CN116769661A - 罗伊氏乳杆菌e9在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了罗伊氏乳杆菌E9在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的罗伊氏乳杆菌E9在斑马鱼氧化应激模型中具有显著降低斑马鱼体内ROS水平，和显著提高斑马鱼体内SOD活性的潜能，此为利用罗伊氏乳杆菌E9开发抗氧化的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及罗伊氏乳杆菌E9在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用。
背景技术
自由基是生命活动中多种生化反应的中间代谢物质。自由基产生过多或清除过慢，会造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。自由基攻击生命大分子和各种细胞器造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重大原因。大量实验研究表明，双歧杆菌属和乳杆菌属的物种能够在体外清除羟自由基和超氧阴离子，在体内具有提高抗氧化酶的作用，表现出良好抗氧化、延缓衰老的功效。然而，目前益生菌在抗氧剂、延缓衰老中的研究和应用较少。
因此，提供罗伊氏乳杆菌E9在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了罗伊氏乳杆菌E9在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用。
甲萘醌是一种氧化剂，通过细胞内还原酶系统(微粒体的P450还原酶和线粒体的呼吸链还原酶)，产生不稳定的半醌，进入氧化还原循环，产生活性氧族。用甲萘醌可诱导斑马鱼建立氧化应激模型。
经过特异性荧光染色(呈绿色，主要定位于细胞核和线粒体)，发生氧化应激反应斑马鱼全身明显比正常斑马鱼绿很多，可以用荧光显微镜下观察到斑马鱼体内的活性氧含量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)E9在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用，所述罗伊氏乳杆菌E9的保藏编号为CGMCC No.21768(参见专利号202210625093.1)。
进一步，所述的罗伊氏乳杆菌E9在制备降低体内ROS水平，提高体内SOD活性产品中的应用。
进一步，所述罗伊氏乳杆菌E9为菌悬液。
罗伊氏乳杆菌E9在体内氧化应激模型中均能显著降低斑马鱼体内ROS水平和显著提高斑马鱼体内SOD活性，增强机体清除自由基的能力，表现出良好抗氧化、抗衰老的作用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了罗伊氏乳杆菌E9在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用，罗伊氏乳杆菌E9在斑马鱼氧化应激模型中具有显著降低斑马鱼体内ROS水平，和显著提高斑马鱼体内SOD活性的潜能，此为利用罗伊氏乳杆菌E9开发抗氧化的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明罗伊氏乳杆菌E9对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中ROS水平影响的直观图；
其中，A：正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：1×106CFU/mL罗伊氏乳杆菌23272；E：1×106CFU/mL罗伊氏乳杆菌E9；
图2附图为本发明罗伊氏乳杆菌E9对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中ROS水平影响的统计图；
图3附图为本发明罗伊氏乳杆菌E9对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中SOD活性的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
还原型谷胱甘肽(GSH)、甲萘醌、二甲基亚砜(DMSO)均购自上海源叶生物科技有限公司；2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒均购自Sigma-Aldrich公司。罗伊氏乳杆菌23272(ATCC 23272)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
实施例1罗伊氏乳杆菌E9菌悬液(菌体)的制备
将罗伊氏乳杆菌E9活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例2罗伊氏乳杆菌23272菌悬液(菌体)的制备
将罗伊氏乳杆菌23272活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例3罗伊氏乳杆菌E9对斑马鱼氧化应激模型中ROS水平的影响
挑选发育至4dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于6孔细胞培养板中，每孔20条鱼。实验设置正常组、模型组、阳性对照组(GSH)、罗伊氏乳杆菌23272干预组、罗伊氏乳杆菌E9干预组。正常组和模型组均加入PBS，阳性对照组加入GSH溶液(100μM)，罗伊氏乳杆菌23272干预组(1×106CFU/mL)加入1×106CFU/mL罗伊氏乳杆菌23272；罗伊氏乳杆菌E9干预组(1×106CFU/mL)加入1×106CFU/mL罗伊氏乳杆菌E9，每孔2.5mL，28℃孵育，每24h后更换新溶液；孵育48h后，正常组加入2.5mL PBS(1％DMSO)，模型组、阳性对照组、罗伊氏乳杆菌23272干预组、罗伊氏乳杆菌E9干预组分别加入6μM甲萘醌(先用DMSO将甲萘醌配制为600μM储备溶液，再用PBS稀释为6μM)，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，弃上述溶液，再用PBS将上述斑马鱼洗涤3次，加入20μg/mL DCFH-DA溶液，每孔3mL，28℃避光孵育1h后，用PBS将上述斑马鱼洗涤3次，置于荧光显微镜下观察斑马鱼体内荧光强度并拍照记录。使用Image J软件对斑马鱼体内荧光强度(S)进行定量统计分析。斑马鱼体内ROS水平计算如下：
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SEM数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：###P<0.005，与模型组相比：***P<0.005。
结果见图1、2；由图1和图2可知，斑马鱼体内绿色荧光的强弱反映ROS水平的高低；与正常组相比，模型组斑马鱼体内绿色荧光强度增强，表明模型组斑马鱼体内ROS水平升高；同时，与正常组(100.00±10.70％)相比，模型组斑马鱼体内ROS水平(204.98±11.91％)显著升高(p<0.005)，表明本次斑马鱼氧化应激模型建立成功。
与模型组相比，阳性对照组(GSH)斑马鱼体内绿色荧光强度减弱，表明GSH在甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中，可降低斑马鱼体内ROS水平；同时，阳性对照组斑马鱼体内ROS水平为109.15±8.25％，与模型组(204.98±11.91％)相比差异性显著(P<0.005)；因此，GSH具有明显的抗氧化作用，与临床结果一致。罗伊氏乳杆菌23272干预组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内的红色荧光强度与模型组相似；同时罗伊氏乳杆菌23272干预组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内ROS水平为196.63±9.43％，与模型组(204.98±11.91％)相比无显著性差异(P>0.05)。与模型组相比，罗伊氏乳杆菌E9斑马鱼体内绿色荧光强度减弱，表明罗伊氏乳杆菌E9在甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中，可降低斑马鱼体内ROS水平；同时罗伊氏乳杆菌E9干预组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内ROS水平为113.32±7.70％，与模型组(204.98±11.91％)相比较差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，罗伊氏乳杆菌E9在体内氧化应激模型中对斑马鱼体内ROS水平的降低作用强于罗伊氏乳杆菌23272，表现出良好抗氧化、抗衰老的作用。
实施例4罗伊氏乳杆菌E9对斑马鱼氧化应激模型中SOD活性的影响
挑选发育至4dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于6孔细胞培养板中，每孔20条鱼。实验设置正常组、模型组、阳性对照组(GSH)、罗伊氏乳杆菌23272干预组、罗伊氏乳杆菌E9干预组，每组3个复孔。正常组和模型组均加入PBS，阳性对照组加入GSH溶液(100μM)，罗伊氏乳杆菌23272干预组(1×106CFU/mL)加入1×106CFU/mL罗伊氏乳杆菌23272；罗伊氏乳杆菌E9干预组(1×106CFU/mL)加入1×106CFU/mL罗伊氏乳杆菌E9，每孔2.5mL，28℃孵育，每24h后更换新溶液；孵育48h后，正常组加入2.5mL PBS(1％DMSO)，模型组、阳性对照组、罗伊氏乳杆菌23272干预组、罗伊氏乳杆菌E9干预组分别加入6μM甲萘醌(先用DMSO将甲萘醌配制为600μM储备溶液，再用PBS稀释为6μM)，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，弃上述溶液，再用PBS将上述斑马鱼洗涤3次，收集斑马鱼至1.5mL离心管，每管50mg斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入250μL缓冲液(超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒缓冲溶液)。用S-18KS手持微量电动组织匀浆器将斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，15000×g，4℃离心15min，收集上清液。使用超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司)检测各组的SOD活性。
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：###P<0.005，与模型组相比：***P<0.005。
结果见图3；由图3可知，与正常组(2.82±0.27U/mg)相比，模型组斑马鱼体内SOD活性(0.84±0.05U/mg)显著降低(p<0.005)，表明本次斑马鱼氧化应激模型建立成功。
阳性对照组斑马鱼体内SOD活性为2.36±0.13U/mg，与模型组(0.84±0.05U/mg)相比差异性显著(P<0.005)，表明GSH具有明显的抗氧化作用，与临床结果一致。罗伊氏乳杆菌23272干预组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内SOD活性为0.98±0.07U/mg，与模型组(0.84±0.05U/mg)相比较无显著性差异(P>0.05)。而罗伊氏乳杆菌E9干预组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内SOD活性为2.07±0.15U/mg，与模型组(0.84±0.05U/mg)相比较差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，罗伊氏乳杆菌E9在体内氧化应激模型中对斑马鱼体内SOD活性的提高作用强于罗伊氏乳杆菌23272，即增强机体清除自由基的能力，表现出良好抗氧化、抗衰老的作用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)E9在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌E9的保藏编号为CGMCCNo.21768。
2.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌E9在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌E9为菌悬液。
3.权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌E9在制备降低体内ROS水平，提高体内SOD活性产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌E9在制备降低体内ROS水平，提高体内SOD活性产品中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌E9为菌悬液。
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