテロコリ チカ IID981菌体の付着の拮抗阻害が関与する可能性が推定される。
[0074] 本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れる ことなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。 なお、本出願は、 2005年 8月 24日付けで出願された日本特許出願 (特願 2005— 243148)に基づいており、その全体が引用により援用される。
また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
産業上の利用可能性
[0075] 本発明のビフィズス菌及び Zまたはビフィズス菌処理物とそれを含有する食品 ·医 薬品組成物により、感染症の原因となる大腸菌などの病原菌が腸上皮細胞などの動 物細胞に付着することを効果的に阻害することが可能となり、本発明は感染症予防 に多大な貢献をすることができる。

Claims

請求の範囲
[1] 病原菌の動物細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌。
[2] ビフイドバタテリゥム ·ビフィダムであることを特徴とする請求項 1に記載のビフィズス 菌。
[3] ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB6374、ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB63
78からなる群力 選ばれた少なくとも 1つの菌株である請求項 1又は 2に記載のビフィ ズス菌。
[4] 前記病原菌がェシエリキア'コリ（Escherichia coli)、サルモネラ'チフィムリウム（
Salmonella Typhimurium)、ビブリオ ·コレラ (Vibrio cholerae)、ビブリオ ·ノ ノレ 二フィカス (Vibrio vulnificus)、エノレシ-ァ ·ェンテロコリチカ (Yersinia enteroc olitica)、シゲラ ·フレキスネル（Shigella flexneri)力もなる群から選ばれた少なくと も 1種の病原菌であることを特徴とする請求項 1から 3のいずれかに記載のビフィズス 菌。
[5] ビフィズス菌に処理を施すことにより得られる、病原菌の動物細胞への付着阻害能 を有するビフィズス菌処理物。
[6] 前記処理物が、ビフィズス菌液を非増殖条件下で静置して得られる上清であること を特徴とする請求項 5に記載のビフィズス菌処理物。
[7] ビフイドパクテリゥム 'ビフイダム菌液であることを特徴とする請求項 5又は 6に記載の ビフィズス菌処理物。
[8] ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB6374、ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB63
78からなる群力も選ばれた少なくとも 1つの菌株である請求項 5から 7のいずれかに 記載のビフィズス菌処理物。
[9] 前記病原菌がェシエリキア'コリ（Escherichia coli)、サルモネラ'チフィムリウム（
Salmonella Typhimurium)、ビブリオ ·コレラ (Vibrio cholerae)、ビブリオ ·ノ ノレ 二フィカス (Vibrio vulnificus)、エノレシ-ァ ·ェンテロコリチカ (Yersinia enteroc olitica)、シゲラ ·フレキスネル（Shigella flexneri)力もなる群から選ばれた少なくと も 1種の病原菌であることを特徴とする請求項 5から 8のいずれかに記載のビフィズス 菌処理物。
[10] 請求項 6に記載の上清より得られることを特徴とする付着阻害因子。
[11] 請求項 1から 4のいずれかに記載のビフィズス菌、請求項 5から 9のいずれかに記載 のビフィズス菌処理物、及び請求項 10に記載の付着阻害因子の少なくとも一つを有 効成分として含み、病原菌の動物細胞への付着阻害能を有する食品 ·医薬品組成 物。
[12] 病原菌の動物細胞への付着阻害剤の製造のための、請求項 1から 4のいずれかに 記載のビフィズス菌、請求項 5から 9のいずれかに記載のビフィズス菌処理物、及び 請求項 10に記載の付着阻害因子の少なくとも一つの使用。
PCT/JP2006/316639 2005-08-24 2006-08-24 病原菌の細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌、その処理物及びそれを含有する食品・医薬品組成物 WO2007023912A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007532178A JP5006198B2 (ja) 2005-08-24 2006-08-24 病原菌の細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌、その処理物及びそれを含有する食品・医薬品組成物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-243148 2005-08-24
JP2005243148 2005-08-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007023912A1 true WO2007023912A1 (ja) 2007-03-01

Family

ID=37771655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/316639 WO2007023912A1 (ja) 2005-08-24 2006-08-24 病原菌の細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌、その処理物及びそれを含有する食品・医薬品組成物

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5006198B2 (ja)
WO (1) WO2007023912A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008127165A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Method and arrangements for scheduling transmission resources with variable guard intervals
CN109628343A (zh) * 2018-12-26 2019-04-16 嘉兴益诺康生物科技有限公司 短双歧杆菌yh68及在降低鼠伤寒沙门氏菌感染风险产品中的应用
EP3366299A4 (en) * 2015-10-19 2019-04-17 Meiji Co., Ltd MEANS OF PREVENTING INFECTIONS FOR SMALL CHILDREN

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10286078A (ja) * 1996-12-23 1998-10-27 Sitia Yomo Spa 凍結乾燥した生の乳酸菌を含有する食品用組成物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10286078A (ja) * 1996-12-23 1998-10-27 Sitia Yomo Spa 凍結乾燥した生の乳酸菌を含有する食品用組成物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAKAYA R. ET AL.: "Chiryo to Chonai Saikin Mura Chonai Saikin Mura to Kansen Bifidobacterium no Sekirikin Kansen Yokusei Sayo", THE JOURNAL OF PEDIATRIC PRACTICE, vol. 47, no. 5, 1984, pages 723 - 728, XP003008636 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008127165A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Method and arrangements for scheduling transmission resources with variable guard intervals
EP3366299A4 (en) * 2015-10-19 2019-04-17 Meiji Co., Ltd MEANS OF PREVENTING INFECTIONS FOR SMALL CHILDREN
CN109628343A (zh) * 2018-12-26 2019-04-16 嘉兴益诺康生物科技有限公司 短双歧杆菌yh68及在降低鼠伤寒沙门氏菌感染风险产品中的应用
CN109628343B (zh) * 2018-12-26 2022-02-18 嘉兴益诺康生物科技有限公司 短双歧杆菌yh68及在降低鼠伤寒沙门氏菌感染风险产品中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP5006198B2 (ja) 2012-08-22
JPWO2007023912A1 (ja) 2009-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2551315C2 (ru) Выделение, идентификация и характеристика штаммов с пробиотической активностью, выделенных из фекалий детей, вскармливаемых исключительно материнским молоком
DK2162143T3 (en) MAMMALS MILK-MICRO-FORMATIONS incorp-border THEM AND THEIR USE FOR THE TREATMENT OF MASTITIS
EP2179028B1 (en) A novel strain of bifidobacterium and active peptides against rotavirus infections
Sharma et al. Identification and probiotic potential of lactic acid bacteria from camel milk
Jamaly et al. Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from known popular traditional Moroccan dairy products
RU2567009C2 (ru) ШТАММ Lactococcus lactis ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАССТРОЙСТВА ПИЩЕВАРЕНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
TW201204374A (en) Lactobacillus plantarum and uses thereof
KR20120099663A (ko) 저콜레스테롤혈증제로서 락토바실러스 플란타룸 균주
CA2868109A1 (en) Probiotic derived non-viable material for infection prevention and treatment
CN114480229B (zh) 一种动物双歧杆菌乳亚种菌株wkb148及其产品与应用
US20220313754A1 (en) Bifidobacterium lactis bl-99 and application thereof
WO2007020884A1 (ja) β－ディフェンシンを介した感染予防効果を有するビフィズス菌または乳酸菌とそれを含有する食品・医薬品組成物
JPWO2009066537A1 (ja) 免疫調節性機能誘導剤及び食品組成物
EP2220210B1 (en) Strains of lactobacillus plantarum as probiotics with immunomodulatory specific effect
Ostad et al. Live and heat-inactivated lactobacilli from feces inhibit Salmonella typhi and Escherichia coli adherence to Caco-2 cells
CA2822892A1 (en) Method for inhibiting pathogens using a nutritional composition
US8648036B2 (en) Use of nutritional compositions including lactoferrin and one or more prebiotics in inhibiting adhesion of pathogens in the gastrointestinal tract
JP2018177703A (ja) Ｔｏｌｌ様受容体２活性化用組成物
US20070134220A1 (en) Lactobacillus fermentum strain and uses thereof
JP5006198B2 (ja) 病原菌の細胞への付着阻害能を有するビフィズス菌、その処理物及びそれを含有する食品・医薬品組成物
EP1997880A1 (en) Breast milk bifidobacteria, compositions thereof, their use and a novel culture media to obtain them
JP2006180836A (ja) 食中毒菌感染を抑制する乳酸菌、ならびにそれを含む発酵物、食品および医薬組成物
WO2017105267A1 (en) New probiotic starter culture for human and animal use
RU2491336C1 (ru) Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей старше 14 лет, способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет
JP2022157465A (ja) 乳幼児用排便促進剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007532178

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06796752

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1