KR20220091695A

KR20220091695A - 프로바이오틱 기능이 있는 신규의 락토바실러스 류테리 efel6901 발효 종균

Info

Publication number: KR20220091695A
Application number: KR1020200182513A
Authority: KR
Inventors: 한남수; 서희
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2022-07-01
Also published as: KR102552976B1

Abstract

본 발명에서 발굴한 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)는 발효 종균으로서의 적합성과 우수한 프로바이오틱스 특성을 보였다. 본 발명의 균주는 김치환경과 저온 (15℃)에서 성장가능하고, 적절한 양의 산을 생성하며 자연발효와 상업용 김치 종균인 Le. mesenteroides DRC1506과 유사한 풍부한 향기성분과 대사산물을 생산하는 특징이 있어 발효 종균으로서 적합하였다. 또한, 산 담즙 내성과 장 부착능이 우수하며, 항산화 활성 및 항염 활성이 높아 프로바이오틱 특징이 있으며, 실제 대장염 유도 동물 모델에서도 항염 활성이 우수한 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 균주는 Biogenic amine 유전자를 보유하고 있지 않으며, 용혈성이 없기 때문에 식품 발효에 사용하기에 안전하다. 결론적으로 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901은 채소, 과일, 곡물 등의 발효 균주로서 적합하고, 항염증 활성의 건강 기능성 프로바이오틱 종균으로 사용될 수 있다.

Description

프로바이오틱 기능이 있는 신규의 락토바실러스 류테리 EFEL6901 발효 종균{Novel starter of Lactobacillus reuteri EFEL6901 with probiotic activity}

본 발명은 신규의 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프로바이오틱 기능이 있는 신규의 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP) 발효 종균에 관한 것이다.

프로바이오틱스는 섭취되어 장에 도달하였을 때에 장내 환경에 유익한 작용을 하는 균주를 말하며, 대부분의 프로바이오틱스는 유산균들이고, 일부 Bacillus 등을 포함하고 있다. 프로바이오틱스는 장내 균총의 분포를 건강한 상태로 유지하여야 하며, 병원균 성장 방지, 면역 강화, 항암 효과, 설사 예방 및 염증성 대장 증후군 완화 등 다양한 건강상의 이점을 제공한다.

현대에는 소비자들이 유익한 영양가로 인식되는 채소, 과일 및 곡물을 기반으로 한 기능성 식품 소비에 점점 더 관심을 보이고 있어, 채소, 과일 및 곡물의 식품을 포함한 비유제품 프로바이오틱 제품은 오늘날 건강한 기능성 식품 소재로 평가받고 있다.

발효유(fermented milk, yogurt)와 같은 발효식품에 사용하는 미생물은 그 역할을 기반으로 크게 두가지로 구분한다. 첫째는 젖산 발효를 진행하여 발효유의 독특한 향미를 제공하는 종균(스타터, starter)이고, 둘째는 인체의 장내에서 정착하여 각종 건강기능성을 제공하는 프로바이오틱스(probiotics)이다. 대부분의 유산균들은 종균이나 프로바이오틱스로 개발되어 각기 다른 목적으로 발효식품에 이용되고 있고, 향미를 위한 종균의 역할과 건강을 위한 프로바이오틱스의 역할 두가지를 한번에 보유한 '프로바이오틱 종균'은 그 개발 사례가 흔치 않다.

한편, 김치는 배추, 무를 고춧가루, 마늘, 생강 등 다양한 재료로 발효시켜 만든 한국의 전통 발효 채소이다. 멸균되지 않은 원료를 이용하여 자연 발효로 김치를 제조하면 다양한 미생물이 증식하여 품질이 균일하지 않고 이미 이취가 생성되어 향미도 부족한 문제가 있다. 반면, 김치 제조에 종균(스타터, starter)을 사용하면 균일한 품질, 관능 특성 향상, 유통 기한 연장, 김치 제품의 기능적 특성 향상과 같은 장점을 기대할 수 있다.

최근 김치 발효에 건강 기능적 특성을 갖는 프로바이오틱스의 사용한 사례들이 여럿 있지만 이들을 실제로 김치에 사용하여 상품화한 사례는 극히 드물다. 이는 프로바이오틱스로 개발된 유산균들을 김치에 적용할 때, 존재하는 제한 사항이 있기 때문이다. 그 첫번째 문제점은, 식약처에서 고시한 19종 프로바이오틱스들은 대부분 우유를 기반으로 한 유가공 식품을 기반으로 개발한 경우가 대다수이고 이들 중 상당 수의 종은 채소를 기반으로 제조한 김치의 영양환경에서 잘 성장하지 못하는 경우가 많은 점이다. 두번째 문제점은 대부분의 프로바이오틱스들은 37℃ 이상에서 자라는 고온성 유산균들로 15℃ 이하의 저온에서 주로 발효하는 김치에 적절하지 않은 점이다. 세번째로 대두되는 문제점은, 프로바이오틱스가 김치에서 성장하는 경우에도 다량의 젖산을 생성하여 기호도와 유통기간을 낮추는 경우가 많고, 이미-이취(off-flavor)를 생성하여 김치의 향미를 저해하는 경우가 있는 점이다.

이를 극복하기 위해 기존의 프로바이오틱스 유산균체를 배양하여 김치 발효 후에 첨가하는 방법도 제안되었지만 김치의 가격을 높혀 경제성이 떨어지는 것으로 판단된다. 또한, 현재 김치 종균으로 널리 사용되는 류코노스톡(Leuconostoc) 속은 산과 담즙에 대한 내성이 약하며, 사람의 대장 상피세포 부착 능력이 부족하여 종균으로는 사용되지만 건강을 제공하는 프로바이오틱스로 간주되지는 않는다.

대한민국 등록특허 제10-1871169호(등록일자: 2018.06.20)에는, 신규 김치유산균 Weissella cibaria MFST 균주 및 이를 이용한 대추씨 조성물에 대해 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1014871호(등록일자: 2011.02.08)에는, 김치 유산균으로 발효된 숙면 발효커피 및 그 제조방법에 대해 기재되어 있다.

본 발명은 발효 종균으로서 적합하고 우수한 프로바이오틱스 기능을 가지는 신규 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 제공한다.

한편, 본 발명의 상기 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)는, 바람직하게 항염 프로바이오틱 활성이 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 채소에 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 채소를 제공한다. 이때, 상기 발효 채소는, 일 예로 김치일 수 있다.

또한, 본 발명은 과일에 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 과일을 제공한다.

또한, 본 발명은 곡물에 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 곡물을 제공한다.

도 1은 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 안전성 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 모의 위장 조건에서 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 생존력을 나타내었다.
도 3은 결장상피세포로서 HT-29 세포에 대한 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 장 부착능에 대한 결과이다.
도 4는 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 항산화 활성을 나타낸다.
도 5는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 산화 질소 (NO)의 발현에 대한 열 불활성화(사멸) 균주의 억제 효과를 보여준다.
도 6은 열 불활성화(사멸) 균주가 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2의 발현에 미치는 억제 효과를 보여준다.
도 7은 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 사이토카인 분비 측정 결과이다.
도 8은 동물 모델에게서 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 항염증 활성을 확인하기 위해 대장염 쥐 모델 관리 모식도를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901이 염증 유발된 대장염 쥐 모델의 증상 개선에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 10은 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색된 생쥐의 결장 조직의 관찰 및 조직학적 점수를 분석한 결과이다.
도 11은 결장 내 tight junction-related protein 수준에 대한 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 효과를 나타낸 결과이다.
도 12는 결장 내 사이토카인 수준에 대한 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 효과를 나타낸 결과이다.
도 13은 맹장 샘플에서 단쇄지방산 (SCFA)을 정량화한 값을 비교한 결과이다.
도 14는 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 및 대조군 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 (KCCM11712P) 균주의 성장률을 측정한 것이다.
도 15는 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 및 대조군 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 (KCCM11712P)의 성장시 pH 값을 측정한 것이다.
도 16은 나박김치의 휘발성 향기 성분에 대해 수행된 principal components analysis (PCA)의 Biplot 결과이다.
도 17은 나박김치의 대사산물에 대해 수행된 principal components analysis (PCA)의 Biplot 결과이다.
도 18은 프로바이오틱 균주로 발효시킨 최적 숙성 나박김치 시료의 관능평가 결과이다.

향미를 위한 종균의 역할과 건강을 위한 프로바이오틱스의 역할 두가지를 한번에 보유한 '프로바이오틱 종균'을 개발하고 이를 식품에 적용하게 되면, 발효 식품(특히, 김치)의 가치가 높아져 소비자의 선호를 높일 수 있을 것이다.

따라서 본 발명에서는 '프로바이오틱 종균'으로서 활용될 수 있는 종균을 개발하였고, 이는 하기와 같은 요소를 충족하였다. 첫째, 김치의 영양성분을 잘 이용하여 생육할 수 있어야한다. 둘째, 김치 발효가 진행되는 저온에서 생육해야 한다. 셋째, 발효과정에서 생성되는 대사물질이 우수한 김치의 향미를 제공하는데 기여해야한다. 넷째, 안전성, 높은 산-담즙 내성, 장부착능, 면역조절능 등의 건강기능성을 보유하여야한다.

이에 본 발명은 상기 4가지 요건을 충족시키는 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 개발하여 제공한다. 본 발명의 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901는 김치 발효에 적합한 발효 종균으로서의 역할과 건강(특히, 항염 활성)을 위한 프로바이오틱스의 역할을 우수하게 발휘한다.

본 발명의 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901는 김치 종균으로서 특성을 조사하고자 김치모사배지에서의 성장곡선, 나박김치 제조 후 GS/MS, ¹H-NMR을 이용한 향기성분 및 대사산물 분석, 관능평가를 실시하였다. 본 발명의 균주는 김치 배지에서 최적온도(37℃)뿐만 아니라 저온인 15℃에서 모두 성장 가능하며, 적절한 양의 산을 생성하였다. 아울러 본 발명의 균주를 종균으로 사용하여 김치를 제조하였을 때, Lactobacillus 속 균주임에도 불구하고, 양성대조구로 사용한 Leuconostoc mesenteroide DRC1506과 유사한 향기성분과 대사산물을 포함하며, 향미가 좋은 김치를 제조할 수 있음이 확인되었다.

다음으로, 본 발명에서는 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 균주의 프로바이오틱스 활성을 확인하여 보았는데, 산-담즙 내성을 나타내 장내 안정성이 우수하였고, 장 부착능이 뛰어났으며, 높은 항산화 활성 및 항염증 활성의 건강기능성을 나타내었다. 즉, 본 발명 균주의 열 불활성화 시료는 LPS로 염증이 자극된 대식세포에서 산화질소 (NO) 억제, 염증 관련 유전자인 iNOS, COX-2의 mRNA 발현양 억제, pro-inflammatory cytokine의 억제와 anti-inflammatory cytokine의 유도로 높은 항염증 효과를 나타내었다. 또한, 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 균주는 동물 모델에서 임상적인 시험을 통해 대장염 징후 개선, 대장 길이 축소 억제, 결장 점막 손상 감소, Tight junction protein 발현양 증가, pro-inflammatory cytokine의 억제와 anti-inflammatory cytokine의 유도, 단쇄지방산 증가로 높은 항염증 효과를 나타내는 것이 확인되어 실제적으로 활용하기에도 안전하며 뛰어난 프로바이오틱 종균임을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 균주는 Biogenic amine 유전자를 보유하고 있지 않으며, 용혈성이 없기 때문에 식품 발효에 사용하기에 안전한 특징이 확인되었다.

또한, 본 발명은 채소에 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 채소를 제공한다. 이때, 상기 발효 채소는 어느 것이든 제한되지 않으나, 일 예로 김치일 수 있다. 또한, 본 발명은 과일에 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 과일을 제공한다. 이때, 상기 발효 과일은 어느 것이든 제한되지 않으나, 일 예로 아차라(atchara)일 수 있다. 또한, 본 발명은 곡물에 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 곡물을 제공한다. 이때, 상기 발효 곡물은 어느 것이든 제한되지 않으나, 일 예로 오트밀일 수 있다

한편, 본 발명의 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 발효 종균으로 사용하여 발효 채소, 발효 과일, 발효 곡물의 제조시, 본 발명 균주를 종균으로 사용하는 것 외에는 당업계에 널리 알려진 발효 방법들을 선택적으로 적용 사용할 수 있다. 따라서, 각 제품별로 구체적인 발효 방법에 대한 설명은 생략하기로 한다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 또는 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1: 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 분리 및 동정]

본 발명의 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) EFEL6901 분리를 위해 탄소원을 변경하여 선택배지를 제조하였다. 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri)는 아라비노스(arabinose)를 대사하며, 테트라사이클린(tetracycline)에 내성을 갖는 것으로 보고되어 있어, 주 탄소원으로 글루코스(glucose) 대신 1% 아라비노스(arabinose)를 첨가하고, 테트라사이클린(tetracycline)(10 ㎍/ml)을 첨가한 MRS+브로모페놀 블루(bromophenol blue) (BPB) 배지를 제조하였다. 인체 분변을 멸균 식염수 (0.85% NaCl)로 희석하여 선택배지에 도말하고, 혐기 조건 하에 37℃에서 48시간 동안 배양하여 콜로니를 얻었다. 그 후에 분리 및 선택되어진 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하고 16S rRNA를 분리하여 유전자 서열을 분석하였고, NCBI에서 type 균주의 서열을 비교함으로써 동정하였다.

이상의 과정을 통해 인체 분변으로부터 분리한 본 발명의 균주를 EFEL6901로 명명하고, 이 분리주의 16S rRNA 유전자 서열을 분석하였다. 그 결과, 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) KACC11452 type 균주와 큰 유사성을 가져 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri)로 동정하였다.

이에 따라, 본 발명의 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) EFEL6901을 농업생명공학연구원에 2020년 06월 02일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 81105BP를 부여받았다.

[실시예 2 : 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주의 생체 아민 유전자 및 용혈능 활성 확인]

프로바이오틱스를 식품에 사용하기 위해서는 식이 단백질로부터 식중독과 같은 건강에 부정적인 영향을 줄 수 있는 Biogenic amine을 생성해서는 안된다. 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) EFEL6901 균주 안정성을 평가하기 위해, Biogenic amine 형성과 관련된 유전자의 존재를 PCR로 조사하였다.

Biogenic amine 생성과 관련된 각 유전자 16s rRNA 유전자를 다중 PCR 방법을 사용하여 검출했다. hdc (histidine decarboxylase)와 tyrdc (tyrosine decarboxylase) 유전자는 다음 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되었다: hdc: HDC3 (5'-GATGGTATTGTTTCKTATGA- 3')와 HDC4 (5'-CAAACACCAGCATCTTC- 3'); tyrdc: TD2 (5'-ACATAGTCAACCATRTTGAA- 3')와 TD5 (5'-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG- 3'); 16s rRNA 유전자: 27F와1492R.

다중 PCR에서 각 Biogenic amine 유전자는 각 해당 프라이머 세트를 추가하여 PCR 튜브에서 16s rRNA 유전자와 동시에 증폭되었다. 16s rRNA 유전자는 PCR 반응 및 주형 조건에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. PCR 조건은 다음과 같았다: 95 ℃에서 5분에 이어서 95℃에서 45초, 58℃에서 45초, 72℃에서 75초를 32사이클한 뒤, 72℃에서 5분동안 최종 연장되었다. 락토바실러스 류테리(L. reuteri) ATCC 23272 및 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) KCCM 11729의 genomic DNA를 각각 hdc, tyrdc 유전자에 대한 양성 대조군으로 사용했다. 용혈 분석을 위해, Ryu and Chang's method를 참고하여 7% 말 혈액 (MB CELL, Seoul, Korea)이 첨가된 BHI 한천 플레이트에 박테리아 세포를 접종하였다. 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 대조군으로 사용하여 37℃에서 24시간 혐기성 배양한 후, 배지에서 용혈을 관찰하였다.

도 1은 본 발명 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) EFEL6901 안전성 테스트 결과를 나타낸 것이다. 도 1의 (A)는 바이오제닉 아민 생산과 관련된 유전자 검출을 나타낸 것이고, 레인 M은 1kb DNA 마커; 레인 1 (B)는 주형 DNA가 없는 음성 대조군; 레인 2 (P)는 각각 hdc (히스티딘 데카 복실 라제, 440bp) 및 tyrdc (티로신 데카복실라제, 1100bp) 유전자를 갖는 락토바실러스 류테리(L. reuteri) ATCC 23272 및 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) KCCM 11729의 genomic DNA로 양성 대조군이다. 16S rRNA 유전자 (1530bp)의 DNA도 증폭되었다. 레인 3은 EFEL6901 균주이다. 도 1의 (B)는 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 용혈 활성 분석 결과이다. 7% 말 혈액을 함유한 BHI 액체 배지에서 용혈 활성을 정하였다. 왼쪽은 EFEL6901 균주이고, 오른쪽은 양성 대조군 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)이다.

도 1의 (A)에서 보이듯이, EFEL6901 균주는 각각 히스타민과 티라민을 생성하는 hdc 및 tyrdc 유전자를 보유하지 않았다. 반면, 이들 유전자에 대한 PCR 산물은 양성 대조군인 락토바실러스 류테리(L. reuteri) ATCC 23272 및 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) KCCM 11729의 genomic DNA에서 검출되었다.

한편, 식품에 사용하기에 또 다른 중요한 특성은 미생물의 용혈 활성이 없는 것이다. EFEL6901 균주의 용혈 활성을 평가하기 위해, 말 혈액 한천 배지에 세포를 접종하고 37℃, 24시간 동안 배양 후 용혈 활성을 조사했다. 그 결과, 도 1의 B와 같이 EFEL6901 균주는 세포 방울 주변에 clear zone을 나타내지 않았고, 반면 양성 대조군 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)는 용혈 활성으로 해석될 수 있는 clear zone을 보여주었다. 이러한 결과는 본 발명 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) EFEL6901에는 hdc 및 tyrdc 유전자가 없으며, 용혈능이 없음을 보여준다.

[실시예 3 : 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주의 산 및 담즙 내성 확인]

산성 조건에 대한 내성은 Conway에 의해 제안된 방법을 약간 수정하여 테스트하였다. 박테리아균주는 MRS 배지에서 밤새 배양하고 6,000 x g에서 10분동안 원심 분리하여 얻었다. 세포는 pH 7.2의 PBS(phosphate-buffered saline)를 사용하여 3회 세척한 후 HCl을 사용하여 pH 3.0 및 2.5로 조절된 동일한 부피의 PBS에 재현탁시켰다. 37℃에서 0, 90, 180분 배양한 후, MRS 한천 배지에 세포를 도말하여 37℃에서 48시간 배양 후 생존 세포를 계수하여 산 내성을 평가하였다. 담즙염에 대한 내성은 0.3%(w/v) 담즙염(Sigma, St. Louis, MO, USA)이 포함된 PBS 용액에 세포를 현탁시켜 37℃에서 배양하여 평가하였다. 담즙염 내성은 산 내성과 동일한 방법으로 측정되었다.

도 2는 모의 위장 조건에서 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 생존력을 나타내었다. 도 2의 (A)는 산성 조건 (pH 3.0), 도 2의 (B)는 산성 조건 (pH 2.5), 도 2의 (C)는 0.3% 담즙염 조건에서의 결과이다. 결과는 평균±표준 편차 (n=3)로 표시하였다. 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) WCFS1 (## p <0.01, ### p <0.001) 또는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) GG (* p <0.05, ** p<0.01)에서 유의한 차이가 나타났다.

도 2의 (A) 및 (B)와 같이, 양성대조구로 사용한 프로바이오틱 균주 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) GG (LGG) 및 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) WCFS1 (WCFS1)와 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 생존력은 pH3.0에서 유지되었다. pH 2.5에서 180분 배양 시, 양성대조구 LGG와 WCFS1의 생존력은 크게 감소하였으나 EFEL6901은 이들과 통계적으로 유의하게 생존력이 높았다(p<0.001). 또한, 도 2의 (C)와 같이, 0.3% 담즙염에서 담즙 내성 분석 결과, EFEL6901은 WCFS1보다 생존력이 감소하였지만 LGG와 비교하여 더 높은 생존력을 보여주었다 (Figure 2C). 결과적으로 EFEL6901은 LGG, WCFS1보다 더 높은 산 내성을 가지며, WCFS1와 유사한 담즙 내성을 보여주므로 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 균주가 위장관 환경에 내성이 있는 것으로 간주되었다.

[실시예 4 : 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주의 장 상피 세포 부착능 확인]

부착 분석은 Messaoudi et al에 의해 설명된 방법(Messaoudi et al., 2012, "In vitro evaluation of the probiotic potential of Lactobacillus salivarius SMXD51", Anaerobe, 18:584-589)으로 수행되었다. 인간 대장 상피 세포인 HT-29 세포는 Korean Cell Line Bank (KCLB; Seoul, Korea)로부터 얻어졌고, 10% 소 태아 혈청(FBS; Hyclone)과 10,000 U/mL penicillin 및 10 mg/mL streptomycin (Hyclone) 각 1% (0.85% NaCl에서)가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Hyclone, Logan, UT, USA)에서 배양했다. HT29 세포를 웰 당 대략 4.7x10⁵ 세포의 밀도로 24-well 조직 배양 플레이트(웰 당 2cm²)에 seeding했다. 배양액이 80% 포화에 도달하면 항생제가 없는 배지로 교체하였다. MRS 배지에서 EFEL6901을 배양한 후, EFEL6901를 원심분리로 회수하여 PBS(pH 7.4)로 2회 세척하여 혈청과 항생제가 없는 DMEM에 10⁸ CFU/ml 농도로 재현탁시켰다. 그런 다음 EFEL6901 세포를 각 웰의 HT29 세포 단일층에 접종하고 37℃(5% CO₂)에서 2시간동안 배양하였다. 배양 후 부착되지 않은 EFEL6901는 PBS로 2회 세척하여 제거했다. 부착된 EFEL6901는 0.1% Triton X-100 및 0.1% trypsin-EDTA (Sigma)를 포함한 detachment solution 으로 15분간 처리했다. 부착된 EFEL6901 수를 계산하기 위해, 분리된 세포의 현탁액을 적절하게 희석하여 MRS 한천 플레이트에서 37℃ 48시간 동안 배양했다.

도 3은 결장상피세포로서 HT-29 세포에 대한 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 장 부착능에 대한 결과이다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (n = 3)로 표현되었다. 통계 분석은 WCFS1과 비교하여 독립적인 T- 검정을 사용하여 수행되었다. (#p<0.05).

그 결과, 도 3과 같이 HT-29 세포에서 EFEL6901은 WCFS1 (1178 CFU/mL)보다는 아니지만, LGG(509CFU/100cells)보다 높은 부착력을 나타내어 양성 대조군과 견줄 정도로 장 부착능이 우수함을 확인할 수 있었다.

[실시예 5 : 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주의 항산화 활성 확인]

락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 균주의 항산화 활성은 Das & Goyal가 제안한 DPPH 억제 분석법을 약간 수정하여 측정되었다. Intact cell와 Cell free extract 제조를 위해, EFEL6901 균주를 전 배양, 본 배양을 각각 12시간씩 수행하고, 600 nm에서 흡광도(optical density)를 1.0으로 맞췄다. EFEL6901 균주를 2회 세척하고 0.85% 식염수에 재현탁하여 온전한 세포를 만들었다. Cell free extract의 경우, 초음파 처리기(VP-050N; Taitec Corp., Saitama, Japan)를 사용하여 10분 동안 초음파 분해 처리를 한 후, 원심분리(10,000 x g 4℃, 5분)에 의해 세포 파편을 제거하였다. ethanolic DPPH 용액(100 μL, 0.4 mmol/L)은 EFEL6901 균주 샘플 또는 물(대조군)과 강하게 혼합하여 37℃의 어두운 곳에서 30분간 배양하였다. 이 혼합물의 흡광도는 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 517 nm에서 측정되었다.

도 4는 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 항산화 활성을 나타낸다. 항산화 활성은 DPPH 억제 분석으로 측정되었고, 결과는 평균±표준편차(n=3)로 표시하였다. 오차 막대의 다른 문자는 유의한 차이를 나타낸다. 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) WCFS1 (WCFS1) (#p <0.05, ### p <0.001) 또는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) GG (*** p <0.01)와 유의한 차이가 나타났다.

도 4와 같이, EFEL6901의 Intact cell은 21.6% DPPH 제거 활성을 보였으며 이는 WCFS1 (10.6%), LGG (17.1%)와 비교하여 통계적으로 더 높았다. EFEL6901의 Cell free extract의 항산화 활성은 12.4%로 WCFS1 (1.6%), LGG (8.0%)보다 유의하게 높았다. 따라서 L. reuteri EFEL6901은 상업적 프로바이오틱스인 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 균주는 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) WCFS1와 L. rhamnosus GG보다 더 높은 항산화 활성을 갖는 것으로 판단되었다.

[실시예 6 : 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주의 항염증 활성 확인]

(1) 산화 질소(Nitric oxide, NO) 억제능

락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 항염증 활성을 분석하기 위해, RAW 264.7 대식세포에 LPS(1 ug/ml)로 자극하여 염증 매개물질인 Nitric oxide (NO)를 과다 생성시킨 후, 균주의 열불활성화 시료의 NO 억제 활성을 측정하였다.

열불활성화 균주의 제조를 위해, 균주의 흡광도를 1.0(OD600 nm)으로 조정하고, 10,000 x g에서 5분간 원심분리하여 세포 펠렛을 PBS로 2회 헹구고 DMEM에 현탁시켜 90℃에서 30분간 열 사멸시켰다. 대식세포주 RAW 264.7 세포주는 KCLB로부터 얻어졌으며, 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM에서 유지되었다(37℃, 5% CO₂). 세포를 plate에서 80∼90% 포화 단계까지 sub-culture했다. RAW 264.7 세포에(96well plate에서 ml 당 5x10⁵cells) LPS (1 μg/mL)와 열불활성화 균주를 첨가하여 24시간 동안 자극하였다. 24시간 후 각 웰의 상층액을 동일한 부피의 Griess 시약과 혼합하고 실온에서 10분 동안 어두운 곳에 두었다. 그 후에 마이크로 플레이트 분광 광도계 (BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며 소듐 니트레이트(sodium nitrate)로 표준곡선을 작성하여 NO의 함량을 산출하였다. 메틸 아르기닌(Methyl arginine, MA)은 양성 대조군으로 사용되었다.

도 5는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 산화 질소 (NO)의 발현에 대한 열 불활성화(사멸) 균주의 억제 효과를 보여준다. MA은 메틸 아르기닌이고, NO 억제는 Griess 반응 분석에 의해 측정되었으며, 결과는 평균±표준편차(n=3)로 표시하였다. 오차 막대의 다른 문자는 유의한 차이를 나타낸다. 통계 분석은 LPS 처리 군과 비교하여 독립적인 T- 검정을 사용하여 수행되었다. (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001)

도 5와 같이 LPS로 처리하지 않은 대조군과 비교하여 LPS로 처리하면 NO 생성이 현저하게 증가했다. 그러나 NO 합성 효소 저해제인 메틸 아르기닌(Methyl arginine, MA) 처리는 LPS 처리군에 비해 용량 의존적으로 NO 생성을 억제했다(p <0.001). 테스트된 모든 열 불활성화 균주의 경우, LPS 처리 군에 비해 NO 생성에 상당한 억제 효과를 나타냈으며 특히 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901은 WCFS1와 LGG보다 더 높은 NO 억제능을 보여주었다.

(2) RT-qPCR을 이용한 iNOS, COX-2 발현 억제 확인

락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 염증 관련 mRNA의 발현 활성은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 열불활성화 균주를 처리하고, RNA 추출 후 cDNA합성 및 RT-qPCR으로 측정되었다. RAW 264.7 세포(1x10⁶ cells/well)를 6 well plate에 배양한 후 LPS (1 ㎍/mL)와 열불활성화 균주를 24시간동안 자극하였다.

각 웰에서 Trizol 시약을 사용하여 RNA를 추출하고, cDNA synthesis kit (LeGene Express 1^st Standard cDNA Synthesis System)를 이용하여 cDNA를 합성한다. GADPH, iNOS, COX-2 유전자는 다음 프라이머 쌍을 사용하여 RT-qPCR을 진행하여 증폭되었다. GADPH: Forward (5'-TTGTCTCCTGCGACTTCAACA-3')와 Reverse (5'-GCTGTAGCCGTATTCATTGTCATA-3'); iNOS : Forward (5'-ACCATGGAGCATCCCAAGTA-3')와 Reverse (5'-CCATGTACCAACCATTGAAGG-3'); COX-2 : Forward (5'-AGCATTCATTCCTCTACATAAGC-3')와 Reverse (5'-GTAACAACACTCACATATTCATACAT-3'). PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 5분 후 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 60℃에서 30초를 40사이클로 진행되었다.

도 6은 열 불활성화(사멸) 균주가 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2의 발현에 미치는 억제 효과를 보여준다. 세포를 열 사멸 균주로 처리하고 LPS로 24 시간 동안 자극하였다. iNOS 및 COX-2의 발현된 mRNA 수준은 실시간 PCR 및 GAPDH를 사용한 정규화에 의한 상대 정량화에 의해 결정되었다. 오차 막대의 다른 문자는 유의한 차이를 나타낸다. 통계 분석은 LPS 처리 군과 비교하여 독립적인 T- 검정을 사용하여 수행되었다. (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001)

도 6과 같이 LPS를 자극하지 않은 안정한 상태에서의 RAW 264.7 cell에서 COX-2와 iNOS의 mRNA 발현은 거의 확인되지 않았지만, LPS 자극에 의해 발현양이 현저하게 증가되었다. 이에 비하여 테스트된 모든 균주의 열불활성화 시료는 COX-2와 iNOS의 mRNA 발현을 유의하게 억제하였으며, 특히, 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901은 WCFS1과 유사한 항염증 활성을 보였다.

(3) ELISA를 이용한 염증성 사이토카인 (IL-12), 항염증 사이토카인 (IL-10)의 분비 측정

락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 면역 조절 활성은 ELISA kit를 사용하여 LPS로 유도된 마우스 복막 대식세포에서 사이토카인의 생산을 평가하여 측정되었다. 동물 프로토콜은 경희대학교 동물실험윤리위원회의 승인(KHUASP(GC)-19-005)을 받았다. DMEM으로 복막 세척을 통해 7주령의 수컷 Balb/c 마우스로부터 복막 대식세포를 수집하고, 세포(4x10⁵ cells/ml)에 LPS (1 ㎍/mL)와 열불활성화 균주로 24시간동안 자극하였다. 각 웰에서 상등액을 수집하고, 배양 배지로 분비된 IL-10 및 IL-12를 ELISA assay kit (R&D systems Mouse DuoSet ELISA IL-10 and IL-12, Minnesota, USA)를 사용하여 정량화하였다.

도 7은 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 사이토카인 분비 측정 결과이다. 도 7의 (A)는 IL-12, 도 7의 (B)는 IL-10, 도 7의 (C)는 IL-10/IL-12이며, 결과는 평균±표준편차 (n=6)로 표시하였다. 오차 막대의 다른 문자는 유의한 차이를 나타낸다. 통계 분석은 LPS 처리 군과 비교하여 독립적 인 T-검정을 사용하여 수행하였다. (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001)

그 결과, LPS는 염증성 사이토카인인 IL-12의 방출을 강하게 유도한 반면(도 7의 (A)), 항염증성 사이토카인인 IL-10은 영향을 받지 않았다(도 7의 (B)). 반면, 테스트된 모든 열불활성화 균주는 IL-12를 완전히 억제하고(도 7의 (A)), IL-10를 강력하게 유도하였다(도 7의 (B)). 특히, EFEL6901의 열불활성화 균주는 IL-10의 강력한 유도제이며, IL-12의 저해제로서, 도 7의 (C)와 같이 상업적 프로바이오틱스인 LGG, WCFS1과 유사한 수준의 높은 항염증 지수(IL-10/IL-12 비율)을 가졌다.

따라서, 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901은 LPS로 자극된 마우스 복막 대식세포에서 IL-12를 감소시키고 IL-10을 유도하며 ex vivo 에서도 면역 조절 능력을 가진 것으로 평가할 수 있었다.

[실시예 7 : 동물 실험을 통한 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주의 항염증 활성 확인]

락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 항염증 활성을 검증하기 위해 DSS로 유도한 대장염 동물모델을 이용하여 대장염 완화 및 억제 효능을 시험하였다.

(1) 동물모델 제작

먼저, EFEL6901은 MRS 액체배지에서 37 ℃, 24시간 배양하여 1x10⁹ CFU가 되도록 흡광도(OD600 nm)를 조정하고 배양액을 10,000 rpm, 5분간 원심분리하여 세포 펠렛을 PBS로 2회 세척하였다. 다시 동량의 PBS에 재현탁하여 시료로 사용하였다. 실험동물은 ㈜코아텍에서 7주의 BALB/c 암컷 쥐를 사용하였다. 1주일간의 적응기간을 마친 후 2주간 1일에 1회 L. reuteri EFEL6901 1x10⁹ CFU을 경구 투여하였으며, 대조군은 동량의 PBS을 투여하였다. 염증 유도를 위해 DSS (molecular mass 36,000~ 50,000 Da; MP Biomedical, USA)를 3%(w/v)로 PBS에 현탁하여 상기 실험동물에게 물 대신 7일간 자유롭게 섭취하게 하였다(도 8). 본 동물실험은 경희대학교 동물실험윤리위원회의 승인(KHGASP-20-134)을 받았다. DSS를 처리하지 않은 정상 실험 동물군을 'Control', DSS만을 처리한 실험 동물군을 'DSS', DSS 처리와 함께 동물에게 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901을 경구투여한 실험 동물군을 'DSS+EFEL6901'로 표시하였다.

(2) 임상적 증상 평가: 체중, 질환 활성 지표(disease activity index, DAI) 점수, 대장 길이, 조직학적 변화

먼저, 총 14일의 실험 기간 동안 체중 변화를 관찰하였으며, 초기 체중에 대한 체중 변화를 %로 계산하여 결과값을 나타내었다. 질환 활성 지표(DAI)의 변화는 Jang YJ et al의 방법(Jang YJ et al., 2019, "Lactobacillus fermentum species ameliorate dextran sulfate sodium-induced colitis by regulating the immune response and altering gut microbiota", Gut Microbes, 10: 696-711)을 참고하여 체중 감소(%), 대변 일관성, 대변 내 혈액을 관찰하여 측정하였으며, 그 방법은 표 1과 같았다. 실험 15일째에 실험동물을 경추탈골로 희생시킨 뒤 대장길이 측정을 위해 맹장 아래의 지점부터 대장 끝까지의 길이를 측정하였다.

Score	Weight loss(%)	Stool consistency	Blood in feces
0	None	Normal	Negative (no bleeding)
1	1.0-5.0
2	5.0-10.0	Loose stools	Positive (slight bleeding)
3	10.0-15.0
4	Over 15.0	Watery diarrhea	Gross bleeding

도 9는 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901이 염증 유발된 대장염 쥐 모델의 증상 개선에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 실험 전반에 걸쳐 (A) 체중, (B) 질병 활동 지수 점수가 평가되었다. 15일째에 마우스를 희생하여 전체 결장을 수확했으며, (C) 및 (D)는 결장 길이를 측정했다. 결과는 평균 ± 표준 오차 평균 (SEM) (n = 7)으로 표시된다. 통계 분석은 DSS 그룹과 비교하여 독립적인 T- 검정을 사용하여 수행되었다.

그 결과, 도 9와 같이 정상대조군(control)에 비해 DSS만을 투여한 그룹(DSS)은 체중이 4% 감소하였으며, EFEL6901를 투여한 경우 체중 감소를 유의하게 억제하였다(도 9의 A, p<0.05). DAI 점수 평가 결과, DSS 섭취 전에 정상 대조군은 대장염의 징후를 보이지 않았으며, DSS 섭취 시 시간이 지남에 따라 점수가 증가하였고, EFEL6901을 투여한 경우 14일차부터 DAI 점수가 유의하게 낮아졌다 (도 9의 (B, p<0.01). 또한, 대장길이 측정 결과, 정상 대조군에 비해 DSS 투여시 대장 길이가 짧아졌으나, EFEL6901을 투여한 경우, 대장 길이 축소가 유의하게 억제되었다 (도 9의 C, D, p<0.05).

한편, 조직학적 변화 관찰을 위해, distal colon을 10% 포르마알데히드(formaldehyde)에 고정하고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) (H&E)에 염색하여 광학현미경을 통해 결장 점막 손상 정도를 관찰하였다. 조직학적 변화는 Wirtz et al의 방법(Wirtz et al., 2017, "Chemically induced mouse models of acute and chronic intestinal inflammation". Nature protocol, 12:1295-1309)을 일부분 수정하여 염증과 crypt 구조의 손실 점수를 합하여 평가하였으며, 그 방법은 표 2와 같았다.

Histological score	Inflammatory cell infiltration	Loss of crypt glands
0	Infrequent, ranged in normal	None
1	Mild increase of inflammatory cells in the lamina propria	Loss of glands, one third of mucosa
2	Moderate increase of inflammatory cells in the lamina propria	Loss of glands, two third of mucosa
3	Mild increase of inflammatory cells in the lamina propria and submucosa	Entirely loss of glands

도 10은 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색된 생쥐의 결장 조직의 관찰 및 조직학적 점수를 분석한 결과이다. 도 10의 (A)는 각 그룹(Control, DSS, DSS+EFEL6901)의 대표적인 결장의 조직학적 특징을 나타낸 것이고, m, 점막(mucosa); sm, 점막하(submucosa); mm, 근육층(muscular layer)이다. Mag는 모두에 대해 X100인 값이다. 도 10의 (B)는 염증세포 침윤(inflammatory cell infiltration) 및 창자샘(Crypt gland) 손실을 결합한 조직학적 점수를 나타낸 결과이다. 결과는 평균±표준 오차 평균 (SEM) (n = 7)으로 표시된다. 통계 분석은 DSS 그룹과 비교하여 독립적인 T- 검정을 사용하여 수행되었다. *, P <0.05; **, P <0.01.

그 결과, 도 10과 같이 정상대조군(control)에 비해 DSS만을 투여시 염증세포의 심한 침투와 거의 모든 창자샘의 손실, 미란(erosive area) 등 점막 손상 정도가 높게 나타났다(도 10의 A). 반면, EFEL6901 처리시 염증 및 점막 손상이 감소하여 조직학적 점수가 DSS group과 비교하여 유의적으로 감소하였다(도 10의 B, p<0.05). 이와 같이 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901를 실제적으로 동물에게 투여시 염증에 의한 체중 감소, 질환 점수 및 대장길이 축소가 유의하게 억제되며, 결장점막 손상도 억제됨으로써 염증으로 인한 증상 완화에 효능이 있는 것으로 간주되었다.

(3) Western blot을 통한 Tight junction protein (E-cadherin, Claudin-3, Occludin) 발현양 측정

대장에서의 Tight junction protein 발현양을 측정하기 위해, 대장조직을 protease inhibitor (Quartett)가 첨가된 1X RIPA buffer (50mM Tris-HCL (pH 7.5), 150mM Nacl, 1mM EDTA, 20mM NaF, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100) 속에서 Tissue lyser (Qiagen)을 사용하여 조직을 분쇄하였다. 그 후에 원심분리(13,000 rpm, 10 min)하여 상층액을 얻고 Braford 방법을 통해 단백질을 정량하였다. 단백질 시료 20 ug을 8~10% gel에서 전기영동하고, gel상의 단백질 밴드를 PVDF membrane (Bio-RAD, 1620177)에 이동시켰다. 이후 E-cadherin (Cell signaling technology, 3195S), Claudin-3 (Thermo Fisher Scientific, 34-1700), Occludin (Thermo Fisher Scientific, 40-4700)을 1차 항체로 사용하고 HRP-conjugated anti-rabbit antibody (BETHYL, A120-101P)를 2차 항체로 사용하여 표지하였으며, 화학 발광 염색법을 통해 단백질 발현양을 관찰하였다.

도 11은 결장 내 tight junction-related protein level에 대한 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 효과를 나타낸 결과이다. 도 11의 (A)는 E-cadherin, Occludin, Claudin-3 및 β-actin의 대표적인 웨스턴 블롯팅을 나타낸 것이고, 도 11의 (B), (C), (D)는 결장에서의 각각의 단백질 발현 수준을 정량화한 것이다(E-cadherin (B), Occludin (C) 및 Claudin-3 (D)). 결과는 평균 ± 표준 오차 평균 (SEM) (n = 7)으로 표시되었다. 통계 분석은 DSS 그룹과 비교하여 독립적인 T- 검정을 사용하여 수행되었다. *, P <0.05; **, P <0.01.

Western blot 결과, 도 11과 같이 정상 정상대조군에 비해 DSS 투여시 E-cadherin, Claudin-3의 발현양이 감소되었으며(도 11의 A, B 및 D, p<0.05), Occludin의 발현양에는 영향을 미치지 않았다 (도 11의 C, p>0.05). 반면, EFEL6901를 투여한 경우 PBS를 투여한 DSS group과 비교하여 대장조직에서 E-cadherin, Claudin-3의 발현양을 유의하게 증가시켰다(도 11의 A, B 및 D, p<0.05).

(4) RT-qPCR을 통한 Cytokine (IL-10, TNF-α, IL-1β) 발현양 측정

유산균의 항염증 활성을 평가하기 위해 대장조직에서의 Cytokine (IL-10, TNF-α, IL-1β) mRNA 발현양을 측정하였다. 대장조직에 1ml의 Trizol 시약을 넣어 Tissue lyser (Qiagen)을 사용하여 조직을 분쇄하여 RNA를 분리하였다. 이후 분리된 RNA를 cDNA synthesis kit (LeGene Express 1^st Standard cDNA Synthesis System)를 이용하여 cDNA를 합성하고 표 3의 primer를 사용하여 real-time qPCR을 진행하였다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분, 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 60℃에서 30초로 40사이클을 진행하였다.

Gene		Primer sequence(5'->3')
GADPH	F	TTGTCTCCTGCGACTTCAACA
GADPH	R	GCTGTAGCCGTATTCATTGTCATA
IL-10	F	GGACAACATACTGCTAACCGACTC
IL-10	R	AAAATCACTCTTCACCTGCTCCAC
IL-1β	F	GTTGACGGACCCCAAAAGAT
IL-1β	R	CACACACCAGCAGGTTATCA
TNF-α	F	ATGATCCGCGACGTGGAA
TNF-α	R	ACCGCCTGGAGTTCTGGA

도 12는 결장 내 사이토카인 수준에 대한 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 효과를 나타낸 결과이다. 결장에서 각각의 mRNA 발현 수준을 정량화한 것이다(IL-10 (A), IL-1β (B) 및 TNF-α (C)). 발현 된 사이토카인의 mRNA 수준은 실시간 PCR에 의해 결정되었으며, GAPDH는 정량을 위한 하우스 키핑 유전자로 사용되었다. 결과는 평균 ± 표준 오차 평균 (SEM) (n = 5)으로 표시되었다. 통계 분석은 DSS 그룹과 비교하여 독립적인 T- 검정을 사용하여 수행되었다. *, P <0.05; **, P <0.01.

RT-qPCR 결과, 도 12와 같이 정상대조군에 비해 DSS 투여 시 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α, IL-1β의 mRNA 발현양이 유의하게 증가하였으며 (도 12의 B 및 C, p<0.05), anti-inflammatory cytokine인 IL-10의 발현양에는 영향을 미치지 않았다 (도 12의 A, p>0.05). 반면, EFEL6901투여시 IL-10의 발현양이 유의하게 증가하였으며, TNF-α, IL-1β의 mRNA 발현양을 유의하게 억제하였다 (Figure 11A, 11B, 11C, p<0.05).

(5) 단쇄지방산(Short chain fatty acids, SCFAs) 농도 측정

단쇄지방산(SCFAs) 농도를 측정하기 위해 맹장 내용물 90 mg을 PBS 1 mL에 현탁하고 원심분리를 통해 상층액을 얻은 뒤, HPLC 분석을 통해 표 4의 조건하에 SCFAs 농도를 측정하였다.

Item	Condition
Instrument	HPLC (1260 Infinity, Agilent Technologies, USA)
Detector	UV (215nm)
Column	AminexHPX-87H (300mm X 7.8mm, Biorad, USA)
Injection volume	20 ㎕
Mobile phase	0.008NH₂SO₄
Flow rate	0.6 mL/min

도 13은 맹장 샘플에서 단쇄지방산 (SCFA)을 정량화한 값을 비교한 결과이다. 결과는 평균 ± 표준 오차 평균 (SEM) (n = 3)으로 표현되었다. 통계 분석은 DSS 그룹과 비교하여 독립적인 T- 검정을 사용하여 수행되었다. *, P <0.05; **, P <0.01.

단쇄지방산(SCFAs) 분석 결과, 도 13과 같이 정상 대조군에 비해 DSS를 투여한 경우 젖산(Lactic acid)과 부티르산(Butyric acid)이 유의하게 감소된 반면, EFEL6901을 투여한 경우 젖산(Lactic acid)과 부티르산(Butyric acid)의 농도가 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 DSS로 인한 SCFAs의 감소가 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) EFEL 6901에 의해 회복될 수 있음을 나타낸다.

[실시예 8 : 김치 모사 주스(simulated kimchi juice)에서 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주의 성장률 측정]

(1) 김치 모사 주스 제작

김치 모사 주스(Simulated kimchi juice)의 재료 및 조성물은 표 5와 같았다. 원료(배추, 무, 마늘, 생강, 부추)는 local market에서 구입했다. 모든 재료를 믹서기를 사용하여 절단하고, 배추양에 대비하여 소금을 첨가하고 밤새 염장시켰다. 젓갈 대신 Fish peptone (Bision Co., Seongnam, Korea)을 첨가하고 SKJ은 70℃ 30분간 저온살균하였다. 이후 실온에서 냉각한 후, 혼합물을 7,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 pulp를 제거하고, 상층액만을 실험에 사용하였다.

Ingredients	Concentration
Cabbage	700g
Raddish	200g
Leek	50g
Ginger	10g
Garlic	20g
Salt	3%
Fish peptone	0.5%

(2) 김치 모사 주스에서의 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주의 성장률 측정

분리물이 김치 발효에 적합한지 조사하기 위해 김치 모사 주스에서 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) EFEL6901의 발효 특성을 모니터링했다. 상업용 김치 스타터인 류코노스톡 메센테로이드(Le. mesenteroidesi) DRC1506를 양성대조구로 사용했다. 각 균주를 전 배양한 후에 10⁷ CFU/mL에 도달하도록 SKJ에 1% 접종하고 균주의 최적증식온도(30℃에서 24시간, 15℃에서 8일 동안 배양하였고 spectrophotometer (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)을 사용하여 optical density (OD600nm)를 측정하고, pH meter (Orion Versa, Thermo, USA)를 사용하여 pH를 측정하였다. 즉, 김치 환경에서 생균주의 적응성을 비교하기 위해 김치 모사 주스에서 최적 온도(30 ℃ 또는 37 ℃)에서 24 시간, 15 ℃에서 8 일 동안 성장률을 측정하였고, 김치 맛에 미치는 영향을 비교하기 위해 pH 값을 측정하였다.

그 결과는 도 14 및 15와 같았다. 도 14는 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 및 대조군 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 (KCCM11712P) 균주의 성장률을 측정한 것으로, 광학밀도(OD) 값은 37℃ (A) 및 15℃ (B)에서 김치 모사 주스(SKJ)에 이들 균주를 접종한 후 측정된 것이다. 결과는 평균±표준편차 (n=3)로 표시하였다. 통계 분석은 독립적인 T-검정 (* p <0.05, ** p <0.01, *** p<0.001)을 사용하여 수행하였다. 도 15는 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 및 대조군 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 (KCCM11712P)의 성장 동안의 pH 값으로, 37℃ (A) 및 15℃ (B)에서 김치 모사 주스(SKJ)에 이들 균주를 접종한 후 측정된 것이다. 결과는 평균±표준편차 (n=3)로 표시하였다. 통계 분석은 독립적인 T-검정 (* p <0.05, ** p <0.01, *** p<0.001)을 사용하여 수행하였다.

본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901는 최적온도(37℃)에서 양성대조구인 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506보다 성장률이 현저히 높았으며, 24시간 발효 후의 pH는 DRC1506와 비교하여 낮았다. 15℃에서 배양한 결과, DRC1506은 1일차부터 성장하였고 이에 비하여 EFEL6901은 배양 5일차부터 성장하였지만 결론적으로 저온에서 성장 가능한 것으로 확인되었다(도 14의 B, p<0.001). 또한 배양 8일차 pH 측정 결과, DRC1506와 통계적으로 유사하였다(도 15의 B, p<0.001). 이러한 결과는 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901이 식물에서 성장하기 위한 영양 요구성이 충족되며, 저온에서 성장이 가능하며, 발효동안 적절한 양의 산을 생성하는 특성으로 김치용 종균으로서 적합한 것으로 판단된다.

[실시예 9 : 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주 사용 나박김치의 향기성분 분석]

Starter가 나박김치 향에 미치는 영향을 평가하기 위해 각각의 다른 starter를 이용한 나박김치를 적식기에 도달할 때까지 발효시킨 후, GC/MS를 통해 휘발성 향기 성분을 분석하였다. starter로는 본 발명의 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901와; 음성 대조구로, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) DRC301, 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) CBA3611; 양성 대조구로, 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506을 사용하였다.

나박김치는 하기의 방법 (나박김치의 기본 레서피는 국내 T사 제조의 나박김치 레서피를 따름)으로 제조하였다. 주원료인 배추와 나박무를 일정 크기로 절단한 후 세척기를 통과하며 이물을 선별하여 원료를 준비하고, 고춧가루 는 이물선별 및 색도를 기준에 맞게 계량하였다. 부원료인 쪽파, 홍고추, 미나리, 마늘, 생강, 당근은 기준에 맞게 세척한 후 당근은 절임 처리하였다. 세척이 완료된 부원료들은 규정된 크기로 절단하여 준비하였다. 각각의 원료 및 부원료들은 배합비에 맞추어 계량한 후 미리 준비한 염수(염도 1.8%)와 혼합하고, 상기 스타터를 각각 접종하였다. 혼합이 완료된 나박물김치는 저온(4℃)에서 2일간 숙성한 후 김치국물과 고형분 함량을 맞추어 용기에 포장을 하였다.

상기 방법으로 제조한 김치 2mL을 headspace vial (20 mL, 22.5 mm×75.5 mm)에 넣고 분석전에 51℃, 20분간 교반하였다. 김치의 휘발성 향기성분은 Solid-phase microextraction (SPME) fibers (DVB/CAR/PDMS, 50/30 μm, Supelco, 57298-U)를 이용하여 표 6의 조건하에서 추출하였다.

Fiber	DVB/CAR/PDMS
Incubation	51℃, 20 min
Adsorption	51℃, 30 min
Desorption	250℃, 2 min

한편, 추출된 휘발성 향기성분은 gas chromatography-mass spectrometer (7820A/5977E MSD, Agilent Technologies, USA) 를 사용하여 표 7의 조건 하에서 분석하였다. 김치의 휘발성 향기성분의 정량은 내부 표준물질인 methyl cinnamate(5 ppm)의 peak area에 대한 각 화합물의 peak area로 계산하였다.

Column	DB-WAS(50 m x 200 ㎛ x 0.2 ㎛)
Carrier gas	Helium
Oven temp	40℃(5 min) ~150℃, 5℃/min(0 min) ~200℃, 7℃/min(10 min)
Injector temp	250℃
Ion source temp	250℃
Split ratio	splitless
Mass scan range	35~350 amu

향기 성분에 대한 실험 결과는 표 8 및 도 16과 같았다.

Aroma compounds	Before fermentation		After fermentation
Aroma compounds	Nk 0day	DRC1506 0day	NK	DRC1506	EFEL6901	CBA3611	DRC301
Sulfur-containing compounds	1019.85±146.83	1238.85±133.38		66.63±28.74	109.54±40.58	70.25±14.31	138.88±14.76	139.11±11.61
2-Thiophenecarboxylic acid, 5-(1,1-dimethylethoxy)-	-	15.38±6.31		-	-	-	-	-
N-Methyltaurine	-	8.70±0.89		-	-	-	-	-
Allyl methyl sulfide	218.41±30.02	230.57±28.76		-	21.36±1.25	16.53±0.36	18.72±3.87	15.18±1.73
Disulfide, dipropyl	4.03±0.64	5.31±0.19		-	-	-	-	-
1,5,2,4-Dioxadithiepane-2,2,4,4-tetraoxide	-	-		-	-	1.34±0.62	3.07±0.65	2.52±0.09
1,2-Dithiolane	29.79±2.94	21.93±13.68		9.01±4.77	-	-	-	-
1-Butene, 4-isothiocyanato-	-	0.00±0.00		26.47±2.58	24.58±12.80	18.22±8.83	39.30±4.85	38.56±3.52
Diallyl disulfide	767.63±114.03	956.97±119.01		31.15±21.78	36.17±16.52	34.16±5.56	32.56±4.51	37.54±4.20
Cyclopentyl isothiocyanate	-	-		-	27.43±13.65	-	45.23±4.35	45.30±3.08
Nitrile- containing compounds	0.98±0.09	7.95±2.86		34.50±5.87	-	22.64±0.84	5.02±2.51	1.24±0.14
Hydroxyurea	-	-		-	-	-	-	1.24±0.14
2-t-Butyl-1-methyl-3-phenyl-imidazolidin-4-one	-	-		-	-	-	3.85±1.72	-
N-Methylcaprolactam	-	7.95±2.86		34.50±5.87	-	22.64±0.84	-	-
R-(-)-Cyclohexylethylamine	0.98±0.09	-		-	-	-	-	-
N-Methoxy-1-ribofuranosyl-4-imidazolecarboxylic amide	-	-		-	-	-	1.07±0.17	-
N-Methoxy-1-ribofuranosyl-4-imidazolecarboxylic amide	-	-		-	-	-	1.39±0.26	-
Alcohols and Amino Alcohols	15.70±2.18	14.65±2.49		8.16±1.83	7.25±1.00	6.84±1.31	7.26±0.94	9.07±1.95
4-amino-1-pentanol	7.60±2.42	-		2.76±0.14	2.60±0.11	2.68±0.75	3.64±1.50	2.84±0.47
4-amino-1-pentanol	1.67±0.39	-		1.14±0.03	1.06±0.14	0.86±0.40	-	0.85±0.10
L-Valinol	-	8.94±2.12		-	-	-	-	-
4-amino-1-pentanol	0.63±0.33	-		-	-	-	-	2.68±0.34
2-(2-Aminopropyl)phenol	-	2.52±0.86		3.07±1.67	2.33±0.78	2.81±0.25	2.37±0.74	2.52±0.17
4-amino-1-pentanol	-	1.22±0.35		-	-	-	-	-
1-Methylene-2b-hydroxymethyl-3,3-dimethyl-4b-(3-methylbut-2-enyl)-cyclohexane	2.12±0.22	1.98±0.20		1.20±0.11	1.26±0.13	1.38±0.21	1.25±0.18	1.08±0.06
2-Methyl-1-[3-methyl-6-(1-methylethylidene)-3-cyclohexen-1-yl]-3-buten-2-ol	3.89±1.40	-		-	-	-	-	-
Benzenes and benzene derivatives	9.62±3.10	6.24±0.54		13.35±2.54	27.01±6.33	25.96±4.07	24.63±2.97	35.49±21.58
Benzeneethanamine, N-[(4-hydroxy)hydrocinnamoyl]-	-	-		-	9.98±0.15	7.41±0.07	-	8.13±0.18
Benzene, 1-methyl-3-(1-methylethyl)-	2.94±2.28	-		-	10.11±1.08	9.98±0.58	13.16±1.97	-
Benzene, 1,3-bis(1,1-dimethylethyl)-	-	-		3.35±1.67	2.37±0.16	2.45±0.23	-	20.35±25.24
Benzaldehyde, 3-(2,4,6-trichlorophenoxymethyl)-4-methoxy-	-	-		2.48±0.59	2.06±0.24	1.77±0.21	1.55±0.36	1.30±0.27
Benzaldehyde, 3-(2,4,6-trichlorophenoxymethyl)-4-methoxy-	-	-		-	-	1.21±0.30	3.21±0.64	1.34±0.41
Benzeneethanamine, 3-fluoro-β,5-dihydroxy-N-methyl-	-	-		-	-	0.55±0.11	-	-
Benzene, 1-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-4-methyl-	6.68±0.88	6.24±0.54		3.04±0.08	3.28±0.37	3.38±0.11	3.01±0.16	2.60±0.14
Benzene, (2-isothiocyanatoethyl)-	-	-		4.48±0.67	3.32±1.51	1.70±0.14	4.77±0.14	4.47±0.19
Acids	6.62±0.38	-		15.70±7.04	13.07±6.68	28.35±6.13	41.57±10.68	34.30±5.24
(Allythio)acetic acid	-	-		-	-	4.36±1.01	7.16±1.24	7.71±1.89
Oxaluric acid	-	-		15.70±7.04	13.07±6.68	23.98±5.93	34.40±9.50	26.59±3.37
2-Butoxyethyl acetate	6.62±0.38	-		-	-	-	-	-
Terpenes	14.81±1.90	11.76±3.97		10.09±0.84	25.62±1.49	53.90±42.23	35.23±5.79	18.07±1.01
β-Terpinen	-	-		-	15.34±0.16	14.29±1.60	23.60±5.40	9.98±0.59
β-Caryophyllene	14.81±1.90	11.76±3.97		10.09±0.84	10.28±1.62	9.64±0.60	11.63±0.41	8.09±0.87
Aldehyde and ketone	1.72±0.47	12.22±2.75		1.32±0.54	1.44±0.54	1.45±0.61	1.43±0.62	1.28±0.47
Methyl salicylate	1.72±0.47	1.74±0.44		1.32±0.54	1.44±0.54	1.45±0.61	1.43±0.62	1.28±0.47
Dodecanal	-	8.63±2.35		-	-	-	-	-
1,1-Dodecanediol, diacetate	-	1.85±0.67		-	-	-	-	-
Hydrocarbon	55.75±19.67	63.60±10.70		35.92±13.75	39.16±3.52	31.90±1.57	57.98±11.01	33.84±3.03
Limonene	55.75±19.67	63.60±10.70		35.92±13.75	36.00±2.81	31.90±1.57	57.98±11.01	33.84±3.03
Propane	-	-		-	0.73±0.25	-	-	-
Miscellaneous	51.82±8.65	29.14±5.87		32.37±1.84	32.14±3.20	25.37±8.90	35.75±3.11	32.17±2.12
Penicillamine, tri-TMS	5.10±5.85	-		0.93±0.11	0.89±0.20	0.98±0.42	-	0.68±0.28
Silane, trichlorodocosyl-	10.67±5.04	5.05±2.96		5.71±0.28	5.55±0.17	4.14±1.88	5.48±0.22	5.10±0.36
Silane, trichlorodocosyl-	-	-		-	3.22±1.66	-	-	3.96±0.50
2-Trifluoroacetoxydodecane	9.04±1.39	7.44±2.10		4.61±0.89	-	-	4.36±0.76	-
Silane, trimethyl(1-methyl-1-phenylethoxy)-	-	-		-	-	4.68±0.76	3.45±0.04	-
trans-(2-Chlorovinyl)dimethylethoxysilane	1.39±0.10	-		-	-	-	-	-
trans-(2-Chlorovinyl)dimethylethoxysilane	1.67±0.53	-		1.18±0.06	1.43±0.46	-	-	-
Silanediol, dimethyl-	23.28±4.04	15.94±3.42		19.50±0.76	19.78±2.08	16.72±4.70	23.62±2.83	21.56±1.22
Metaraminol	0.67±0.09	-		-	-	0.77±0.19	-	-
Topotecan	-	0.71±0.05		-	0.54±0.11	0.77±0.03	-	0.86±0.02
Topotecan	-	-		1.15±0.20	0.90±0.51	-	-	-

향기성분 분석결과, 상기 표 8과 같이 sulfur containing compounds, alcohols, acids, benzene 등을 포함한 다양한 휘발성 향기화합물이 검출되었으며, 그 중에서 sulfur containing compounds의 함량이 가장 높았다. 향기 화합물 중 sulfur containing compounds는 배추, 무, 마늘 생강 등에서 유래되며, 이의 함량은 자연발효(NK)와 EFEL6901 발효 나박김치에서 상대적으로 낮았고, DRC301 및 CBA3611 발효 나박김치에서 상대적으로 높았다. 또한, 향기 화합물 중 Terpenes는 마늘과 생강에서 유래되며, 이의 함량은 EFEL6901 발효 나박김치에서 상대적으로 높고, 자연발효(NK)와 CBA3611 발효 나박김치에서 상대적으로 낮았다.

Hong EJ et al의 연구(Hong EJ et al., 2010. "The reduction of "off-flavor" in cheonggukjang and kimchi", Journal of the Korean Society of Food Culture, 25: 324-333)에 따르면, sulfur containing compounds는 낮은 역치값(threshold values)을 가지며, 특유의 강한 향으로 인해 김치 제품의 품질을 결정하는데 중요한 역할을 한다고 보고했다. 또한, Hawer et al의 연구(Hawer WS et al., 1994, "Effective separation and quantitative analysis of major heat principles in red pepper by capillary gas chromatography, Food Chemistry, 49: 99-103)에 따르면 sulfur containing compounds에 속하는 모든 화합물들이 이취(off-flavor)는 아니지만, 일부 외국인들은 이취(off-flavor)를 느껴 sulfur containing compounds에 거부감을 가졌다고 보고했다. 따라서 이는 과도한 양의 sulfur containing compounds는 김치의 관능을 저하시킬 수 있음을 나타낸다.

한편, Cha YH et al의 연구(Cha YH et al., 1998, "Aroma-active compounds in kimchi during fermentation", Journal of Agricultural and Food chemistry, 46: 1944-1953)에 따르면, Terpenes는 sulfur containing compounds에 비해 높은 역치값(threshold values)을 가져 상대적으로 김치의 풍미에 큰 영향을 미치지 않는다고 보고했다. 오히려, Kim DW et al의 연구(Kim DW et al., 2017, "Effects of different salt treatments on the fermentation metabolites and bacterial profiles of kimchi", Journal of Food Sicence, 82:1124-1131)에 따르면, sulfur containing compounds의 감소와 Terpenes의 증가가 김치의 향미를 개선하는데 관련이 있음을 보고했다. 따라서, 본 연구 결과 EFEL6901 발효 나박김치는 다른 나박김치와 비교하여 상대적으로 sulfur containing compounds의 함량이 낮고 Terpenes의 함량이 높기 때문에 김치의 향미를 개선하는데 도움이 될 것으로 사료된다.

한편, 도 16은 나박김치의 휘발성 향기 성분에 대해 수행된 principal components analysis (PCA)의 Biplot 결과이다. (A)는 발효전 시료를 포함한 결과이고, (B)는 발효전 시료를 제외 결과이다. 도 16과 같이, 발효 전과 발효 후의 비휘발성 향기성분은 확연한 차이가 있었다(도 16의 A). 발효 후의 나박김치만 PCA를 적용하였을 때, PC1 축을 기준으로 자연발효 (NK), DRC1506, EFEL6901 발효 나박김치는 왼쪽에 위치하고, DRC301, CBA3611 발효 나박김치는 오른쪽에 위치한 것으로 보아 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506와 유사한 향기성분을 함유하는 것으로 판단된다.

[실시예 10 : 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주 사용 나박김치의 대사산물 분석]

나박김치의 대사산물 분석은 500 MHz NMR spectrometer을 사용하여 수행되었다. 간단히, 김치국물 3ml을 pH 6.0으로 조절한 다음 13000rpm, 5분으로 원심분리 하여 상층액을 얻었다. 상층액을 99.9% D₂O (deuterium oxide; Sigma-Aldrich, USA) with 0.5 mM 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate sodium salt (DSS; Sigma-Aldrich, USA)에 1:1비율로 현탁 하여 5mm NMR tube로 옮겼다. 후에 Bruker 500-MHz NMR spectrometer (Bruker Magnetics, Faellanden, Switzerland)를 사용하여 ¹H NMR spectra를 얻고, 개별의 metabolites의 동정 및 정량은 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate sodium salt (DSS; Sigma-Aldrich, USA)을 internal standard로 사용하여 Chenomx NMR Suite v. 6.1 (Chenomx, Canada)에 의해 수행되었다. 그 결과는 표 9 및 도 17과 같았다.

Group	Compound	NK 0day	DRC1506 0day	NK	DRC1506	EFEL6901	DRC301	CBA3611
Carbohydrate	Glucose	7.85±0.22	7.64±0.12	6.06±0.36	6.39±0.24	6.58±0.94	5.13±0.18	6.34±0.24
	Fructose	9.90±0.07	9.41±0.05	2.65±0.79	1.73±0.05	2.51±0.49	3.62±0.04	4.36±0.09
	Sucrose	0.61±0.02	0.30±0.00	0.75±0.23	1.05±0.08	0.49±0.23	0.22±0.04	0.41±0.02
Alcohol	Ethanol	4.14±0.68	3.23±0.00	10.52±0.50	11.85±0.11	11.97±0.41	6.58±0.21	7.98±0.08
Alcohol	Mannitol	1.72±0.22	1.43±0.08	12.92±0.32	13.08±0.60	13.34±0.08	8.01±0.33	10.80±0.17
Organic acid	2-Aminobutyrate	0.08±0.00	0.08±0.01	0.16±0.06	0.19±0.09	0.16±0.05	0.27±0.02	0.30±0.01
	4-Aminobutyrate	0.64±0.01	0.58±0.01	0.99±0.06	1.25±0.08	1.03±0.08	0.82±0.11	1.31±0.03
	Acetate	0.23±0.00	0.58±0.00	9.68±0.31	10.46±0.06	10.81±0.22	9.36±0.49	10.84±0.11
	Lactate	0.44±0.02	0.79±0.02	13.16±0.44	13.59±0.04	13.99±0.36	13.92±0.32	15.15±0.06
	Succinate	0.07±0.00	0.09±0.00	0.29±0.16	0.45±0.03	0.41±0.01	0.39±0.01	0.08±0.00
	Pyruvate	0.14±0.01	0.13±0.01	0.04±0.02	0.12±0.04	0.06±0.02	0.08±0.01	0.03±0.01
Amino acid	Alanine	0.48±0.02	0.51±0.03	1.06±0.05	0.94±0.07	0.86±0.03	0.81±0.11	1.08±0.03
	Arginine	0.24±0.01	0.23±0.05	0.38±0.24	0.91±0.02	0.55±0.16	0.46±0.00	1.15±0.01
	Asparagine	0.53±0.00	0.61±0.10	0.57±0.12	1.21±0.07	0.58±0.11	0.35±0.00	0.98±0.25
	Aspartate	0.45±0.09	0.26±0.06	0.30±0.09	0.99±0.08	0.19±0.01	0.28±0.04	0.94±0.11
	Cysteine	0.29±0.04	0.23±0.02	0.19±0.10	0.55±0.03	0.24±0.10	0.35±0.00	0.45±0.02
	Glutamate	1.43±0.01	1.32±0.02	0.91±0.12	1.11±0.00	1.18±0.13	1.17±0.07	1.35±0.09
	Glutamine	0.18±0.03	0.18±0.00	0.95±0.25	0.72±0.08	1.24±0.03	1.05±0.00	1.51±0.04
	Glycine	0.36±0.13	0.07±0.01	0.39±0.17	0.86±0.04	0.59±0.16	0.28±0.05	0.24±0.04
	Histidine	0.00±0.00	0.00±0.00	0.08±0.06	0.05±0.05	0.00±0.00	0.06±0.09	0.04±0.03
	Isoleucine	0.10±0.02	0.15±0.01	0.07±0.03	0.17±0.05	0.05±0.03	0.13±0.00	0.17±0.01
	Leucine	0.10±0.01	0.14±0.01	0.10±0.06	0.17±0.02	0.15±0.02	0.16±0.04	0.24±0.02
	Lysine	0.03±0.00	0.08±0.02	0.04±0.02	0.09±0.01	0.07±0.03	0.18±0.16	0.07±0.05
	Malonate	0.13±0.02	0.12±0.02	0.04±0.06	0.34±0.05	0.10±0.02	0.16±0.03	0.15±0.04
	Methionine	0.11±0.02	0.11±0.01	0.10±0.01	0.19±0.01	0.05±0.02	0.10±0.00	0.09±0.04
	Proline	0.13±0.05	0.38±0.10	0.51±0.24	0.40±0.11	0.40±0.06	0.45±0.00	0.85±0.07
	Phenylalanine	0.03±0.04	0.00±0.00	0.09±0.03	0.05±0.04	0.13±0.01	0.13±0.10	0.14±0.04
	Serine	1.19±0.06	0.86±0.03	1.61±0.18	1.19±0.30	0.96±0.22	0.70±0.17	0.86±0.00
	Ornithine	0.07±0.03	0.02±0.00	0.13±0.03	0.16±0.05	0.10±0.04	0.07±0.00	0.03±0.03
	trans-4-Hydroxy-L-proline	0.54±0.00	0.53±0.02	0.34±0.13	0.92±0.13	0.08±0.06	0.37±0.13	0.52±0.03
	Threonine	0.07±0.00	0.07±0.00	0.47±0.24	0.35±0.13	0.38±0.07	0.46±0.13	0.46±0.01
	Tryptophan	0.00±0.00	0.00±0.00	0.05±0.03	0.02±0.02	0.02±0.02	0.09±0.04	0.23±0.02
	Tyrosine	0.00±0.00	0.01±0.00	0.20±0.10	0.07±0.02	0.03±0.02	0.10±0.00	0.22±0.06
	Valine	0.06±0.01	0.10±0.00	0.17±0.03	0.19±0.03	0.10±0.04	0.12±0.01	0.07±0.01

도 17은 나박김치의 대사산물에 대해 수행된 principal components analysis (PCA)의 Biplot 결과이다. (A)는 발효전 시료를 포함한 결과이고, (B)는 발효전 시료를 제외한 결과이다. 도 17의 A와 같이, 발효 전과 발효 후의 대사산물은 확연한 차이가 있었다. 또한, 도 17의 B와 같이, 발효 후의 나박김치만 PCA를 적용하였을 때, PC1 축을 기준으로 자연발효 (NK), DRC1506, EFEL6901 발효 나박김치는 왼쪽에 위치하고, DRC301, CBA3611 발효 나박김치는 오른쪽에 위치한 것으로 보아 EFEL6901은 자연발효(NK)와 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506와 유사한 대사산물을 함유하는 것으로 판단된다. 특히, EFEL6901 발효 나박김치는 DRC1506와 mannitol의 함량이 유사했다. LAB는 fructose를 환원시킴으로써 Mannitol을 생산하는데, 이는 상쾌하고 부드러운 단맛이 있으며 김치에서 청량감을 준다. 또한 신맛을 억제하여 김치가 과도하게 시어지는 현상을 억제하는 특성으로 김치의 맛을 향상시키는데 도움이 된다고 보고되어 있다. 이러한 결과는 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506과 가장 유사한 대사산물을 함유하며, 높은 mannitol의 함량으로 김치의 맛과 풍미를 향상시킬 수 있음을 의미한다.

[실시예 11 : 본 발명 락토바실러스 류테리( Lactobacillus reuteri ) EFEL6901 균주 사용 나박김치의 관능평가]

관능평가는 총 5종의 나박 김치가 적식기(산도 0.17∼0.31%/pH 3.99)에 도달한 후 9점 척도법에 따라 총 30명의 관능요원이 평가하였다. 평가내용은 선호도 기준으로 향 (aroma), 신맛 (Sour taste), 단맛 (Sweet taste), 탄산미 (Carbonic acid-like taste), 이미·이취 (Off-flavor), 종합적 선호도(Total preference)를 평가하였고, 그 정도는 1에 가까울수록 선호도가 낮고 9에 가까울수록 선호도가 높은 것으로 나타내었다.

그 결과는 도 18에 나타내었다. 도 18은 프로바이오틱 균주로 발효시킨 최적 숙성 나박김치 시료의 관능평가 결과이다. 결과는 평균±표준 오차 평균 (SEM) (n=30)로 표시하였으며, 전반적인 평가항목에서 EFEL6901 발효 나박김치가 가장 높은 선호도를 보였지만, 샘플 간에 유의한 차이가 없었다.

전체 평가항목에서 모든 나박김치는 평균 5점 이상으로 보통 이상의 선호도를 보여주었다. 종합적인 선호도 평가 결과, EFEL6901 발효 나박김치가 가장 높은 선호도를 보였으며, 자연발효 (NK) 나박김치가 가장 낮은 선호도를 보였지만 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 본 관능평가 결과에서 유의적인 차이가 나타나지는 않았지만 전반적으로 모든 발효 나박김치에서 보통 이상의 선호도가 나타났으며, 이는 본 발명 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 스타터 첨가가 나박김치의 관능에 부정적인 영향을 나타내지 않는다는 것을 의미한다.

기탁기관명 : 농업생명공학연구원

수탁번호 : KACC81105

수탁일자 : 20200602

Claims

락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP).
제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri)는,
항염 프로바이오틱 활성이 있는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP).
채소에 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 채소.
제3항에 있어서,
상기 발효 채소는,
김치인 것을 특징으로 하는 발효 채소.
과일에 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 과일.
곡물에 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) EFEL6901 (KACC 81105BP)를 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 곡물.