CN113151072A - 一株短双歧杆菌nx-5及其在抗氧化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株短双歧杆菌NX‑5及其在抗氧化中的应用,属于微生物技术领域。本发明公开的一株短双歧杆菌NX‑5,保藏编号为CGMCC No.20113;短双歧杆菌NX‑5的发酵上清液、菌悬液,在体内氧化应激模型中均能显著降低斑马鱼体内活性氧水平,和显著提高斑马鱼体内超氧物歧化酶活性,具备应用于体内抗氧化的潜能。本发明公开的一株短双歧杆菌NX‑5在抗氧化方面有巨大的潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,更具体的说是涉及一株短双歧杆菌NX-5及其在抗氧化中的应用。
背景技术
活性氧(reactive oxygen species,ROS)是细胞有氧代谢的副产物,主要包括过氧化氢(O2 2-)、单线态氧(1O2)、超氧自由基(O2 ·-)、羟基自由基(·OH)等,在细胞生命周期中发挥着重要作用。低浓度的ROS可作为细胞内的关键信号分子以调节细胞的生长、增殖和分化。然而,ROS的积累会严重破坏细胞生物大分子如蛋白质、脂质和DNA等,导致多种慢性疾病,包括动脉粥样硬化、关节炎、糖尿病、神经退行性疾病、老化、炎症肠病等。其中,ROS介导的氧化应激诱导的衰老可以说是引起和驱动衰老程序的最持久但可改变的因子。随着年龄的增长,全身性氧化和炎症应激因子的增加是衰老的自然原因,最终导致衰老相关的组织和器官功能障碍。大量实验研究表明,抗氧化剂或自由基清除剂有助于避免ROS的积累,对氧化损伤具有保护作用,均可有效控制这些疾病的发生,发挥良好的预防作用。但大多数化学合成或植物提取的抗氧化药物因具有潜在的不良反应而不推荐长期使用。因此,寻找一种疗效可靠、毒副作用小的治疗方式成为主要研究方向。与传统抗氧化药物相比,具有抗氧化功效的益生菌因其副作用小并且具有其他益生功效等特点,而被广泛关注。
益生菌是活的微生物,当以足够的量施用时,会给宿主带来健康益处。益生菌的使用已经与一些健康有益效果相关,包括肠道菌群的调节、氧化还原平衡、免疫应答、脑神经调节等。这解释了基于益生菌的饮食干预越来越多地用于治疗和预防不同的慢性疾病,尤其是与压力和炎症相关的慢性疾病。大量实验研究表明,双歧杆菌属和乳杆菌属的物种能够在体外清除羟自由基和超氧阴离子,在体内具有提高抗氧化酶的作用,表现出良好抗氧化、延缓衰老的功效。然而,目前益生菌在抗氧剂、延缓衰老中的研究和应用较少。同时,当前国际益生菌专利申请集中于美、日、俄传统研发强国,而我国缺乏拥有自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口,而且国外菌株未必适合我国居民胃肠道生理状况。另外,益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据,严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此,针对菌种资源的功能深入挖掘,筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株,对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力,促进我国益生菌制品发展尤为重要。
因此,提供一株短双歧杆菌NX-5及其在抗氧化中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一株短双歧杆菌NX-5及其在抗氧化中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一株短双歧杆菌Bifidobacterium breveNX-5,其保藏编号为CGMCC No.20113,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏日期为2020年07月19日,分类命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve。
进一步,所述的一株短双歧杆菌NX-5在抗氧化中的应用。
进一步,所述菌悬液或发酵上清液在降低体内ROS水平,提高体内SOD活性中的应用。
进一步,所述的一株短双歧杆菌NX-5在制备抗氧化食品、化妆品、药品中的应用。
进一步,所述短双歧杆菌NX-5在制备发酵乳制品及其他发酵食品中的应用。
进一步,所述短双歧杆菌NX-5为菌悬液或发酵上清液。
本发明所述短双歧杆菌NX-5,在体内氧化应激模型中具有降低斑马鱼体内ROS水平,和提高斑马鱼体内SOD活性的作用,表现出良好的抗氧化的益生功效。
本发明所述在体内氧化应激模型中能显著降低斑马鱼体内ROS水平,和显著提高斑马鱼体内SOD活性的菌株,包括菌株发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明公开提供了一株短双歧杆菌NX-5及其在抗氧化中的应用,短双歧杆菌NX-5是从健康婴幼儿粪便中分离筛选得到的,在斑马鱼氧化应激模型中具有显著降低斑马鱼体内ROS水平,和显著提高斑马鱼体内SOD活性的潜能,此为利用短双歧杆菌NX-5开发抗氧化的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明短双歧杆菌NX-5形成的菌落形态图;
图2附图为本发明短双歧杆菌NX-5革兰氏染色后的显微形态观察;
图3附图为本发明短双歧杆菌NX-5的发酵上清液、菌悬液对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中ROS水平影响的直观图;
图4附图为本发明短双歧杆菌NX-5的发酵上清液、菌悬液对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中ROS水平影响的统计图;
图5附图为本发明短双歧杆菌NX-5的发酵上清液、菌悬液对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中SOD活性的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1短双歧杆菌NX-5分离、鉴定及保藏
(1)分离:将健康婴幼儿粪便经梯度稀释后,分别接种于BHI固体培养基、BS固体培养基、MRS固体培养基中,37℃厌氧培养48h,挑取平板上的单菌落划线分离得到纯菌落。将平板上的纯菌落接种于BS液体培养基中,37℃厌氧培养12~16h,加入20%甘油,置于-80℃冰箱中保存。
(2)菌株形态学鉴定:对筛选出的菌株革兰氏染色后于显微镜下观察,革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
(3)菌株的分子生物学鉴定:对所获得的菌株提取基因组DNA,通过PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段,之后进行测序,鉴定菌株的种属。
27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;SEQ ID NO.1;
1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’;SEQ ID NO.2。
实验结果:从广东省广州市健康婴幼儿新鲜粪便中筛选出的菌株,经形态观察、16S rDNA鉴定,其中菌株NX-5被鉴定为短双歧杆菌,其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
GGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGCTGCCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGACGTTGCTGATTCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGGGATCCGCTCCAGCTCGCGCTGTCGCATCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAACCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCGGCACAATCCGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCCGCCCCGAAGGGAAACCCCATCTCTGGGATCGTCGGGAACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAG;SEQ ID NO.3。
该菌单菌落接种到BS固体培养基上,37℃厌氧生长良好、呈球形、边缘整齐的白色菌落(图1),革兰氏染色呈阳性(图2)。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏日期为2020年07月19日,分类命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve,保藏编号为CGMCC No.20113。
实施例2短双歧杆菌NX-5发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)的制备
将短双歧杆菌NX-5活化培养后接种于BS液体培养基中,37℃培养15h后,调整发酵菌浓度为1×106CFU/mL,4℃,6000r/min离心10min,得到培养上清液和菌体沉淀,上清液经0.22μm滤膜过滤后得发酵上清液(胞外分泌物);菌体沉淀经PBS两次洗涤后,将菌体用PBS重新悬浮,调整细胞浓度为1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例3短双歧杆菌NX-5对斑马鱼氧化应激模型中ROS水平的影响
还原型谷胱甘肽(GSH)、甲萘醌、二甲基亚砜(DMSO)均购自上海源叶生物科技有限公司;2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)购自Sigma-Aldrich公司。
挑选发育至4dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于6孔细胞培养板中,每孔20条鱼。实验设置空白对照组、模型组、阳性对照组、样品(菌悬液、发酵上清液)干预组,每组20条鱼。空白对照组加入PBS,模型组加入PBS,阳性对照组加入GSH溶液(100μM),菌悬液组加入菌悬液,发酵上清液组加入发酵上清液,每孔2.5mL;28℃孵育24h后,空白对照组加入2.5mL PBS(1%DMSO),模型组、阳性对照组、菌悬液组、发酵上清液组分别加入6μM甲萘醌(先用DMSO将甲萘醌配制为600μM储备溶液,再用PBS稀释为6μM),每孔2.5mL;28℃孵育24h后,弃上述溶液,再用PBS将上述斑马鱼洗涤3次,加入20μg/mL DCFH-DA溶液,每孔3mL,28℃避光孵育1h后,用PBS将上述斑马鱼洗涤3次,置于荧光显微镜下观察斑马鱼体内荧光强度并拍照记录。使用Image J软件对斑马鱼体内荧光强度(S)进行定量统计分析。斑马鱼体内ROS水平计算如下:
结果见图3、4;由图3和图4可知,斑马鱼体内绿色荧光的强弱反映ROS水平的高低;与空白对照组相比,模型组斑马鱼体内绿色荧光强度增强,表明模型组斑马鱼体内ROS水平升高;同时,与空白对照组(100.00±3.22%)相比,模型组斑马鱼体内ROS水平(161.47±9.42%)显著升高(p<0.005),表明本次斑马鱼氧化应激模型建立成功。
与模型组相比,阳性对照组(GSH)斑马鱼体内绿色荧光强度减弱,表明GSH在甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中,可降低斑马鱼体内ROS水平;同时,阳性对照组斑马鱼体内ROS水平为112.33±6.03%,与模型组(161.47±9.42%)相比差异性显著(P<0.005);因此,GSH具有明显的抗氧化作用,与临床结果一致。与模型组相比,短双歧杆菌NX-5的发酵上清液、菌悬液组斑马鱼体内绿色荧光强度也减弱,表明短双歧杆菌NX-5的发酵上清液、菌悬液在甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中,可降低斑马鱼体内ROS水平;同时短双歧杆菌NX-5的发酵上清液、菌悬液组斑马鱼体内ROS水平分别为120.78±8.21%、133.13±8.65%,与模型组(161.47±9.42%)相比较均差异性显著(P<0.05)。因此,上述结果表明短双歧杆菌NX-5的发酵上清液、菌悬液在体内氧化应激模型中均能显著降低斑马鱼体内ROS水平,表现出良好抗氧化的作用。
实施例4短双歧杆菌NX-5对斑马鱼氧化应激模型中SOD活性的影响
挑选发育至4dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于6孔细胞培养板中,每孔20条鱼。实验设置空白对照组、模型组、阳性对照组、样品(菌悬液、发酵上清液)干预组,每组20条鱼。空白对照组加入PBS,模型组加入PBS,阳性对照组加入GSH溶液(100μM),菌悬液组加入菌悬液,发酵上清液组加入发酵上清液,每孔2.5mL;28℃孵育24h后,空白对照组加入2.5mL PBS(1%DMSO),模型组、阳性对照组、菌悬液组、发酵上清液组分别加入6μM甲萘醌(先用DMSO将甲萘醌配制为600μM储备溶液,再用PBS稀释为6μM),每孔2.5mL;28℃孵育24h后,弃上述溶液,再用PBS将上述斑马鱼洗涤3次,收集斑马鱼至1.5mL离心管,每管50mg斑马鱼,每个实验组收集6管;将离心管中的水吸干后,加入250μL缓冲液(超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒缓冲溶液)。将离心管用超声波破碎仪在冰浴中处理,工作5s、间隔8s,超声破碎10次,12000×g,4℃离心10min,收集上清液。使用超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司)检测各组的SOD活性。
结果见图5;由图5可知,与空白对照组(2.81±0.17U/mg)相比,模型组斑马鱼体内SOD活性(0.85±0.12U/mg)显著降低(p<0.005),表明本次斑马鱼氧化应激模型建立成功。
阳性对照组斑马鱼体内SOD活性为2.21±0.22U/mg,与模型组(0.85±0.12U/mg)相比差异性显著(P<0.005),表明GSH具有明显的抗氧化作用,与临床结果一致。短双歧杆菌NX-5的发酵上清液、菌悬液组斑马鱼体内SOD活性分别为1.74±0.13U/mg、1.57±0.17U/mg,与模型组(0.85±0.12U/mg)相比较均差异性显著(P<0.05)。因此,上述结果表明短双歧杆菌NX-5的发酵上清液、菌悬液在体内氧化应激模型中均能显著提高斑马鱼体内SOD活性,增强机体清除自由基的能力,表现出良好抗氧化的作用。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 广东南芯医疗科技有限公司 广州悦芯科技有限公司 佛山市朗芯生物科技有限公司
<120> 一株短双歧杆菌NX-5及其在抗氧化中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 877
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggggttaggc caccggcttc gggtgctgcc cactttcatg acttgacggg cggtgtgtac 60
aaggcccggg aacgcattca ccgcgacgtt gctgattcgc gattactagc gactccgcct 120
tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg aactgagacc ggttttcagg gatccgctcc 180
agctcgcgct gtcgcatccc gttgtaccgg ccattgtagc atgcgtgaag ccctggacgt 240
aaggggcatg atgatctgac gtcatcccca ccttcctccg agttaacccc ggcggtcccc 300
cgtgagttcc cggcacaatc cgctggcaac acggggcgag ggttgcgctc gttgcgggac 360
ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacgaccatg caccacctgt gaacccgccc 420
cgaagggaaa ccccatctct gggatcgtcg ggaacatgtc aagcccaggt aaggttcttc 480
gcgttgcatc gaattaatcc gcatgctccg ccgcttgtgc gggcccccgt caatttcttt 540
gagttttagc cttgcggccg tactccccag gcgggatgct taacgcgtta gctccgacac 600
ggaacccgtg gaacgggccc cacatccagc atccaccgtt tacggcgtgg actaccaggg 660
tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc gctcctcagc gtcagtaacg gcccagagac 720
ctgccttcgc cattggtgtt cttcccgata tctacacatt ccaccgttac accgggaatt 780
ccagtctccc ctaccgcact caagcccgcc cgtacccggc gcggatccac cgttaagcga 840
tggactttca caccggacgc gacgaaccgc ctacgag 877
Claims (6)
1.一株短双歧杆菌Bifidobacterium breve NX-5,其特征在于,其保藏编号为CGMCCNo.20113。
2.权利要求1所述的一株短双歧杆菌NX-5在抗氧化中的应用。
3.根据权利要求2所述的一株短双歧杆菌NX-5在抗氧化中的应用,其特征在于,所述短双歧杆菌NX-5为菌悬液或发酵上清液。
4.根据权利要求3所述的一株短双歧杆菌NX-5在抗氧化中的应用,其特征在于,所述菌悬液或发酵上清液在降低体内ROS水平,提高体内SOD活性中的应用。
5.权利要求1所述的一株短双歧杆菌NX-5在制备抗氧化食品、化妆品、药品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述短双歧杆菌NX-5为菌悬液或发酵上清液。
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