KR20060108964A - 엔테로코커스 패칼리스 ｃｂｔ―ｓｌ（5）, 이를 이용한항균 배양액 분리농축물의 제조 방법 및 이를 포함하는조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes) 및 식품의 변패와 식중독 원인균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 등의 성장을 저해하는 항균기능을 갖는 유산 균주인 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5), 이를 이용한 항균 배양액 분리농축물의 제조방법 및 상기 농축물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

유산균주, 여드름 치료제, 식품변패, 식중독, 항균기능, 프로피오니박테리움 애크니스

Description

엔테로코커스 패칼리스 ＣＢＴ―ＳＬ（5）, 이를 이용한 항균 배양액 분리농축물의 제조 방법 및 이를 포함하는 조성물{Enterococcus faecalis CBT-SL(5), preparation of its culture fluid and composition comprising the same}

도 1은 본 발명에 의한 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5)의 배양액 분리 농축물을 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 공정을 나타낸 순서도이다.

도 2는 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5)의 배양 2시간째(A) 4시간째(B) 현미경 사진이다.

도 3은 분리균의 16S rRNA 염기서열 (1,570 bp)이다.

도 4는 분리균의 동정에 대한 분류계통도이다.

도 5는 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5)의 항균물질 발효 경시변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5) 배양액 분리 농축물이 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)의 성장억제 저지환 관찰도이다.

도 7은 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5)의 항균물질 정제사진이며 화살표는 단일정제물의 분자량을 나타낸 것이다.

도 8은 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5)의 항균물질의 열안정성 그래프이다.

도 9는 항균활성물질 처리에 의한 경시적인 바실러스 세레우스의 세포막 파괴현상을 보여주는 전자현미경 사진(좌에서 우로 5,000, 10,000, 30,000배 확대)이다.

도 10은 배양시간별 프로피오니 박테리움 애크니스에 대한 항균활성이다.

도 11은 배양시간별 바실러스 세레우스와 스테필로코커스 아우레우스에 대한 항균활성이다.

도 12-14는 정제된 항균활성물질의 아미노산 서열(12)과 유전자 확인을 위한 프라이머 염기서열(13) 및 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5)의 염색체를 주형으로 한 증폭된 유전자의 염기서열과 아미노산 서열(14)을 나타낸 것이다.

본 발명은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes) 및 식품의 변패와 식중독의 원인균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 등의 성장을 저해하는 항균기능을 갖는 유산 균주인 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5), 이를 이용한 항균 배양액 분리농축물의 제조방법 및 상기 농축물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

종래부터, 유산균의 배양액 등이 화장품에 적용되어 왔는데, 상기 배양액 등을 화장품에 적용함에 있어서는, 균체 및 불용성 성분을 제거한 유산균 배양액이 주로 이용되어 왔다. 이러한 유산균의 배양액에는 주요 성분으로써 젖산, 유당, 아미노산, 인산염 등이 포함되어 있는 바, 이들 성분은 피부의 각질성분에 친화적으로 작용하거나, 피부의 항산화작용, 보습작용, pH 조절 작용 및 피부균총의 조절 작용 등을 할 수 있어서, 화장품에 유용하게 이용되어 왔으며, 이에 따라, 여러 가지 유산균의 배양액이 그 성분에 따라, 여러 종류의 화장품용 소재로서 개발되어 왔다.

특히, 여러 가지 유산균 중에서도 스트렙토코쿠스 서모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)속에 속하는 미생물 중에서 보습효과, 활성 산소 제거 효과 및 면역 부활 기능을 가지는 유산균의 배양액이 화장품에 주로 적용되어 왔으며, 계속적인 연구의 결과로 적용되는 미생물의 범위는 점차로 넓어지고 있다.

상기 종래 기술에 의한 화장품용 유산균의 배양 방법 및 이를 이용한 화장료 조성물의 제조 방법에 관하여 좀 더 살펴보면 다음과 같다.

화장품용 유산균배양 → 균체분리 → 배양여액 또는 여액건조물 제조 → 화장료 조성물 제조

상기한 바와 같이, 유산균 배양액을 이용한 화장료 조성물을 제조하기 위해서는 우선, 적절한 유산균을 선택하여 이를 배양하게 되는 바, 종래 기술에 있어 서, 이러한 유산균 배양은 일반적으로 펩톤류, 육즙, 효모추출물, 포도당 및 무기이온이 조합된 발효배지를 이용하여 혐기적 발효장치 내에서 이루어지게 되며, 이러한 배양 단계를 진행한 후, 그 배양액으로부터 균체를 분리하게 된다.

상기 분리 단계는 원심분리 또는 한외여과기를 이용하여 이루어지게 되며, 이러한 방법으로 균체가 분리된 유산균 배양액을 건조 분말화 시키거나 액체 상태에서 화장품 성분, 증점제, 유화제 등과 혼합하여 화장료 조성물을 제조하게 된다.

한편, 염증성 여드름 질환에 관련된 임상적 치료요법에 있어서는, 주로 테트라사이클린(tetracycline), 신다마이신(cindamycine), 에리스로마이신(erythro -mycin) 등의 항생제가 주로 이용되어 왔으나, 이러한 항생제를 장기간 투여할 경우, 여드름의 원인균이 내성을 가지게 됨으로써, 치료효과가 떨어지는 문제점이 있었으며, 여드름 유발균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)는 그 인위적 배양이 어려워서, 이들 약제에 대한 감수성 실험이 미약 할 수 밖에 없으므로, 적절한 약제선정에 어려움이 따랐고, 더구나, 상기 약제들은 모두 항생제이므로 화장품으로서의 이용이 불가능한 문제가 있었다.

이와 같이, 종래 기술에 있어서, 유산균 배양액의 화장품 이용은 그 배양액에 포함된 여러 가지 성분을 통하여 보습 효과, 면역 부활 기능, 활성 산소 제거 기능, 유기산 등에 의한 정균 작용 등의 부수적인 효과를 거두기 위한 것에 국한될 뿐, 특정 균주의 생육을 저해함으로써, 여드름 등의 피부 질환을 치유하기 위한 적용은 없었던 것이 사실이다.

따라서, 여드름 등의 피부 질환은, 그 치료를 위하여 주로 항생제가 이용되 어 왔으나, 항생제의 과다 투여로 인한 내성의 발생, 화장품에는 적용할 수 없는 한계 등 그 문제점이 많았으며, 이러한 종래 기술의 문제점으로 인하여, 항균 미생물의 배양액이 적용됨으로써, 여드름 등의 피부 질환을 유발하는 원인균의 생육을 저해할 수 있고, 이에 따라, 부작용이 없이 여드름 등의 피부 질환을 근본적으로 치유할 수 있도록 하는 기능성 화장품의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

특히, 이러한 항균 미생물의 배양액은 내성 등의 부작용이 없고, 항생제에 비하여 일상생활에서 사용되는 화장품에 비교적 쉽게 적용될 수 있어서, 여드름 등의 치료에 있어서, 그 효용이 크다고 할 것인 바, 이러한 효능을 가질 수 있는 유산균주, 그 배양액 분리 농축물의 제조 방법 및 이를 이용한 화장료 조성물의 필요성은 더욱 크다고 할 것이다.

한편, 식품에 있어서 식품 부패 등을 방지하기 위한 방부제의 남용은 다른 부작용 등을 유발될 수 있을 뿐 아니라, 인체에도 별로 이롭지 않기 때문에 그 사용이 자제되고 있으나, 더운 여름이나 식품을 오래 저장, 보관하는 경우에는 식품 부패와 함께 식중독을 유발할 수 있는 균의 번식을 방지하기 위하여 부득이 하게 사용되어야 하는 경우가 많이 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하고자, 본 발명은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)의 생육을 특이적으로 억제할 수 있는 유산균주 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5)와 상기 본 발 명에 의한 균주의 배양액 분리 농축물 및 이러한 분리 농축물을 포함함으로써, 여드름 예방 및 치료 효과를 가지게 되는 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 식중독의 원인균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 등의 성장을 저해하는 항균활성을 가진 유산균주 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5)와 상기 본 발명에 의한 균주의 배양액 분리 농축물 및 이러한 분리 농축물을 포함함으로써, 식품 변패의 방지 효과를 갖는 식품보존제 조성물 및 식품 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 피부염증 및 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)의 생육 및 식중독의 원인균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 등의 성장을 특이적으로 억제할 수 있는 유산균주인 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5)를 제공한다.

또한, 본 발명은 프로피오니움엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5)를 이용하여 얻은 항균활성 물질 및 프로피오니움엔테로코커스 패칼리스Enterococcus faecalis) CBT-SL(5)의 배양액으로부터 얻은 상기 항균활성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리농축물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 배양액을 제조하는 단계와, 상기 배양액에 상기 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5) 균주를 접종하여 pH를 조절하면서 유산균을 배양하는 단계와, 상기 유산균 균체를 제거하고 발효여액을 분리, 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 배양액 분리농축물 제조방법을 제공한다.

상세하게는, 본 발명은 3.0~5.0중량%의 포도당, 0.5~1.0중량%의 효모추출물, 1.0~2.0중량%의 육즙, 1.0~2.0중량%의 단백가수분해물 및 0.005~0.1중량%의 이온성분을 물에 용해시켜, 혐기적 발효관에서 살균하여 제조한 배양액에 상기 본 발명에 의한 균주를 접종하여 유산균을 배양하는 단계와, 원심분리 또는 막분리를 통해서 균체를 제거하고 농축한 배양여액에 대하여 1~10 중량%의 말토덱스트린(maltodextrin)등의 흡착제를 혼합한 후 동결건조를 통하여 항균물질 분리농축액을 얻는 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 분리 농축물 제조 방법에 있어서, 상기 이온성분으로는, 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 칼슘 클로라이드, 시스테인하이드로클로라이드, 폴리소르베이트 80 으로 이루어진 그룹에서 선택된 물질을 사용함이 바람직하다.

또한, 본 발명에 의한 분리 농축물 제조 방법은 상기 항균물질 분리농축액을 제조하는 단계를 진행한 후에, 제조된 분리 농축물을 동결 건조하는 단계를 부가적으로 포함하여 구성될 수도 있다. 이러한 단계를 부가적으로 포함함으로써, 제조된 분리 농축액의 저장 안정성을 향상시킬 수 있게 된다.

나아가, 본 발명은 상기의 방법에 의하여 제조된 유산균 배양액의 분리 농축물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 이 때, 0.1중량 % 이상의 농도 또는 프로피오니박테리움 애크니스에 대한 성장저해 활성이 100 AU/g 이상의 항균 활성을 가질 수 있도록 상기 분리농축액을 포함하는 것이 바람직하며, 이러한 화장료 조성물은 여드름 원인균의 생육을 억제할 수 있으므로, 이러한 조성물을 이용하여 화장품을 제조함으로써, 여드름에 대한 치료 효과를 거둘 수 있게 되는 것이다.

상기 본 발명에 의한 조성물에 있어서, 상기 조성물은 적용되는 화장품의 종류에 적합하도록 W/O(water-in-oil), O/W(oil-in-water) 유화제형, 투명스킨, 현탁스킨, 로션, 에센스, 클렌저, 젤 제형 등으로 제조될 수 있으며, 또한, 비누, 샴푸, 린스, 바디샴푸, 주방세제 등에 적용될 수 도 있다.

본 발명에 의하면, 유해세균에 대한 정균작용, 미백, 보습, 항산화 효과를 나타내는 보조 성분으로서 소디움히알루로닉산(Sodium hyaluronic acid), 락토페린(Lactoferrin), 혈청 단백질(Serum protein), 판테틴(Pantethine), 살리실산(Salicylic acid), 트리클로산(Triclosan) 등이 부가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의하여 제조된 유산균 배양액의 분리 농축물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항생제 대체용 식품보존제 및 이를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명에 의한 유산균주, 배양액 분리농축물의 제조 방법 및 이를 포함하는 조성물에 관해 좀 더 상세하게 설명하기로 하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 여드름 원인균과 식중독 원인균에 특이적 저해활성을 지닌 신규한 유산균주의 개발, 상기 균주에 대한 최적 발효배지 및 발효공정의 구성, 상기 발효를 통해 형성된 배양액으로부터, 항균활성을 가진 배양액 분리 농축물을 제조하는 방법, 상기 분리 농축물을 포함하며 화장료 조성에 용이한 액제 또는 수용성 분말 상태의 조성물과, 이를 이용하여 제조되는 다양한 제형의 화장료 조성물에 관한 것이다.

이러한 본 발명에 사용되는 유산 균주는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)로 동정되는 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5) 유산구균으로서, 여드름 원인균으로 알려진 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes) 에 대하여 특이적 저해활성을 나타내는 물질을 생산한다.

상기 균주에 대한 최적 발효배지 및 발효조건은 여드름 원인균에 대한 생육 억제 물질의 대량생산에 적합하도록 구성되었으며, 항균물질의 분리 농축 과정은 원심분리 또는 막분리를 통한 균체 및 불용성 성분의 제거공정을 포함한다. 건조 분체화 공정은 농축액의 살균 후 수용성 포집제를 이용한 분사식 유동층 건조 또는 동결건조를 통하여 이루어진다.

이와 같은 공정으로 획득되어진 유산균 배양 분획건조물은 유화제 및 기타 화장품 원료 등과 혼합하여 스킨, 로션, 에센스, 클렌저, 메이크업, 색조 화장품 등의 모든 화장품 제형 등의 화장료로 제조되어질 수 있다.

상기와 같은, 본 발명에 의한 균주, 분리 농축물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관해 상세하게 설명하면 다음과 같다.

1) 균주선발 및 동정

엔테로코커스 패칼리스를 반유동 배지에서 혐기적으로 배양하고 나서, 상기 배양액으로부터 균체를 분리한 유산균 배양 여액에 대해, 지시균으로서 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)를 사용하여 저지환 시험을 진행한다. 위와 같은 시험 결과 800 AU/ml 이상의 항균활성을 발휘하는 유산균을 선별하여 16S rRNA를 분석하였다.

분석된 염기서열은 NCBI GenBank blast 결과 엔테로코커스 패칼리스로 동정되어 NCBI GenBank에 관련자료를 등록번호 AY692453으로 등록하였으며, 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5) (Enterococcus faecalis CBT-SL(5))라고 명명하고, 이를 부다페스트 조약에 의한 국제 기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자원센터(KCTC)에 기탁 번호 KCTC 10699BP로 등록하였다.

2) 배양 및 항균활성 물질 생산

상기한 바와 같이, 본 발명에 사용된 유산균주는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5)로서, 이는 엔테로코커스 패칼리스를 반유동 배지에서 혐기적으로 배양한 후, 이를 통해 제조된 유산균 배양여액에 대해 지시균으 로 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)를 사용하여, 저지환 시험을 진행함으로써, 800 AU/ml이상의항균활성을 발휘하는 유산균을 선별하여 제조된 것이다.

상기 균주에 의한 항균물질 생산은 3~5중량%의 포도당, 0.5~1중량%의 효모추출물, .0~2.0중량%의 육즙, 1.0~2.0중량%의 단백가수분해물 및 0.005~0.1중량%의 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스테이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 칼슘 클로라이드, 시스테인하이드로클로라이드, 폴리소르베이트 80 등의 이온성분을 물에 용해시켜 제조된 배양용 배지에, 상기 본 발명에 의한 균주를 접종하고 산소가 제거된 혐기적 조건 및 pH 6.2~6.5의 조건으로 7시간 발효함으로써 이루어진다.

항균물질 발효공정의 경시변화는 도 5에 나타내었는데 최적 pH 조건에서 7시간 경과시 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)에 대하여 최대 12,800 AU/ml 이상의 저해활성을 나타내는 항균활성 물질이 생산되었다.

3) 발효액 분리농축

상기와 같은 방법으로 발효 단계를 진행한 후, 상기 발효액은 15,000 rpm 이상의 고속원심분리기에 의해 균체와 여액으로 분리된다.

4) 건조 분체화

분리농축 여액에 대비하여 중량비 1~10%의 유당, 말토덱스트린, 만니톨, 탈지분유를 혼합하여 용해시키고 80℃ 온도조건에서 교반하여 가면서, 2회 30분간 열처리 하여 기타 잡균 및 유산균 등을 제균하고 동결건조기에 투입하여 건조시키거나 또는 분사식 유동층건조기에서 건조하고 분쇄하여 분말을 제조한다. 경우에 따라 항균활성 물질의 농축액을 화장료 원료로 직접 사용하는 경우에는 건조분체화 공정을 생략할 수 있다.

5) 유효 성분의 분리 및 아미노산 서열 확인

생리활성이 강한 여액 농축물 중 프로피오니박테리움 애크니스의 생육을 강력히 억제하는 유효 성분을 분리하기 위하여 상기의 방법에 의하여 얻은 추출물을 양이온 교환수지에 흡착시킨 후 1N 암모니아수(NH4OH)로 탈리시켜 활성분획을 회수하였고, 흡착성 수지를 이용하여 한단계 더 정제하였으며, 단일물질을 얻고자 FPLC를 이용하여 이온교환 크로마토그래피, 소수성 이온교환 크로마토그래피 등을 번복하면서 단일물질을 정제한 후 단백질 전기영동 장치로 유효성분의 정제도와 분자량을 측정하였으며 15% SDS-PAGE를 이용하여 단일물질을 분리한 후 PVDF 막에 옮기고 염색 및 탈색을 거쳐 Procise 492 단백질 서열분석기(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 아미노산 서열을 분석하였다.

6) 정제물의 항균활성 측정

항균활성물질의 활성측정을 위해 전기영동한 표준 분자량 단백질과의 전개 거리를 비교한 결과 약 3000∼6000 달톤의 분자량을 가진 단백질임을 확인할 수 있었으며 (도 7), 정제된 박테리오신을 전기영동한 젤을 프로피오니박테리움 애크니스가 생육하는 고체 배지 위에 올려놓고 배양한 결과 박테리오신이 확인된 밴드에서 프로피오니박테리움 애크니스의 생육 저지환이 생성되었다 (도 6).

7) 항균활성 물질의 유전자 확인

정제된 항균활성물질의 아미노산 서열을 이용하여 GenBank Protein Blast 프로그램을 이용하여 단백질 동질성을 조사한 결과 엔테로 코커스 페시움 유래의 엔테로신과 높은 상동성을 나타내었다. 상기 결과에 근거하여 본 발명의 분리균에서 엔테로신 유전자의 존재를 확인하고자 엔테로코커스 페칼리스로부터 염색체를 분리하였고 이것을 주형으로하여 엔테로신 유전자 특이적 프라이머(도 13)를 합성하여 PCR 수행하였으며 증폭된 유전자를 T-easy 클로팅 벡터에 삽입하여 항균활성 유전자의 DNA 서열을 확인하였다 (도 14).

8) 열 안정성

생리활성물질의 열 안정성의 조사는 여액 농축물 0.5 ml를 각각의 다른 조건에서 지정시간 정치 시킨 후 일정액을 취하여 시험균주가 도말된 한천 평판배지에 연속 희석한 희석액 일정량을 취해 점적한 후 항온기내에서 배양하여 성장에 따른 저지환을 확인하였다. 시험균주는 본 발명의 궁극적인 목표인 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스에 대한 성장저지력을 확인하는 것으로 대체하였다.(도 8 참조)

본 발명의 결과에 의한 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5)가 생산하는 생리활성 물질은 피부염증 및 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스에 대해 높은 항균활성을 나타내었으며 표 1 과 같이Arbitrary Unit (AU)로 나타내었다. 열안정성 실험 결과 항균활성 물질은 121 ℃, 20 분에서 매우 안정하였다.

< 표 1 > 열안정성 조사결과

열처리조건	항균활성(AU**) (프로피오니박테리움 애크니스 ATCC 29399 )
- 30 ℃, 24시간	29
25 ℃, 60분	28
70 ℃, 30분	28
70 ℃, 60분	28
100 ℃, 30분	28
100 ℃, 60분	28
121 ℃, 20분	28
121 ℃, 30분	27

** AU(Arbitrary Unit) : 순차적인 2배 희석을 통하여 나타난 항균활성 값의 최소농도역수

9) 항균 스펙트럼 조사

본 발명에 의한 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5) (Enterococcus faecalis CBT-SL(5))의 여액 농축물의 유해미생물에 대한 성장 억제능을 확인하고자, 본 발명의 궁극적 적용목표인 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스 외에 스테필로코커스 아우레우스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 세레우스를 5 x 107 승/ml 도말한 0.75% 한천평판배지에 10 마이크로리터 농축여액을 점적한 후 37도씨 항온기에서 12-24시간 배양하여 항균활성을 측정하였으며 연속희석법에 의한 저해활성 단위를 AU로 계산하여 표 2에서와 같이 나타내었다.

< 표 2 > 각종 시험균에 대한 항균활성

지시균	항균활성 (AU)	비고
프로피오니박테리움 애크니스 ATCC 29399	27 - 28	Semiagar 점적법
프로피오니박테리움 애크니스 KCTC 3314	27 - 28	위동
바실러스 서브틸리스 KFRI 179	26	위동
바실러스 세레우스 KCTC 3624	25	위동
스테필로코커스 아우레우스 KCTC 1927	25	위동

10) 전자현미경 관찰

농축물의 항균활성 기작 규명은 인산완충액 (pH 7.4)에 농축물의 항균활성이 800 AU/g으로 되도록 희석한 후 균체를 점적하여 경시변화에 따른 항균활성물질의 세포막 파괴현상에 의한 세포괴사 현상을 관찰하였다. 시험 대상균으로는 배양이 비교적 손쉬운 바실러스 세레우스를 이용하였으며 일정시간 반응후 종료 균체는 2% 글루탈알데히드와 에탄올 시리즈(30 ~ 100%)에 각각 15분간 처리하여 탈수, 고정한 후 금 코팅에 의해 세포막 파괴현상을 관찰하였다. 비교 실험은 항균 농축물 처리군과 비처리군의 차이로 확인하였다 (도 9).

본 발명에 의한 항균 농축물 또는 이의 건조 분말에 적절한 첨가물을 첨가, 혼합하여 식품 부패 방지를 위한 보존제제로 사용할 수 있으며, 공지의 방법을 통하여 이를 포함한 각종 형태의 식품을 만드는 것이 가능하며, 이러한 변형예도 본 발명의 범위에 포함됨은 물론이다.

11) 화장료 제조

상기 항균물질 농축물을 원료로 포함한 화장료 제형에 있어서 특별히 한정되는 것은 없다. 본 발명에 의한 화장료의 제형에는 구체적으로 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 크림, 로션, 클렌저, 스킨, 메이크업, 색조 화장품 등의 모든 화장품 제형이 가능하며, 각 제형의 화장료 제조에 있어서 점증제, 방부제, 향료, 착색료 등의 일반적인 원료성분들은 화장료의 제조방법, 제형, 사용목적 등에 따라 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.

화장료의 제조시 본 발명의 핵심성분인 항균물질 농축물은 전체 조성물에 대하여 0.1% 이상의 농도 또는 100 AU/g 이상의 항균활성을 유지하도록 배합하며, 추가적으로 기타 유해세균에 대한 정균작용, 미백, 보습, 항산화 효과를 나타내는 보조 성분으로서 소디움히알루로닉산(Sodium hyaluronic acid), 락토페린(Lactoferrin), 혈청 단백질(Serum protein), 판테틴(Pantethine), 살리실산(Salicylic acid), 트리클로산(Triclosan) 등을 단독 또는 혼합하여 화장료를 제조한다.

실시예 1) 엔테로코커스 패칼리스 CBT-SL(5) 균에 의한 여드름 원인균을 저해하는 농축 발효액 및 농축건조물의 제조

포도당 3 Kg, 육즙 1 Kg, 효모추출물 1 Kg, 카제이펩톤 2 kg, 소이펩톤 1 kg, 시스테인하이드로클로라이드 50 g, 디포타슘 포스페이트 50 g, 소디움 아세테이트 50 g, 디암모니움 시트레이트 50 g, 마그네슘 설페이트 10 g, 망간 설페이트 5 g, 칼슘 클로라이드 50 g, 폴리소르베이트 80 50 g을 물 100 L에 첨가하여 용해시키고 200 L 용량의 혐기적 발효관에 이송하여 121 도씨에서 15분간 살균하고 미리 배양한 종균 1 L를 접종하여 pH 6.2~6.5의 조건으로 7 시간 발효하였다.

유산균 발효액에 대하여 원심분리기를 이용하여 15,000 rpm 의 조건으로 발효여액을 확보하였다. 항균물질 발효여액에 대하여 중량비 1~10% 범위의 말토덱스트린, 만니톨, 유당 등의 수용성 부형제를 사용하여 동결건조 또는 분사식 유동층 건조하여 수용성 분말화 하였다. 이때 항균활성은 최종 분말의 경우 25,600~104,200 AU/g이 되도록 희석비를 조정하였다.

실시예 2)- 5) 유산균 배양액 농축건조물을 함유하는일반 화장수의 제조

< 표 3 > 실시예 2- 5에 따른 조성비

성분	조성비(w/w, %)
	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
1)정제수	To 100	To 100	To 100	To 100
2)글리세린	10.0	10.0	10.0	10.0
3)소디움 하이얼 유론산	5.0	5.0	5.0	5.0
4)녹차 추출물	1.0	1.0	1.0	1.0
5)락토패드 (1000~2000AU/g)	5.0	5.0	5.0	5.0
6)에탄올	10	10	10	10
7)살리시릭 산	-	0.5	-	0.5
8)트리클로잔	-	-	0.3	0.3
9)경화 비버유	0.5	0.5	0.5	0.5
10)방부제	적량	적량	적량	적량
11)향	적량	적량	적량	적량

원료 1)~5)을 혼합하여 균질하게 용해시켰다. 별도의 용기에서 원료 6)~11)을 40℃ 이하의 온도로 가열하면서 혼합하여 용해시킨 후, 먼저 제조된 1)~5)원료 용액에서서히 투입하고 믹서에서 균질화 시켜 화장수를 제조하였다. 이때, 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스를 포함한 피부 유해세균에 대한 항균작용에 관련한 활성성분으로써 주 성분인 5)Lactopad에 대하여 보조성분으로서7)Salicylic acid, 8)Triclosan을 단독 또는 동시에 일정한 농도로 혼합하여 화장수를 제조하였다.

실시예 6)-9) 항균물질 농축건조물을 함유하는 영양화장수의 제조

<표 4> 실시예 6)-9)에 따른 조성비

성분	조성비(w/w, %)
	실시예 6	실시예 7	실시예 8	실시예 9
1)세토스테아릴 알코올	1.7	1.7	1.7	1.7
2)폴리소르베이트 60	1.2	1.2	1.2	1.2
3)솔비탄 스테아릴산e	0.5	0.5	0.5	0.5
4)스테아릴산	0.5	0.5	0.5	0.5
5)트리글리세라이드	3.0	3.0	3.0	3.0
6)세틸-에틸 헥사노에이트	4.0	4.0	4.0	4.0
7)메틸파라벤	0.2	0.2	0.2	0.2
8)프로틸파라벤	0.1	0.1	0.1	0.1
9)사이클로메티콘	3.0	3.0	3.0	3.0
10)정제수	To 100	To 100	To 100	To 100
11)글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0
12)락토패드 (1000~2000AU/g)	5.0	5.0	5.0	5.0
13)살리시릭 산	-	0.5	-	0.5
14)트리클로산	-	-	0.3	0.3
15)향	적량	적량	적량	적량
16)점증제	1.0	1.0	1.0	1.0

원료 1)~9)를 혼합하고 가열하여 65~70℃까지 온도를 상승시켜 용해시켰다. 별도의 용기에서 원료 10)~11)를 혼합하여 용해시키고 가열하여 65~70℃까지 온도를 상승시키고 앞서 제조한 용액에 서서히 투입하면서 homo-mixer에서 균질화 시켜 에멀젼을 형성시켰다.

이 형성된 에멀젼 용액에 대하여 원료 12)~16)을 순서대로 혼합하여 점증있는 에멀젼을 제조하였다. 이때 일반화장수의 제조와 마찬가지로 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스를 포함한 피부 유해세균에 대한 항균작용에 관련한 활성성분으로서 주성분인 5)Lactopad에 대하여 보조성분으로서 7)Salicylic acid, 8)Triclosan을 단독 또는 동시에 일정한 농도로 혼합하여 영양화장수를 제조하였다.

이상 실시예 2)~9)에 의하여 만들어진 화장료 조성물들은 각각 실온에서 한달 이상 보관하면서 제품 중의 층분리 현상을 비교 측정하였는데 모두 안정하여 층 분리 등의 현상은 없었으며 항균활성도 그대로 유지되었다. 락토패드(LACTOPAD)를 사용한 화장료 조성물의 제형안정성 및 임상자료는 표 5-6에 나타내었다.

< 표 5 > 유산균 배양 농축물을 함유한 화장료 조성물의 제형 안정성

화장료		경 과 일
		0	10	20	30	40	50
스 킨	층분리	없음	없음	없음	없음	없음	없음
	항균활성 (AU/g)	800	800	800	800	800	800
	색상	Light brown	Light brown	Light brown	Light brown	Light brown	Light brown
로 션	층분리	없음	없음	없음	없음	없음	없음
	항균활성(AU/g)	3200	3200	3200	3200	3200	3200
	색상	White	White	White	White	White	White
클렌저	층분리	없음	없음	없음	없음	없음	없음
	항균활성 (AU/g)	3200	3200	3200	3200	3200	3200
	색상	White	White	White	White	White	White

< 표 6 > 유산균 배양농축물을 함유한 화장료 조성물의 임상시험

화장료	항 목	매우 개선	약간 개선	변화 없음	나빠짐
로션(항균활성 3200 AU/g 포함)	탄력성	4	6	8	2
	보습성	8	8	4	0
	여드름 개 선	10	4	4	1
	미백효과	6	6	7	1
	피부신선도	8	8	2	2

** 성인 여성 20명에 대하여 이틀 간격으로 15일간 처리

이와 같이, 본 발명인 여드름원인균에 대한 항균기능을 갖는 유산균 배양액의 분리농축물 제조방법 및 그 조성물은 여드름 예방 및 치료효과를 가진 기능성 제품의 사용상 효율성을 극대화 한다.

본 발명인 여드름원인균에 대한 항균기능을 갖는 신규한 유산 균주, 상기 균주의 배양액 분리농축물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스에 대하여 특이적 저해활성 기능을 가지고 있어 피부에 서식하는 여드름 원인균 및 유해세균에 대하여 항균작용을 발휘하여 여드름 질환을 치료하고 예방하며, 본 수용성 항균성분의 분리농축물은 화장료 조성에 적합한 물성이므로 스킨, 로션, 에센스, 클렌저, 메이크업, 색조 화장품 등의 모든 화장품류로 제조될 수 있어 사용자의 사용상 효율성을 극대화 할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 분리농축물은 식품의 변패 및 식중독의 원인균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 성장을 저해하는 항균활성을 가지고 있어, 인체에 무해한 항생제 대체용 식품 보존제로 이용될 수 있다.

Claims (17)

1. 유산균주 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5)(기탁번호 KCTC 10699BP).
2. 프로피오니움엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5)를 이용하여 얻은 항균활성 물질.
3. 프로피오니움엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) CBT-SL(5)의 배양액으로부터 얻은 항균활성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리농축물.
4. 배양액을 제조하는 단계와;

   상기 배양액에 상기 제 1 항의 균주를 접종하여 pH를 조절하면서 유산균을 배양하는 단계와;

   상기 유산균 균체를 제거하고 발효여액을 분리, 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 배양액 분리농축물 제조방법.
5. 제 4 항에 있어서,

   상기 배양액은 3~5중량%의 포도당, 0.5~1중량%의 효모추출물, 1.0~2.0중량%의 육즙, 1.0~2.0중량%의 단백가수분해물 및 0.005~0.1중량%의 이온성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 배양액 분리농축물 제조방법.
6. 제 4 항에 있어서,

   상기 발효여액을 분말화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 배양액 분리농축물 제조방법.
7. 제 6 항에 있어서,

   동결건조 또는 분사식 유동층 건조방법으로 분말화 하는 것을 특징으로 하는 항균 배양액 분리농축물 제조방법.
8. 제 5 항에 있어서,

   상기 이온성분은, 시스테인하이드로클로라이드, 디포타시움 포스페이트, 소디움 아세테이트, 디암모니움 시트레이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 칼 슘 클로라이드, 폴리소르베이트 80으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 물질 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 항균 배양액 분리농축물 제조방법.
9. 제 4 항에 있어서,

   상기 배양단계에서 pH는 6.2-6.5 인 것을 특징으로 하는 항균 배양액 분리농축물 제조방법.
10. 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 항에 의해 얻어진 항균 배양액 분리농축물.
11. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 항에 의해 얻어진 분리농축물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
12. 제 11 항에 있어서,

    상기 화장료는 water-in-oil(W/O) 또는 oil-in-water(O/W) 유화제형, 투명스킨, 현탁 스킨, 로션, 에센스, 클렌저, 젤 제형으로 이루어지는 군으로부터 선택되 는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
13. 제 11 항에 있어서,

    소디움히알루로닉산(Sodium hyaluronic acid), 락토페린(Lactoferrin), 혈청 단백질(Serum protein), 판테틴(Pantethine), 살리실산(Salicylic acid), 트리클로산(Triclosan)으로 이루어진 성분 중 선택된 하나의 물질 또는 둘 이상의 혼합물을 더 포함함을 특징으로 하는 화장료 조성물.
14. 제 11 항에 있어서,

    0.1중량 % 이상의 농도 또는 프로피오니박테리움 애크니스에 대한 성장저해 활성이 100 AU/g 이상의 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
15. 제 11 항에 있어서,

    상기 화장료는 비누, 샴푸, 린스, 바디샴푸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
16. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 항에 의해 얻어진 분리농축물을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품보존제 조성물.
17. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 항에 의해 얻어진 분리농축물을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.

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