KR20180110848A

KR20180110848A - 신규한 락토바실러스 루테리 균주 및 그 프로바이오틱 용도

Info

Publication number: KR20180110848A
Application number: KR1020170040691A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 디 김
Original assignee: 다니엘 디 김
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2018-10-11

Abstract

본 발명은 항노화 및 항염증 특성을 가지는 신규한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri ) BM36301 균주 및 그 용도에 관한 것으로, 본 발명의 L. reuteri BM36301은 in vitro 실험에서 항 염증성 균주로 선정되었고, 이 균주는 실험 대상을 건강한 상태를 유지할 수 있도록 도왔으며. 이러한 결과는 L. reuteri BM36301을 노화 문제의 다양한 측면을 개선하기 위한 가능성이 좋은 probiotic 균주로 사용할 수 있다는 것을 시사한다.

Description

신규한 락토바실러스 루테리 균주 및 그 프로바이오틱 용도{A novel Lactobacillus reuteri BM36301 and a Probiotic Benefits of the same}

본 발명은 신규한 락토바실러스 루테리 균주 및 그 프로바이오틱 용도에 관한 것이다.

미생물총 (microbiota)이라고 불리는 공생 미생물 군집은 유전적 및 대사적 다양성뿐만 아니라 숙주의 세포수보다 그 숫자가 많다. 특히 모든 공생 균의 90 % 이상을 차지하는 장내 미생물 군집은 신진 대사, 면역 조절 또는 심지어 신경 기능을 포함한 신체 계통의 개발과 유지에 있어 숙주에게 중대한 영향을 미친다. 미생물 군집의 정상적인 구성이 붕괴되면 광범위한 건강 문제가 발생할 수 있다는 보고가 증가하고 있다[Gilbert JA, Krajmalnik-Brown R, Porazinska DL, Weiss SJ, Knight R: Cell 2013, 155(7):1446-1448;Devaraj S, Hemarajata P, Versalovic J: Clinical chemistry 2013, 59(4):617-628; Mayer EA, Knight R, Mazmanian SK, Cryan JF, Tillisch K: The Journal of Neuroscience 2014, 34(46):15490-15496;Turroni F, Ventura M, Butto LF, Duranti S, O'Toole PW, Motherway MO, van Sinderen D: Cellular and molecular life sciences : CMLS 2014, 71(2):183-203;Sekirov I, Russell SL, Antunes LC, Finlay BB: Physiol Rev 2010, 90(3):859-904]. 여기에는 비만, 당뇨병, 대사 증후군, 염증성 장 질환(IBD),자가 면역 질환, 결장암, 우울증 및 신경 발달 장애가 포함된다.

흥미롭게도 건강 문제로 고통받는 개인에게 선택적 세균을 경구로 보충하는 것은 증상을 개선하거나 질병을 치료하는 데 효과적이며 부분적으로는 장의 미생물 조성을 재조정하는 것으로 나타났다. 결과적으로, 이러한 유익한 미생물 (또는 프로바이오틱스) 및 이들의 대사 산물은 질병치료나 개선을 위한 가능성이 있어 큰 관심을 받고 있다. 따라서 한 세기 동안 식품 가공에 널리 사용되던 유산균 (lactic acid bacteria, LAB)은 이제 프로바이오틱스 효능에 대한 재평가가 진행되고 있다.

식용으로서의 프로바이오틱스가 내장에서 효과적으로 기능을 나타나게 하기 위해서는, 그들은 특정한 기본 조건을 충족해야 한다. 첫째, 그들은 위장과 내장에서 위산, 소화 효소 또는 담즙 염의 어려운 환경들을 견딜 수 있어야 한다. 또한, 병원균에 대한 내재적인 항균 활성을 가짐은 숙주에게 유익하며, 마지막으로 위장 (GI) 기관의 점막층에 충분히 접착할 수 있는 것이 바람직하다. 특히 영양소 섭취를 위해 다른 병원균과 경쟁해야 하기 때문에 더욱 필요한 일이다.

프로바이오틱스는 일반적인 건강상의 이점뿐만 아니라 훨씬 더 다양한 혜택을 포함한다. 특히 숙주 면역 기능의 조절에 있어 장내 미생물의 관여는 매우 포괄적이다. 많은 연구에서 무균 또는 항생제로 처리한 마우스를 사용한 것과 기존의 방법으로 키운 마우스 또는 무항생제처리 마우스를 사용하여 면역 질환 발병에 대한 감수성을 비교했다. 숙주 면역 조절에서 장 미생물의 역할에 대한 현재의 이해는 다음과 같이 간략하게 요약될 수 있다. 첫째, 장내 미생물 군은 TH17 세포, TReg 세포, IgA 생성 형질 세포 및 선천성 림프성 세포를 포함한 다양한 림프 세포의 발생에 기여한다. 둘째, 장내 미생물군은 선천적인 적응성 면역을 강화하여 병원균이나 바이러스에 대한 내성을 부여한다. 셋째, 장내 미생물군은 장 질환 발병에 영향을 미친다. 예를 들어, 병원성 공생충의 전례없는 과증식은 IBD를 자극할 수 있다. 이 경우 유익한 박테리아와 병원균 간의 항상성이 염증 변화를 최소화하는 데 중요하다. 마지막으로, 장내 미생물은 다발성 경화증, 관절염, 1형 당뇨병, 알레르기 성 염증 및 암과 같은 외인성 질환에도 영향을 줄 수 있다. 이러한 조직적인 효과들은 심지어 면역계를 통해 피부 건강, 피부 상처 치유, 습진 및 내분비 경로 에까지 영향을 미친다.

장내 microbiota와 숙주 사이의 국소적인 상호 작용은 주로 인접한 상피 세포와 내장의 면역 세포에 의한 세균 표면 분자의 직접적인 인식을 포함한다. 예를 들어, 특정 세균 세포벽의 리포 폴리 사카 라이드 (lipopolysaccharide, LPS), 펩티도 글리 칸 (peptidoglycan), 리포 사이코익산 (lipoteichoic acids) 및 엑소 폴리 사카 라이드 (exopolysaccharide)는 다양한 장 반응을 유도할 수 있다. 이들 구획의 발현 및 변형은 박테리아 유전자 및 물질대사의 활성에 의존하며, 이는 각 균주마다 가지는 특이성이 있음을 설명한다. 한편, 원격 상호 작용은 다양한 박테리아 대사 산물의 분비에 의해 시작될 수 있다. 예를 들어 L- 유산( Lactobacillus casei strain Shirota)와 다양한 장내 세균의 SCFAs(fatty acids)와 같은 유기산들,폴리아민(Bifidobacterium animalis subsp. lactis strain LKM512), AI-3 대사물질 (공생 대장균), 히스타민 (L. reuteri 균주 ATCC PTA 6475) 또는 p40 / p75 단백질(Lactobacillus rhamnosus strain GG 유래) 들도 원격 면역 조절 역할에 대해 보고되었다.

면역 조절이 가능한 미생물을 찾기 위한 노력으로 THP-1, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 수지상 세포(dendritic cells, DC) 또는 장 상피 세포 (IEC)와 같은 골수 세포를 이용한 체외 조직 배양(in vitro)이 널리 사용되어왔다 . 공통적인 사이토킨 연구에는 주로 염증 반응을 유발하는( 주로 프로-염증성) 것으로 알려진 TNF-α, 인터루킨( 종양괴사 인자:IL- 8, IL- 12 및 IL-17) 등이 있다. 대조적으로 성장 전이 인자(TGF β) 나 IL-10들을 항염증표식으로 사용하기도 한다. 예를 들면 다양한 시험관 내 조직배양 시스템에서 여러 LAB 배양 상등액들에는 TNF-α 발현을 억제하거나 IL-10의 발현을 향상시키는 대사 산물을 포함하고 있음을 안다. 또한살아있는 박테리아의 면역세포로 직접 치료함으로써 다양한 사이토카인의 분비를 유도 하였다. 이러한 연구들이 면역 조절 가능 미생물 및 대사 산물을 알아내기 위해 이루어진 체외조직 배양방법들이다.

LAB의 이러한 규제 기능은 각각의 균주(스트레인)에 특화되어 있기 때문에 LAB 개개균주의 특성을 더 찾아내는데 큰 잠재력으로 남아 있다.

장내 미생물 공생균총(The gut microbiota)은 숙주의 면역력 조절에 생각보다도 더 중요한 역할을 하고 있다. 미생물들이 가지고 있는 많은 효과들은 각각의 스트레인 별로 다르다(strain specific)는 것을 알지만 그 세부적 작용 기작(mechanism)의 내용은 아직도 파악하기 어려우며, 면역력 조절 기능을 가지고 있는 새로운 프로바이오틱 균주를 선정하는 일은 아직도 많은 관심의 대상이기도 하다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제1020150133284호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항노화 효과를 가지는 신규한 프로바이오틱 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항염 활성을 가지는 신규한 프로바이오틱 균주를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항노화 특성을 가지는 신규한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri ) BM36301 균주(기탁번호 KCCM11987P)를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 항염증 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 항노화 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항노화 효과는 남자의 경우에는 체중 증가 감소 또는 테스토스테론 증가인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항노화 효과는 여자의 경우에는 탈모 억제 또는 혈청 TNF-α 감소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 항노화 및 염증성 질환의 개선에 효과가 있어 이를 포함하는 건강기능성식품으로 이용가능하다. 이는 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제, 과립제 등으로 제형화하여 사용할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 건강기능성식품은 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜렛 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱,과자 제품, 오일 및 지방제품, 유제품 음료 (dairy drink) 및 우유 음료, 두유 및 콩 유제품 (soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 효모 제품, 케이크 및 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

정제 형태의 건강기능성식품은 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 적당한 방법으로 과립상으로 한 다음 활택제 등을 넣어 압축 성형하여 조제하거나 정제 형태의 건강기능성식품을 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 직접 압축 성형하여 만들거나 또는 미리 만든 과립에 건강기능성식품을 그대로 혹은 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 다음 압축성형하여 조제하거나 건강기능성식품에 부형제, 결합제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 분말을 용매로 습윤시키고, 습윤 된 분말을 저압으로 틀에 넣어서 성형한 후, 적당한 방법으로 건조하여 조제한다.

또한, 상기 정제 형태의 건강기능성식품에 필요에 따라 교미제 등을 넣을 수 있으며, 적당한 제피제로 제피 가능하다.캡슐 형태의 건강기능성식품 중 경질 캡슐제는 보통 캡슐에 건강기능성식품 또는 건강기능성식품에 적당한 부형제 등을 고르게 섞은 것 또는 적당한 방법으로 입상으로 한 것 또는 입상으로 한 것에 적당한 제피제로 제피한 것을 그대로 또는 가볍게 성형하여 충전하여 조제하며, 연질 캡슐제는 보통 캡슐에 건강기능성식품 또는 건강기능성식품에 적당한 부형제 등을 넣은 것을 젤라틴 등 적당한 캡슐기제에 글리세린 또는 소르비톨 등을 넣어 소성을 높인 캡슐기제로 피포하여 일정한 형상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 상기 캡슐기제에 착색료 보존료 등을 첨가할 수 있다.

환 제형의 건강기능성식품은 보통 건강기능성식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 구상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

과립 제형의 건강기능성식품은 보통 건강기능성식품을 그대로 또는 건강기능성식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 넣어 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 입상으로 만들고 될 수 있는 대로 입자를 고르게 한 것이며, 필요에 따라 착향료, 교미제 등을 넣을 수 있다.

음료 제형의 건강기능성식품은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 의약조성물은 항노화 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 용도를 갖는다. 항노화 관련 질환은 비만, 갱년기, 탈모, 스테미너, 피부노화 등이고, 염증성 질환은 급성장염, 크론씨병, 궤양성 대장염 및 허혈성 대장염을 포함하며 기능성 장질환에는 설사, 변비, 장게실 및 과민성 장증후군을 포함한다.

본 발명의 조성물을 포함하는 의약조성물의 경우, 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 의약조성물은 투여를 위해서 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제,시럽, 즙, 현탁제, 또는 유제 등이 될 수 있다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구,무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가로스, 벤토나이트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 약학 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 잠재적인 면역 조절 능력을 지닌 프로 바이오 틱스 LAB를 선별하기 위한 프로토콜을 확립하고 시험 관내에서 각 세균 균주의 항 염증 및 프로 염증 활성을 비교했으며. 마지막으로 선별된 LAB를 마우스 모델 시스템에 적용하여 시험 관내 선별 검사와의 관련성을 확인하고자 하였다.

먼저 숙주 면역력조절에 효과가 있는 프로바이오틱 유산균(LAB) 을 선정하였다. 일부 LAB은 LAB 배양 상등액을 THP-1 세포에 첨가했을 때 TNF-α 유도를 억제함으로서 LAB의 항염증성(anti-inflammatory) 잠재력을 나타내 보인다.

이러한 억제 물질은 열 또는 트립신에 의해 불활성화되지 않았다. 한편 살아있는 박테리아 세포들로 THP-1을 직접 처리하면 TNF-의 생산을 확실히 촉진시키는 친 염증성(pro- inflammatory) LAB 군도 확인되었다. 이 방법으로 항염증성 균주로 Lactobacillus reuteri BM36301을, 전(pro) 염증성 균주로 L. reuteri BM36304를 선정하였고 in vivo 효과를 더 연구하였다.

이 실험은 C57BL/6 쥐에게 식수에 넣은 박테리아를 공급하면서 20주 동안 표준식단을 제공하였다. 흥미롭게도, L. reuteri 균주는 생쥐의 성별에 따라 다른 결과를 초래하였다. 즉, BM36301로 처리 한 수컷의 체중 증가가 적고 테스토스테론 수치가 높았다. BM36301으로 처리 한 암컷은 활성 모낭 생성 및 모발 성장으로 건강한 피부뿐만 아니라 더 낮은 혈청 TNF-α를 유지했다. 또한, BM36304로 처리 한 수컷은 TNF-α와 인슐린 수치가 더 높았지만 대조적으로 암컷은 이 박테리아 균으로부터 영향을 받지 않았다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 probiotic lactic acid bacteria의 특성

본 발명자들은 인간, 동물, 식물 및 식품을 비롯한 다양한 소재에서 수년간 유산균 (LAB)을 분리해 왔다. 이 Benebios Microorganisms (BM) 컬렉션은 500 종 이상의 균주로 구성되어 있으며 프로바이오틱스로의 잠재력이 있는 균주 선정을 목표로 한 초기 스크리닝을 하였다. 본 발명에서는 분변에서 유래 한 4 개의 인간 공생 균주를 선택하여 더 자세히 연구했으며 (표 1). 구체적으로 조사한 균주들은 두 Lactobacillus reuteri 균주들 (BM36301 및 BM36304), L. gasseri 균주 (BM33601) 및 Bifidobacterium animalis subsp. lactis 균주 (BM10307)이었다. 먼저 probiotics로서 그들의 일반적인 자격과 관련하여 박테리아를 검사하였다 (표 1). 첫째, 이들 BM 균주는 산 (pH 2.5)과 담즙 염 (0.3 %)에 대한 내성을 나타내 었으며 37 ℃에서 1 시간 처리 후 43.5 %에서 98.5 %의 생존율 범위를 나타내 었으며 합리적으로 높은 점수를 얻었다.

다음으로, 장내 세균에 대한 항균 역가을 시험하였다. L. gasseri BM33601이 시험자 균주 E. coli의 최소 억제를 나타내었지만, 다른 모든 균주들은 구별되는 억제 구역 (LAB 가장자리로부터 0.5-3 mm 거리)을 형성하였다. 이러한 억제 효과는 일반적으로 박테리오신, 유기산 (젖산 또는 아세트산), 과산화수소 또는 LAB의 에탄올에 의해 발생한다. 마지막으로 체외에서 인간의 장 상피 세포 (IECs)에 결합하는 능력을 관찰했다. 이를 위해 coverslips에서 인간 결장암 세포 인 HT-29를 15 일 동안 배양한 후 라이브 LAB 배양물을 1 시간 동안 적용하였다(실시예 참조). 그리고 광범위하게 세척한 후, 남아있는 박테리아 세포를 그램 염색으로 현미경으로 계수 하였다. L. reuteri 균주 BM36301 및 BM36304는 높은 보유 점수 (HT-29 당 5.5-7.4 박테리아)를 보인 반면에, L. gasseri BM33601은 온건함 (HT-29 당 1.7 박테리아)을 보이고, B. animalis subsp. lactis BM10307은 (HT-29 당 0.3 박테리아) 점수가 낮았다. LAB를 IEC에 보다 강하게 부착시키는 것은 특히 중요하다. 왜냐하면 숙주가 효과를 발휘할 수 있을만큼 오랫동안 장의 점막층에 머무를 필요가 있기 때문이다. 이러한 1 차 실험으로부터 2 종의 L. reuteri 균주는 우수한 품질의 probiotics로서 높은 잠재력을 보였다.

인 비트로에서 젖산균에 의한 TNF -알파 생성의 조절

먼저 장염증을 억제할 수 있는 가능성을 가진 LAB를 선별하는 것을 목표로 삼았다. 이를 위해 우리는 인간 골수 세포 (THP-1)가 박테리아 지질 다당류 (LPS)에 의한 Toll 유사 수용체 (TLR)의 활성화 때 TNF-α를 분비하는 시험관 조직 배양 시스템을 채택했다. 첫째, 3.5 시간 동안 150 ng / ml 용량으로 LPS로 처리한 1 ml 배양물에서 5x10⁴의 THP-1 세포가 200-300 pg / ml TNF-α의 생성을 야기한다는 것을 확인했다 (그림 1A, 레인 1 및 2). 다음으로, 24시간 동안 배양한 박테리아 배양물의 상등액을 수집하고, 진공 건조시킨 다음 조건부 배지 (CM)를 재구성하였다 (실시예 참조). 이 CM은 LAB와 배양 조건에 따라 TNF--α를 억제하고 또 유도하는 복합적인 활성을 가지고있다. 실제로, 본 발명자들은 LPS가 없는 BM36304 및 BM36301의 CM에 의한 TNF-α의 경미한 생산을 관찰하였지만,이 양은 LPS로 자극을 유도한 것의 20 % 미만이었다 (데이터는 표시되지 않음).

마지막으로, LPS와 5%의 THP-1 배양물 (v / v)이 되는 CM을 첨가하였다(그림 1A, 레인 3-6). LPS가 있을 때 (208±49 pg / ㎖, 레인 2)의 TNF 알파생산은 L. reuteri BM36301 유래 CM 첨가시(90.90±49.3 pg / ml, 레인 3) 40%로 억제되었고, B. animalis subsp. lactis BM10307 유래 CM 첨가시(118.8 ± 19.0 pg / ml, 레인 6) 52%까지 TNF-알파가 억제되었다. 선별 목적으로, TNF-알파의 억제를 LPS 처리에 의한 발현의 50% 이하로 억제하는 것을 항염증제로 간주했다. 그러나 L. reuteri BM36304 및 L. gasseri BM33601의 CM은 그 시점까지 TNF-알파 생산을 억제할 수 없었다. 본 발명자들은 다양한 배양 조건으로 제조한 CM을 사용하여서도 생산억제를 못하는 불활성 활동을 확인하였다(데이터는 표시되지 않음).

다음으로, 그램 양성균의 세포 성분이 염증 반응을 유도할 수 있기 때문에 박테리아 세포 자체의 TNF-알파 유도 용량을 조사했다. 이를 위해 박테리아를 기하 급수적인 단계 (16 시간)까지 성장시킨 다음, 수확하고, 씻고, THP-1 배양물에 250 배 이상 세균 세포를 첨가하였다. 박테리아 세포의 대사 활성은 THP-1 배지에 첨가 된 항생제에 의해 최소화되었다. 배양 6 시간 후 분비 된 TNF-α를 정량적으로 측정하였다 (그림 1B). 4 개의 LAB 세포 모두 TNF-α를 유도하는 것으로 밝혀졌지만 BM36301은 BM36304 (2,342 pg / ml), BM33601 (3,100 pg / ml) 및 BM10307 (7,141pg / ml)보다 유의차가 있게 적은 양 (609 pg / ml) 이었다.

이 6시간의 공동 배양 동안 우리는 사용 된 LAB에 따라 THP-1 세포가 다양한 세포 사멸을 경험한다는 것을 관찰했다. 특히 가장 낮은 TNF-α 유도제인 BM36301은 THP-1의 사망 (9.7 %)이 가장 적었고, 다른 TNF-α의 높은 유도 균주는 24 ~ 38%의 사망률을 보였다. 그러므로 BM36301이 THP-1 생존율의 손실 자체 때문에 낮은 TNF-를 유도한 것은 아니다. 우리 선별 목적 상, 전(pro) 염증성 TNF-알파 활성이 1,000 pg / ml 이상인 LAB를 전 염증성 물질로 간주했다.

요약하면, 시험 관(in vitro)내 면역 조절 활성은 억제성 CM (BM36301 및 BM10307) 과 유도성 생균 (BM36304, BM33601, 및 BM10307)으로 나누어진다. BM10307은 두 가지 활동을 모두 보여 주었기 때문에 이중 기능을 보유한 것으로 지정했다 (그림 1C). L. reuteri 두 균주는 별개의 활동을 보였다. 광범위한 BM 수집 물의 초기 스크리닝에서 항염증성 균주는 드물지만 5 % 미만의 발견률을 보였다 (데이터는 표시되지 않음). 또한 일부 균주는 활성도를 보이지 않아 '중립'범주에 속한 것으로 분류하였다 (데이터는 표시되지 않음).

CMs에서 억제 분자들은 열 및 트립신에 대해 안정함

LAB의 CM은 다양한 박테리아 대사 물질과 세포 성분으로 구성되어 있기 때문에 CM의 항 염증 특성을 더 잘 이해하고자했다. TNF-α의 발현은 L. reuteri BM36301 (그림 2A)과 B. animalis subsp.lactis BM10307 (그림 2B)에서 CM의 농도가 증가함에 따라 정량적으로 감소했다). 흥미롭게도, BM36301 (0.5 x input 또는 2.5 % v / v)의 적은 양의 CM이 실제로 TNF-α를 유도했으며 (그림 2A, 레인 2, 3) 이는 소량의 CM이 TNF-α 유도물질을 어느 정도 함유하고 있다는 관찰과 일치한다.그럼에도 불구하고 억제 효과는 CM 양이 증가함에 따라 지배적으로 나타났으며, 이는 항염증 물질이 정량적으로 첨가되고 THP-1 세포 표면의 해당 수용체가 풍부하여CM처리에 쉽게 반응할 수 있음을 시사한다.

전반적으로, 이러한 관찰은 CMs가 복잡한 성질에도 불구하고 TNF-α 억제에 관여하는 활성 대사 산물을 함유하고 있음을 시사한다. 우리는 CM에서 항 염증 물질의 물리 화학적 특성을 조사했다. 10 분 동안 각 균주에서 CM을 10분간 끓여 열처리한 것은 천연 CM과 비교하여 TNF-α 억제 기능을 변경하는 데 효과적이지 않은 것으로 나타났다 (그림 2C, 레인 3 및 4). 마찬가지로, 트립신 처리도 그들의 활동에 영향을 미치지 않았다 (그림 2C, 레인 5). 이러한 관찰은 CMs의 주된 억제 인자가 단백질이나 열에 민감한 분자가 아님을 제시한다.

프로바이오틱 균주로 처리된 마우스에서 TNF -α 조절

궁극적인 질문은 LAB 선정을 시험관(in vitro) 내 TNF-α의 조절방법으로 하는 것이 생체(in vivo) 내 적용과 얼마나 관련이 있는지를 보는 것이다. 이를 위하여 선택된 L. reuteri 균주를 마우스 모델 시스템에 적용하였다. 그룹당 6 마리의 수컷과 8마리의 암컷의 20주 된, 근친교배 된 C57BL / 6 마우스를 준비했으며, 그런 다음 20 주 동안 한 그룹은 항염증제 BM36301로 처리하였고, 다른 그룹은 프로 염증성 BM36304로 처리하였고 대조 그룹(control)은 덱스트로스 (실시예 참조)로 처리되었다. 동물에 대한 고통을 최소화하기 위한 수단으로 LAB 배양물을 마우스 당 1 x 10⁶박테리아의 일일 소비량에 맞게 식수로 투여했다. 또한 노화 과정이 그 기간 동안 자연스럽도록 표준 식단을 제공했다. 20 주 배양 (총 40 주령)이 끝날 때 우리는 쥐를 안락사시키고 정량적 ELISA 방법을 사용하여 사이토 카인 및 테스토스테론을 측정하기 위해 혈청 준비를 위해 혈액을 회수했다. 부검을 시행 할 때 육안 적 이상이 없음을 확인하였다.

주 관심사인 쥐의 혈청 TNF-α 수준을 조사하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 대조 수컷은 5.85 ± 1.34 pg / ml의 혈청 TNF-α를 나타내었다. BM36301로 처리 한 수컷은 유의차가 없었지만 (p = 0.59), 약간의 감소 (4.90 ± 0.9 pg / ml)를 보였다. 그러나 BM36304로 처리 한 수컷은 유의차가 높은 TNF-α 수치를 보였다 (8.28 ± 1.09 pg / ml, 대조군 대 p = 0.006). 우리는 또한 암컷의 TNF-α농도를 정량화했다 (그림 3B). 우리는 여성 대조군이 남성 대조군보다 TNF-α (7.9 ± 1.05 pg / ml)가 유의하게 높았다 (p = 0.42). 특히 BM36301을 먹인 암컷은 TNF-α (5.17 ±0.80 pg / ml, p = 0.017 대 대조군)의 양을 현저하게 감소시켰고, BM36304를 처리한 암컷은 대조군과 유사하게 나타났다 (7.43 ±2.69 pg / ml , p = 0.71 대 대조군). TNF-α의 이러한 변이와는 달리, 우리는 그룹간에 유의 한 혈청 IL-10 농도의 차이를 확인할 수 없었다 (데이터 미제공).

요약하면, BM36301균주 처리군에서 항염증성인 혈액의 TNF-α의 감소가 관찰되었으며, 암컷에서 관찰된 효과가 더 뚜렷하였다. 친 염증성 BM36304균주는 수컷에서는 TNF-α의 증가를 가져 왔지만 암컷에서는 그렇지 않았다. 이러한 결과는 우리의 in vitro screening이 TNF-α의 생체 내 유지와 의미있는 관련이 있음을 시사한다. 이 해당 균주를 2017년 3월13일 대한민국 서울시 서대문구 홍제내2가길 45 (홍제동) 유림빌딩 소재 한국 미생물 보존센터에 기탁번호 KCCM11987P로 기탁하였다.

L. reuteri BM36301은 수컷 마우스에서 감소된 체중 증가 및 높은 테스토스테론을 유지함

노화는 당뇨병과 비만을 포함하여 많은 건강 문제의 근원이다. 동물 모델에서 이러한 노화 문제를 빨리 진행시키기 위해 고지 방식이 종종 사용된다. 그러나, 가속화된 실험에 대한 해석은 인간의 고령화가 고지 방식의 목표에 의해 이루어지지 않기 때문에 복잡할 수 있다. 우리는 노화 과정이 가장 자연스러울 수 있도록 모든 표준 생쥐를 사육했다. 20 주령의 실험 시간대에서 대조군 수컷은 약 8g (7.83 ± 1.2g), 대조군 암컷은 약 5g (4.8 ± 0.94g) 증가했다. 놀랍게도, 항염증성 BM36301을 먹인 수컷의 체중 증가는 대조군 (5.78 ± 0.75 g, p = 0.040)보다 36 % (그림 4A, 레인 1 및 2)보다 유의하게 낮았다. 그러나 BM36304로 처리한 수컷 (7.53 ± 0.74 g)의 체중 증가는 대조군과 유의한 차이가 없었다 (p = 0.67). 암컷 집단의 체중 증가는 통계적으로 서로 다르지 않았다.

또 다른 중요한 차이점은 BM36304로 치료 한 수컷의 혈청 인슐린 수치였다 (그림 4B). 대조군 수컷 그룹은 3.18 ±0.65 ng / ml의 인슐린을 보였지만 BM36304를 투여 한 수컷 그룹은 4.91 ± 0.63 ng / ml의 인슐린을 보였다 (p = 0.027). 그러나 이 그룹의 체중 증가가 대조군과 큰 차이가 없었고 (그림 4A), BM36304로 처리한 수컷그룹에서 더 많은 복부 지방 축적을 관찰하지 못했다 (데이터는 표시되지 않음). 40 주된 시점에서, 인슐린 스파이크는 생쥐에서 임상적으로 명백한 당뇨병을 일으키지 않았을 수 있지만, 마우스가 더 오래되면 인슐린 스파이크가 더 두드러 질 수도 있음을 배제할 수 없다. 암컷 그룹 사이의 인슐린 변이는 서로 유의 한 차이가 없었다.

마지막으로 수컷의 테스토스테론 수준에 초점을 맞추었다. 항 염증성 BM36301 수컷은 대조군 (2.20 ± 0.38 ng / ml, p = 0.0025)보다 유의하게 높은 혈청 테스토스테론 (5.18 ± 0.87 ng / ml)을 유지 하였다. 그러나 BM36304 투여군은 대조군과 통계적으로 차이가 없었다 (3.23 ± 2.10 ng / ml, p = 0.07). 테스토스테론 결과를 더 잘 이해하기 위해 각 마우스의 고환을 검사했다. BM36301을 먹인 수컷군의 쌍성 고환의 무게는 0.579 ± 0.075 g로 대조군의 것보다 10 % 더 무거웠다 (0.525 ± 0.05 g, p = 0.049). BM36301 그룹 (그림 3A)에서 체중 증가가 더 작은 것을 고려하면,이 고환의 크기 차이는 더욱 분명하였다. 대조군의 고환 체중 대 체중 증가율 (TW / WG)의 비율은 BM36301 군의 67 %에 불과했다. 그러나 우리는 정자와 조직의 미세한 차이를 관찰할 수 없었다. 두 그룹 사이의 정관 세관 직경은 유의차가 없었다(156.03 ± 6.65 um의 대조군 vs, 153.95 ± 18.66 um의 BM36301- 처리군, 수컷, p = 0.51 ). spermatogenesis 또는 Leydig 세포 영역을 비교하는 것 같은 다른 연구를 수행하지 않았다.

요약하면, BM36301은 수컷에게 더 큰 고환과 더 많은 테스토스테론생성을 하며, 낮은 체중 증가를 유지하는 것을 도왔다. 노화된 수컷의 테스토스테론 생산 감소는 아마도 염증성에 의한 모욕의 결과로 고환의 연령 의존성 병변과 관련이 있다고 제안되어왔다. 한편, 전 염증성 BM36304는 수컷들에게서 체중 증가 또는 테스토스테론의 변화없이 인슐린의 증가를 유발했다. 특히, 이들 세균 균주 중 어느 것도 암컷 생쥐에서 신체 측정에 유의한 영향을 미치지 않았다.

BM36301 유래 건강한 암컷 피부

BM36301은 시험 관내(in vitro) 및 생체(in vivo) 내에서 항염증 효과를 보였으므로, 이 균주가 피부에서 어떠한 건강상의 이점을 유발할 수 있는지에 대한 질문을 가졌다. 쥐실험 18주에 각 그룹에서 2 마리의 마우스의 등털를 깎아 내고 1 주일 후에 모발검사를 하였다. 흥미롭게도, BM36301을 먹인 암컷 마우스는 면도 된 부위에서 완전한 회복은 아니지만 더 빠른 모발 재성장을 보였다 (그림 5A). 이와는 대조적으로, 대조군이나 BM36304 군은 이러한 빠른 회복 속도를 보이지 않았다. 실험에 포함된 된 수컷들은 모발의 재성장하는 속도가 대조군과 구별할 수 없었다. 이것은 촉진 된 모발 성장이 암컷에서만 뚜렷하게 나타났음을 말해준다. 피부 건강을 평가하는 또 다른 측정 기준은 모피의 광택을 검사하는 것이다. 그러나 대조군의 비교적 반짝이는 모피 조건으로 인해 감각 측정기 또는 측광기 측정을 통해 각 그룹간에 의미있는 차이를 관찰하지 아니하였다 (데이터는 표시되지 않음).

Hematoxylin과 Eosin으로 염색한 후 현미경으로 피부 단면을 검사하여 피부 건강을 평가했다. 도표 5B 및 5C에 도시된 바와 같이, BM36301 처리된 암컷 마우스는 대조군 암컷 마우스보다 더 많은 피하 모낭 (HF)의 수를 나타냈다. 대조군 암컷 군은 400o 해상도에서 현미 경상 당 HF 수는 3.50 ± 0.52이었고, BM36301을 먹은 암컷 군은 4.80 ± 0.61이었다 (p = 0.023). 그러나 BM36304로 치료 한 암컷은 약간의 변화만을 보였다 (4.15 ± 1.73, p = 0.55 vs. 대조군). 모낭에 대한보다 상세한 분석 결과, BM36301을 먹인 암컷은 대조군보다 약간 더 활동적인 모발주기 단계를 나타냈다는 것을 발견했다 (아나젠 + catagen : telogen은 대조군에서 81:19 대 BM36301-fed 암컷에서 95 : 5였다 ). 한편, 수컷 그룹의 HF 수치는 크게 차이가 없었다 (그림 5B).

마지막으로, 우리는 또한 표피에서 panniculus carnosus까지의 깊이로 측정 한 피부 두께를 평가했다 (그림 5C). 대조군과 BM36301 처리된 암컷 간의 심도의 차이를 찾을 수 없었다. 그러나 BM36301을 먹인 생쥐의 피부층은 대조군보다 약간 더 깊은 것으로 판명되었으며 BM36301을 처리 한 생쥐의 지방 조직은 대조군보다 얕았다. 대부분의 피하 HF는 진피에서 발견되었다.

전반적으로, 이러한 관찰 결과는 BM36301 치료가 여성의 모발 재성장 및 HF 수치에 의해 입증된 것처럼 건강한 피부를 육성했다는 것을 시사한다. 그러나, BM36301 그룹과 대조군 사이의 피부 샘플의 현미경적 차이는 다소 적게 나타났다. 이러한 피부 건강 효과는 남성에서는 관찰되지 않았다. 또한, 전 염증성 BM36304도 실험시 피부에 어떠한 부작용도 일으키지 않았다.

본 발명에서 사용된 약어에 대한 풀 네임은 하기와 같다.

LAB: lactic acid bacteria,

IBD: inflammatory bowel disease,

TLR: Toll-like receptor,

LPS: lipopolysaccharide,

TNF: tumor necrosis factor,

IEC: intestinal epithelial cell,

IL: interleukin,

BM: Benebios Microorganism,

CM: conditioned medium,

ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay,

HF: hair follicle

본 발명의 L. reuteri BM36301은 in vitro 실험에서 항 염증성 균주로 선정되었고, 이 균주는 실험 대상을 건강한 상태를 유지할 수 있도록 도왔으며. 이러한 결과는 L. reuteri BM36301을 노화 문제의 다양한 측면을 개선하기 위한 가능성이 좋은 probiotic 균주로 사용할 수 있다.

도 1은 인 비트로에서 LAB에 의한 면역조절을 나타낸 그림,(A) THP - 1에서 LPS가 유발한 TNF -알파 생산에 대한 항염증 활성을 위한 조건화 배지 (CM)와 유산균 (LAB)의 스크리닝. LPS가 없으면 탐지할 수 없는 양의 TNF-α가 관찰되었다 (lane 1). 150 ng / ml의 LPS 처리로 THP-1 세포는 상당한 양의 TNF-α( lane 2)를 생산했다. 각 CM은 THP-1 배양물의 5 %로 처리하여 억제 효과를 평가하였다 (레인 3, L. reuteri BM36301, 레인 4, L. reuteri BM36304, 레인 5, L. gasseri BM33601 및 레인 6, B. animalis subsp. lactis BM10307). MRS를 사용한 대조(LPS 유무)구의 TNF-α 생성을 비교하였다(레인 1 과 2). BM36301 CM 처리 (레인 3) 와 BM10307 CM 처리 (대조군 ,레인 1) 사이의 t- 검정으로부터 p <0.03을 나타내었다. 대조군( 레인 1) 과 BM10307 CM처리(레인 6)도 p<0.03을 나타내었다 이 자료는 5개의 반복 실험의 평균의 표준 편차 (SD)로 차이를 나타내었다( 유의 차: p<0.03)
도 1(B) THP-1 세포에서 TNF-α 생성을 유도하기 위한 프로 - 염증 활성을 위한 살아있는 세포를 갖는 LAB의 스크리닝. 기하 급수적으로 성장하는 배양물로부터 대략 1.5x10⁸의 박테리아 세포를 6 × 10⁵THP-1 세포에 6시간 동안 적용하였다. 무 세포 상층 액을 수집하고 ELISA 방법으로 분비 된 TNF-α에 대해 평가하였다. 결과는 4 번의 반복된 실험을 통해 SD의 평균을 보여준다.
(C) 다양한 유산균에 의한 시험 관내 면역 조절 요약.
도 2는 억제적인 CM이 정량적이고, 열 및 효소 분해에 대한 저항성을 가진다는 것을 나타내는 그림, (A) L. reuteri 균주인 CM36301은 LPS로 처리한 THP-1 세포의 TNF-α 생성을 정량적으로 억제한다. LPS (레인 2 - 6) 또는 없는 레인 (레인 1)을 사용한 THP-1 배양물에서 생성된 TNF-알파 수준을 ELISA 방법으로 측정하였다. CM의 처리를 위해, 2.5 % (0.5x, 레인 3), 5 % (1x, 레인 4), 10 % (2x, 레인 5) 또는 15 % (3x, 레인 6) THP-1 배양 부피(v / v)를 LPS 자극시 첨가 하였다. 대조 배지(MRS)로부터 유래한 CM을 레인 1 및 2에서 5 %로 첨가하였다. 데이터는 3 개의 독립적인 분석으로부터 SD를 갖는 평균을 나타낸다. (B) B. animalis subsp. lactis 균주 BM10307 유래 CM은 LPS로 처리한 THP-1 세포에서 TNF-알파 생성을 정량적으로 억제하는 대사 산물을 포함하고 있다. LPS 및 CM은 기재된 바와 같이 처리하였다. 대조배지(BL) 유래 CM을 레인 1 및 2에서 5%로 첨가 하였다. 데이터는 3 가지 독립적인 실험으로부터 나온 것이다. (C) BM36301 (회색) 또는 BM10307 (흑색) 유래 CM을 가열(레인 4) 또는 트립신(레인 5)으로 처리하여 본래 CM (레인 3)과의 활동을 비교하였다. 결과는 세 번의 독립적 인 실험을 통해 SD와의 평균값이다.
도 3은 프로바이오틱 균주로 급여된 C57BL/6 마우스 유래 TNF-알파를 나타낸 그림, (A) 수컷 마우스(n = 6 각각) 유래 혈청의 TNF-알파, 각각은 L. reuteri 균주를 공급. **는 대조군 (레인 1 및 3)과 비교하여 t- 테스트로부터 p = 0.006을 나타낸다. (B) 암컷 마우스(n = 8 각각) 유래 혈청의 TNF-알파, 각각은 L. reuteri 균주를 공급. *는 대조군 (레인 1 및 2)과 비교하여 t- 테스트로부터 p = 0.017을 나타낸다.
도 4는 L. reuteri strain BM36301 급여된 노화된 수컷 마우스가 건강한 신체 지수를 유지한다는 것을 나타낸 그림, (A) 20 주 동안 각 L. reuteri 균주를 먹인 마우스 C57BL / 6의 순 체중 증가 (수컷은 회색 막대가 6 마리, 암컷은 어두운 바가 8 마리). *는 대조군 (수컷 레인 1 및 2)과 비교하여 t- 검정으로부터 p = 0.040을 나타낸다. (B) (A)에서와 같이 각 L. reuteri 균주를 급여한 마우스의 혈청 인슐린 농도. **는 대조군 (수컷레인 1 및 3)과 비교하여 t- 검정으로부터 p = 0.027을 나타낸다. (C) (A)에서와 같이 각 L. reuteri 균주를 먹인 수컷 쥐의 혈청 테스토스테론 양. ***는 대조군 (레인 1 및 2)과 비교하여 t- 테스트로부터 p = 0.0025를 나타낸다.
도 5는 L. reuteri strain BM36301 급여된 노화된 암컷 마우스가 건강한 피부 등을 나타낸다는 것을 나타낸 그림, (A) L. reuteri 균주 처리된 물 또는 대조 수를 섭취하는 C57BL / 6 마우스에 대한 모발 재성장 실험. 2 × 2cm의 넓은 피부 부위가 분명히 면도되었고, 모발 재성장은 일주일 후 조사되었다. (B) 대조군 또는 L. reuteri 균주를 먹인 쥐의 피부 절편 샘플에서 모낭 (HF) 수를 수집했다. 5 ~ 8 마리의 생쥐에서 400x 해상도로 5 개의 현미경 이미지를 계산했다. *는 대조군 (암컷 레인 1 및 2)과 비교하여 t- 검정으로부터 p = 0.023을 나타낸다. (C) 대조군 (왼쪽)과 BM36301 처리 마우스 (오른쪽)의 피부 절편을 Hematoxylin과 Eosin으로 염색하여 피부 조직층과 HF를 표지로 나타내었다. 사진은 100 해상도로 찍었다. 막대는 척도의 길이가 100 um임을 나타낸다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 박테리아 배양, 인간 세포주, 배지 및 화학물질

본 발명에 사용된 모든 LAB을 인간의 변에서 분리했다 (표 1). Lactobacilli는 DeMan, Rogosa, Sharpe (MRS; 3M Health Care, St. Paul, MN) 배지에서 배양하였고 bifidobacterium은 BL 배지(Acumedia, Lansing, MI)에 배양 하였다. Anaero Pack-Anaero (미쯔비시 가스 케미칼, 일본)의 향낭을 공기 차단 용기에 넣어 혐기 조건을 만들었다. 액체 배지에서 24 시간 배양하여 L. reuteri BM36301 및BM36304는 1ml (CFU / ml) 당 1.3xx10⁹ 콜로니 형성 단위, L. gasseri BM33601 는 2x10⁸CFU / ml, B. animalis subsp. lactis BM10307는 1x10⁹ CFU / ml였다.

Hemacytometer에서 측정한 L. reuteri 균주의 물리적 세포 수는이 일반적으로 약 1.1 × 10⁹/ ml이었고, 대부분의 세포가 콜로니를 생성할 수 있을 만큼 손상되지 않았다. DH10b 및 DH5a의 대장균 균주는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 성장시켰다. 인간 세포주 인 THP-1 (TIB-202)과 HT-29 (HTB-38)는 ATCC (Manassas, VA)에서 구입하여 RPMI-1640 배지 (ATCC)에서 37 ℃, 5 % McCoy의 5A 변형 배지 (Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 각각 배양하였다. 이들 배지에는 10 % 태아 소 혈청 및 100U / ml 페니실린 + 스트렙토마이신 (Life Technologies)이 보충되었다. Oxgall 분말은 Chem-Impex Int'l (Wood Dale, IL)에서 구입했다. 그람 염색 키트는 Fisher Scientific (Pittsburg, PA)의 키트입니다. 대장균 0127 : B8의 LPS는 Sigma (St. Louis, MO)로부터 수득하였다.

Strain	Taxonomy	^{Resistance against a}		^{Antimicrobial activity b}	^{Adhesion to IEC c}
Strain	Taxonomy	*Acids (pH 2.5)*	*^{Bile salts (0.3%)}*	^{Antimicrobial activity b}	^{Adhesion to IEC c}
BM36301	L. reuteri	50.2%	53.4%	+	5.5± 0.4
BM36304	L. reuteri	83.5%	89.4%	++	7.4 ± 0.8
BM33601	L. gasseri	98.5%	72.6%		1.7 ± 0.2
BM10307	B. animalis subsp. lactis	43.0%	47.3%	+	0.3 ± 0.05

표 1은 본 발명에서 얻은 프로바이오틱 균주의 특성

(a) 처리된 배양물의 콜로니 형성 단위 (CFU)와 미처리 대조군의 생존율을 비교하여 생존율을 계산하였다. 세 가지 독립적인 실험의 대표적인 데이터가 표시된다.

(b) 시험기 균주의 성장에 대한 명백한 구역별 억제는 지점의 가장자리로부터 측정되었고 (방법 참조), 다음과 같이 표현되었다; (0.5 mm 미만 억제 영역), + (0.5 ~ 1.0 mm) 또는 ++ (1.0 ~ 3.0 mm).

(c) HT-29 세포 당 평균 세균 수는 표준 편차 ( SD)로 표시된다.

실시예 2: 프로바이오틱 특성 규명

분류 - 분류 학적 분류는 16S rRNA를 시퀀싱하고 EZ-taxon[Chun J, Lee JH, Jung Y, Kim M, Kim S, Kim BK, Lim YW: International journal of systematic and evolutionary microbiology 2007, 57(Pt 10):2259-2261] 또는 BLAST 프로그램을 공개 데이터베이스에 대해 실행함으로써 확인되었다.

산성 및 담즙 내성 - 담즙성 항염증제 0.3 % Oxgall을 함유한 MRS 배지 및 pH 2.5로내린 MRS 배지에 기하 급수적으로 증식시킨 세균 배양 물을 접종하여 37 ℃에서 1시간 동안 항온 처리하여 산 또는 담즙산 염에 대한 내성 시험을 수행하였다. 연속 희석시킨 후 플레이트배지에 깔았다. 이들 처리가 없는 대조 배양물을 병행 처리하여 생존율을 계산하였다.

항균 활성 - 각 균주로부터 1-2ⅹ10⁵ CFU 접종을 한 직경 5mm의 스폿을 MRS 한천 플레이트상에서 1-2 일 동안 성장시킨 다음, 대장균을 함유 한 LB 연한 한천을 부었다. 명확한 억제 영역은 LAB 반점의 가장자리에서 측정되었다.

Adhesion Assay - 접착 분석은 Bernet et.의 방법을 변형하여 수행하였다[Bernet M-F, Brassart D, Neeser J, Servin A: Applied and Environmental Microbiology 1993, 59(12):4121-4128].

간략 요약하면, HT-29 세포를 조직 배양 coverslips (Sarstedt, 뉴턴, 노스 캐롤라이나)에 뿌려 접착하고 하루 건너 배지를 갈아주며 15--20일 동안 배양하였다. 1 ~ 5ⅹ10⁸ CFU의 밤새 성장한 박테리아 배양물을 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 1시간 동안 커버 슬립에 적용하였다. 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 5 번 세척한 후, 부착 된 박테리아를 메탄올로 고정시키고 그램 염색으로 시각화하였다. 20개의 무작위 현미경 사진에서 세균 세포 수를 세었으며 그 과정을 세 번 이상 반복했다. HT-29 세포 당 평균 접착성 박테리아 수가 보여졌다

실시예 3: CM 또는 생존 세포와 반응하는 THP 유래 TNF -α 측정

CM의 준비를 위해, LAB 세포는 MRS 또는 BL과 같은 글루코오스 기반 배지에서 37℃에서의 대기 배양에서 정체상태 (최대 24시간)까지 성장시켰다. 세포를 4,000 g에서 10 분 동안 회전시켜 제거하였다. 수집된 상등액을 필터 멸균 (0.2 um, Corning, NY)하고, 진공 건조시키고, 같은 부피의 RPMI-1640에 재현탁시켰다. 배양 부피 1 ㎖ 중 5 × 10⁴의 THP-1 세포를 5 % CO₂ 와 37℃에서 3.5 시간 동안 E. coli LPS(150ng/ml)로 자극하였다. 필요할 때 LPS를 첨가하기 전에 CM을 5 % (v / v)로 첨가 하였다. 배양물을 채취하고 상등액을 사용하여 제조자의 지시 (Ready-Set-Go kit, eBioscience, San Diego, CA)에 따라 ELISA 방법으로 TNF-알파를 정량적으로 측정하였다. 물리 화학적 안정성을 위해 CM을 10분간 끓이거나 37 ℃에서 30 분간 트립신 (0.25 mg / ml)으로 처리하였다. 생균 처리를 위해 LAB 세포를 16시간 동안 지수 적으로 성장시키고 상기와 같이 수집 한 다음 PBS로 한 번 씻은 다음 6 × 10⁵ THP-1 세포에 250 배 초과하여 투여했다. 5 % CO₂와 함께 37 ℃에서 6시간 동안 배양 한 후, 배양 물을 수집하고 상층 액을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 TNF-α를 측정 하였다.

실시예 4; 동물 실험

마우스 - 18 주 된 특정 병원균이없는 C57BL / 6 마우스를 The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)에서 구입하여 국제 실험 동물 관리 협회 (AAALAC)의 인증을 받은 시설에 보관하였다. 총 24 마리의 암컷과 18 마리의 수컷 마우스가 개별 환기 케이지의 사회적으로 호환 가능한 그룹에 수용되었다. 쥐에게 임의로 Teklad Global 14 % Protein Rodent Maintenance 식단 (Teklad, Madison, WI)을 급여 하였다. 생쥐가 보관 된 방은 12:12 라이트 : 어두움 싸이클하에 유지되었다. 마우스는 실험적 사용을 시작하기 전에 2 주 동안이 조건에 순응시켰다. 모든 연구는 University of Notre Dame 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았다.

처리군 - 20 주령에, 대조군, BM36301 및 BM36304에 대해 3 마리의 처리 그룹 (그룹당 6 마리의 암컷 및 8 마리의 암컷)으로 마우스 케이지를 무작위로 배치 하였다. 마우스는 그들이 정상적인 물을 소비했다는 것을 확증하기 위해 면밀히 관찰되었다. 그들은 매주 무게를 측정하였다.

Probiotic Preparations - BM36301과 BM36304의 동결 건조 제제를 250ml의 역삼 투 (RO) 수에 녹여 물병에 넣었다. 이 처리구의 균주는 매일 재구성되었고 이 신선한 물병은 매일 우리(cage)에게 생수 공급원으로 공급되었다. 대조군 마우스는 덱 스트로스 (균주에 포함됨)가 함유된 RO 물만을 받았다. 사용된 박테리아의 양은 재구성 된 물 공급을 위해 조정되어 각 마우스는 20주 동안 매일 약 1 x 10⁶개의 생균을 섭취할 수 있으며 생존 세균 수는 과정 중에 확인되었다.

Hair Coat 평가 - 세균 치료가 모발에 미치는 영향을 평가하기 위해 모발의 광택과 모발 재성장을 때때로 평가했다. 모발 재성장을 평가하기 위해 18 주간의 LAB 치료 후 2 × 2cm의 모발을 쥐의 등쪽에서 깍아 내었다. 각 마우스의 모발 광택은 외부 빛의 오염이없는 어두운 방에서 LAB 처리19 주에 측정되었다. 광원은 1 개의 50 와트 할로겐 전구로 구성되어 430 루멘을 제공했다. 광도계는 Seiconic Flashmate (모델 L-308S)로 Lumidisc 센서가 설치되어있어 직접 검출기로 반사되는 빛을 포착하여 광원에서 나오는 오염을 제거했다. Flashmate의 ISO는 100으로 설정되었고 일관된 거리, 광원 각도 및 검출기 각도를 유지하기 위해베이스와 지지대를 제작하였다.

안락사 및 혈청 수집 - 치료 개시 후 20 주 (40 주령), 심한 이산화탄소 마취 상태에서 쥐를 삽혈로 안락사시켰다. 경피적 심장 천자에 의해 혈액을 채취하고 혈청을 원심 분리로 분리 하였다. 동물의 사망을 보장하기 위해 양측 기흉을 실시했다.

실시예 5:부검과 조직병리

안락사 이후, 모든 육안 이상을 확인하기 위해 각 마우스에서 부검을 실시했다. 각 마우스에서 면도한 부위의 피부 샘플을 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF)과 액체 질소에 넣었다. 각 마우스에서 고환을 짝을 짓고 NBF에 넣었다. 포르말린 - 고정 된 조직을 3-5㎛로 절편하고 조직 검사를 위한 준비로 헤마톡실린 및 에오신으로 염색 하였다. 피부 표본은 표피 피판 깊이에 대해 현미경으로 평가하였다. 피부 두께를 측정하기 위해 선택된 필드는 섹션의 각도에 의해 규정되었다. 즉, 조직의 전체를 절단하지 않고 panniculus carnosus의 두께가 전체적으로 유사하지 않은 부분은 포함에서 제외되었다. 각 마우스에 대해 5회의 측정을 수행했다. 또한, 모낭의 수는 샘플 당 최소 5개의 대표 고전력 필드로 계산되었다. 모낭 스테이징은 실험군 당 최소 30개의 길이 방향 모발 모낭에서 수행되었다. Follicles는 이전에 묘사된 형태 학적 기준을 사용하여 H & E 염색 절편을 위해 준비되었다. 고환을 현미경으로 검사하고 정소 세관의 10 개의 단면의 직경을 각 마우스에 대해 측정하였다. 조직 블록은 대부분의 세균관을 단면으로 나타내도록 방향을 잡았다. 세관의 직경은 미성년자의 프로필에서 측정되었다. 모든 사진은 Zeiss Axioplan 현미경에 장착 된 SPOT RT 디지털 카메라 (소프트웨어 v3.5)로 촬영 하였다.

혈장 사이토 카인, 테스토스테론 및 인슐린 측정

마우스 혈청의 TNF- 및 IL-10 양을 마우스 TNF-α 고감도 ELISA 키트 및 마우스 IL-10 백금 ELISA 키트 (eBioscience)로 각각 측정 하였다. 인슐린은 초 민감성 마우스 인슐린 ELISA 키트 (Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL)로 정량화 하였다. 혈청 테스토스테론은 Enzo Life Science (Farmingdale, NY)의 ELISA 키트로 측정했다.

통계 분석

GraphPad Prism 6 프로그램 (GraphPad Software, San Diego, CA)을 사용하여 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 방법의 Tukey 테스트를 통해 여러 마우스 데이터의 쌍 비교를 수행했다. 두 데이터 세트 비교는 Excel 프로그램 (Microsoft, Richmond, WA)을 사용하여 학생 t- 검정에 의해 확인되었다. 0.05보다 작은 모든 p 값은 통계적으로 의미있는 것으로 간주되었다.

[기탁 번호]

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11987P

수탁일자 : 20170313

Claims

항노화 특성을 가지는 신규한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri ) BM36301 균주(기탁번호 KCCM11987P).
제1항에 있어서, 상기 균주는 항염증 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 포함하는 항노화 조성물.
제3항에 있어서, 상기 항노화 효과는 남자의 경우에는 체중 증가 감소 또는 테스토스테론 증가인 것인 것을 특징으로 하는 항노화 조성물.
제3항에 있어서, 상기 항노화 효과는 여자의 경우에는 탈모 억제 또는 혈청 TNF-α 감소인 것인 것을 특징으로 하는 항노화 조성물.
제1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물.