WO2007020884A1 - β－ディフェンシンを介した感染予防効果を有するビフィズス菌または乳酸菌とそれを含有する食品・医薬品組成物 - Google Patents

β－ディフェンシンを介した感染予防効果を有するビフィズス菌または乳酸菌とそれを含有する食品・医薬品組成物 Download PDF

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bifidobacteria
strain
defensin
lactic acid
bifidum
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Tsuyoshi Shibata
Masaki Terahara
Masako Yajima
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Meiji Dairies Corporation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
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    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
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    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Bifidobacteria or lactobacilli having anti-infection effect via j3-defensin and food / pharmaceutical composition containing the same
  • the present invention relates to a bifidobacteria or lactic acid bacterium capable of promoting the expression of j8-defensin known as an antibacterial peptide and exhibiting an infection prevention effect, and a food / pharmaceutical composition containing the bacterium.
  • defensin has attracted attention as an antibacterial peptide induced by Escherichia coli and the like.
  • Defensins have three S—S bonds with six cysteine residues, and can be divided into ⁇ -defensins and j8-defensins based on differences in S—S bonds.
  • ⁇ -diffensin is secreted mainly by neutrophils
  • j8-defensin is secreted by epithelial cells such as the digestive tract, skin, oral cavity, and trachea.
  • 13-defensins 1 to 3 (hereinafter human 13-defensins 1, 2, and 3 may be abbreviated as hBDl, 2, and 3) have been discovered.
  • hBDl is constitutively expressed and hBD2 and 3 are inducibly expressed.
  • j8-defensin exhibits chemotaxis against mast cells and rod-like cells and shows an important function in the acquired immune system as well as the natural immune system alone.
  • human ⁇ -defensin 2 is known to exhibit a high antibacterial action against pathogenic bacteria such as Escherichia coli, caries-causing bacteria (eg, Streptococcus mutans), and Staphylococcus aureus (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Documents 1 and 2 a plurality of types of food material extracts are added to human keratinocytes and cultured, and the hBD2 expression enhancing effect of each food material extract is observed.
  • the food material extract used in the examples is not necessarily specified so as to be reproducible by those skilled in the art with regard to its properties and the like.
  • Patent Documents 1 and 2 it has been confirmed that the concentrated yogurt extract for shochu moromi, roasted maranth, amazake, roasted wheat germ, roe, and yew has the effect of enhancing hBD2 induction.
  • the effect of inducing or enhancing the induction of hBD2 expression by “bacterial powder” has not been confirmed (Patent Documents 1 and 2, Example 4, Example 6, Vote 4, and FIG. 2).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 11 286496
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-248676
  • Non-Patent Document 1 Jolly S et al., J. Clinc. Microbiol, 2004, No. 42, No. 3, p. 10 24- 1029
  • Non-Patent Document 2 Midrika K. et al., Infect. Immun., 2003, No. 71, No. 7, p. 373 0-3739
  • Non-Patent Document 3 One'Jiichi et al., Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 200 Oct. 3rd, No. 34, No. 4, p. 622-624
  • the present invention has been made in view of the above situation, and the problem to be solved by the present invention is considered to be useful as an antibacterial peptide by simple means.) Promoting the expression of 8-defensin, By increasing the expression level, it is to provide microorganisms that can be used for foods or pharmaceuticals, which have a higher infection prevention effect.
  • the inventors have made utmost efforts to solve the above problems.
  • the present inventors cultured various bifidobacteria and added them to HT-29 cells (human intestinal epithelium-derived cell line), and observed the effect of bifidobacteria on the expression level of hBD2.
  • bifidobacteria stimulation treatment was first performed, and E. coli stimulation treatment was performed after a certain time.
  • co-culture treatment co-stimulation treatment
  • bifidobacteria single stimulation treatment was performed.
  • the present inventors have not only proved that bifidobacteria have an
  • Bifidobacteria or lactic acid bacteria that act to increase the expression level of defensin 10 times or more by acting on animal cells together with the microorganisms when the animal cells come into contact with the microorganisms,
  • the bifidobacteria described in (1) to (4) above which is at least one selected from the group consisting of terium syudulongum and bihuid butterium adrescentiska.
  • the microorganism is at least one selected from the group consisting of Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Pseudomo nas aeruginosa ⁇ Streptococcus goraonii, Porphylomonas gingivalis, Actinobacillis act inomycetemcomitans, Staphylococcus epidermidis, and Streptococcus pyogenes.
  • the bifidobacteria or lactic acid bacterium according to any one of (2) to (4) above, which is a species of microorganism.
  • Biff id Corynebacterium 'bifidum OLB6374 strains Biff id Agrobacterium', characterized in that at least one strain group force was also chosen for Adoretsuse Nteisu JCM1275 T 3 ⁇ 4 strain, when the animal cell is in contact with the microorganism Bifidobacteria have the effect of increasing the expression level of ⁇ -defensin more than 5 times by acting on animal cells together with microorganisms.
  • a bifidobacteria or lactic acid bacterium having ⁇ -defensin expression promoting ability, and there is! / ⁇ is a food or drink or a medicine containing any of the processed products of any of the above.
  • Bifidobacterium is Bifido Batterium 'Bifidum JCM1255 T , Bifidobacterium bifidum OLB6374, Bifido Batterium Bifidum OLB6378, Bifido Batterium' Longham JCM1217 T , Bifid Batterium 'Addresses sensibility JCM1275 T 3 ⁇ 4
  • Bifidobacterium which is Bifidobacterium 'Bifidum OLB6374 strain (Accession number NITE BP-123) or Bifidobacterium' Bifidum OLB6378 strain (Accession number NITE BP-31).
  • a method for preventing or treating a microbial infection comprising a step of administering bifidobacteria or lactic acid bacteria having an ability to promote ⁇ -defensin expression.
  • the present invention provides bifidobacteria and lactic acid bacteria that promote ⁇ -defensin expression in animal cells.
  • bifidobacteria and sputum or lactic acid bacteria according to the present invention By administering bifidobacteria and sputum or lactic acid bacteria according to the present invention to animals, the expression level of one defensin during infection with pathogenic bacteria can be increased and infection with pathogenic bacteria can be easily prevented.
  • pathogenic bacteria such as Escherichia coli invade and proliferate
  • the bifidobacteria and lactic acid bacteria according to the present invention can strongly promote the expression of ⁇ -defensin, and as a result, exert infection prevention or treatment effects. Conceivable.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression level of human ⁇ -defensin 2 in an induction experiment according to Experimental Example 1 (5 hours culture after bifidobacteria followed by 1 hour culture after addition of E. coli). The value when induced only with E. coli (E.coli J CM1649 T ) is shown as 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the expression level of human ⁇ -defensin 2 in the induction experiment according to Experimental Example 1 (5 hours after bifidobacteria culture and 3 hours after addition of E. coli). The value when induced only with E. coli (E.coli J CM1649 T ) is shown as 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the expression level of human ⁇ -defensin 2 (1 hour culture in the presence of both E. coli and bifidobacteria) in the induction experiment according to Experimental Example 2. The value when induced only with E. coli (E.coli JCM 1649 ⁇ ) is shown as 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the expression level of human ⁇ -defensin 2 (3-hour culture in the presence of both E. coli and bifidobacteria) in the induction experiment according to Experimental Example 2. The value when induced only with E. coli (E.coli JCM 1649 ⁇ ) is shown as 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the expression level of human ⁇ -defensin 2 (1 hour culture in the presence of Escherichia coli, bifidobacteria alone, in an induction experiment according to Experimental Example 3). The value when induced by E. coli (E.coli JCM1 649 ⁇ ) is shown as 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the expression level of human ⁇ -defensin 2 (3 hours culture in the presence of Escherichia coli, bifidobacteria alone, in an induction experiment according to Experimental Example 3). The value when induced by E. coli (E.coli JCM1 649 ⁇ ) is shown as 1. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention provides bifidobacteria or lactic acid bacteria that have an infection-preventing action by increasing the expression level of ⁇ -defensin.
  • 8-defensin in an animal cell is induced by treatment with E. coli
  • the present inventors treated the animal cell with bifidobacteria simultaneously with or in advance of the E. coli treatment to express j8-defensin. It was confirmed that the amount increased significantly.
  • the expression level of j8-defensin means the production amount of j8-defensin protein.
  • the ⁇ -defensin expression level induced when the animal cells come into contact with microorganisms such as pathogenic bacteria can be increased thereafter.
  • the effect of increasing the expression level of j8-defensins by the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention is remarkable.
  • the animal cells were brought into contact with microorganisms by sensitizing the animal cells in advance with the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention.
  • the expression level of j8-defensin can be increased 10-fold or even 20-fold or more. Therefore, if the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention are administered to animals such as humans, it is possible to prevent the animals from being subsequently infected with microorganisms.
  • the expression level of j8-defensin in an animal cell can be increased by contacting the bifidobacteria or lactic acid bacterium of the present invention with the animal cell simultaneously with a microorganism such as a pathogenic bacterium. Even when the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention are used in this way, the effect of promoting the expression of j8-defensin is remarkable. For example, as shown in the Examples, the expression level can be promoted up to 10 times or more. It is. Therefore, it is considered that microbial infection can be alleviated or treated by administering the bifidobacteria or lactic acid bacterium of the present invention to animals such as humans infected with microorganisms.
  • the type of lactic acid bacteria of the present invention is not particularly limited.
  • the gram-positive gonococci of Streptococcus family St bird of Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc
  • the Gram-positive gonococci of the Lactobacilli family Licobacillus genus
  • the type of bifidobacteria of the present invention is not particularly limited.
  • bifidobacteria are used mainly for the prevention of microbial infection, bifidobatterium 'bifidum JCM1255 T strain, bifidobatterum' bifidum O LB6374 strain, bifidobata Terium 'Bifidum OLB6378 strain, Bifido Batterium longum JCM121a strain, Bifido Batterum adrecentis JCM1275 strain group It is preferable to select at least one selected strain, As long as it is a bifidobacteria having a defensin expression promoting effect, not only the above strains but also other strains can be used.
  • Biff Ido Bata Teri ⁇ beam Bifidum OLB6374 strains Bifuidobata Teriumu 'address Tsu Sen infantis JCM1275 T 3 ⁇ 4 strains, if administered to microbial infected animals, in particular can be expected the effect,) 8 -As long as it is a Bifidobacterium strain having an effect of promoting defensin expression, not only the above strains but also other strains can be used.
  • the Bifidobatterium bifidum OLB 6374 strain of the present invention is deposited under the following conditions.
  • the Bifidobatterum bifidum OLB 6374 strain of the present invention has the following mycological properties.
  • the Bifido Batterium bifidum OLB 6374 strain is a Gram-positive obligate anaerobic gonococcus from which human fecal force has also been isolated.
  • the fungus is a gonococcus or a branched polymorph and has no spore formation or motility. Colony with opaque circular hemispherical luster when this bacteria is applied on a plate of BL agar (Eiken) and cultured at 37 ° C for 48 hours in anaerobic condition using AnaeroPack 'kenki (Mitsubishi Gas Chemical). Form.
  • BiBIF-1 CCA CAT GAT CGC ATG TGA TT (SEQ ID NO: 1)
  • BiBIF-2 CCG AAG GCT TGC TCC CAA A (SEQ ID NO: 2)
  • the Bifidobatterium bifidum OLB 6378 strain used in the present invention is deposited under the following conditions.
  • the Bifidobatterium bifidum OLB 6378 strain of the present invention has the following mycological properties.
  • Bifido Batterium Bifidum OLB 6378 is a gram from which human fecal matter was also isolated. It is a positive obligate anaerobic gonococcus, and the shape of the bacterium is gonococcus or branched polymorph, and spore formation
  • the Bifidobacterium bifidum OLB 6374 strain and the Bifidobacterium 'bifidum OLB 6378 strain of the present invention were infected with microorganisms even when they were contacted with animal cells prior to microbial infection of animal cells.
  • the effect of promoting the expression of ⁇ -defensin can be exerted even when contacted with animal cells.
  • Microorganisms that can be prevented from infection by bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention are not particularly limited, but are mainly microorganisms having j8-defensin sensitivity, preferably pathogenic microorganisms (pathogenic bacteria).
  • pathogenic microorganisms pathogenic bacteria.
  • examples of such microorganisms include E. coli, Pseudomon as aeruginosa, (Harder J. et al. Am. J. Respir Cell Mol. Biol. 2000, No. 22, p. 714-21), Salmonella enteritidis (Ogushi K. et al. J. Biol. Chem., 2001, No. 276, No. 32, p.
  • the “animal cell” is not particularly limited as long as it is an animal-derived cell.
  • Preferred examples include epithelial cells such as intestine, oral cavity, trachea and skin, and organ cells. Examples include cells that express j8-defensin.
  • In vivo animal cells fresh cells isolated from animals, primary cell cultures derived from animals, and cell lines derived from animals are also included in the “animal cells” of the present invention.
  • the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention can also be used as pharmaceuticals or foods and drinks.
  • the pharmaceutical or food containing bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention is useful in that it has an effect of promoting ⁇ -defensin 2 expression, and can be used particularly as a pharmaceutical or food and drink for microbial infection prevention or infection treatment.
  • a single strain may be used, or two or more strains may be used in combination.
  • the state is not limited.
  • the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention can be used in the above-mentioned pharmaceuticals or foods or drinks even if they are live bacteria, killed bacteria, or processed products.
  • a culture of bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention concentrates thereof, pasted pastes, spray dried products, freeze dried products, vacuum dried products, drum dried products, liquids dispersed in a medium Products, diluted products diluted with a diluent, and crushed products obtained by crushing dried products with a mill or the like can be used in the above-mentioned medicines or foods and drinks.
  • the food and drink of the present invention can also be applied to health functional foods and foods for the sick.
  • the functional health food system was established not only for regular foods but also for foods in the form of tablets, capsules, etc., based on domestic and external trends and consistency with conventional food systems for specified health use. It consists of two types of food for specified health use (individual permission type) and functional nutritional food (standard type).
  • the type of the food or drink is not particularly limited.
  • various foods and drinks milk, processed milk, soft drinks, fermented milk, chocolate, cheese, other dairy products, bread, biscuits, crackers, pizza crusts, prepared milk powder, liquid foods, food for the sick, infant formula Foods, breast milk powdered foods, nutritional foods, etc.
  • the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention and their processed products may be used as they are, or may be mixed with other foods or food ingredients in accordance with the production method for ordinary food compositions. it can.
  • the shape of the food or drink is not particularly limited, and the shape of the food or drink that is usually used is particularly limited. It doesn't matter.
  • the shape may be in the form of solid (including powder and granules), paste, liquid, suspension, etc., but is not limited thereto.
  • the food and drink containing the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention includes water, proteins, carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, organic acids, organic bases, fruit juices, flavors and the like in ordinary foods. Any component can be included.
  • the protein source for example, whole milk powder, skim milk powder, partially skim milk powder, casein, whey powder, whey protein, whey protein concentrate, whey protein isolate, ⁇ -casein, ⁇ -casein , K-casein, j8-lactoglobulin, ⁇ -lactoalbumin, ratatofurin, soy protein, egg protein, meat protein, and other proteins or proteins commonly used in food production, such as hydrolysates Noble-containing raw materials can be used.
  • sugar sources include processed starch (in addition to text phosphorus, soluble starch, pre-taste starch, oxidized starch, starch ester, starch ether, etc.), dietary fiber, and the like.
  • Examples of lipid sources include lard, fish oil, etc., fractionated oils thereof, hydrogenated oils, transesterified oils and other animal oils; palm oil, safflower oil, corn oil, rapeseed oil, coconut oil, fractionated oils thereof. And vegetable oils such as oil, hydrogenated oil, and transesterified oil.
  • vitamins include vitamin ⁇ , carotene, vitamin ⁇ group, vitamin C, vitamin D group, vitamin E, vitamin K group, vitamin P, vitamin Q, niacin, nicotinic acid, pantothenic acid, biotin, inositol, choline
  • Examples of minerals include calcium, potassium, magnesium, sodium, copper, iron, manganese, zinc, and selenium.
  • the organic acid examples include malic acid, citrate, lactic acid, tartaric acid, and the like.
  • Various milk-derived components such as butter, dairy minerals, cream, whey, non-protein nitrogen, sialic acid, phospholipid, and lactose are suitably used for the production of foods and beverages containing the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention. This is an example of an ingredient that can be used. .
  • These components can be used in combination of two or more.
  • the above-mentioned raw materials may be a natural product, a processed natural product, a synthetic product, or a food containing a large amount of Z or a misalignment.
  • the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention can be used as a medicament for preventing or treating infection.
  • the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention are viable bacteria, Alternatively, it can be used as a crushed or unground product after sterilization.
  • the bacteria used may be single or multiple types.
  • the amount of the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention in the above pharmaceuticals can be arbitrarily determined depending on the purpose and application (prophylactic agent, therapeutic agent, etc.).
  • the present invention is not limited to this.
  • the dosage of the pharmaceutical comprising the bifidobacteria or lactic acid bacterium of the present invention as an active ingredient is appropriately set in consideration of various factors such as the route of administration and the age, weight, and symptoms of animals to be administered including humans. be able to.
  • the active ingredient may include 1 to: LOOOmgZk gZday, but the present invention is not limited thereto.
  • the amount may be smaller than the above range.
  • since there is no safety problem with this active ingredient it is considered that it may be used in a larger amount than the above range.
  • the above pharmaceutical dosage form is preferably a dosage form that can be administered orally in order to allow the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention to reach the intestines.
  • preferable dosage forms of the pharmaceutical product according to the present invention include tablets, coated tablets, capsules, granules, powders, solutions, syrups, troches, and the like. These various preparations are prepared by adding the excipient, binder, disintegrant, lubricant, coloring agent, flavoring agent, solubilizing agent to the cells and Z of the present invention, which are the main agents, according to conventional methods. , Suspensions, coating agents, and the like, and can be formulated using adjuvants that can be usually used in the pharmaceutical formulation technical field.
  • the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention can sensitize animal cells such as epithelial cells in advance, so that when the animal cells come into contact with a large amount of pathogenic bacteria, the expression level of j8-defensin is contacted only with the pathogenic bacteria.
  • the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention are present together with pathogenic bacteria when animal cells come into contact with a large amount of pathogenic bacteria such as Escherichia coli. By acting on animal cells, it has the effect of increasing the expression level of ⁇ -defensin more than 10 times.
  • the bifidobacteria or lactic acid bacteria of the present invention can be used to prevent pathogenic bacteria such as E. coli. Induced expression of j8-defensin is significantly promoted and increases in its amount.
  • the induction of ⁇ -defensin when E. coli or the like invades or grows in the animal body. Can be strongly promoted
  • HT-29 cells were cultured in a 96-well plate (BECTON DICKINSON cat: 353072) to confluence in an atmosphere of 37 ° C and 5% CO.
  • a PBS suspension of each Bifidobacterium that had been heat-treated at 60 ° C. for 60 minutes in advance was prepared in RPMI medium to 1 ⁇ 10 7 cells / ml, and 200 ⁇ l per lwell was added.
  • a PBS suspension of E. coli JCM1649 T that has been heat-treated at 60 ° C for 60 minutes was prepared in RPMI medium to 1 ⁇ 10 8 cellsZml.
  • the cells were cultured at 37 ° C for 5 hours under 5% CO.
  • As a negative control, only RPMI medium was
  • the culture supernatant after each culture time is collected and centrifuged with a centrifuge (3000 rpm, 10 minutes, 4 ° C). A measurement sample was obtained.
  • HT-29 cells were cultured in a 96-well plate (BECTON DICKINSON cat: 353072) to confluence in an atmosphere of 37 ° C and 5% CO. Subsequently, the culture supernatant was removed and washed with RPMI medium (GIBCO).
  • the plate was cultured for 5 hours in an atmosphere of 37 ° C and 5% CO.
  • HT-29 cells were cultured in a 96-well plate (BECTON DICKINSON cat: 353072) to confluence in an atmosphere of 37 ° C and 5% CO.
  • RPMI medium was added at 200 ⁇ l per lwell.
  • the culture supernatant after each incubation time of 1 hour and 3 hours is collected and centrifuged with a centrifuge (3000 rpm, 10 minutes, 4 ° C) to measure j8-diffusin 2 A sample was used.
  • sample diluent 3% PEG 0.01M PBS—Tween
  • human j8-defensin 2 standard solution SIGMA cat: D9690 diluted as appropriate
  • E. coli JCM1649 T in Figs. 1 and 2 shows the results when E. coli JCM1649 T was added after washing after adding only the medium instead of various bifidobacteria in Experimental Example 1.
  • E. coli JCM1649 T in Figures 3 and 4 shows the results when only E. coli JCM1649 T was added in Experimental Example 2.
  • 8-defensin 2 in Experimental Examples 1, 2, and 3 an E. coli JCM1649 T solution having a concentration of 1 ⁇ 10 8 cellsZml was used. Table 1 shows the numerical results shown in the graphs of Figs.
  • Table 2 shows the numerical results of the graphs shown in Figs.
  • Table 3 shows the numerical results of the graphs shown in Figs.
  • Tables 1 to 3 add the results of studies on several strains along with the results of studies on the strains shown in Figures 1 to 6.
  • bifidobacteria and Z or lactic acid bacteria that promote the expression of the antibacterial peptide j8-defensin could be provided.
  • the amount of antimicrobial peptide expressed in the body can be increased. That is, the bifidobacteria and lactic acid bacteria of the present invention are used for infection prevention or treatment. It can be used as a pharmaceutical or a food product, and is extremely useful.

Abstract

　本発明はβ―ディフェンシンの発現量を高めることにより感染予防効果を有するビフィズス菌または乳酸菌を提供する。これを動物細胞に前もってあるいは同時に感作することで、多量の大腸菌などの病原菌に感染した際にβ―ディフェンシンの発現量を飛躍的に高めることができる。また、当該ビフィズス菌及び／または乳酸菌を有効成分として含有する、β－ディフェンシンの発現量を高めることにより感染予防効果を有する食品・医薬品組成物を提供する。

Description

明 細 書
j3 -ディフェンシンを介した感染予防効果を有するビフィズス菌または乳 酸菌とそれを含有する食品 ·医薬品組成物
技術分野
[0001] 本発明は、抗菌ペプチドとして知られている j8—ディフェンシンの発現を促進し、感 染予防効果を発揮可能なビフィズス菌または乳酸菌、および上記菌を含有する食品 •医薬品組成物に関する。
[0002] 植物、昆虫、哺乳動物を含む高等動物等は、自己防衛のために抗菌物質を産生 する能力を有している。特に、皮膚、消化器、呼吸器などの外部と接触する粘膜上皮 細胞は、抗菌物質（内因性抗菌ペプチド)分泌能を有し、病原菌を排除する役割を 果たす。
[0003] 近年、大腸菌などにより誘導される抗菌ペプチドとして、ディフェンシンが注目され ている。ディフェンシンは、 6つのシスティン残基による 3つの S— S結合を持ち、 S— S結合の違いから α ディフェンシン、 j8—ディフェンシンに分けられる。 α—ディフ ヱンシンは主に、好中球などから、 j8—ディフェンシンは消化管、皮膚、口腔、気管な どの上皮細胞力 分泌される。
[0004] β—ディフェンシンとしては、 13—ディフェンシン 1〜3 (以下、ヒト 13—ディフェンシ ン 1, 2, 3を hBDl, 2, 3と省略する場合がある）が発見されている。 hBDlは構成的 に、 hBD2、 3は誘導的に発現する。
[0005] j8—ディフェンシンは、肥満細胞ゃ榭状細胞などに対する走ィ匕性を示し、自然免 疫系だけでなぐ獲得免疫系でも重要な働きを示すことが示唆されている。
[0006] 特にヒト β ディフェンシン 2は、大腸菌や齲蝕原因細菌（例えば Streptococcus mutans)、黄色ブドウ球菌などの病原菌に対して高い抗菌作用を示すことが知ら れている (非特許文献 1, 2)。
[0007] このような β ディフェンシンの抗菌作用を利用した食品または医薬品が開発でき れば、感染予防上極めて有用と考えられる。実際、ヒト j8—ディフェンシン 2の抗菌作 用に着目し、これを食品や医薬品に利用しょうとする動きがある。例えば、生体防御 機構の強化可能な食品、医薬品等を提供するため、 hBD2の mRNAを増幅可能なプ ライマーを用いて、抗菌ペプチドの産生を誘導または増強することのできる因子を食 品素材中から検出する方法が知られている（特許文献 1及び、その分割出願である 特許文献 2)。
[0008] 上記特許文献 1および 2の実施例は、複数種類の食品素材抽出液をヒト表皮角化 細胞に添加して培養し、各食品素材抽出液による、 hBD2発現増強効果を観察して いる。しかし、該実施例で使用された食品素材抽出液については、その性状などに 関し、必ずしも当業者が再現可能なほど特定されていない。特に、特許文献 1および 2の実施例で使用された食品として「ビフィズス菌末」なる物質の開示はあるが、該ビ フィズス菌の具体的な菌種ゃ「菌末」の特性につ 、て一切詳細な記載は ヽな 、。また 、特許文献 1および 2の実施例では、焼酎もろみ、ローストアマランス、甘酒、ロースト 小麦胚芽、ノ、イチユウ用濃縮ヨーグルトエキスに hBD2の誘導増強作用があることを 確認している力 一方、「ビフィズス菌末」による hBD2発現の誘導効果あるいは誘導 増強効果は確認されていない (特許文献 1および 2、実施例 4、実施例 6、票 4および 図 2)。
[0009] 一方、ワン 'ジ一（Wang G)等は、ヒト結腸由来の培養細胞である HT— 29におい て、ビフィズス菌（ビフイドバタテリゥム ·ロンガム（Bifidobacterium longum) )による j8—ディフェンシン 2の誘導能を評価し、熱処理されたビフィズス菌、ビフィズス菌の 細胞壁および細胞壁タンパク質力 HT-29における hBD2の産生が誘導されることを mRNAレベルで確認したと報告している（非特許文献 3)。し力し上記報告のように、ビ フィズス菌または処理物自身が hBD2を誘導するのであれば、ビフィズス菌を医薬品 や食品として摂取したとしても、ビフィズス菌が排除されるべき微生物と認識されてし まうことになつてしまい、上記報告は、ビフィズス菌を感染予防物質として有効利用す ることを、反って否定することになりかねない。
[0010] 特許文献 1 :特開平 11 286496号公報
特許文献 2：特開 2004 - 248676号公報
非特許文献 1 :ジヨリー S他， J. Clinc. Microbiol, 2004年，第 42卷，第 3号， p. 10 24- 1029 非特許文献 2 :ミドリカヮ K他， Infect. Immun. , 2003年，第 71卷，第 7号， p. 373 0- 3739
非特許文献 3 :ワン 'ジ一他， Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 200 3年 10月，第 34卷，第 4号， p. 622-624
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しょうとする課題 は、簡便な手段で抗菌ペプチドとして有用と考えられる )8—ディフェンシンの発現を 促進し、その発現量を増加させることにより、より高い感染予防効果を有する、食品ま たは医薬品に利用可能な微生物を提供することである。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明者等は、上記課題を解決すベぐ鋭意努力した。本発明者等は、各種ビフィ ズス菌を培養して HT-29細胞（ヒト腸上皮由来細胞株）に添カ卩し、 hBD2の発現量へ のビフィズス菌による影響を観察した。具体的には、第一の実験系において、まずビ フィズス菌刺激処理を行い、一定時間後に大腸菌刺激処理を行った。第二の実験系 において、ビフィズス菌と大腸菌の共培養処理 (共刺激処理)を行った。第三の実験 系において、ビフィズス菌単独刺激処理を行った。この検討において、 HT-29細胞に ビフィズス菌単独刺激を行った場合にはディフェンシン発現促進効果は認められな かった。しかし、ビフィズス菌を大腸菌よりも先にまたは同時に上皮細胞等に暴露した 場合には、大腸菌などの刺激により HT-29細胞がディフェンシンを発現する作用が 促進され、大腸菌単独刺激の場合に比べてより高いディフェンシン発現量増加が導 かれることが、この検討によって初めて明らかになった。本発明者等は、上記検討に より、ビフィズス菌が |8—ディフェンシン発現促進効果を有することを証明したのみな らず、ビフィズス菌自体は /3一ディフェンシンによる排除対象ではな 、ことを明らかに した。この知見は、ビフィズス菌が感染予防作用を有する食品や医薬品として有効で あることを強く示唆するものである。すなわち本発明は、 j8—ディフェンシン発現促進 作用を有する微生物に関し、具体的には下記の発明を提供するものである。
[0013] (1) j8—ディフェンシンの発現量を高めることにより感染予防作用を有するビフィズ ス菌または乳酸菌、
(2) 動物細胞を前もって感作することで、動物細胞が微生物に接した際に、 β—デ ィフェンシンの発現量を 10倍以上に高めることができる、予防作用を発揮するビフィ ズス菌または乳酸菌、
(3) 微生物感染時に j8—ディフェンシン発現量を高め殺菌作用を強めるビフィズス 菌または乳酸菌、
(4) 動物細胞が微生物に接した際に、該微生物と共に動物細胞に作用することで、 ディフェンシンの発現量を 10倍以上に高める作用を有するビフィズス菌または 乳酸菌、
(5) 前記ビフィズス菌カ ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム、ビフイドバタテリゥム ·ロン ガム、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、ビフイドバタテリゥム 'インファンテイス、ビフイド バタテリゥム.カテヌラータム、ビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム、ビフイドバタテリ ゥム ·アドレツセンティスカもなる群より選ばれた少なくとも 1つである、上記（1)から (4 )に記載のビフィズス菌。
(6) 前記ビフィズス菌カ ビフイドバタテリゥム'ビフィダム JCM1255T菌株、ビフイド バタテリゥム.ビフィダム OLB6374菌株、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378 菌株、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム JCM1217T菌株、ビフイドバタテリゥム 'アドレツセ ンテイス JCM1275T菌株の群力も選ばれた少なくとも 1つの菌株である、上記（1)か ら（4)に記載のビフィズス菌。
(7) 前記微生物が、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、コレラ菌、チフス菌、 Pseudomo nas aeruginosa^ Streptococcus goraonii、 Porphylomonas gingivalis、 Actinobacillis act inomycetemcomitans、 Staphylococcus epidermidis、及び Streptococcus pyogenes力ら なる群より選ばれた少なくとも 1種の微生物であることを特徴とする、上記（2)から (4) のいずれかに記載のビフィズス菌または乳酸菌。
(8) ビフイドバタテリゥム.ビフィダム JCM1255T菌株、ビフイドバタテリゥム.ビフイダ ム OLB6374菌株、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378菌株、ビフイドバタテリ ゥム ·ロンガム JCM 1217菌株の群力も選ばれた少なくとも 1つの菌株であることを特 徴とする、動物細胞を前もって感作することで、動物細胞が微生物に接した際に、 13 一ディフェンシンの発現量を 10倍以上に高めることができる、予防作用を発揮するビ フィス、ス菌。
(9) ビフイドバクテリウム'ビフィダム OLB6374菌株、ビフイドバクテリウム'アドレツセ ンテイス JCM1275T¾株の群力も選ばれた少なくとも 1つの菌株であることを特徴と する、動物細胞が微生物に接した際に、微生物と共に動物細胞に作用することで、 β ディフェンシンの発現量を 5倍以上に高める作用を有するビフィズス菌。
(10) β—ディフェンシン力ヒト j8—ディフェンシン 2である、上記（1)から（7)のいず れかに記載のビフィズス菌または乳酸菌。
(11) 上記（1)から（10)の 、ずれかに記載のビフィズス菌及び Zまたは乳酸菌を有 効成分として含有し、 β ディフェンシンの発現量を高めることにより感染予防作用 を有する食品 ·医薬品組成物。
(12) 上記（1)から（10)の 、ずれかに記載のビフィズス菌及び Ζまたは乳酸菌を有 効成分として含有し、微生物感染時に j8—ディフェンシン発現量を高めることができ る、感染予防作用を有する食品 ·医薬品組成物。
(13) β一ディフェンシン発現促進能を有するビフィズス菌または乳酸菌、ある!/ヽは 上記いずれかの菌の処理物のいずれかを含有する、飲食品または医薬品。
(14) ビフィズス菌がビフイドバタテリゥム'ビフィダム JCM1255T菌株、ビフイドバクテ リウム ·ビフィダム OLB6374菌株、ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB6378菌株、 ビフイドバタテリゥム 'ロンガム JCM1217T菌株、ビフイドバタテリゥム 'アドレツセンティ ス JCM1275T¾株力もなる群より選ばれる少なくとも一つの菌株である、上記（13)記 載の飲食品または医薬品。
(15) ビフイドバクテリウム'ビフィダム OLB6374菌株（受託番号 NITE BP-123)、ま たはビフイドバクテリウム'ビフィダム OLB6378菌株（受託番号 NITE BP-31)である ビフィズス菌。
(16) β一ディフェンシン発現促進能を有するビフィズス菌または乳酸菌を投与する 工程を含む、微生物感染症の予防または治療方法。
(17)微生物感染症の予防または治療用食品を製造するための、 β—ディフェンシン 発現促進能を有するビフィズス菌または乳酸菌の使用。 (18)微生物感染症の予防または治療用医薬品を製造するための、 β—ディフェン シン発現促進能を有するビフィズス菌または乳酸菌の使用。 発明の効果
[0014] 本発明によって、動物細胞の β一ディフェンシン発現を促進するビフィズス菌及び 乳酸菌が提供された。本発明によるビフィズス菌及び Ζまたは乳酸菌を動物に投与 することで、病原菌感染時の 一ディフェンシンの発現量を高め、病原菌感染を簡 便に予防できる。また、特に大腸菌などの病原菌が侵入 ·増殖した際は、本発明によ るビフィズス菌及び乳酸菌は、 β一ディフェンシンの発現を強く促進することができ、 その結果、感染予防または治療効果を発揮すると考えられる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]実験例 1による誘導実験におけるヒト β一ディフェンシン 2の発現量 (ビフィズス 菌 5時間培養の後、大腸菌添加後 1時間培養)を示すグラフである。大腸菌 (E.coli J CM1649T)のみで誘導した場合の値を 1として示す。
[図 2]実験例 1による誘導実験におけるヒト β一ディフェンシン 2の発現量 (ビフィズス 菌 5時間培養の後、大腸菌添加後 3時間培養)を示すグラフである。大腸菌 (E.coli J CM1649T)のみで誘導した場合の値を 1として示す。
[図 3]実験例 2による誘導実験におけるヒト β一ディフェンシン 2の発現量 (大腸菌とビ フィズス菌、双方の存在下での 1時間培養）を示すグラフである。大腸菌（E.coli JCM 1649τ)のみで誘導した場合の値を 1として示す。
[図 4]実験例 2による誘導実験におけるヒト β一ディフェンシン 2の発現量 (大腸菌とビ フィズス菌、双方の存在下での 3時間培養）を示すグラフである。大腸菌（E.coli JCM 1649τ)のみで誘導した場合の値を 1として示す。
[図 5]実験例 3による誘導実験におけるヒト β一ディフェンシン 2の発現量 (大腸菌、各 ビフィズス菌、単独存在下での 1時間培養）を示すグラフである。大腸菌（E.coli JCM1 649τ)によって誘導した場合の値を 1として示す。
[図 6]実験例 3による誘導実験におけるヒト β一ディフェンシン 2の発現量 (大腸菌、各 ビフィズス菌、単独存在下での 3時間培養）を示すグラフである。大腸菌（E.coli JCM1 649τ)によって誘導した場合の値を 1として示す。 発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、 β一ディフェンシンの発現量を高めることにより感染予防作用を有する ビフィズス菌または乳酸菌を提供する。本発明者らは、動物細胞における |8—ディフ ンシン発現が大腸菌処理によって誘導される場合に、該動物細胞に対し、大腸菌 処理と同時にまたは事前にビフィズス菌処理を施すことによって、 j8—ディフェンシン 発現量が著しく増加することを確認した。本発明において j8—ディフェンシン発現量 とは、 j8—ディフェンシンタンパク質の産生量を意味する。
[0017] 本発明のビフィズス菌または乳酸菌を動物細胞に接触させると、その後、該動物細 胞が病原菌などの微生物に接触した場合に誘導される β一ディフェンシン発現量を 増加させることができる。本発明のビフィズス菌または乳酸菌による j8—ディフェンシ ン発現量増加効果は顕著であり、例えば、本発明のビフィズス菌または乳酸菌で動 物細胞を前もって感作することで、該動物細胞が微生物に接触した場合の j8—ディ フェンシン発現量を、 10倍、さらには 20倍以上に増加させることができる。したがって 、本発明のビフィズス菌または乳酸菌をヒトを始めとする動物に投与すれば、その後 に該動物が微生物に感染することを予防することができる。
[0018] または、本発明のビフィズス菌または乳酸菌を、病原菌などの微生物と同時に動物 細胞に接触させることにより、該動物細胞における j8—ディフェンシン発現量を増加 させることもできる。本発明のビフィズス菌または乳酸菌をこのように使用した場合も、 その j8—ディフェンシン発現促進効果は顕著であり、例えば実施例にあるように、発 現量を 10倍以上までに促進することも可能である。したがって、本発明のビフィズス 菌または乳酸菌を、微生物に感染したヒト等の動物に投与することにより、微生物感 染を緩和または治療することが可能と考えられる。
[0019] 本発明の乳酸菌としては、特に種類は限定されないが、例えばストレプトコッカス科 のグフム陽'性球菌 (Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc の St鳥)およ び乳酸桿菌科のグラム陽性桿菌 (Lactobacillus 属）等を挙げることができる。
[0020] 本発明のビフィズス菌としては、特に種類は限定されな 、が、例えば、ビフイドパク テリゥム'ビフィダム、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、ビ フイドバタテリゥム 'インファンテイス、ビフイドバタテリゥム'カテヌラータム、ビフイドバタ テリゥム 'アドレツセンテイス、ビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム等が挙げられる。さ らに具体的には、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム JCM1255T¾株、ビフイドバクテリウ ム'ビフィダム OLB6374菌株、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378菌株、ビフ イドバタテリゥム'ロンガム JCM 1217丁菌株、ビフイドバタテリゥム ·ブレーべ JCM 1192 丁菌株、ビフイドバタテリゥム 'インファンテイス JCM1222T菌株、ビフイドバクテリウム' カテヌラータム JCM1194T菌株、ビフイドバタテリゥム 'アドレツセンティス JCM1275T 菌株、ビフイドバクテリウム'シユードロンガム JCM1205T菌株等が挙げられる。
[0021] 本発明にお 、て、微生物感染予防を主目的としてビフィズス菌を用いるのであれば 、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム JCM1255T菌株、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム O LB6374菌株、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378菌株、ビフイドバタテリゥム •ロンガム JCM121ァ丁菌株、ビフイドバタテリゥム ·アドレツセンティス JCM1275菌株 の群力 選ばれた少なくとも 1つの菌株を選択することが好ましいが、 β -ディフェンシ ン発現促進効果を有するビフィズス菌株であれば、上記菌株に限らず、上記以外の 菌株ち使用することがでさる。
[0022] また本発明において、ビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB6374菌株、ビフイドバタ テリゥム 'アドレツセンティス JCM1275T¾株は、微生物感染した動物に投与する場 合、特にその効果を期待できるが、 ）8 -ディフェンシン発現促進効果を有するビフィズ ス菌株であれば、上記菌株に限らず、上記以外の菌株も使用することができる。
[0023] 本発明のビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB 6374菌株は下記の条件で寄託さ れている。
(1) 寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センタ
(2) 連絡先： 292— 0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8
電話番号 0438 - 20- 5580
(3)受託番号： NITE BP— 123
(4) 原寄託の受託番号（国内寄託の受託番号）： NITE P— 123
(5) 識別のための表示： Bifidobacterium bifidum OLB 6374 (6) 原寄託日： 平成 17年 (2005年) 8月 4日
(7) ブダペスト条約に基づく寄託への移管日：2006年 8月 9日
[0024] 本発明のビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB 6374菌株は、以下の菌学的性質 を有するものである。
[0025] ビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB 6374菌株は、ヒト糞便力も分離されたグラム 陽性偏性嫌気性桿菌である。菌形状は桿菌または分岐状の多形であり、芽胞の形 成、運動性はない。 BL寒天培地 (栄研)平板上で本菌を塗布し、 AnaeroPack'ケン キ (三菱ガス化学製)使用による嫌気状態にて 37°C48時間培養すると、不透明な円 形半球状の光沢を有するコロニーを形成する。また本菌株は、下記に示す 16S rRNA 領域の種特異的プライマー (腸内フローラシンポジウム 8、腸内フローラの分子生物 学的検出 '同定、光岡知足、松本隆広)を用いて PCR法を行うとき、 PCR産物を確認 できる。
BiBIF-1： CCA CAT GAT CGC ATG TGA TT (配列番号： 1)
BiBIF-2: CCG AAG GCT TGC TCC CAA A (配列番号： 2)
[0026] 本発明で用いるビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB 6378菌株は下記の条件で 寄託されている。
(1) 寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センタ
(2) 連絡先： 292— 0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8
電話番号 0438 - 20- 5580
(3) 受託番号： NITE BP— 31
(4)原寄託の受託番号： NITE P— 31
(5) 識別のための表示： Bifidobacterium bifidum OLB 6378
(6) 原寄託日： 平成 16年（2004年） 10月 26日
(7) ブダペスト条約に基づく寄託への移管日：2006年 1月 18日
[0027] 本発明のビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB 6378菌株は、以下の菌学的性質 を有するものである。
[0028] ビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB 6378菌株は、ヒト糞便力も分離されたグラム 陽性偏性嫌気性桿菌であり、菌形状は桿菌または分岐状の多形であり、芽胞の形成
、運動性はない。 BL寒天培地（栄研）平板上で本菌を塗布し、 AnaeroPack'ケンキ (三菱ガス化学製)使用による嫌気状態にて 37°C48時間培養すると、不透明な円形 半球状の光沢を有するコロニーを形成する。また、上述の 16S rRNA領域の種特異的 プライマー（配列番号： 1および 2)を用いて PCR法を行うとき、 PCR産物を確認できる。
[0029] 本発明のビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB 6374菌株およびビフイドバクテリウ ム'ビフィダム OLB 6378菌株は、動物細胞の微生物感染に先立って動物細胞と接 触させても、微生物に感染した動物細胞に接触させても、 β ディフェンシン発現促 進効果を発揮することができる。特に、動物細胞の微生物感染に先立って動物細胞 と接触させる場合に際立った効果を示すことが確認されており、本発明の上記菌株 を感染予防用医薬品または食品として応用した場合には、極めて優れた効果を発揮 するものと期待できる。
[0030] 本発明のビフィズス菌または乳酸菌によって感染予防可能な微生物は、特に限定 されないが、主に j8—ディフェンシン感受性を有する微生物、その中でも好ましくは 病原性微生物 (病原菌）である。このような微生物の例として、大腸菌、 Pseudomon as aeruginosa, (Harder J.他 Am. J. Respir Cell Mol. Biol. 2000年，第 22卷， p. 714— 21)、 Salmonella enteritidis (Ogushi K. 他 J. Biol. Chem . , 2001年，第 276卷，第 32号， p. 30521— 30526)、 Streptococcus gordonii , Porphyiomonas gmgivalis, Actinobacilns actinomycetemcomitans, Sta phylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes (Whasun O.他, Infe ct. Immun. , 2004年，第 72卷，第 1号， p. 352— 358)等を挙げ、ること力 Sできる。 また上記のほか、サルモネラ菌、赤痢菌、コレラ菌、チフス菌感染に対しても、本発明 のビフィズス菌または乳酸菌は有効に予防効果を発揮するものと考えられる。
[0031] また本発明にお 、て「動物細胞」とは、動物由来の細胞であれば特に問わな 、が、 好ましい例として、腸、口腔内、気管、皮膚などの上皮細胞、臓器の細胞など j8—デ ィフェンシンを発現する細胞が挙げられる。また、 in vivoの動物細胞、動物から分離し たフレッシュな細胞、動物由来の初代培養細胞、動物由来の細胞株は本発明の「動 物細胞」に含まれる。 [0032] 本発明のビフィズス菌または乳酸菌は、医薬品または飲食品として利用することも できる。本発明のビフィズス菌または乳酸菌を含む医薬品または食品は、 β—ディフ ェンシン 2発現促進効果を有する点で有用であり、特に、微生物感染予防または感 染治療用の医薬品または飲食品として利用できる。本発明のビフィズス菌または乳酸 菌を医薬品または飲食品として利用する場合には、単独の菌株を使用してもよぐま たは 2以上の菌株を組み合わせて使用してもよい。
[0033] 本発明のビフィズス菌または乳酸菌を上記医薬品または飲食品に使用するにあた り、その状態は問わない。例えば、本発明のビフィズス菌または乳酸菌は、生菌、死 菌、または処理物であっても上記医薬品または飲食品に使用できる。例えば、本発 明のビフィズス菌または乳酸菌の培養物、その濃縮物、ペースト状に加工したペース ト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、媒体に分散させた液 状物、希釈剤で希釈した希釈物、乾燥物をミルなどで破砕した破砕物などを上記医 薬品または飲食品に用いることが出来る。
[0034] さらに本発明の飲食品は、、保健機能食品や病者用食品にも適用することができる 。保健機能食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性 を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として 設けられたもので、特定保健用食品 (個別許可型)と栄養機能食品 (規格基準型)の 2種類の類型からなる。本発明のビフィズス菌または乳酸菌を、特定保健用食品等の 特別用途食品や栄養機能食品として、ヒト等の動物に投与することにより各種の感染 に対する予防が可能となる。
[0035] 本発明のビフィズス菌または乳酸菌を飲食品として利用する場合、飲食品の種類 は特に限定されない。例えば、各種飲食品 (牛乳、加工乳、清涼飲料、発酵乳、ョー ダルト、チーズ、その他の乳製品、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製 粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品 等）に加工することができる。このような飲食品の製造にあたっては、本発明のビフィ ズス菌または乳酸菌やその処理物をそのまま使用したり、他の食品ないし食品成分と 混合するなど、通常の食品組成物における製法にしたがうことができる。また、飲食 品の形状についても特に限定されず、通常用いられる飲食品の形状であれば特に 問わない。、例えば、固体状 (粉末、顆粒状を含む)、ペースト状、液状、懸濁状など の形状の 、ずれでもよく、またこれらに限定されな 、。
[0036] 本発明のビフィズス菌または乳酸菌を含有する飲食物には、水、タンパク質、糖質 、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等、通常の 食品に含まれる成分であればいずれであっても含めることができる。上記飲食物の製 造において、タンパク質源として、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼ イン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物 、 α—カゼイン、 β—カゼイン、 κ—カゼイン、 j8—ラクトグロブリン、 α—ラクトアルブ ミン、ラタトフヱリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タ ンパク質、これら加水分解物等の、食品製造に通常使用されるタンパク質またはタン ノ ク質含有原材料を使用することができる。糖類の供給源の例としては、加工澱粉（ テキストリンのほか、可溶性澱粉、プリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、 澱粉エーテル等)、食物繊維などが挙げられる。脂質源としては、例えば、ラード、魚 油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂;パーム油、 サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル 交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミン Α、 カロチン類、ビタミン Β群、ビタミン C、ビタミン D群、ビタミン E、ビタミン K群、ビタミン P 、ビタミン Q、ナイァシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビォチン、イノシトール、コリン、 葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシゥ ム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例 えば、リンゴ酸、クェン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。バター、乳性ミネラル、ク リーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分な どは本発明のビフィズス菌または乳酸菌を含有する飲食品の製造に好適に用いるこ とのできる成分の例である。。これらの成分は、 2種以上を組み合わせて使用すること ができる。また上記原材料は、天然物、天然物加工品、合成品及び Z又はこれらを 多く含む食品の 、ずれを用いてもょ 、。
[0037] 本発明のビフィズス菌または乳酸菌は、感染予防または治療用医薬品とすることが できる。上記医薬品を製造する場合、本発明のビフィズス菌または乳酸菌は、生菌、 または殺菌後、破砕あるいは未粉砕した処理物として使用することができる。また、使 用する菌は単独でも、複数種であってもよい。
[0038] 上記医薬品中における本発明のビフィズス菌または乳酸菌の量は、その目的、用 途 (予防剤、治療剤等）に応じて任意に定めることができる。含量の一例として、全体 量に対して 0. 001〜100% (wZw)、特に 0. 1〜100%を示すことができる力 本 発明はこれに限定されない。
[0039] 本発明のビフィズス菌または乳酸菌を有効成分とする医薬品の投与量は、投与経 路、ヒトを含む投与対象動物の年齢、体重、症状など、種々の要因を考慮して、適宜 設定することができる。適当な投与量の一例として、有効成分として 1〜： LOOOmgZk gZdayを挙げることができるが、本発明はこれに限定されない。例えば、長期間に亘 つて予防目的で摂取する場合には、上記範囲よりも少量であってもよい。また本有効 成分は安全性の問題が見当たらないため、上記範囲よりも多量に使用してもさしつか えないと考えられる。
[0040] 上記医薬品の剤型は、本発明のビフィズス菌または乳酸菌を腸内に到達させるた め、経口投与が可能な剤型が好ましい。本発明による医薬品の好ましい剤型の例と しては、例えば錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、トロ 一チ剤等をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬である本発 明の菌体および Zまたは処理物に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯 味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの、医薬の製剤技術分野にお いて通常使用しうる補助剤を用いて製剤化することができる。
[0041] 本発明のビフィズス菌または乳酸菌は、上皮細胞などの動物細胞を前もって感作 することで、当該動物細胞が多量の病原菌に接した際に、 j8—ディフェンシンの発現 量を病原菌のみに接した場合の発現量の 10倍以上に高めて、予防作用を発揮する また、本発明のビフィズス菌または乳酸菌は、動物細胞が多量の大腸菌などの病 原菌に接した際に、病原菌と共に存在し動物細胞に作用することで、 β ディフェン シンの発現量を 10倍以上に高める作用を有する。
[0042] このように、本発明のビフィズス菌または乳酸菌によって、大腸菌などの病原菌より 誘導される j8—ディフェンシンの発現が著しく促進され、その量が増加することになる 。本発明のビフィズス菌または乳酸菌を摂取し、本発明のビフィズス菌または乳酸菌 ビフィズス菌が優位な菌叢をあらかじめ形成することにより、大腸菌などが動物体内 に侵入または増殖した場合に β一ディフェンシンの誘導を強く促進することができる
[0043] なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0044] 以下、本発明を実施例を挙げて説明する力 本発明はこれらにより限定されるもの ではない。
[0045] [実験例 1] (ビフィズス菌での刺激処理後、大腸菌による誘導実験）
96穴プレート（BECTON DICKINSON cat: 353072)に HT— 29細胞を、 37 °C、 5%COの雰囲気下でコンフルェントにまで培養した。
2
ついで、培養上清を除去し、 RPMI培地（GIBCO)で洗浄した。
予め 60°C 60分間熱処理を施した各ビフィズス菌の PBS懸濁液を、 1 X 107cells /mlになるように RPMI培地に調製し、 lwellあたり 200 μ 1添カ卩した。
このプレートを 37°C、 5%COの雰囲気下、 5時間培養した後、上清を除去し、 RP
2
Ml培地で洗浄した。
別途、 60°C 60分間熱処理を施した E. coli JCM1649Tの PBS懸濁液を、 1 X 108c ellsZmlになるように RPMI培地に調製し、 lwellあたり 200 1添カ卩して、一定時間 37°C、 5%COの培養条件で培養した。陰性対照として、 RPMI培地のみを lwellあ
2
たり 200 1添加した。
E. coliの添加から 1時間後、 3時間後のそれぞれの培養時間後の培養上清を採 取して、遠心分離機により遠心分離し（3000rpm、 10分、 4°C)、 ディフヱンシン 2の測定試料とした。
[0046] [実験例 2] (大腸菌とビフィズス菌とを同時に使用した誘導実験）
96穴プレート（BECTON DICKINSON cat: 353072)に HT— 29細胞を、 37 °C、 5%COの雰囲気下でコンフルェントにまで培養した。 ついで、培養上清を除去し、 RPMI培地（GIBCO)で洗浄した。
予め 60°C 60分間熱処理を施した E. coli JCM1649Tの PBS懸濁液と各ビフィズス 菌の PBS懸濁液とをそれぞれ 1 X 108cellsZml各ビフィズス菌の PBS懸濁液を 1 X 107cellsZmlになるように RPMI培地に調製し、 lwellあたり合計で 200 μ 1添加した 。陰性対照として、 RPMI培地のみを lwellあたり 200 μ 1添カ卩した。
このプレートを 37°C、 5%COの雰囲気下、 5時間培養した。
2
E. coli及びビフィズス菌の添加から 1時間後、 3時間後のそれぞれの培養時間後 の培養上清を採取して、遠心分離機により遠心分離し (3000rpm、 10分、 4°C)、 β ディフヱンシン 2の測定試料とした。
[0047] [実験例 3] (大腸菌またはビフィズス菌単独刺激処理による ΗΤ— 29細胞の比較誘 導実験）
96穴プレート（BECTON DICKINSON cat: 353072)に HT— 29細胞を、 37 °C、 5%COの雰囲気下でコンフルェントにまで培養した。
2
ついで、培養上清を除去し、 RPMI培地（GIBCO)で洗浄した。
別途、予め 60°C 60分間熱処理を施した E. coli JCM1649T (あるいは各ビフィズス 菌）の PBS懸濁液を、 l X 108cellsZmlとなるように RPMI培地に調製し、 lwellあた り 200 1添加して、このプレートを 37°C、 5%COの雰囲気下で培養した。陰性対照
2
として、 RPMI培地のみを lwellあたり 200 μ 1添カ卩した。
添加した後、 1時間後、 3時間後のそれぞれの培養時間後の培養上清を採取して、 遠心分離機により遠心分離し（3000rpm、 10分、 4°C)、 j8—ディフヱンシン 2の測定 試料とした。
[0048] [実験例 4] ( β ディフェンシン 2のサンドイッチ ELISA法による測定）
96穴プレート（NUNC cat:4394521)にコーティングバッファー（0. 1M炭酸緩 衝液 pH9. 6)で 1000倍に希釈した抗ヒト j8—ディフェンシン 2ヒッジ抗体（Santa C ruz Biotechnology cat: SC— 10854)を ΙΟΟ Ι/well添カロした。
これを 37°Cで 90分間反応させ、その後、 0. 01M PBS-Tween (pH7. 2)で 3 回洗净した。
ついで、ブロッキング溶液（1%FCS 3% PEG 0. 01M PBS— Tween)を 20 0 μ lZwell添カ卩し、 37°Cで 30分間反応させた。
サンプル希釈液（3% PEG 0. 01M PBS— Tween)で希釈した測定試料（実 施例 1〜3)またはヒト j8—ディフェンシン 2標準溶液（SIGMA cat: D9690 適宜 希釈）を 100 μ lZwell添カ卩して、 37°Cで 90分間反応させた。
これを 0. 01M PBS— Tween (pH7. 2)で 3回洗浄し、 1%FCS 3% PEG 0. 01M PBS—Tween溶液で 1000倍に希釈した抗ヒト j8—ディフェンシン 2ゥサギ抗 体（Santa Cruz Biotechnology cat: SC— 20798)を 100 lZwell添カ卩した。 これを 37°Cで 60分間反応させ、 0. 01M PBS -Tween (pH7. 2)で 3回洗浄した
1%FCS 3% PEG 0. 01M PBS— Tween溶液で 10000倍に希釈したペル ォキシダーゼ標識抗ゥサギ IgG抗体（CHEMICON cat： AP188P)を 100 μ \/ well添カ卩して、これを 37°Cで 60分間反応させた。
これを 0. 01M PBS -Tween (pH7. 2)で 3回洗浄し、 TMBペルォキシダーゼ 基質溶液 (KPL cat: 50— 76— 00)を 100 lZwell添加して、 37°Cで 30分間反 応させた。ついで 2N H SOを 100 lZwell添カ卩した。その後に、マイクロプレート
2 4
リーダーにて測定 (450nm)を行った。
[実施例及び比較例]
[表 1]
β一ディフェンシン 2¾ϋ¾ vs E.coli 培養時間 ー1時 3時間 菌株 平均 標準偏差 平均 標準偏差
B. bifidum JCM1255T ビフィ くクテリウム■ビフィダム JCM 1255τ 23.325 35.924 6.388 3.913
B. bifidum OLB6374 ビフイドバクテリウム'ビフィダム OLB6374 5.315 5.762 18.643 2.945
B. bfidum OLB6374 ビフイドバクテリウム'ビフィダム OLB6374 6.866 7.953 18.032 1.909
B. longum JCM 1217T ビフイドバクテリウム'ロンガム JCM121 7T 33.646 41.143 4.239 4.833
B. longum MEP1704401 ビフイドバクテリウム'ロンガム MEP1704401 1 1.861 14.843 3.697 3.786
B. longum MEP1704402 ビフイドバクテリゥム'ロンガム MEP1704402 1 1.262 1 1.659 6.421 7.109
B. breve JC 1 192T ビフイドバクテリウム'ブレーべ JCM1 192T 7.588 8.043 6.776 3.376
B. breve MEP1704403 ビフイドバクテリウム'ブレーべ ΜΕΡΠ04403 38.934 60.193 15.083 4.390
B. breve MEP 1704404 ビフイドバクテリウム'ブレーべ MEP1704404 3.280 0.640 4.464 1.518
B. infantis JCM12221 ビフイドバクテリウム'インファンテイス JCM1222T 4.859 2.935 4.744 3.004
B. infantis MEP 1704405 ビフイド/くクテリウム■インファンテイス MEP1 704405 0.941 0.367 10.252 6.647
B. infantis MEP 1704406 ビフイドバクテリウム'インファンテイス MEP1 704406 1.778 1.032 4.452 1.100
B. catenulatum JC 1 194T ビフイドパクテリゥム '力テヌラータム JCM1 194T 6.826 1 1.823 0.820 0.617
B. catenulatum MEP 1704407 ビフイド/くクテリゥム'力テヌラ一タム MEP1704407 1.1 13 1.192 1.405 1.128
B. catenulatum MEP 1704408 ビフイド/くクテリウム■力テヌラ一タム MEP1704408 2.897 1.660 2.549 0.776
B. adolescentis JCM1275T ビフィ くクテリゥム 'アドレツセンティス JCM1275τ 3.881 0.991 2.814 1.699
B. adolescentis MEP 1704409 ビフイド/くク亍リウム 'アドレツセンティス ΜΕΡ1704409 4.774 6.1 16 4.693 2.201
B. adolescentis MEP 1704410 ビフイドバクテリゥム 'アドレツセンティス ΜΕΡ1 704410 6.880 2.591 2.248 1.745
B. pseudolongum JCM1 20o ビフイドバク亍リウム'シュ一ドロンガム JCM1205T 3.002 3.265 2.256 0.272
B. pseudolongum MEP 170441 1ビフイドバク亍リウム'シュ一ドロンガム MEP170441 1 3.272 2.137 2.188 1.963
E. coli JCM 1649 1.000 0.064 1.000 0.507 陰性対照 0.000 0.000 0.000 0.000
Figure imgf000020_0001
B. longum MEP1 704402 ビフイドバクテリウム'ロンガム MEP1704402 7.575 3.389 2.685 1.251
B. breve JCM1 192T ビフイドバクテリゥム 'ブレーべ JCM1 192T 17.480 0.320 6.078 1.902
B. breve MEP1 704403 ビフイドバクテリゥム'ブレ一ベ MEP1 704403 16.524 4.288 6.902 2.533
B. breve MEP 1 704404 ビフイドバクテリウム'ブレーべ MEP1 704404 4.461 2.017 1 1.777 18.375
B. infantis JCM1222T ビフイドバクテリゥム 'インファンテイス JCM1222T 7.840 2.036 2.183 0.895
B. infantis MEP1704405 ビフィドノくクテリゥム'インファンテイス MEP1704405 5.553 4.019 5.052 2.261
B. infantis MEP 1704406 ビフイド/くクテリウム■インファンテイス MEP1704406 1.774 0.123 2.815 0.282
B. catenulatum JCM1 194T ビフイドバクテリゥム '力テヌラ一タム JCM 1 194T 6.992 1.050 7.132 0.61 1
B. catenulatum EP1704407 ビフイド/くクテリゥム■力テヌラ一タム MEP1704407 18.031 1 1.701 12.855 1.762
B. catenulatum MEP1704408 ビフイド/くクテリゥム■力テヌラ一タム MEP1704408 24.631 6.392 27.524 27.800
B. adolescentis JCM1275T ビフイドバク亍リウム'アドレツセンティス JCM 12751 81.219 17.506 8.434 0.378
B. adolescentis MEP1704409 ビフイドバクテリウム'アドレツセン亍イス MEP1704409 1 7.337 13.628 8.992 5.504
B. adolescentis MEP1704410 ビフイドバクテリウム'アドレツセンティス MEP1704410 27.620 7.361 7.180 1.407
B. pseudolongum JCM1203 ビフイド/くクテリゥム■シュ一ドロンガム JCM1205τ 18.787 12.502 2.969 0.514
B. pseudolongum MEP170441 1ビフイド/くクテリゥム■シュ一ドロンガム ΜΕΡ1 70441 1 6.285 0.761 5.497 0.890
E. coli JCM1649 1.000 0.680 1.000 0.083 陰性対照 0.000 0.000 0.151 0.017
。 ^^^^鶯室都^〕^図 s¾^^i¾^：！:^¾;¾0052！：！：！l613：8〜〜〜. βーデ フェンシン 量 vs E.coli 培養時間 1時間 3Bf間 一— 菌株 平均 標準偏差 平均 標準偏差
B. bifidum JCM12551" ビフイドバクテリゥム ■ビフィダム JCM1255T 0.017 0.015 0.060 0.042
B. bifidum OLB6374 ビフイドバクテリゥム ■ビフィダム OLB6374 0.020 0.018 0.000 0.000
B. bfidum OLB6374 ビフイドバクテリゥム 'ビフィダム OLB6374 0.013 0.023 0.087 0.063
B. longum JCM1217T ビフイドバクテリゥム •ロンガム JCM1217T 0.033 0.005 0.046 0.065
B. longum MEP1 704401 ビフイドバク亍リウム-ロンガム MEP1704401 0.01 1 0.019 0.068 0.096
B. longum MEP1 704402 ビフイドバク亍リウム-ロンガム MEP1704402 0.000 0.000 0.168 0.052
B. breve JCM1 192T ビフイドバクテリゥム -ブレ一ベ JCM1 192T 0.000 0.000 0.102 0.073
B. breve MEP1 704403 ビフイドバクテリゥム 'ブレ一ベ MEP1704403 0.000 0.000 0.026 0.037
B. breve MEP 1 704404 ビフイドバクテリゥム ■ブレ一ベ MEP1704404 0.000 0.000 0.036 0.051
B. infantis JC 1222T ビフイドバクテリゥム ■インファンテイス JCM 1222T 0.000 0.000 0.000 0.000
B. infantis MEP 1704405 ビフイドバクテリゥム 'インファンテイス ΜΕΡΠ04405 0.000 0.000 0.025 0.036
B. infantis MEP 1704406 ビフイドバクテリゥム 'インファンテイス ΜΕΡΠ04406 0.000 0.000 0.000 0.000
B. catenulatum JCM1 194T ビフイドバクテリゥム ■カテヌラータム JCM1 194T 0.000 0.000 0.000 0.000
B. catenulatum MEP1704407 ビフイドバクテリゥム -カテヌラ一タム MEP 1704407 0.000 0.000 0.000 0.000
B. catenulatum MEP1704408 ビフイドバクテリゥム '力テヌラータム MEP 1704408 0.000 0.000 0.000 0.000
B. adolescentis JCM 1275T ビフイドバクテリウム-アドレツセンティス JCM1275T 0.000 0.000 0.000 0.000
B. adolescentis MEP1704409 ビフイドバクテリウム'アドレツセンテイス MEP1704409 0.000 0.000 0.000 0.000
B. adolescentis MEP1704410 ビフイドバクテリウム-アドレツセンテイス MEP1704410 0.000 0.000 0.000 0.000
B. pseudolongum JCM 1205T ビフイドバクテリゥム -シュ一ドロンガム JCM 1205T 0.000 0.000 0.000 0.000
B. pseudolongum MEP170441 1ビフイドバクテリゥム ■シュ一ドロンガム MEP170441 1 0.000 0.000 0.000 0.000
E. coli JCM1649 1.000 0.160 1.000 0.130 陰性対照 0.000 0.000 0.000 0.000
ン 2発現量 (タンパク質産生量)を 1とした時の相対量として)を、横軸は試験試料の 菌種を示す。図 1,2中の E. coli JCM1649Tは、実験例 1において各種ビフィズス菌の 代わりに培地のみを添加'洗浄後、 E. coli JCM1649Tを添カ卩した時の結果を示す。図 3,4中の E. coli JCM1649Tは、実験例 2において E. coli JCM1649Tのみを添カ卩した時 の結果を示す。実験例 1, 2, 3における |8—ディフェンシン 2の誘導実験では、 1 X 1 08 cellsZml濃度の E. coli JCM1649T溶液を用いた。表 1は図 1および図 2にグラフ として示された結果を数値で示したものである。表 2は図 3および図 4にグラフとして示 された結果を数値で示したものである。表 3は図 5および図 6にグラフとして示された 結果を数値で示したものである。ただし、表 1から 3は、図 1から 6に示された菌株に関 する検討結果とともに、さらに数菌株に関する検討結果を追加してある。
なお、名称に「OLB」の文字が入って!/ヽる菌株および「MEP」の文字が入って!/ヽる菌 株はヒト糞便力も分離した。また、名称に「JCM」の文字が入っている菌株は、独立行 政法人理ィ匕学研究所バイオリソースセンターから入手した。
[0053] 図 5及び 6のグラフ並びに表 3から明らかなように、大腸菌単独と比べ、各ビフィズス 菌単独ではほとんど j8—ディフェンシン 2の誘導能は無 、ことが分かる。
一方、図 1及び 2並びに表 1に示すビフィズス菌で予めビフィズス菌で刺激処理した 後に大腸菌を添加した結果によれば、いずれのビフィズス菌においても誘導効果は なかったが、発現量の増強については非常に高いレベルで j8—ディフェンシン 2が 発現していることが分力つた。これは予想し得ないレベルであり、本発明の有効性を 示すことが出来た。
また、同時に添カ卩した系である図 3及び 4並びに表 2の結果でも、予めビフィズス菌 で刺激処理した系の図 1及び 2並びに表 1に示す結果よりはやや劣る力 明らかに発 現量の増強効果があることが分かった。
産業上の利用可能性
[0054] 本発明により、抗菌ペプチドである j8—ディフェンシンの発現を促進するビフィズス 菌及び Zまたは乳酸菌を提供することができた。本発明のビフィズス菌および乳酸菌 を動物体内に投与することにより、体内で発現する抗菌ペプチド量を増加させること ができる。すなわち、本発明のビフィズス菌および乳酸菌は、感染予防または治療用 の医薬品または食品として利用でき、極めて有用である。

Claims

請求の範囲
[1] β一ディフェンシンの発現量を高めることにより感染予防作用を有するビフィズス菌 または乳酸菌。
[2] 動物細胞を前もって感作することで、動物細胞が微生物に接した際に、 β—ディフ ェンシンの発現量を 10倍以上に高めることができる、予防作用を発揮するビフィズス 菌または乳酸菌。
[3] 微生物感染時に β—ディフェンシン発現量を高め殺菌作用を強めるビフィズス菌ま たは乳酸菌。
[4] 動物細胞が微生物に接した際に、該微生物と共に動物細胞に作用することで、 β ディフェンシンの発現量を 10倍以上に高める作用を有するビフィズス菌または乳 酸菌。
[5] 前記ビフィズス菌カ ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム、ビフイドバタテリゥム ·ロンガム 、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、ビフイドバタテリゥム 'インファンテイス、ビフイドバクテ リウム'カテヌラータム、ビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム、ビフイドバクテリウム'ァ ドレツセンティスカもなる群より選ばれた少なくとも 1つである、請求項 1から 4に記載の ビフィズス菌。
[6] 前記ビフィズス菌カ ビフイドバタテリゥム'ビフィダム JCM1255T¾株、ビフイドバタ テリゥム'ビフィダム OLB6374菌株、ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム OLB6378菌株 、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム JCM1217T菌株、ビフイドバタテリゥム 'アドレツセンテ イス JCM1275T菌株の群から選ばれた少なくとも 1つの菌株である、請求項 1から 4に 記載のビフィズス菌。
[7] 前記微生物が、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、コレラ菌、チフス菌、 Pseudomonas aeruginosa^ Streptococcus gordonii、 Porphylomonas gingivalis、 Actinobacnlis actino mycetemcomitans、 Staphylococcus epidermidis、及び Streptococcus pyogenes力らな る群より選ばれた少なくとも 1種の微生物であることを特徴とする、請求項 2から 4のい ずれかに記載のビフィズス菌または乳酸菌。
[8] ビフイドバタテリゥム'ビフィダム JCM1255T菌株、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム O
LB6374菌株、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378菌株、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム JCM1217T¾株の群力も選ばれた少なくとも 1つの菌株であることを特徴と する、動物細胞を前もって感作することで、動物細胞が微生物に接した際に、 β—デ ィフェンシンの発現量を 10倍以上に高めることができる、予防作用を発揮するビフィ ズス菌。
[9] ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6374菌株、ビフイドバタテリゥム 'アドレツセンテ イス JCM1275T¾株の群力も選ばれた少なくとも 1つの菌株であることを特徴とする、 動物細胞が微生物に接した際に、微生物と共に動物細胞に作用することで、 βーデ ィフェンシンの発現量を 5倍以上に高める作用を有するビフィズス菌。
[10] β—ディフェンシンがヒト β—ディフェンシン 2である、請求項 1から 7のいずれかに 記載のビフィズス菌または乳酸菌。
[11] 請求項 1から 10のいずれかに記載のビフィズス菌及び Ζまたは乳酸菌を有効成分 として含有し、 β ディフェンシンの発現量を高めることにより感染予防作用を有する 食品 ·医薬品組成物。
[12] 請求項 1から 10のいずれかに記載のビフィズス菌及び Ζまたは乳酸菌を有効成分 として含有し、微生物感染時に j8—ディフェンシン発現量を高めることができる、感染 予防作用を有する食品 ·医薬品組成物。
[13] β一ディフェンシン発現促進能を有するビフィズス菌または乳酸菌、ある!/ヽは上記 いずれかの菌の処理物のいずれかを含有する、飲食品または医薬品。
[14] ビフィズス菌がビフイドバクテリウム'ビフィダム JCM1255T菌株、ビフイドバタテリゥム
'ビフィダム OLB6374菌株、ビフイドバタテリゥム'ビフィダム OLB6378菌株、ビフィ ドバクテリゥム.ロンガム JCM1217T菌株、ビフイドバタテリゥム 'アドレツセンティス JC Μ1275τ¾株力もなる群より選ばれる少なくとも一つの菌株である、請求項 13記載の 飲食品または医薬品。
[15] ビフイドバタテリゥム.ビフィダム OLB6374菌株（受託番号 NITE BP-123)、または ビフイドバクテリウム'ビフィダム OLB6378菌株（受託番号 NITE BP-31)であるビフィ ズス菌。
[16] |8—ディフェンシン発現促進能を有するビフィズス菌または乳酸菌を投与する工程を 含む、微生物感染症の予防または治療方法。
[17] 微生物感染症の予防または治療用食品を製造するための、 |8—ディフェンシン発現 促進能を有するビフィズス菌または乳酸菌の使用。
[18] 微生物感染症の予防または治療用医薬品を製造するための、 |8—ディフェンシン発 現促進能を有するビフィズス菌または乳酸菌の使用。
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