JPH11286496A - 抗菌ペプチド誘導及び／又は増強因子 - Google Patents
抗菌ペプチド誘導及び／又は増強因子Info
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- JPH11286496A JPH11286496A JP10365103A JP36510398A JPH11286496A JP H11286496 A JPH11286496 A JP H11286496A JP 10365103 A JP10365103 A JP 10365103A JP 36510398 A JP36510398 A JP 36510398A JP H11286496 A JPH11286496 A JP H11286496A
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- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Non-Alcoholic Beverages (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗菌ペプチドの産生を誘導及び／又は増
強することのできる因子を食品成分中から見出し、該因
子を配合する食品組成物及び医薬組成物を提供するこ
と。 【解決手段】 ヒト抗菌ペプチドの発現を誘導する因
子、例えば、ヒトβディフェンシン２（hBD-2)を含有す
る食品抽出物、該因子を配合する食品組成物、該因子を
含む医薬組成物、並びに該因子の検出法。
強することのできる因子を食品成分中から見出し、該因
子を配合する食品組成物及び医薬組成物を提供するこ
と。 【解決手段】 ヒト抗菌ペプチドの発現を誘導する因
子、例えば、ヒトβディフェンシン２（hBD-2)を含有す
る食品抽出物、該因子を配合する食品組成物、該因子を
含む医薬組成物、並びに該因子の検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、食品素材中に含ま
れる、抗菌ペプチドの産生を誘導及び／又は増強する因
子に関するものである。
れる、抗菌ペプチドの産生を誘導及び／又は増強する因
子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】免疫機構をもたない生物は、生体防御機
構として抗菌性物質を作りだし、細菌等の微生物の感染
などから身を守っているが、免疫機構を持つ脊椎動物も
抗菌（抗微生物活性）ペプチドといわれる物質を作るこ
とが知られている。これら抗菌ペプチドの大きさ及び構
造はかなりの多様性を示すが、一般には、それらは中性
ｐＨで正味の正電荷を有する膜活性両親媒性分子であ
る。これらカチオン性ペプチドには、大まかに区分され
た２つのファミリー：つまり線状ペプチド（例えば、セ
クロピン類（cecropins)) 及びシステインに富むペプチ
ドがある。後者には、哺乳動物ディフェンシン、気管抗
微生物性ペプチド及びウシバクテネシン類（bovine bac
tenecines)等が含まれる。ヒトの抗菌ペプチドとして
は、ディフェンシンとよばれる物質が存在し、好中球や
小腸粘膜のPaneth細胞の他に体内の様々な組織で、恒常
的に又は発達段階に一過性に発現されていることが知ら
れている。ディフェンシンは好中球のアズール顆粒の主
要構成成分であり、これまでにHNP-1 、-2、-3及び-4と
呼ばれる４種類のディフェンシンが単離されその構造も
明らかにされている。かかるディフェンシンは２９〜３
４個のアミノ酸から成る塩基性ペプチドであり、６個の
システインと１個のグリシンが共通して保存されている
遺伝子ファミリー(hBD-1) を構成している。又、ヒトPa
neth細胞で発現しているディフェンシンファミリー遺伝
子の存在も証明された。これらの消化器ディフェンシン
はヒトディフェンシン５及び６と呼ばれ、その構造も決
定された（特表平７−５０７２１３）。以上のことか
ら、ヒトディフェンシンは正常細胞叢の維持、及び外来
細菌からの防御に貢献していることが示唆されている。
構として抗菌性物質を作りだし、細菌等の微生物の感染
などから身を守っているが、免疫機構を持つ脊椎動物も
抗菌（抗微生物活性）ペプチドといわれる物質を作るこ
とが知られている。これら抗菌ペプチドの大きさ及び構
造はかなりの多様性を示すが、一般には、それらは中性
ｐＨで正味の正電荷を有する膜活性両親媒性分子であ
る。これらカチオン性ペプチドには、大まかに区分され
た２つのファミリー：つまり線状ペプチド（例えば、セ
クロピン類（cecropins)) 及びシステインに富むペプチ
ドがある。後者には、哺乳動物ディフェンシン、気管抗
微生物性ペプチド及びウシバクテネシン類（bovine bac
tenecines)等が含まれる。ヒトの抗菌ペプチドとして
は、ディフェンシンとよばれる物質が存在し、好中球や
小腸粘膜のPaneth細胞の他に体内の様々な組織で、恒常
的に又は発達段階に一過性に発現されていることが知ら
れている。ディフェンシンは好中球のアズール顆粒の主
要構成成分であり、これまでにHNP-1 、-2、-3及び-4と
呼ばれる４種類のディフェンシンが単離されその構造も
明らかにされている。かかるディフェンシンは２９〜３
４個のアミノ酸から成る塩基性ペプチドであり、６個の
システインと１個のグリシンが共通して保存されている
遺伝子ファミリー(hBD-1) を構成している。又、ヒトPa
neth細胞で発現しているディフェンシンファミリー遺伝
子の存在も証明された。これらの消化器ディフェンシン
はヒトディフェンシン５及び６と呼ばれ、その構造も決
定された（特表平７−５０７２１３）。以上のことか
ら、ヒトディフェンシンは正常細胞叢の維持、及び外来
細菌からの防御に貢献していることが示唆されている。
【０００３】最近、新たな抗菌ペプチドがヒトの表皮ケ
ラチノ（角化）細胞から発見された。この抗菌ペプチド
は、上記ディフェンシン遺伝子ファミリーに見られる共
通配列を有しておりこれらと相同性が高いことから、ヒ
トβディフェンシン２（hBD-2)と名付けられた。更に、
このhBD-2 の転写のレベルが細菌の感染によって変化す
ることが判明した。又、このhBD-2 は肺及び気管等でも
発現していることが判った（ジェイ・ハーダー他、ネイ
チャー（Nature) 、第３８７巻、第８６１ページ、１９
９７）。しかしながら、その発現調節機構は未だ明らか
となっていない。
ラチノ（角化）細胞から発見された。この抗菌ペプチド
は、上記ディフェンシン遺伝子ファミリーに見られる共
通配列を有しておりこれらと相同性が高いことから、ヒ
トβディフェンシン２（hBD-2)と名付けられた。更に、
このhBD-2 の転写のレベルが細菌の感染によって変化す
ることが判明した。又、このhBD-2 は肺及び気管等でも
発現していることが判った（ジェイ・ハーダー他、ネイ
チャー（Nature) 、第３８７巻、第８６１ページ、１９
９７）。しかしながら、その発現調節機構は未だ明らか
となっていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、このような抗
菌ペプチドの産生を誘導及び／又は増強することのでき
る因子を、例えば食品成分中から見出すことが出来れ
ば、このような因子を配合することによって生体防御機
構の強化が可能な食品、又は、消化器系等の障害の治療
に有効な医薬品の開発が可能になる。
菌ペプチドの産生を誘導及び／又は増強することのでき
る因子を、例えば食品成分中から見出すことが出来れ
ば、このような因子を配合することによって生体防御機
構の強化が可能な食品、又は、消化器系等の障害の治療
に有効な医薬品の開発が可能になる。
【０００５】本発明者は上記課題を解決する為に、ヒト
角化細胞及びヒト鼻粘膜上皮細胞を使い、死菌や食品素
材抽出物を添加することによって、抗菌ペプチドの発現
レベルの変化をＲＴ−ＰＣＲ法によって測定し、抗菌ペ
プチド産生を誘導及び／又は増強する因子を検出する実
験系を構築することに成功し、抗菌ペプチドの産生を誘
導及び／又は増強することのできる成分を見出して、本
発明を完成させた。
角化細胞及びヒト鼻粘膜上皮細胞を使い、死菌や食品素
材抽出物を添加することによって、抗菌ペプチドの発現
レベルの変化をＲＴ−ＰＣＲ法によって測定し、抗菌ペ
プチド産生を誘導及び／又は増強する因子を検出する実
験系を構築することに成功し、抗菌ペプチドの産生を誘
導及び／又は増強することのできる成分を見出して、本
発明を完成させた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、ヒト抗
菌ペプチドの発現を誘導する因子を含有する食品抽出
物、及びヒト抗菌ペプチドの発現を増強する因子を含有
する食品抽出物に係わるものである。ヒト抗菌ペプチド
としては、従来から知られている各種の物質を対象とす
ることができる。好適な例として、ヒトβディフェンシ
ン２（hBD-2)を挙げることができる。本発明の食品抽出
物は、各種食品素材を、当業者には公知の如何なる抽出
操作を施すことによっても調製することができる。例え
ば、無機酸、有機酸、塩類、糖質等を含む水又は熱水に
よる抽出、アルコール類による抽出、或いは液化炭酸ガ
スによる抽出等を挙げることができる。又、該食品組成
物は，固形、液体、ゾル、ゲル、粉末、及び顆粒等のあ
らゆる形態を採ることが可能である。
菌ペプチドの発現を誘導する因子を含有する食品抽出
物、及びヒト抗菌ペプチドの発現を増強する因子を含有
する食品抽出物に係わるものである。ヒト抗菌ペプチド
としては、従来から知られている各種の物質を対象とす
ることができる。好適な例として、ヒトβディフェンシ
ン２（hBD-2)を挙げることができる。本発明の食品抽出
物は、各種食品素材を、当業者には公知の如何なる抽出
操作を施すことによっても調製することができる。例え
ば、無機酸、有機酸、塩類、糖質等を含む水又は熱水に
よる抽出、アルコール類による抽出、或いは液化炭酸ガ
スによる抽出等を挙げることができる。又、該食品組成
物は，固形、液体、ゾル、ゲル、粉末、及び顆粒等のあ
らゆる形態を採ることが可能である。
【０００７】本明細書中で、「抗菌」又は「抗微生物活
性」という用語は、微生物の生育を阻害するか、または
不可逆的に阻止する化合物の能力を意味するものであ
る。この種の阻害または阻止は、殺微生物作用または微
生物静止阻害を介するものとし得る。ここで「殺微生物
作用」という用語は、標的微生物を殺傷するか、または
取り返しのつかないように損傷を与えることのできる化
合物の能力を示すものである。又、「微生物静止阻害」
という用語は、微生物の死滅にまでは至らないが、その
増殖及び生育を抑制することを意味するものである。
性」という用語は、微生物の生育を阻害するか、または
不可逆的に阻止する化合物の能力を意味するものであ
る。この種の阻害または阻止は、殺微生物作用または微
生物静止阻害を介するものとし得る。ここで「殺微生物
作用」という用語は、標的微生物を殺傷するか、または
取り返しのつかないように損傷を与えることのできる化
合物の能力を示すものである。又、「微生物静止阻害」
という用語は、微生物の死滅にまでは至らないが、その
増殖及び生育を抑制することを意味するものである。
【０００８】従って、本発明は、上記因子又は該因子を
含有する食品抽出物を配合したことを特徴とする食品組
成物にも係わるものである。本発明の食品組成物を摂取
することによって、消化器系統に於いてヒトディフェン
シン等の抗菌ペプチドの発現が誘導又は増強されて、潜
在的な微生物病原体を予防又は除去することが期待され
る。該食品組成物は，固形、液体、ゾル、ゲル、粉末、
及び顆粒等のあらゆる形態を採ることが可能である。製
造方法も当該技術分野で公知の如何なる方法も可能であ
る。本発明の食品組成物における上記因子又は食品抽出
物の含有量は、配合目的及び食品組成物の種類・形態等
に応じて当業者が適宜選ぶことができる。
含有する食品抽出物を配合したことを特徴とする食品組
成物にも係わるものである。本発明の食品組成物を摂取
することによって、消化器系統に於いてヒトディフェン
シン等の抗菌ペプチドの発現が誘導又は増強されて、潜
在的な微生物病原体を予防又は除去することが期待され
る。該食品組成物は，固形、液体、ゾル、ゲル、粉末、
及び顆粒等のあらゆる形態を採ることが可能である。製
造方法も当該技術分野で公知の如何なる方法も可能であ
る。本発明の食品組成物における上記因子又は食品抽出
物の含有量は、配合目的及び食品組成物の種類・形態等
に応じて当業者が適宜選ぶことができる。
【０００９】更に、本発明は、上記因子又は該因子を含
有する食品抽出物を含む医薬組成物にも係わるものであ
る。本発明の医薬組成物は、微生物感染症又は消化器系
炎症等の予防及び治療に使用することができる。本発明
の医薬組成物は、かかる予防及び治療に有効な量の上記
因子又は該因子を含有する食品抽出物の他に、当業者に
公知の薬学的に許容し得る適当なキャリアを含むことが
できる。本発明の医薬組成物は、広範な種類の微生物、
例えばカビ及び細菌（グラム陽性及び陰性の両者）等に
起因する感染症又は消化器系炎症等に有効である。該医
薬組成物中に配合される上記因子又は食品抽出物の量
は、他の成分の性状、使用目的、患者の年齢・体重、及
び要求される効果の程度等に応じて当業者が適宜選ぶこ
とができる。
有する食品抽出物を含む医薬組成物にも係わるものであ
る。本発明の医薬組成物は、微生物感染症又は消化器系
炎症等の予防及び治療に使用することができる。本発明
の医薬組成物は、かかる予防及び治療に有効な量の上記
因子又は該因子を含有する食品抽出物の他に、当業者に
公知の薬学的に許容し得る適当なキャリアを含むことが
できる。本発明の医薬組成物は、広範な種類の微生物、
例えばカビ及び細菌（グラム陽性及び陰性の両者）等に
起因する感染症又は消化器系炎症等に有効である。該医
薬組成物中に配合される上記因子又は食品抽出物の量
は、他の成分の性状、使用目的、患者の年齢・体重、及
び要求される効果の程度等に応じて当業者が適宜選ぶこ
とができる。
【００１０】本発明の医薬組成物は、当該技術分野で公
知の任意の形態を採ることができ、例えば、様々な塩及
び緩衝剤によって緩衝化した、溶液、懸濁液、乳濁液等
の液体製剤とすることができる。塩は、大半のものをア
ルカリ及びアルカリ土類ハロゲン化物、リン酸塩及び硫
酸塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは硫酸
ナトリウムとし得る。種々の緩衝剤、例えばクエン酸
塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、トリス等を、この種の緩衝
剤が処置される対象に生理学的に許容され得る程度で使
用することができる。又、本発明の医薬組成物を錠剤、
顆粒、粉末、ゲル、ゾル等の剤型とする場合には、当業
者には公知の種々の賦形剤または他の添加物を使用する
ことができる。更に、上記因子又は食品抽出物及び上記
の各種添加物を薬学的に許容し得るリポソームで包摂し
た製剤形態とすることも可能である。医薬組成物の形態
及び投与対象の性状等に応じて、種々の様式で本発明の
医薬組成物を投与することができる。例えば、経口、静
脈内、皮下、筋肉内、腹膜内等、鼻咽頭等により施すこ
とができる。
知の任意の形態を採ることができ、例えば、様々な塩及
び緩衝剤によって緩衝化した、溶液、懸濁液、乳濁液等
の液体製剤とすることができる。塩は、大半のものをア
ルカリ及びアルカリ土類ハロゲン化物、リン酸塩及び硫
酸塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは硫酸
ナトリウムとし得る。種々の緩衝剤、例えばクエン酸
塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、トリス等を、この種の緩衝
剤が処置される対象に生理学的に許容され得る程度で使
用することができる。又、本発明の医薬組成物を錠剤、
顆粒、粉末、ゲル、ゾル等の剤型とする場合には、当業
者には公知の種々の賦形剤または他の添加物を使用する
ことができる。更に、上記因子又は食品抽出物及び上記
の各種添加物を薬学的に許容し得るリポソームで包摂し
た製剤形態とすることも可能である。医薬組成物の形態
及び投与対象の性状等に応じて、種々の様式で本発明の
医薬組成物を投与することができる。例えば、経口、静
脈内、皮下、筋肉内、腹膜内等、鼻咽頭等により施すこ
とができる。
【００１１】更に本発明は、ヒト抗菌ペプチド誘導及び
／又は増強因子の検出法に係わる。かかる検出方法にお
いては、ヒト抗菌ペプチドを発現し得る各種培養細胞、
例えば、ヒト表皮角化細胞及びヒト鼻粘膜上皮細胞等を
使用する。かかる細胞を、ヒト抗菌ペプチド誘導及び／
又は増強因子を含有すると考えられる、各種食品素材か
らの抽出物等の試料の存在下で培養する。検出方法とし
ては、当業者には公知の各種方法、例えば、定量ＲＴ−
ＰＣＲ法、リポータジーンアッセイ、抗菌試験、免疫測
定法等を使用することができる。各検出方法における測
定条件等は当業者が適宜、実験的に選択することができ
る。
／又は増強因子の検出法に係わる。かかる検出方法にお
いては、ヒト抗菌ペプチドを発現し得る各種培養細胞、
例えば、ヒト表皮角化細胞及びヒト鼻粘膜上皮細胞等を
使用する。かかる細胞を、ヒト抗菌ペプチド誘導及び／
又は増強因子を含有すると考えられる、各種食品素材か
らの抽出物等の試料の存在下で培養する。検出方法とし
ては、当業者には公知の各種方法、例えば、定量ＲＴ−
ＰＣＲ法、リポータジーンアッセイ、抗菌試験、免疫測
定法等を使用することができる。各検出方法における測
定条件等は当業者が適宜、実験的に選択することができ
る。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により説明
するが、本発明は、これら実施例に限定されるものでは
ない。
するが、本発明は、これら実施例に限定されるものでは
ない。
【００１３】
【実施例】実施例１：ヒトβディフェンシン２の最少誘
導濃度の決定 １０φのディッシュでコンフルエントにまで培養したヒ
ト表皮角化細胞（日水製薬（株））に、オートクレーブ
滅菌した大腸菌のＰＢＳ懸濁液を大腸菌の終濃度が０、
０．２、１、５、２５ng／mlとなるように添加し、３７
℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。約１６時間後、培
地を除きＰＢＳで洗い、スクレパーによって細胞を回収
した。回収した細胞からRNeasy(Qiagen 社）を用いて総
ＲＮＡを抽出した。各総ＲＮＡ溶液の濃度を、１μｇ／
μｌに調整した。抽出した各ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ
−ＰＣＲ法によって目的のｍＲＮＡを増幅した。
導濃度の決定 １０φのディッシュでコンフルエントにまで培養したヒ
ト表皮角化細胞（日水製薬（株））に、オートクレーブ
滅菌した大腸菌のＰＢＳ懸濁液を大腸菌の終濃度が０、
０．２、１、５、２５ng／mlとなるように添加し、３７
℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。約１６時間後、培
地を除きＰＢＳで洗い、スクレパーによって細胞を回収
した。回収した細胞からRNeasy(Qiagen 社）を用いて総
ＲＮＡを抽出した。各総ＲＮＡ溶液の濃度を、１μｇ／
μｌに調整した。抽出した各ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ
−ＰＣＲ法によって目的のｍＲＮＡを増幅した。
【００１４】ＲＴ−ＰＣＲの条件は、まずヒトβディフ
ェンシン２のｃＤＮＡの配列（Accession No.Z71389)を
もとに、hBD-2 f プライマー（5'-CCAGCCATCAGCCATGAGG
GT-3')及びhBD-2 r プライマー（5'-GGAGCCCTTTCTGAATC
CGCA-3')を作製した。GAPDH(glyceraldehyde-3-phospha
te dehydrogenase) ｃＤＮＡの配列（Accession No.M33
197)を参考にして、GAPDH f プライマー（5'-ACCACAGTC
CATGCCATCAC-3') とGAPDH r プライマー（5'-TCCACCACC
CTGTTGCTGTA-3') を作製し、内部標準として用いた。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲの反応液はOneStep RNA PCR Kit(Takara酒造
（株）製）を用いて、まず１チューブあたり以下の表１
に示す組成になるようにマスターミックスを作製し、さ
らに各総ＲＮＡを表２に示す組成になるように混合し、
２５μｌの系で反応を行った。
ェンシン２のｃＤＮＡの配列（Accession No.Z71389)を
もとに、hBD-2 f プライマー（5'-CCAGCCATCAGCCATGAGG
GT-3')及びhBD-2 r プライマー（5'-GGAGCCCTTTCTGAATC
CGCA-3')を作製した。GAPDH(glyceraldehyde-3-phospha
te dehydrogenase) ｃＤＮＡの配列（Accession No.M33
197)を参考にして、GAPDH f プライマー（5'-ACCACAGTC
CATGCCATCAC-3') とGAPDH r プライマー（5'-TCCACCACC
CTGTTGCTGTA-3') を作製し、内部標準として用いた。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲの反応液はOneStep RNA PCR Kit(Takara酒造
（株）製）を用いて、まず１チューブあたり以下の表１
に示す組成になるようにマスターミックスを作製し、さ
らに各総ＲＮＡを表２に示す組成になるように混合し、
２５μｌの系で反応を行った。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写反応を５０℃下３
０min、９４℃下２min、ＰＣＲ反応を、９４℃下３０se
c６８℃下３０secの条件で２５サイクル行った。反応
後、反応液１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動によ
り分析した。表３のように、大腸菌溶液の添加によって
濃度依存的な傾向でβディフェンシン２ｍＲＮＡの検出
が可能であることがわかった。大腸菌終濃度が１ng／ml
以上の添加量では、βディフェンシン２のｍＲＮＡの発
現が認められた（表３）。このことからディフェンシン
最少誘導濃度を１ng／mlと決定した。限界検出感度とし
て総ＲＮＡの量は１μｇ、増幅サイクル数は２５サイク
ルとした。
０min、９４℃下２min、ＰＣＲ反応を、９４℃下３０se
c６８℃下３０secの条件で２５サイクル行った。反応
後、反応液１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動によ
り分析した。表３のように、大腸菌溶液の添加によって
濃度依存的な傾向でβディフェンシン２ｍＲＮＡの検出
が可能であることがわかった。大腸菌終濃度が１ng／ml
以上の添加量では、βディフェンシン２のｍＲＮＡの発
現が認められた（表３）。このことからディフェンシン
最少誘導濃度を１ng／mlと決定した。限界検出感度とし
て総ＲＮＡの量は１μｇ、増幅サイクル数は２５サイク
ルとした。
【００１８】
【表３】
【００１９】実施例２：食品素材抽出物の調製 各食品素材１ｇを精製水に懸濁し１０mlとした後、オー
トクレーブ滅菌した。これらを遠心し、上清を食品素材
抽出液（食品抽出物）とした。
トクレーブ滅菌した。これらを遠心し、上清を食品素材
抽出液（食品抽出物）とした。
【００２０】実施例３：ヒトβディフェンシン２の誘導 実施例１の実験系を使い、大腸菌溶液の代わりに実施例
２で調製した各食品素材抽出液を終濃度で０．１％とな
るように添加した。その結果、糠味噌濃縮液及び焼酎も
ろみを添加した場合に、大腸菌の場合と同様なβディフ
ェンシン２ｍＲＮＡの誘導効果が認められた。
２で調製した各食品素材抽出液を終濃度で０．１％とな
るように添加した。その結果、糠味噌濃縮液及び焼酎も
ろみを添加した場合に、大腸菌の場合と同様なβディフ
ェンシン２ｍＲＮＡの誘導効果が認められた。
【００２１】実施例４：ヒトβディフェンシン２の増強 実施例３で誘導効果が認められなかった食品素材抽出液
を実施例１の実験系にさらに加え、大腸菌溶液と共存す
る状態でβディフェンシン２ｍＲＮＡの発現を調べたと
ころ、ローストアマランス、ロースト小麦胚芽、ハイチ
ュウ用濃縮ヨーグルトエキス、甘酒について大腸菌溶液
単独の場合よりも発現の増強が認められた。以上の実施
例３及び４で得られた結果を表４に示す。
を実施例１の実験系にさらに加え、大腸菌溶液と共存す
る状態でβディフェンシン２ｍＲＮＡの発現を調べたと
ころ、ローストアマランス、ロースト小麦胚芽、ハイチ
ュウ用濃縮ヨーグルトエキス、甘酒について大腸菌溶液
単独の場合よりも発現の増強が認められた。以上の実施
例３及び４で得られた結果を表４に示す。
【００２２】
【表４】
【００２３】以上の結果から明らかなように、抗菌ペプ
チドの誘導及び／又は増強効果を有する因子が各種食品
素材中に存在することが見出された。これらの誘導因子
はそれ自身で抗菌ペプチドの発現を調節する機能を持
ち、一方、増強因子は大腸菌の感染によって抗菌ペプチ
ドの発現のスイッチがオンになった後にそのシグナルを
より強くする機能を持つと考えられる。こうして確認さ
れた各種食品素材中の因子の抗菌ペプチドの誘導及び／
又は増強効果を、以下の実施例で更に定量的に測定し
た。
チドの誘導及び／又は増強効果を有する因子が各種食品
素材中に存在することが見出された。これらの誘導因子
はそれ自身で抗菌ペプチドの発現を調節する機能を持
ち、一方、増強因子は大腸菌の感染によって抗菌ペプチ
ドの発現のスイッチがオンになった後にそのシグナルを
より強くする機能を持つと考えられる。こうして確認さ
れた各種食品素材中の因子の抗菌ペプチドの誘導及び／
又は増強効果を、以下の実施例で更に定量的に測定し
た。
【００２４】実施例5：ヒトβディフェンシン2の発現誘
導条件の設定 ６ウェルマルチプレート（ファルコン社製）でコンフル
エントにまで培養したヒト表皮角化細胞（日水製薬
（株）製）に、オートクレーブ滅菌した大腸菌のＰＢＳ
懸濁液を大腸菌の終濃度が0, 0.07, 0.7, 7, 70, 700 u
ｇ/ｍｌとなるように添加し、37℃、5％ＣＯ2雰囲気下
で培養した。約16時間後、培地を除きＰＢＳで洗った。
ＲＮｅａｓｙ(Ｑｉａｇｅｎ社)を用いて、回収した細胞
から総ＲＮＡを抽出した。抽出した各ＲＮＡを鋳型とし
て、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって目的のｍＲＮＡを増
幅した。定量ＲＴ−ＰＣＲの条件は、まずヒトβディフ
ェンシン2のｃＤＮＡの配列 (Accession No.Z71389)を
もとに、qRThBD2fプライマー（5'-cttccaggtgtttttggtg
gta-3'）、qRThBD2rプライマー（5'-ggagccatatgtcatcc
agtc-3'）、更に、ABI PRISM TaqManTMプローブとしてh
BD2 probe（5'-aggcgatcctgttacctgccttaagag-3'）を作
製した。GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrog
enase)遺伝子のmRNAをTaqManTMGAPDH Control Regents
（（株）パーキンエルマージャパン製）を用いて同時に
測定し、鋳型のmRNA量の内部標準とした。ＲＴ−ＰＣＲ
の反応液はTaqMan EZ RT-PCR Kit（（株）パーキンエル
マージャパン製）を用いて、まず1チューブあたり以下
の表５に示す組成になるようにマスターミックスを作製
した。さらに各総ＲＮＡを表６に示す組成になるように
混合して、サンプルあたり25μｌｘ３本の系で増幅反応
をおこない、ABI PRISM 7700 sequence detecter
（（株）パーキンエルマージャパン製）によるリアルタ
イム検出を行った。RT-PCRは、逆転写反応を60℃ 30 mi
n、95℃ 5 min、PCR反応を、94℃ 20 sec、60℃ 1 min
の条件で40〜 45サイクル行った。更に付属の解析ソフ
ト（Sequence Detector v1.6.3）上で閾値を設定し、発
現量の計算をおこなった。ＰＢＳのみを加えたサンプル
を１００％として、相対発現量を求めた。図１の様に、
大腸菌溶液の添加によって濃度依存的にβディフェンシ
ン2 mRNAの検出が可能であることがわかった。大腸菌終
濃度が7 ug/ml以上の添加量では、ディフェンシンのmRN
Aの発現の増加が認められた。（図１）このことからデ
ィフェンシン誘導濃度を7 ug/mlと設定した。
導条件の設定 ６ウェルマルチプレート（ファルコン社製）でコンフル
エントにまで培養したヒト表皮角化細胞（日水製薬
（株）製）に、オートクレーブ滅菌した大腸菌のＰＢＳ
懸濁液を大腸菌の終濃度が0, 0.07, 0.7, 7, 70, 700 u
ｇ/ｍｌとなるように添加し、37℃、5％ＣＯ2雰囲気下
で培養した。約16時間後、培地を除きＰＢＳで洗った。
ＲＮｅａｓｙ(Ｑｉａｇｅｎ社)を用いて、回収した細胞
から総ＲＮＡを抽出した。抽出した各ＲＮＡを鋳型とし
て、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって目的のｍＲＮＡを増
幅した。定量ＲＴ−ＰＣＲの条件は、まずヒトβディフ
ェンシン2のｃＤＮＡの配列 (Accession No.Z71389)を
もとに、qRThBD2fプライマー（5'-cttccaggtgtttttggtg
gta-3'）、qRThBD2rプライマー（5'-ggagccatatgtcatcc
agtc-3'）、更に、ABI PRISM TaqManTMプローブとしてh
BD2 probe（5'-aggcgatcctgttacctgccttaagag-3'）を作
製した。GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrog
enase)遺伝子のmRNAをTaqManTMGAPDH Control Regents
（（株）パーキンエルマージャパン製）を用いて同時に
測定し、鋳型のmRNA量の内部標準とした。ＲＴ−ＰＣＲ
の反応液はTaqMan EZ RT-PCR Kit（（株）パーキンエル
マージャパン製）を用いて、まず1チューブあたり以下
の表５に示す組成になるようにマスターミックスを作製
した。さらに各総ＲＮＡを表６に示す組成になるように
混合して、サンプルあたり25μｌｘ３本の系で増幅反応
をおこない、ABI PRISM 7700 sequence detecter
（（株）パーキンエルマージャパン製）によるリアルタ
イム検出を行った。RT-PCRは、逆転写反応を60℃ 30 mi
n、95℃ 5 min、PCR反応を、94℃ 20 sec、60℃ 1 min
の条件で40〜 45サイクル行った。更に付属の解析ソフ
ト（Sequence Detector v1.6.3）上で閾値を設定し、発
現量の計算をおこなった。ＰＢＳのみを加えたサンプル
を１００％として、相対発現量を求めた。図１の様に、
大腸菌溶液の添加によって濃度依存的にβディフェンシ
ン2 mRNAの検出が可能であることがわかった。大腸菌終
濃度が7 ug/ml以上の添加量では、ディフェンシンのmRN
Aの発現の増加が認められた。（図１）このことからデ
ィフェンシン誘導濃度を7 ug/mlと設定した。
【００２５】
【表５】
【００２６】
【表６】
【００２７】実施例6：食品によるヒトβディフェンシ
ン2の誘導及び増強 実施例5の実験系を使い、実施例2で調整した各食品素材
抽出液を終濃度で0.1％となるように添加した。食材の
みを加えた場合と大腸菌溶液と同時に加えた場合で比較
した。その結果、焼酎もろみ及び甘酒を添加した場合に
大腸菌の場合と同様なβディフェンシン2 mRNAの誘導効
果が認められた。また、大腸菌溶液と共存する状態で
は、焼酎もろみ、ローストアマランス、甘酒について大
腸菌溶液のみ、あるいは食品抽出液のみの場合よりも発
現の増強効果が認められた。得られた結果を図2に示
す。
ン2の誘導及び増強 実施例5の実験系を使い、実施例2で調整した各食品素材
抽出液を終濃度で0.1％となるように添加した。食材の
みを加えた場合と大腸菌溶液と同時に加えた場合で比較
した。その結果、焼酎もろみ及び甘酒を添加した場合に
大腸菌の場合と同様なβディフェンシン2 mRNAの誘導効
果が認められた。また、大腸菌溶液と共存する状態で
は、焼酎もろみ、ローストアマランス、甘酒について大
腸菌溶液のみ、あるいは食品抽出液のみの場合よりも発
現の増強効果が認められた。得られた結果を図2に示
す。
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、抗菌ペプチドの誘導及
び／又は増強因子、或いは該因子を含む食品素材（食品
抽出物）を検出することができ、かかる因子又は食品抽
出物を配合した食品組成物又は医薬組成物は生体防御の
強化、各種疾患の治療に有効である。更に、焼酎もろみ
等、従来は産業廃棄物として処理され、環境汚染の原因
とされていた物質を、本発明によれば有用な素材として
再利用することが出来る。
び／又は増強因子、或いは該因子を含む食品素材（食品
抽出物）を検出することができ、かかる因子又は食品抽
出物を配合した食品組成物又は医薬組成物は生体防御の
強化、各種疾患の治療に有効である。更に、焼酎もろみ
等、従来は産業廃棄物として処理され、環境汚染の原因
とされていた物質を、本発明によれば有用な素材として
再利用することが出来る。
【図１】大腸菌溶液の添加による、βディフェンシン2
mRNAの濃度依存的な発現を示す。
mRNAの濃度依存的な発現を示す。
【図２】各食品素材抽出液の添加による、βディフェン
シン2 mRNA発現の誘導効果及び誘導・増強効果を示す。
シン2 mRNA発現の誘導効果及び誘導・増強効果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｆ 3/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ２３Ｌ 2/38 １０２ // Ａ２３Ｌ 2/38 １０２ Ｇ０１Ｎ 33/02 Ｇ０１Ｎ 33/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ
Claims (9)
- 【請求項１】 ヒト抗菌ペプチドの発現を誘導する因子
を含有する食品抽出物。 - 【請求項２】 熱水抽出物であることを特徴とする請求
項１に記載の食品抽出物。 - 【請求項３】 ヒト抗菌ペプチドがヒトβディフェンシ
ン２である請求項１又は２に記載の食品抽出物。 - 【請求項４】 ヒト抗菌ペプチドの発現を増強する因子
を含有する食品抽出物。 - 【請求項５】 熱水抽出物であることを特徴とする請求
項４に記載の食品抽出物。 - 【請求項６】 ヒト抗菌ペプチドがヒトβディフェンシ
ン２である請求項４又は５に記載の食品抽出物。 - 【請求項７】 請求項１ないし６のいずれか一項に記載
した因子又は食品抽出物を配合したことを特徴とする食
品組成物。 - 【請求項８】 請求項１ないし６のいずれか一項に記載
した因子又は食品抽出物を含む医薬組成物。 - 【請求項９】 ヒト抗菌ペプチド誘導及び／又は増強因
子の検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10365103A JPH11286496A (ja) | 1997-12-22 | 1998-12-22 | 抗菌ペプチド誘導及び／又は増強因子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36577597 | 1997-12-22 | ||
| JP9-365775 | 1997-12-22 | ||
| JP10365103A JPH11286496A (ja) | 1997-12-22 | 1998-12-22 | 抗菌ペプチド誘導及び／又は増強因子 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004097326A Division JP3936704B2 (ja) | 1997-12-22 | 2004-03-30 | ヒトβディフェンシン２の検出方法 |
| JP2005169097A Division JP3950147B2 (ja) | 1997-12-22 | 2005-06-09 | 抗菌ペプチド誘導及び／又は増強因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11286496A true JPH11286496A (ja) | 1999-10-19 |
Family
ID=26581638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10365103A Withdrawn JPH11286496A (ja) | 1997-12-22 | 1998-12-22 | 抗菌ペプチド誘導及び／又は増強因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11286496A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2391476A (en) * | 2002-08-02 | 2004-02-11 | Coletica | Non-inflammatory stimulators of type 2 or type 3 beta-defensins |
| JP2004175733A (ja) * | 2002-11-28 | 2004-06-24 | Masami Moriyama | 薬剤耐性菌による感染症治療剤 |
| WO2005077349A1 (ja) * | 2004-02-17 | 2005-08-25 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | ヒトβディフェンシン産生促進剤 |
| WO2007020884A1 (ja) * | 2005-08-12 | 2007-02-22 | Meiji Dairies Corporation | β－ディフェンシンを介した感染予防効果を有するビフィズス菌または乳酸菌とそれを含有する食品・医薬品組成物 |
| JP2007070292A (ja) * | 2005-09-07 | 2007-03-22 | Asahi Breweries Ltd | 植物病害抵抗性遺伝子活性化用組成物 |
| US7870822B2 (en) | 2006-01-19 | 2011-01-18 | Ecolab Usa Inc. | Method and system for recapturing and reusing unreacted antimicrobial solutions in spray applications |
| JP2021023198A (ja) * | 2019-08-05 | 2021-02-22 | 発酵のまち横手Ｆｔ事業協同組合 | ヒトβディフェンシン２誘導用味噌 |
-
1998
- 1998-12-22 JP JP10365103A patent/JPH11286496A/ja not_active Withdrawn
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2391476A (en) * | 2002-08-02 | 2004-02-11 | Coletica | Non-inflammatory stimulators of type 2 or type 3 beta-defensins |
| GB2391476B (en) * | 2002-08-02 | 2006-12-20 | Coletica | Use of active ingredients stimulating type 2 and/or type 3 human beta-defensins and cosmetic or pharmaceutical compositions containing such active ingredients |
| JP2004175733A (ja) * | 2002-11-28 | 2004-06-24 | Masami Moriyama | 薬剤耐性菌による感染症治療剤 |
| JP4554150B2 (ja) * | 2002-11-28 | 2010-09-29 | 雅美 森山 | 薬剤耐性菌による感染症治療剤 |
| JPWO2005077349A1 (ja) * | 2004-02-17 | 2007-10-18 | 大塚製薬株式会社 | ヒトβディフェンシン産生促進剤 |
| WO2005077349A1 (ja) * | 2004-02-17 | 2005-08-25 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | ヒトβディフェンシン産生促進剤 |
| WO2007020884A1 (ja) * | 2005-08-12 | 2007-02-22 | Meiji Dairies Corporation | β－ディフェンシンを介した感染予防効果を有するビフィズス菌または乳酸菌とそれを含有する食品・医薬品組成物 |
| JP2007070292A (ja) * | 2005-09-07 | 2007-03-22 | Asahi Breweries Ltd | 植物病害抵抗性遺伝子活性化用組成物 |
| US7870822B2 (en) | 2006-01-19 | 2011-01-18 | Ecolab Usa Inc. | Method and system for recapturing and reusing unreacted antimicrobial solutions in spray applications |
| US8916094B2 (en) | 2006-01-19 | 2014-12-23 | Ecolab Usa Inc. | Method and system for recapturing and reusing unreacted antimicrobial solutions in spray applications |
| US9259029B2 (en) | 2006-01-19 | 2016-02-16 | Ecolab Usa Inc. | Method and system for recapturing and reusing unreacted antimicrobial solutions in spray applications |
| US9693580B2 (en) | 2006-01-19 | 2017-07-04 | Ecolab Usa Inc. | Method and system for recapturing and reusing unreacted antimicrobial solutions in spray applications |
| JP2021023198A (ja) * | 2019-08-05 | 2021-02-22 | 発酵のまち横手Ｆｔ事業協同組合 | ヒトβディフェンシン２誘導用味噌 |
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| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20050610 |