CN113528384A - 一种双重二裂酵母发酵产物的制备方法和产品及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双重二裂酵母发酵产物的制备方法和产品及其应用，双歧杆菌Rayting‑B01已于2021年4月27日保藏于中典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2021470，保藏编号为CCTCC M 2021470。所述双歧杆菌由环境有机污染物刺激、耐氧气刺激方法筛选得到，经过阶段通氧方法控制发酵工艺发酵，利用低温高压匀浆的方法破壁得到二裂酵母发酵产物和溶胞物两种体系，命名为双重二裂酵母发酵产物。该产物能清除人体皮肤上自由基，保护人体皮肤不被氧化，对人体皮肤细胞氧化损伤起到一定的保护作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及到一种双重二裂酵母发酵产物的制备方法和产品及其应用。
背景技术
近年来，微生态护肤成为最火热点，将益生菌利用到人体皮肤上，维持皮肤微生态，减少自由基对皮肤细胞的氧化损伤，使得益生菌发酵产品成为备受化妆品界关注的产品开放思路。双歧杆菌(Bifidobacterium)是人和动物肠道中最重要的一类益生菌，在维持肠道微生态平衡中起着至关重要的作用。根据研究报道，人体内双歧杆菌的数量，随着人年龄的增长而出现下降趋势。在一些健康长寿老人肠道内，经常能筛选到双歧杆菌。因此，双歧杆菌在维持人体健康，抗衰老方面具有很明显的效果。
细菌的耐溶剂抗氧化防御系统：细菌具有耐受多种溶剂的能力，通过结合耐溶剂细菌常见的多种耐溶剂机制，耐溶剂细菌可以在严酷和极端的环境下生存，包括暴露于各种溶剂，它们能够激发不同酶活力表达，来应对溶剂的刺激。
溶剂对细胞的毒性，是通过膜的破坏、呼吸链的损伤以及电子转移链中活性氧的产生来测量的。因此，细胞ROS清除能力是细胞在环境有机污染物存在下生存的必要前提。大多数细菌具有主要用于活性氧清除的抗氧化酶系，包括过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、烷基过氧化氢还原酶(Ahp) 和谷胱甘肽s-转移酶(GST)。
目前，双歧杆菌属于严格厌氧微生物，普通条件下很难发酵大量培养；且自然条件下，少量的双歧杆菌活性物含量少，抗氧化性能弱。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种双重二裂酵母发酵产物的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种双重二裂酵母发酵产物的制备方法，包括，
将具有耐氧胁迫的双歧杆菌Rayting-B01接种到发酵培养基中厌氧发酵，发酵过程中，当菌种处于对数生长期以后，每隔3～4h向罐内通气，使得溶解氧保持在5～10％，诱导发酵2～3h；
然后通入氮气将溶解氧降低至0，继续厌氧发酵2～3h；
再次进行通氧发酵，溶解氧保持在5～10％，诱导发酵2～3h，再次厌氧- 好氧发酵，直至发酵液中葡萄糖被消耗完全，菌体OD600不再升高；
发酵结束后，通过低温高压匀浆法制得破壁后的发酵液；
将破壁后的发酵液，采用陶瓷膜过滤澄清，过滤过程控制温度不超过40℃。所得清液即为双重二裂酵母发酵产物；
其中，所述的双歧杆菌Rayting-B01Bifidobacteriumsp.Rayting-B01已于2021年4月27日保藏于中典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCM2021470。
作为本发明所述双重二裂酵母发酵产物的制方法的一种优选方案，其中：所述双歧杆菌Rayting-B01，其筛选方法包括，
通过PM2.5、环境有机污染物、氧化剂中的一种或几种物质刺激培养双歧杆菌，诱导抗氧化酶的表达，筛选得到双歧杆菌Rayting-B01。
作为本发明所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述发酵，其中，发酵培养基为：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，可溶性淀粉2g/L，氯化钠5g/L，吐温800.1g/L，pH7.0；
通过121℃灭菌20分钟备用。
作为本发明所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述低温高压匀浆法，包括，
将发酵后的样品温度冷却至4～8℃，高压匀浆温度维持在30℃以下，高压匀浆5遍，制得破壁后的发酵液。
作为本发明所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述高压匀浆，其中，压力为900～1500Bar。
作为本发明所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述将具有耐氧胁迫的双歧杆菌Rayting-B01接种到发酵培养基中厌氧发酵，其中，接种量以质量比计为2～3％。
作为本发明所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述厌氧发酵，其中，发酵温度为37℃。
作为本发明所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述采用陶瓷膜过滤澄清，其中，陶瓷膜的孔径为0.22～1μm。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种双重二裂酵母发酵产物的制备方法制得的产品，所述产品包含双歧杆菌溶胞物和发酵产物滤液。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种双重二裂酵母发酵产物产品在抗衰类化妆品配方中的应用。
本发明有益效果：
(1)本发明提供一种具有抗氧化功能的双重二裂酵母发酵产物化妆品原料的制备方法及其应用，经过试验数据验证，经过本方法筛选所得双歧杆菌，发酵制备后所得的双重二裂酵母发酵产物具有良好的DPPH自由基清除能力、显著的羟自由基清除能力。
(2)本发明经过特有的筛选技术，获得高活性双歧杆菌Rayting-B01，并采用低温循环破壁技术，在保证双歧杆菌破壁完全的前提下，有效保护了双歧杆菌中活性物不被破坏，所制得的双重二裂酵母发酵产物中，包含了二裂酵母发酵产物滤液和二裂酵母发酵产物溶胞物两种活性成分，与现有单一成分的二裂酵母系列化妆品原料相比，具有更加佳的抗氧化功能；同时，针对现有双歧杆菌需要在严格厌氧条件下发酵，且菌体表达活性物含量少，高压匀浆高温导致活性物丧失的技术缺陷，本发明的技术能有效解决此类技术“难题”。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例中不同培养条件下四株双歧杆菌SOD活性图。
图2为本发明实施例中不同培养条件下四株双歧杆菌CAT活性图。
图3为本发明实施例中不同培养条件下四株双歧杆菌GST活性图。
图4为本发明实施例中不同培养条件下四株双歧杆菌T-AOC活性图。
图5为本发明实施例中不同培养条件双重二裂酵母发酵产物对DPPH自由基清除能力对比图。
图6为本发明实施例中使用含有双重二裂酵母发酵产物化妆品后脸部皱纹面积减少度对比图。
图7为本发明实施例中中使用含有双重二裂酵母发酵产物化妆品后脸部皱长度减少度对比图。
图8为本发明实施例中使用含有双重二裂酵母发酵产物化妆品后脸部皱纹数减少度对比图。
图9为本发明实施例中使用含有双重二裂酵母发酵产物化妆品后脸部皱纹深度减少量对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明双歧杆菌Rayting-B01Bifidobacteriumsp.Rayting-B01已于2021年4 月27日保藏于中典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCM2021470。
实施例1
耐环境有机污染物菌种的筛选：
菌种从健康长寿老人肠道内筛选得到共10株双歧杆菌，编号为 Rayting-B01、02、03、04、05、06、07、08、09、10。
所得菌种采用MRS培养基增殖培养，培养条件为：37℃，厌氧培养箱中培养，培养至对数生长期12h，按照1*10^7cfu/ml接种量接种至含有0、100、200、300、400mg/L甲苯的MRS培养基96孔细胞培养板中培养24h，每隔3h 取出，用酶标仪测定菌体OD600。
菌体在24h后OD600如表1。
表1
从表1中选取具有明显甲苯耐受的双歧杆菌Rayting-B01、05、08、10作为后续筛选的目标菌种。
实施例2
耐氧胁迫机制菌种的筛选：
将耐溶剂菌株双歧杆菌Rayting-B01、05、08、10在MRS培养基中厌氧培养至对数生长期，接种至3L厌氧发酵罐中厌氧条件下发酵。
发酵培养基为双歧杆菌发酵培养基为(g/L)：蛋白胨10，葡萄糖20，酵母浸粉10，可溶性淀粉2，氯化钠5，吐温800.1，pH7.0，121℃灭菌20分钟备用。
接种量按照发酵罐装液量的2％，接种进发酵罐开始厌氧发酵。过程检测菌种OD600，当到对数生长期时，开始进行厌氧-好氧交替法通氧气诱导发酵，通气方式为：每隔4h通气使得发酵罐内溶解氧(DO)维持在5％-10％，保持 1h，随后通入氮气使得DO降为0，并氮气保压发酵；
如此交替发酵至24h，中间每隔3h取样测定菌体OD600。
表2
4株菌发酵物采用冰浴超声破壁，得到产物分别测定其在不同条件下的超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、过氧化氢酶(CAT)酶活性、谷胱甘肽转移酶 (GST)酶活性、总抗氧化力(T-AOC)。采用试剂盒进行测定.
其中，
超氧化物歧化酶(SOD)酶活定义为：在25℃条件下，每毫升0.1mM的邻苯三酚中反应液自氧化速率抑制50％的酶量定义为一个单位
过氧化氢酶(CAT)酶活定义为：在25℃、pH7.0条件下，每分钟裂解1 μM过氧化氢的酶量定义为一个酶活单位。
谷胱甘肽转移酶(GST)定义为：在37℃条件下，每分钟降解1μM谷胱甘肽的酶量定义为一个酶活单位。
总抗氧化力(T-AOC)定义为：在37℃，每分钟每毫升样品使反应体系的吸光度每增加0.01，为一个抗氧化能力单位。
测定结果见图1～4。
可以看出经过厌氧-好氧交替法刺激后，双歧杆菌Rayting-B01表现出优越的抗氧化性能，其SOD、CAT、GST酶活力分别较正常培养条件提升了3.1倍、 3.39倍、9.58倍，T-AOC提升了4.09倍。
实施例3
双重二裂酵母发酵产物的制备
厌氧发酵培养基(g/L)：蛋白胨10，葡萄糖20，酵母浸粉10，可溶性淀粉2，氯化钠5，吐温800.1，pH7.0，121℃灭菌20分钟备用。
将双歧杆菌Rayting-B01在37℃厌氧条件下培养至对数生长期，按照发酵装液量2％接种量接种至装有2.5L发酵培养基的3L厌氧发酵罐中，开始厌氧发酵。
过程中用2MNaOH将pH维持在4.5～7.0之间，并每隔2h取样测定菌体 OD600。
当菌体生长达到对数生长期时，通入空气使得溶解氧(DO)在6％，并维持1h，随后通入氮气，使得DO降低至0，保压厌氧发酵3h后，再次进行通氧发酵，直至发酵液中葡萄糖被消耗完全，菌体OD600不再升高，则发酵结束。
发酵结束后，将发酵液温度降低至7℃，采用高压匀浆机破碎细胞(压力为1500Bar)，破碎过程温度控制在20～25℃，破碎5遍。
将破壁后的发酵液，采用陶瓷膜过滤(孔径为0.22～1μm)澄清，过滤过程控制温度不超过40℃。
所得清液即为双重二裂酵母发酵产物，富含多种氨基酸、寡糖和后生元物质。具有优异的清除DPPH自由基、羟自由基的效果，结果见图5。
可以看出，经过厌氧-好氧交替法发酵得到的二裂酵母发酵产物，其清除自由基能力得到有效增强，是正常发酵条件下的2～3倍。
实施例4
双重二裂酵母发酵产物的应用
双重二裂酵母在化妆品中的使用：
(1)双重二裂酵母抗衰护肤水，见表3。
表3
配方步骤：将各组分逐一加入水中并搅拌，混合直至均匀。
(2)双重二裂酵母修护霜，见表4。
表4
配方步骤：混合A相并搅拌，直至完全分散。将A相和B相分别加热至 80℃。将A相加入B相中，均质5分钟。一边搅拌一边冷却。预分散C相，在室温下加入AB相中。按照所述顺序加入D相。搅拌至均匀。
(3)双重二裂酵母抗衰护肤精华，见表5。
表5
配方步骤：预分散A相并搅拌，直至完全分散。将A相和B相分别加热至80℃-85℃。将C相加入B相，将A相加入BC相。均质化3分钟，然后一边搅拌一边冷却。在室温下按照所述顺序加入D相，搅拌直至均匀。用E相调节pH值直至6左右。
实验周期：30天
实验人数：20名
实验对象：20～30岁女性
实验材料：
A组——双重二裂酵母护肤水、双重二裂酵母抗衰精华、双重二裂酵母修护霜
B组——安慰剂。
试验方法：所有受试者分成两组，每天早晚各一次，在清洁皮肤后，使用相应的产品。
评估目标：脸部皱纹、皮肤光泽和肤色均匀度
脸部皱纹：面部图像分析仪VISIA-CR
实验结果：
从面部皱纹面积、皱纹长度、皱纹深度、皱纹数来判定；受试组涂抹了含有双重二裂酵母系列产品4周后，结果见图6～9，可以看出，面部眼角皱纹数、皱纹长度、皱纹深度皱纹面积明显减少；说明该方法所制备得的双重二裂酵母发酵产物，对人体抗衰祛皱具有良好的效果。与安慰剂组对比，使用了双重二裂酵母系列产品的抗衰数据之间，**P<0.001。
本发明涉及一种具有抗氧化功能的双歧杆菌Rayting-B01的筛选技术、发酵和后处理工艺及其应用，所述的双歧杆菌Rayting-B01已于2021年4月7日保藏于中典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCM2021470。
本发明的双歧杆菌Rayting-B01由环境有机污染物刺激、耐氧气刺激方法筛选得到，经过阶段通氧方法控制发酵工艺发酵，利用低温高压匀浆的方法破壁得到二裂酵母发酵产物和溶胞物两种体系，并命名为双重二裂酵母发酵产物，该产物能清除人体皮肤上自由基，保护人体皮肤不被氧化，对人体皮肤细胞氧化损伤起到一定的保护作用。
与现有技术相比，本发明经过特有的筛选技术，获得高活性双歧杆菌，采用低温循环破壁技术，在保证双歧杆菌破壁完全的前提下，有效保护了双歧杆菌中活性物不被破坏，所制得的双重二裂酵母发酵产物中，包含了二裂酵母发酵产物滤液和二裂酵母发酵产物溶胞物两种活性成分，与现有单一成分的二裂酵母系列化妆品原料相比，具有更加强大的抗氧化功能。
大多数双歧杆菌缺乏可以直接清除活性氧的酶类，当氧气存在时，双歧杆菌为抵抗氧毒害作用，会通过提高自身细胞膜的稳定性，增强氧化应激过程中相关蛋白的表达，提高在氧化、酸、胆盐等不利环境中耐受能力。双歧杆菌具有耐氧化胁迫机制，双歧杆菌可诱导氧化酶活性，包括谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。耐氧双歧杆菌中存在SOD 活性，SOD将O2-转化为H2O，进而增强细胞抗氧化能力，阻止超氧阴离子的形成。基于此，提供一种具有抗氧化功能的双重二裂酵母发酵产物化妆品原料的制备方法及其应用，通过耐PM2.5,、环境有机污染物、耐氧气筛选方法，筛选得到在微氧条件下也能生存，且具有很好的抗氧化功效的双歧杆菌，经过低温高压匀浆破碎细胞，得到发酵产物滤液和溶胞物滤液，极大程度的富集和保留了双歧杆菌发酵产物的活性成分。
目前，关于双歧杆菌耐氧胁迫研究中，多用加入氧化剂的策略来刺激双歧杆菌，尚未发现用有机污染物刺激双歧杆菌的抗氧化酶系表达来筛选抗氧化双歧杆菌的报道。双歧杆菌严格厌氧，氧化剂对其刺激性很强，有氧化剂存在的条件下，菌株很难存活，筛选困难。而用有机污染物刺激双歧杆菌，具有更好地可操作性，在微量的96孔板中即可进行刺激培养，可以使用高通量筛选设备进行实验；与直接用氧化剂刺激相比，筛选通量增大了上万倍，并且好控制、检测方便。另外，本发明筛选方法筛选得到的菌株，抗氧化活性高；在用有机溶剂初筛后，利用阶段通氧的筛选方法复筛，优选具有耐氧机制的双歧杆菌作为本发明的生产用菌，通过多重筛选策略结合，可得到稳定表达抗氧化物的双歧杆菌。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种双重二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于：包括，
将具有耐氧胁迫的双歧杆菌Rayting-B01接种到发酵培养基中厌氧发酵，发酵过程中，当菌种处于对数生长期以后，每隔3～4h向罐内通气，使得溶解氧保持在5～10％，诱导发酵2～3h；
然后通入氮气将溶解氧降低至0，继续厌氧发酵2～3h；
再次进行通氧发酵，溶解氧保持在5～10％，诱导发酵2～3h，再次厌氧-好氧发酵，直至发酵液中葡萄糖被消耗完全，菌体OD600不再升高；
发酵结束后，通过低温高压匀浆法制得破壁后的发酵液；
将破壁后的发酵液，采用陶瓷膜过滤澄清，过滤过程控制温度不超过40℃。所得清液即为双重二裂酵母发酵产物；
其中，所述的双歧杆菌Rayting-B01 Bifidobacterium sp.Rayting-B01已于2021年4月27日保藏于中典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2021470。
2.如权利要求1所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于：所述双歧杆菌Rayting-B01，其筛选方法包括，
通过PM2.5、环境有机污染物、氧化剂中的一种或几种物质刺激培养双歧杆菌，诱导抗氧化酶的表达，筛选得到双歧杆菌Rayting-B01。
3.如权利要求1所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于：所述发酵，其中，发酵培养基为：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，可溶性淀粉2g/L，氯化钠5g/L，吐温80 0.1g/L，pH 7.0；
通过121℃灭菌20分钟备用。
4.如权利要求1或2所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于：所述低温高压匀浆法，包括，
将发酵后的样品温度冷却至4～8℃，高压匀浆温度维持在30℃以下，高压匀浆5遍，制得破壁后的发酵液。
5.如权利要求4所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于：所述高压匀浆，其中，压力为900～1500Bar。
6.如权利要求1所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于：所述将具有耐氧胁迫的双歧杆菌Rayting-B01接种到发酵培养基中厌氧发酵，其中，接种量以质量比计为2～3％。
7.如权利要求1所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于：所述厌氧发酵，其中，发酵温度为37℃。
8.如权利要求1所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于：所述采用陶瓷膜过滤澄清，其中，陶瓷膜的孔径为0.22～1μm。
9.如权利要求1～8中任一所述双重二裂酵母发酵产物的制备方法制得的产品，其特征在于：所述产品包含双歧杆菌溶胞物和发酵产物滤液。
10.如权利要求8所述双重二裂酵母发酵产物产品在抗衰类化妆品配方中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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