KR20160121632A

KR20160121632A - 효모 발효 허브 복합체을 이용하여 항산화 효과가 우수하고 저자극인 추출물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20160121632A
Application number: KR1020150050084A
Authority: KR
Inventors: 주진영
Original assignee: 스마일뷰티시스템즈(주)
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2015-04-09
Publication date: 2016-10-20

Abstract

본 발명에서는 화장품 원료로서 안전성과 다양한 기능을 가지는 항산화 효과를 높이기 위해 기존에 안티에이징 및 항염, 디톡스 기능의 허브로 알려진 에델바이스,브델리아, 타임의 전초를 이용하여 이를 에탄올과 물의 혼합용매로 추출하고 다시 이를 이스트 발효하여 총폴리페놀과, 총플라보노이드의 함량을 높이고 또한 세포독성을 낮추어 안전성을 개선시킨 추출물에 관한 것이다.

Description

효모 발효 허브 복합체을 이용하여 항산화 효과가 우수하고 저자극인 추출물의 제조 방법{Manufacturing Method of Fermented Herb Complex Extract for Anti-Oxidant And Low Skin-Irritation}

본 발명은 효모 발효된 에델바이스, 브델리아, 타임의 전초를 이용하여 피부자극 완화용 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 피부의 자극을 유발하는 물질은 일상생활 속에서 많이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 피부와 관련 된 제품은 자극이나 염증, 알레르기를 유발할 수 있는 물질을 함유하고 있는 경우도 많다. 또한 개인위생관리 및 피부 관리제품을 사용하는 사람 중 10% 이상이 피부에 대한 부작용을 호소하고 있으며, 1990년대 미국에서는 소비자를 대상으로 조사한 결과 50% 이상이 자신을 민감성 피부라고 생각하고 있는 것으로 나타났다. 더군다나, 최근의 화장품은 피부에 실질적인 효과를 줄 수 있는 기능성화장품(Cosmeceutical)에 치중하는 동향이어서 화장품 등의 개인관리 제품의 사용으로 인한 피부 부작용은 점점 증가할 것으로 보여진다.

이처럼 민감성 피부라고 느끼고 있는 비율이 증가하고 있는 요인은 UV, 흡연, 공해물질, 중금속 등의 물리, 화학적인 물질 및 외부환경 생활공간의 건조화, 개인의 알레르기 체질, 스트레스 등이 거론되고 있다. 이러한 물리, 화학적인 외부환경에 의해 세포 내 작용에 이상을 초래하거나 활성산소의 생성이 방어계의 용량을 초과할 정도로 과 생성될 경우 산화 스트레스가 야기되며, 피부 자극발생 및 노화를 촉진시키게 된다. 또한 화장품을 만들기 위해서는 다양한 원료들이 사용되며 통상적으로 20 종에서 50 여종까지의 원료를 사용하게 된다. 이들

원료들은 피부 자극 검사를 통하여 그 안전성이 입증되었으나 제품에 적용됨으로써 피부에 염증, 가려움증 및 알레르기 등의 자극을 일으킬 수도 있다. 이러한 반응들이 모든 사람에게 일어나는 것은 아니며, 특정인에게만 일어날 수도 있다.

이러한 요인으로 인하여 피부 자극이 가중되고 이는 피부의 염증 반응으로 나타나거나 알러지성 또는 아토피성 피부의 형태로 나타난다. 염증은 본래 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화하고 손상부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어목적으로 나타나는 것이며, 통증, 부종, 발적, 발열 등을 일으켜 기능 장애가 일어나게 된다. 이러한 염증은 일반적인 상태에서는 초기 상태가 지난 후 정상으로 돌아오나, 염증을 자극하는 자극제가 없어지지 않거나, 계속 염증 반응이 생기게 되면 세포손상 등 여러 가지 부작용이 생기게

된다. 항염증제에는 다양한 물질이 있으나, 피부 안전성 면에서나 화장료 배합시 안정성 면에서 부작용이 없는 항염 물질이 중요하다. 한편으로 최근 소비자의 지향이 자연 친화적 및 저자극으로 이행되고 있는 것도 민감성 피부에 대한 의식을 향상시키는 요인이 되고 있는 것으로 추측되고 있다. 따라서 화장품의 자극을 완화시켜 주는 물질에 대한 관심이 높아지고 있다. 이에 자외선 및 다양한 피부 자극위험 요인으로부터 피부를 보호해 줄 수 있는 자극완화원료의 중요성이 점점 높아져, 안전하고 효과가 우수한 천연물 유래의 자극완화소재 및 화장품 개발이 증가 되고 있다.

한편, 허브로서 에델바이스, 브델리아, 타임은 예로부터 피부자극을 완화하고 피부를 개선시키는 원료로서 고대 스위스 지방과 유럽을 중심으로 많이 활용되어져 왔다. 에델바이스 추출물은 스위스의 높은 고산 지역에서 자생 하기 때문에 잦은 온도 변화와 강한 자외선 등 거친 환경적 요소에 대항하여 유효한 보호 성분을 많이 포함. 항산화, 항염 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 브델리아는 DNA 보호 및 항산화효과 우수, 상처치유효과가 우수하고 타임은 오존으로부터 피부보호 및 스트레스 감소시키는 역할이 있는 것으로 알려져 왔다. 이 허브들은 모두 스위스의 고산지역에서 주로 서식하는 식물들로서 이 지역의 엄한 환경으로 살아남기 위해 생체 내에 다양한 2차 대사산물을 만들어 냈는데 이것들은 플라보노이드류와, 폴리페놀류등으로 구분되어 질 수 있다. 특별히 이들 식물에서의 항산화 물질은 다양한 피부자극을 일으키는 유해 인자로부터 보호하기 위한 항산화 물질과 피부 보호물질로 추정되어 질 수 있다.

그러나 최근에는 이를 발효처리등의 바이오컨버젼 기술을 이용하여 그 효능을 극대화 시키는 방법들이 요구되어 진다. 즉, 발효라 함은 Bio Conversion 기술을 일컬을 수 있다 즉 사용하는 미생물에 따라 그 대사 산물이 달라지게 되고 그 대사산물을 이용하는 것이다.

포괄적 의미로 미생물이나 균류 등을 이용해 유용한 물질을 얻어 내는 과정을 말하며, 좁은 의미로 산소를 사용하지 않고 에너지를 얻는 당분해 과정을 말한다.

생화학적 의미 : 유기화합물이 전자 공여체 및 전자 수용체로 이용되는 혐기적 에너지 생산과정

산업적 의미 : 미생물, 동, 식물의 대량 배양에 의해 인류복지에 필요한 물질을 생산하는 과정으로 부패와 구별된다.

발효의 종류는 크게 젓산발효, 에탄올 발효, 초산발효, 3가지로 나뉜다.

- 젖산 발효

젖산균이 산소가 없는 상태에서 포도당을 분해하여 젖산을 생성하는 반응

- 에탄올 발효

미생물(효모, 세균등)이 혐기적으로 당류를 에탄올로 변환시키는 일, 즉 미생물에 의한 탄수 화물의 무효소적 분해의 일종으로 당 또는 다당류에서 최종적으로 에탄올과 이산화 탄소를 생성

- 초산 발효

알코올이 산화되면서 초산을 만드는 반응(다량의 공기 필요)

발효의 장점은 다음과 같다.

1. 분자 구조가 작아진다.

: 피부에 흡수될 정도로 분자 구조가 작아짐에 따라 흡수성이 증대된다.

2. 영양성분이 증가한다.

: 발효에 따른 새로운 유기물 생성이 생성됨에 따라 더 유용 해진다 예) 우유와 요구르트, 포도즙과

포도주, 인삼과 홍삼 , 식초, 젓갈 등

3. 피부에 좋은 신물질이 생성된다.

: 미생물이 먹고 배설한 대사산물(아미노산류, 비타민류, 각 종 기능성 물질 생성)은 피부가 98%이

상 흡수하는 최상의 물질이다.

4. 보존이 용이하다, 영양성분이 깨지지 않는다.

: 발효물은 열과 이산화탄소에 강하고, 된장, 간장, 젓갈 등 발효제품은 상하지 않는다. 즉, 보존성과

안전성이 증가한다.

5. 발효물은 각종 독성을 해독한다/부작용이 없다.

: 발효라는 전처리 과정을 통해 독성이 완화된다.

6. 피부흡수율이 높아진다.

: 발림성. 퍼짐성. 밀착성. 흡수성이 뛰어나다.

본 발명은 효모 발효된 에델바이스, 브델리아, 타임의 전초 추출물을 이용하여 피부 자극 완화시켜 보다 안전한 화장품을 제공하는 방법에 관한 것이다.

천연물이 지니고 있는 유용성 물질의 구조는 피부에 직접적으로 흡수 되는 데 있어 한계를 지니게 된다. 피부에 있는 모공은 3 만-5 만 nm의 엷은 막으로 구성되어 있다. 피부의 해부학적 구조는 피부 겉면으로부터 표피, 진피, 피하조직으로 구분되며 각각의 두께는 표피 0.07-2 nm, 진피 0.3-3 nm, 피하 조직의 두께는 피하지방의 양에 의해 결정된다. 다시 표피는 5개 층으로 이루어져 있는데 각 피부 층의 사이에는 200nm 라는 아주 미세한 층으로 이루어져 있다. 이 피부 층보다 작은 입자와 모공을 통과할 수 있는 물질이 혼합되어 있지 않고는 모공을 통과할 수 없고 영양분이 침투하여 세포에 작용할 수 없다. 따라서 본 발명에서는 발효를 이용하여 이를 해결하려 하였다.

발효라 함은 Bio Conversion 기술을 일컬을 수 있다 즉 사용하는 미생물에 따라 그 대사 산물이 달라지게 되고 그 대사산물을 이용하는 것이다. 포괄적 의미로 미생물이나 균류 등을 이용해 유용한 물질을 얻어 내는 과정을 말하며, 좁은 의미로 산소를 사용하지 않고 에너지를 얻는 당분해 과정을 말한다. 또한 생화학적 의미로서의 발효는 유기화합물이 전자 공여체 및 전자 수용체로 이용되는 혐기적 에너지 생산과정이며, 산업적 의미는 미생물, 동, 식물의 대량 배양에 의해 인류복지에 필요한 물질을 생산하는 과정으로 부패와 구별된다.

< 사용균주 >

(1) Sacharomyces Cerevisiae

효모는 진핵미생물(핵과 세포질이 핵막에 의하여 나누어져 있는 생물)에 속하며 세포벽, 세포막, 핵, 사립체, 과립 등 세포 소기관을 갖추고 있다.

성의 구별이 없는 이들은 주로 budding(출아법)으로 번식하는데, 분리된 많은 효모들 중에는 발효능이 없는 것, budding 대신 fission(분열) 혹은 bud-fission 방법으로 증식하는 것, ascospore(자낭포자)가 아닌 ballistospore를 형성하거나 spore(포자)형성이 관찰되지 않는 것 등 다양한 그룹의 효모도 존재한다

크기는 보통 5∼10×5∼12㎛로 세균의 5∼10배 크기이며, 적정 pH는 4.5∼5.5이나 1∼10에서도 생존한다. (pH1에서 12시간 생존) 효모는 박테리아보다 산에 강하므로 배지의 pH를 3.5~3.8 정도로 맞추면 박테리아의 오염을 어느 정도 억제할 수 있다.

일반적으로 효모는 다른 미생물과 같이 성장에 있어서 탄소원과 에너지원, 무기 및 유기 질소원, 각종 미네랄 및 비타민을 필요로 한다. 효모 탄소원으로는 포도당(glucose), 갈락토스(galactose), 말토스(maltose), 자당(sucrose), 락토스(lactose) 등을 사용하며 질소원으로는 다양한 종류가 알려 졌는데 보통 요소(urea), 암모늄 이온(ammonium ion), 아미노산(amino acid) 는 효모에 의해 쉽게 이용되는 질소원으로 알려져 있다. 효모가 필요로 하는 비타민 중 메소-이노시톨(meso-inositol)을 제외한 모든 비타민은 조효소(coenzyme)의 일부로서 촉매작용(catalytic function)을 수행한다.

Saccharomyces cerevisiae로 분류되는 효모는 맥주 또는 포도주 발효 효모로 광범위하게 이용되고 있다.

본 발명에서 에델바이스, 브델리아, 타임의 전초를 1차로 에탄올과 정제수의 혼합용매로 추출하고 2차로 발효하여 추출물을 제조할 경우 항산화활성을 증가시키고 세포독성을 낮출 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1 : 에델바이스, 브델리아, 타임 혼합 발효 추출물제조

에델바이스, 브델리아, 타임은 대한민국 경기도 용인 및 인근 지역의 화초 재배상에서 구매한 것이며, 별도 언급이 없는 한 용매 등은 대정화학(대한민국), 삼광화학(대한민국)에서 구입한 것이다.

에델바이스 30 g 및 브델리아 30 g을 타임 30 g 혼합한 혼합물 60 g을 삼베포에 담아 70% 에탄올 2 Kg에 담고 1주일간 방치한 후 1㎛ 필터 여과장치로 여과를 실시하고 그 여액을 1.8 kg을 얻었다. 이를 감압 농축기를 이용하여 에탄올을 제거 하여 540g을 얻었고 여기에 Sacharomyces Cerevisiae(Angel Yeast(BINZHOU) Co.,LTD)를 10 g 투입하여 25도에서 1주일간 현탁 발효하였다. 이 후 0.2 ㎛ 필터 여과장치로 여과를 실시하고 그 여액을 530 g을 얻었다.

비교예 1 : 에델바이스, 브델리아, 타임 혼합 추출물제조

에델바이스 30 g

*다양한 추출용매를 이용한 부용 및 뚝갈의 혼합 추출물 제조

하기 표 1의 용매로 하여 혼합 추출물을 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

	용매	수득량
비교예??	물	1.8 kg
비교예??	에탄올????	0.1 kg
비교예??	Butylene Glycol 30%	1.8 kg
비교예??	Propylene Glycol 30%	1.8 kg

실험예 1 : 세포 무독성 및 세포증식 촉진 효과 확인

비교예 1, 2, 3, 4, 5 에 대하여 세포 독성 효과를 측정하여 그 결과를 추출 조건설정에 근거로 사용하였다.

시료를 농도별 각각 0.01, 0.1, 1.0 %(W/V) 로 준비 하였고, 먼저 tyrosinase 활성 억제 실험을 통해, 효과가 확인된 추출방법을 통한 죽여 추출물을 선정하였다. 선택된 추출물의 용매를 제거 한 후, dimethyl sulfoxide (DMSO)로 농도별로 희석 하여 sample을 만들었다. B16F1 cell을 well당 5×10³개 96 well plate에 접종하고 24시간 배양 한 후, 각 sample이 포함된 배지로 갈아주어 3일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배지를 제거하고 dulbecco’s phosphate buffered saline (D-PBS)로 2회 세척한 다음 2 mg/mL thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) solution 50 μL씩 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 incubation 하였다. MTT solution을 제거하고 (D-PBS)로 세척한 다음, 생성된 formazan crystal에 DMSO를 200 μL씩 넣어 용해시키고 분광광도계를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

MTT Assay 흡광도

	Experimental (O.D 595)
	0.01	0.1	1
Control	1.231	1.361	1.253
실시예 1	1.198	1.331	1.221
비교예 1	0.964	1.001	0.812
비교예 2	1.002	1.127	0.996
비교예 3	0.987	1.001	0.878
비교예 4	0.934	1.011	0.774
비교예 5	0.967	0.999	0.862

Cell Viability(%)

	Control을 100%로 할때 O.D 데이터 값의 % 비율
	0.01	0.1	1
Control	100.000	100.000	100.000
실시예 1	97.319	97.796	97.446
비교예 1	78.310	73.549	64.804
비교예 2	81.397	82.807	79.489
비교예 3	80.179	73.549	70.072
비교예 4	75.873	74.284	61.772
비교예 5	78.554	73.402	68.795

< 총페놀 함량 측정>

페놀성 화합물의 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용하는 법- 0.1%(w/v) 시료 용액 0.5 ml에 Folin-ciocalteu's phenol reagent 2.5 ml를 첨가하여 잘 혼합하고 5분간 실온에서 방치한다. 정확히 5분 반응시킨 후, 7.5% Na₂CO₃ 2 ml를. 가하여 혼합하고 50oC에서 5분간 발색시킨 후 760 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였다. 이 때 페놀성 화합물의 함량은 tannic acid를 0-500 ?g/ml 농도로 하여 시료와 동일한 방법으로 측정한 표준곡선으로부터 계산한다.

< 총플라보노이드 함량 측정>

총플라보노이드 함량은 에탄올 추출액 1ml와 diethyleneglycol 2ml, 1N-NaOH 20㎕를 가한 다음 37? 항온수조에서 1시간 동안 방치한 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 Rutin를 이용한 표준곡선은 0,10, 20, 40, 60ppm이 되도록 작성하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

* 시료 중 총 플라보노이드 함량 계산식(검량선 Y= aX + b)

X : 분광법으로 측정한 흡광도

Y : 분광광도계로 주입된 표준용액의 농도(ppm, ㎍/ml)

- 시료 중 총 플라보노이드 함량(㎍/g) = Y'×V/S

Y' : 표준물질로 구한 검량선에 대입하여 얻은 Y값 (ppm)

V : 추출용매(70% 에탄올)의 총 부피(ml), S : 추출 시료의 무게(g)

< 항산화 활성 측정법( DPPH 법)>

물질(주로 천연물)의 전자공여능 측정을 통한 항산화능 평가하는 것으로 구체적으로는 추출물의 전자공여능을 DPPH의 Free Radical Scavenging Activity를 이용하여 측정한다.

DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazoyl)는 Free radical을 가지는 분자량 394.32의 검보라색 고형 물질이다. DPPH는 MeOH에 녹이 보랏빛을 띄며 이때 517nm 파장의 UV에서 최대 흡광도를 가진다. 항산화제 즉, 추출물이 공여하는 전자에 의해 DPPH의 free radical이 소거되면 DPPH는 보랏빛을 잃고 연노란색으로 변하게 된다. 따라서 517nm의 파장으로 흡광도를 조사하며 흡광도의 변화를 보면 추출물의 DPPH free radical 소거능력 정도를 알 수 있다.

(1) 시약의 준비

0.15 mM DPPH in Ethanol

MW of DPPH = 394.3

0.15 × 10^-3 × 394.3 g/l = 0.059 g/l

0.0059 g/100ml 또는 0.00295 g/50ml

(2) 추출물 준비

수용성 추출물을 Ethanol로 50%로 녹여 준비한다.(만약 현탁이 된다면 더 희석배수를 높인다.)

(3) DPPH 반응

(가) Experimental 용액 : 추출물용액 0.5ml + DPPH 용액 0.5ml

(나) Blank용액 : 추출물 용액 0.5ml + Ethanol 0.5ml

(다) Control 용액 : Ethanol 0.5ml + DPPH용액 0.5ml

* 섞어 주는 용액은 동량이면 됨

- 피펫을 이용하여 충분한 Mixing 후 37℃ 항온조에서 30분 반응 후 517nm에서 흡광도를 측정한다.

- DPPH scavenging Activity(%) =

{1-(Experimental 용액 흡광도 - Blank 용액 흡광도)/Control 용액 흡광도}×100

<시험결과>

총플라보노이드, 총페놀 함량 및 DPPH 소거능

	분석항목	단위	분석방법	분석결과
실험예 1	총플라보노이드 함량	?g/ml	UV-Vis	414
	총폴리페놀 함량	ppm	UV-Vis	1340.66
	DPPH Scavenging Activity	%	UV-Vis	90.94
비교예 1	총플라보노이드 함량	?g/ml	UV-Vis	312
	총폴리페놀 함량	ppm	UV-Vis	1001.21
	DPPH Scavenging Activity	%	UV-Vis	87.94
비교예 2	총플라보노이드 함량	?g/ml	UV-Vis	297
	총폴리페놀 함량	ppm	UV-Vis	1121.37
	DPPH Scavenging Activity	%	UV-Vis	77.31
비교예 3	총플라보노이드 함량	?g/ml	UV-Vis	232
	총폴리페놀 함량	ppm	UV-Vis	981.98
	DPPH Scavenging Activity	%	UV-Vis	77.26
비교예 4	총플라보노이드 함량	?g/ml	UV-Vis	258
	총폴리페놀 함량	ppm	UV-Vis	882.44
	DPPH Scavenging Activity	%	UV-Vis	70.21
비교예 5	총플라보노이드 함량	?g/ml	UV-Vis	285
	총폴리페놀 함량	ppm	UV-Vis	862.32
	DPPH Scavenging Activity	%	UV-Vis	75.29

위의 분석 데이터로부터 실시예 1의 에델바이스, 브델리아, 타임의70% 에탄올로 추출하고 다시 에탄올을 제거하여 이스트 발효하여 얻어진 추출물의 경우 세포독성이 현저히 줄어들어 안전성이 개선되며, 반면에 총 폴리페놀 함량과, 총 플라보노이드 함량이 증가되고 더불어 항산화활성(DPPH Scavenging Activity)이 증가되어 항산화 활성과 안전성이 향상되는 추출물을 얻을 수 있었다.

Claims

에델바이스, 브델리아, 타임 전초를 혼합하여 발효 시킨 추출물
청구항1에서 사용되어지는 미생물 균종이 Saccharomyces cerevisiae , Lactobacillus plantarum Bifidobacterium bifidum , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus salivarius , Bifidobacterium infantis , Lactobacillus lactis , Lactobacillus reuteri , Lactobacillus brevis, Streptococcus thermophilus , Bifidobacterium longum , Lactobacillus bulgaricus , Lactobacillus acidophilus DDS -1, Lactobacillus casei , Lactobacillus rhamnosus 인 것
청구항 1의 제조방법에서 먼저 에탄올 과 물의 혼합용매로 추출하고 후에 다시 미생물을 접종하여 발효시킨 단계를 거친 추출물