KR102199934B1

KR102199934B1 - 황련해독탕의 김치유산균 발효물을 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102199934B1
Application number: KR1020190076213A
Authority: KR
Inventors: 홍성욱; 노성운; 이호재
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2021-01-08
Also published as: KR20210000927A

Abstract

본 발명은 신규 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 균주, 이를 이용한 황련해독탕 유산균 발효물, 이의 제조방법, 및 상기 황련해독탕 유산균 발효물을 포함하는 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 균주는 기존 락토바실러스 플랜타룸 보다 월등한 항균 및 항산화 활성을 가지며, 이를 이용한 황련해독탕 유산균 발효물의 경우 다른 생약재들과는 달리 항균 활성 및 항염증 효과가 우수하여 여드름과 같은 염증성 피부질환을 개선하는데 유용한 물질로 활용할 수 있다.

Description

황련해독탕의 김치유산균 발효물을 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic compositions containing Hwangryunhaedoktang fermented with Lactobacillus plantarum WiKim0111 for anti-acne}

본 발명은 항균 활성과 항산화 활성이 우수한 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 균주로 발효시킨 황련해독탕 유산균 발효물에 관한 것이다.

황련해독탕은 황금, 황련, 황백 및 치자 이렇게 네 가지 한방천연물을 배오하여 약재의 독성을 제거하면서 효능을 강화한 처방으로 예로부터 해열 및 소염작용이 있어 피부질환 치료에 널리 사용했다고 보고되어 있으며, 아토피성 피부염, 습진, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 꽃가루병 등에 효과적인 것으로 알려져 있다.

황련에는 베르브린(berberine)과 오레인(worenine) 같은 알칼로이드성 물질이 함유되어 해열, 진통, 진정, 국소마비, 혈압저하 및 담(痰)을 원활하게 해주는 작용이 있는 것으로 알려져 있다. 황금은 습사(濕邪)와 습열사(濕熱邪)를 제거하고 지혈 및 해독하는 효능을 가지고 있으며 바이칼린(baicalin)과 바이칼레인(baicalein)을 다량 함유하고 있어 항염증, 항알러지 및 알러지성 천식을 완화하는 것으로 알려져 있다. 황백은 펠로덴드린(phellodendrine)과 베르브린(berberine) 같은 알칼로이드와 오바쿨락톤(obaculactone) 및 오바쿠논(obacunone) 물질이 함유되어 있으며 해열 및 진통억제 효능이 보고되어 있다. 이와 같이 황련, 황금, 황백은 공통적으로 청열 해독의 기능을 가지므로 이들을 혼합하면 효과가 더 증가될 뿐 아니라 천연 방부효과도 있는 것으로 알려져 있다.

치자는 소염, 해열, 이뇨, 지혈, 진정, 이담, 혈압강하제로 사용되어 왔으며 치자의 황금색 색소는 식용 및 염료로도 사용되어 왔다. 치자는 카로테노이드(carotenoid) 계열 중 크로세틴(crocetin)에 다양한 당이 결합한 배당체 형태로 구성되어 있으며, 크로세틴 디엔티오비오사이드 (crocetin digentiobioside)인 크로신(crocin)이 주성분으로 보고되어 있다. 치자 추출물은 피부 미백, 모노아민 옥시다아제(monoamine oxidase(MAO)) 저해 및 항염증 효과가 있는 것으로 보고되어 있다.

여드름은 모낭 피지선에 발생하는 만성 염증성 피부질환으로 사춘기 이후부터 성인에 이르기까지 호르몬, 환경 공해, 스트레스, 식습관으로 인해 과다한 피지 생성과 피지의 산화, 여드름균인 쿠티박테리움 아크네(Cutibacterium acne)의 증식과 각질화와 염증이 발생하는데, 락토바실러스 플란타룸 김치유산균으로 발효한 황련해독탕 발효물이 여드름과 같은 염증성 피부질환 화장료 소재로서 항산화 활성, 항균활성 및 항염증 활성에 있어서 효과적인 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 수탁번호 KACC 92265P의 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (Lactobacillus plantarum WiKim0111) 균주로 발효시킨 황련해독탕 유산균 발효물, 이의 제조방법 및 황련해독탕 유산균 발효물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KACC 92265P의 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 균주로 발효시킨 황련해독탕 유산균 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (KACC 92265P) 균주로 발효시킨 황련해독탕 유산균 발효물 및 상기 황련해독탕 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 황련해독탕을 멸균 후, 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (KACC 92265P), 이의 파쇄물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 황련해독탕 유산균 발효물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 구성을 상세하게 설명한다.

본 발명은 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (Lactobacillus plantarum WiKim0111) (KACC 92265P) 균주에 관한 것이다.

본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (KACC 92265P) 균주는 김치 유래의 락토바실러스 플랜타룸 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 균주를 김치에서 분리, 동정하기는 하였으나, 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예를 통해 김치로부터 분리한 항산화 활성이 우수한 유산균 균주를 미생물 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석한 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 상기 핵산서열은 NCBI GenBank(http://www.ncbi.nin.gov)에서 제공하는 블라스트 서치 프로그램(blast search program)을 통해 상동성(homology)을 확인해 본 결과, 락토바실러스 플랜타룸 표준균주 JCM1149 와 98% 동일함을 확인하였다.

따라서, SEQ ID NO: 1의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (Lactobacillus plantarum WiKim0111)로 명명하였으며, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2019년 6월 13일자로 기탁하였다(수탁번호 KACC 92265P).

본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111은 그람양성균이며, 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이고, 간균의 형태를 취하고 있다. 또한, 쿠티박테리움 아크네(Cutibacterium acne)에 대한 항균 활성이 우수한 김치유산균들에 비해 항산화 및 항균활성이 동시에 우수한 것을 확인하였다.

본 발명은 또한, 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (KACC 92265P) 균주로 발효시킨 황련해독탕 유산균 발효물 및 상기 황련해독탕 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (KACC 92265P) 균주는 김치로부터 유래된 것일 수 있다.

또한, 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (KACC 92265P) 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 포함할 수 있다.

상기 발효는 미생물(예, 유산균)이 가지고 있는 효능을 이용하여 유기물을 분해시키는 과정을 말한다. 발효와 부패는 비슷한 과정에 의해 진행되지만 분해 결과 우리의 생활에 유용하게 사용되는 물질이 만들어지면 발효라고 하고, 악취가 나거나 유해한 물질이 만들어지면 부패라고 한다. 따라서, 생약재를 미생물을 이용하여 발효시키면 한약재의 독성이 감소되거나, 저분자화되어 소화가 용이하거나, 피부에 도포시 경피 흡수 등이 용이하게 되어 생체 이용률이 향상된다. 또한, 천연성분들은 그 자체로도 약리 작용을 나타낼 수 있지만, 발효를 통해 약리효과가 더욱 강화되거나 미생물의 대사에 의해 기존 발효 전의 한약재에 없던 약리 작용을 발휘할 수 있다.

본 발명에 따른 황련해독탕 유산균 발효물은 항산화 활성과 항균 활성이 우수하며, 또한, 대조군에 비해 RAW264.7 세포에서 LPS 자극에 의해 증가된 염증 매개물인 Nitric oxide(NO), 사이토카인(cytokine)을 유의적으로 억제시키는 효과를 확인하였다.

특히, 발효 전의 황련해독탕의 경우 항균 활성을 확인할 수 없었지만, 김치유산균 WiKim0111 (KACC 92265P)로 발효한 황련해독탕 유산균 발효물은 항균활성이 확인되어 김치유산균 발효에 의해 항균물질이 생성된 것으로 사료되었다. 또한 항산화 및 항염 효과가 탁월하여, 여드름과 같은 염증성 피부질환을 개선하는데 유용한 화장품 소재로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 황련해독탕을 멸균 후, 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (KACC 92265P)을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 황련해독탕 유산균 발효물의 제조방법을 포함한다.

황련해독탕에 유산균을 접종시켜 발효 시 온도는 유산균 생육에 적절한 온도이면 특별히 한정하지 않으나, 40℃ 이하에서, 바람직하게는 10 내지 35℃에서 실시한다. 또한, 36시간 내지 48시간 실시한다.

또한, 추가로 상기 황련해독탕을 유산균 접종 전에 멸균시킬 수 있다.

본 발명의 황련해독탕 발효에 사용되는 유산균은 항산화 활성과 항균활성이 우수한 김치 유래 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (KACC 92265P)을 사용함으로써 항산화 및 항균 활성이 나타나 여드름 예방 또는 개선용 화장료 소재로 사용될 수 있다. 유산균은 초기 유산균 농도가 10⁵ 내지 10⁷ CFU/ml이 되도록 접종한다.

상기 발효 과정을 통해 제조된 황련해독탕 유산균 발효물은 배양물 그 자체 또는 배양 상등액일 수 있으며, 화장품 소재로 사용 시 장기간 보존을 위해 멸균 과정을 거쳐 4℃에서 냉장보관 할 수 있다.

본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 균주는 기존 김치유산균들에 비해 월등한 항균 효과를 가지며, 특히 다른 생약재들과 달리 유독 황련해독탕 발효에 사용 시 우수한 항균, 항산화 및 항염 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 여드름 예방 또는 개선에 탁월한 효과를 갖는 화장품 소재로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1a는 1차 선발을 위한 여러 김치 분리 유산균의 항균 활성을 조사한 결과이다.
도 1b는 김치 분리 유산균들의 항산화 활성 그래프를 나타낸 것으로, 항산화 우수 균주를 최종 선발하였다.
도 2는 분리 유산균의 16S rRNA 유전자 시퀀싱 미생물 동정 결과이다.
도 3은 김치유산균 WiKim0111 발효 황련해독탕의 항균 활성 결과이다.
도 4a는 김치유산균 WiKim0111 발효 황련해독탕의 항산화 활성 측정법 중 ABTS 항산화 측정법 결과이다.
도 4b는 김치유산균 WiKim0111 발효 황련해독탕의 항산화 활성 측정법 중 DPPH 항산화 측정법 결과이다.
도 5a는 김치유산균 WiKim0111 발효 황련해독탕의 항염증 활성 측정법 중 Nitric oxide 항염증 측정법 결과이다.
도 5b는 김치유산균 WiKim0111 발효 황련해독탕의 항염증 활성 측정법 중 IL-1β 항염증 측정법 결과이다.
도 5c는 김치유산균 WiKim0111 발효 황련해독탕의 항염증 활성 측정법 중 IL-6 항염증 측정법 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 유산균 선발

다양한 김치로부터 분리한 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 락토바실러스(Lactobacillus) 속 300종에 대한 배양상등액의 쿠티박테리움 아크네(Cutibacterium acne)에 대한 항균 활성을 측정한 결과, 항균활성이 우수한 30균주를 1차 선발하였고, 동일한 방법으로 2차 반복 실험을 수행하여, 9균주를 선발하였다(도 1a).

Cutibacterium acne에 대한 항균 활성이 우수한 김치유산균 9종에 대한 배양상등액의 항산화 활성(superoxide dismutase)을 측정한 결과, 항산화 활성이 우수한 4균주(WiKim0111, J7, PK2, CM2)를 선발하였다. 항균활성과 항산화 활성이 동시에 우수한 김치유산균 WiKim0111을 황련해독탕 발효를 위해 최종적으로 선발하였다(도 1b).

본 실험에 사용한 미생물은 배추김치에서 분리한 항균활성 및 항산화 활성이 우수한 WiKim0111 김치유산균의 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 미생물 동정한 결과, 락토바실러스 플랜타룸 (Lactobacillus plantarum) 표준균주 JCM1149와 98% 동일함을 확인하였고 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (Lactobacillus plantarum WiKim0111)로 명명하였다(도 2).

실시예 2: 항산화 활성 측정

황련해독탕 발효는 분쇄한 황금, 황련, 황백, 치자 혼합물(2%)과 효모 추출물(0.5%)를 혼합하여 121℃에서 2시간동안 열처리한 후, 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (Lactobacillus plantarum WiKim0111) 10⁷ CFU/ml를 접종(0.5%)하고 30℃에서 36시간동안 발효하였다. 배양상등액을 취해 동결건조한 후, 항균활성, 항산화활성 및 항염증 활성을 조사하였다.

피부질환에 효과가 있는 황련해독탕과 같은 한방 천연물을 항산화 및 항균 활성이 우수한 김치유산균인 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 (Lactobacillus plantarum WiKim0111)로 발효하여 여드름 원인균인 쿠티박테리움 아크네(Cutibacterium acne)에 대한 항균활성을 비교·확인한 결과, 발효 황련해독탕 100 μg/ml 농도이상에서 생육저지대가 확인되었다. 황련해독탕에서는 항균활성을 확인할 수 없는 것으로 보아 김치유산균의 발효에 의하여 항균물질이 생성된 것을 사료되었다(도 3).

황련해독탕의 항산화 활성은 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid); ABTS 분석, 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl; DPPH 분석을 통해 측정하였는데, 황련해독탕 저농도(6.25-25 μg/ml)에서 ABTS와 DPPH 항산화 활성측정 결과, 김치유산균 WiKim0111 발효시 5-15% 이상 항산화 활성이 더 증가하였으며, 황련해독탕 고농도(50-400 μg/ml)에서는 발효 황련해독탕과 비발효 황련해독탕 간에 유의차가 거의 없었으나, DPPH 항산화 활성 측정시 농도비례적으로 발효 황련해독탕의 항산화 활성도 조금씩 증가하는 경향을 확인하였다(도 4a, 4b).

실시예 3: 항염증 활성 측정

한국세포주은행으로부터 분양받은 대식세포주 RAW264.7 cell (Murine macrophage cell line)을 배양한 96-well plate에 10% MTS solution이 함유된 DMEM medium를 well당 100㎕씩 넣어주고 3시간동안 배양한 후, ELISA microplate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 cell viability를 측정한 결과, 김치유산균 WiKim0111 발효 황련해독탕 농도(25-400 μg/ml)에서 89.2-99.9% 세포 생존율을 나타내었고, 비발효 황련해독탕(25-400 μg/ml)도 88.7-101.9% 세포 생존율을 나타내어 모두 RAW264.7 cell에 대하여 유의적인 독성반응을 나타내지 않는 것으로 확인하였다.

항염증 활성은 RAW264.7 세포 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess reagent system을 이용하여 측정하였고, 배양액에 함유된 nitric oxide 소거능을 ELISA kit을 이용하여 측정하였다. LPS(10 ㎍/mL)를 이용하여 RAW264.7 세포의 NO 생성에 대한 발효 황련해독탕과 비발효 황련해독탕(대조군)의 효과를 측정한 결과, LPS를 처리한 군에서 NO 농도는 농도 의존적으로 NO 생성이 억제되는 것을 확인하였고, 400 ㎍/ml농도에서 발효 황련해독탕이 대조군보다 항염증 효과(5.7 μM)가 더 우수한 것으로 확인하였다(도 5a).

배양액에 분비된 염증성 사이토카인(cytokine) 발현량을 측정하기 위하여 Quantikine® ELISA kit를 이용하여 측정하였으며, 측정한 사이토카인(cytokine)으로는 interleukin-1β(IL-1β), interleukin-6(IL-6)를 확인하였고 RAW264.7 세포주에 시료를 10 ㎕ 처리한 후에 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간동안 배양하였다.

IL-1β의 경우, 200 μg/ml 농도에서 처리시 IL-1β 발현량 감소 효과를 확인한 결과, 발효 황련해독탕이 대조군에 비해 IL-1β 발현량(17.2pg/ml)에서 더 감소한 효과가 확인되었고 IL-6의 경우, 400 μg/ml 농도에서 처리시 발효 황련해독탕의 IL-6 발현량(623.4 pg/ml)에서 더 감소한 효과(2.4배)가 확인되어 항염증 효과가 대조군에 비해 더 우수한 것으로 확인하였다(도 5b, 5c).

본 발명은, 김치로부터 분리한 항균 활성이 우수한 새로운 균주인 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111(Lactobacillus plantarum WiKim0111)은 황련해독탕을 발효하였을때 여드름 원인균에 대한 항균 효과가 생성되었으며, 비발효 황련해독탕 대조군 보다 항산화 및 항균 활성과 RAW264.7 세포에서 LPS 자극에 의해 증가된 NO 등 염증매개물을 유의적으로 억제시키는 효과가 증가되는 우수한 결과를 확인하였다.

국립농업과학원 농업유전자원센터(국내)

1390860KACC92265P

20190613

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Lactobacillus plantarum WiKim0111 <130> P19R10C0380 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1435 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus plantarum WiKim0111 <220> <221> gene <222> (1)..(1435) <400> 1 gcagtcgaac gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt 60 ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa 120 cagatgctaa taccgcataa caacttggac cgcatggtcc gagcttgaaa gatggcttcg 180 gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca 240 tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc 300 ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga 360 gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac 420 atatctgaga gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta 480 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa 540 agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg 600 catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg 660 aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga 720 cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccataccgt 780 aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta 840 agcattccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900 gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt 960 gacatactat gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt 1020 gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080 ccttattatc agttgccagc attaagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc 1140 ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200 ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaac tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca 1260 ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320 cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380 tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg gtaacctttt aggaaccagc cgcct 1435

Claims

수탁번호 KACC 92265P의 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 균주로 발효시킨 황련해독탕 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0111 균주는
SEQ ID NO: 1로 표시되는 16S rRNA를 포함하는 것인, 여드름 개선용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 황련해독탕 유산균 발효물은, 항균 활성을 가지는 것인 여드름 개선용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 황련해독탕 유산균 발효물은, 항산화 활성을 가지는 것인 여드름 개선용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 황련해독탕 유산균 발효물은, 항염증 활성을 가지는 것인 여드름 개선용 화장료 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 황련해독탕 유산균 발효물은, 쿠티박테리움 아크네(Cutibacterium acne)에 대하여 항균 활성을 가지는 것인 여드름 개선용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 파우더, 파운데이션, 비누 또는 세정제의 제형인 여드름 개선용 화장료 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 비누 또는 세정제의 제형인 여드름 개선용 화장료 조성물.
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