KR102134820B1

KR102134820B1 - 항균 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 sw1 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102134820B1
Application number: KR1020190066849A
Authority: KR
Inventors: 최용준; 정선욱
Original assignee: 서울시립대학교 산학협력단
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2019-06-05
Publication date: 2020-07-17

Abstract

본 발명은 항균 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주 또는 이의 배양액은 저자극성 방부제로 사용되는 2,4-펜탄디올 생산능 및 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 세 종류의 테스트 균주에 항균 활성을 나타내므로, 의약품, 식품 및 화장품에 첨가되어 상기 제품의 보존 기간을 증가시키는 방부제의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항균 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주 및 이의 용도{Lactobacillus paracasei subsp. tolerans SW1 having antibacterial activities and uses thereof}

본 발명은 항균 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

인간의 피부에는 다양한 미생물들이 존재하는데 이들의 대부분은 인간에 해를 미치지 않으며 오히려 다양한 도움을 주기도 하지만 리스테리아 모노키토게네스, 살모넬라 속, 황색 포도상구균과 일부 병원성 대장균같은 세균이나 칸디다 알비칸스 같은 진균은 기회적 병원체로서 인간의 건강을 위협할 수 있다(Wong et al., 2000; Behravan et al., 2005; Jiang et al., 2012). 화장품의 경우 미생물 오염 가능성이 상존하며(Ku et al., 2013), 미생물 번식에 의해 이를 사용하는 인간에 심각한 문제를 초래할 수 있다(Behravan et al., 2005). 화장품은 고분자성 지질이나 물을 주성분으로 하여 기타 여러 가지 물질들이 혼합되어 이루어져 있으며 이러한 물질들 중 미생물의 탄소원이 되는 글리세린이나 소르비톨 등이 함유되어 있고, 질소원으로 아미노산 유도체 및 단백질 등이 배합된 것이 많아 탄소원 및 질소원을 매개체로 하는 세균과 곰팡이 등이 번식하기 쉬운 조건이므로 오염이 잘 일어난다. 이러한 문제 때문에 미생물 오염으로 화장품이 리콜되는 사례도 빈번하게 일어나고 있는 실정이며(Wong et al., 2000; Lundov and Zachariae, 2008), 국내에서도 테스터 화장품에서 Bacillus subtilis와 인간에 병원성을 나타낼 수 있는 포도상구균 속, 칸디다 속, 마이크로코커스 속 등의 미생물이 다수 검출되었다는 보고가 있다(Lee, 2017).

의약품, 화장품, 및 식품 등의 제품에는 물성변화방지, 효능의 유지 및 부패 방지를 위하여 방부제가 첨가되어 있다. 상기 제품 등에 포함되는 방부제는 세균 등 미생물의 번식을 저해하여 제품의 보존기간을 증가시키는 기능을 한다. 현재 미생물 오염을 방지하기 위해 항균활성 범위가 크고 넓은 pH와 온도 범위에서 안정한 파라벤, 페녹시에탄올, 클로페네신 등의 화학합성 방부제를 많이 사용하고 있다. 다만, 화학 합성 방부제는 제조 단계가 단순하고 낮은 단가로 대량 생산이 가능하며 방부 효과가 우수한 이점이 있지만 인간에 피부염, 알러지 및 호르몬 분비 이상 등을 유발할 수 있고 피부에 잔류할 수 있는 위험성을 안고 있다(White and Groot, 2006). 화학 합성 방부제 중 가장 널리 사용되는 파라벤은 유방암 조직에서 발견되는 성분으로 밝혀져 논란이 되고 있으며 남성의 정자 수를 감소시키고 활성 산소를 발생시켜 피부 노화를 촉진시키며, 주름살과 적갈색 반점을 형성한다는 연구결과도 있으며, 흔히 화장독으로 알고 있는 접촉성 피부염이나 피부 알레르기의 주요 원인이 되는 성분이기도 한다. 과거에 파라벤은 화장품뿐만 아니라 잼이나 간장, 소스 등 식품에 첨가되는 방부제로도 널리 쓰였지만, 안정성 문제가 꾸준히 제기되자 현재는 식품에 첨가하는 것이 금지된 물질이다. 다만 화장품에는 여전히 보존제로 파라벤이 첨가되고 있으며, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤 및 부틸파라벤을 단독으로 배합할 경우 0.4%의 한도, 혼합하여 배합할 경우 0.8% 한도 내에서 첨가하도록 되어 있지만, 씻어 내는 화장품이 아닌 스킨케어용 화장품에 첨가되는 경우 체내에 축적될 가능성이 있다.

따라서 최근에는 방부제를 이용하지 않는 제품이나, 화학 합성 방부제를 대체할 수 있는 방부 효능을 가진 천연 방부제에 대한 관심이 증가하고 있다. 현재 널리 사용되고 있는 천연 방부제로는 잇꽃 추출물, 자몽추출물, 히노키티올 (hinokitol), 마그놀롤 (magnolol) 과 같은 식물 추출물이 있으나, 이는 생산 단가가 높아 대중적으로 사용되기 어려우며 방부 효능이 낮아 미생물이 번식할 수 있는 위험이 있다.

최근에는 독성이 없고 사람에게 해를 끼치지 않는 천연항균물질을 생산하는 미생물에 대한 관심이 증가하고 있으며 의약품 분야에서는 화학기반의 항생제를 생물유래 물질로 전환하거나 미생물 자체 혹은 미생물 대사산물을 이용한 항균제 시장 진출 전략을 강화하고 있다(Kim et al., 2018). 자연계에 널리 존재하는 미생물의 경우 서식환경에서의 생존 및 우점을 위한 대사물질을 분비하는데 이러한 대사물질은 다른 미생물 개체의 생장을 저해하거나 사멸하는 효능을 지니고 있다. 미생물에 의해서 생산된 항균 활성을 가지는 대사 물질에는 biosurfactant, bacteriocin 등이 있으며(Jiang et al., 2012; Sharma and Saharan, 2014), 이외에도 미생물에 의해서 생산된 항균, 항진균 물질인 다양한 효소 및 siderophore 등이 보고되었다(Nagarajkumar et al., 2004). 이러한 미생물 유래 대사산물은 화학합성성분과 유사한 구조 및 효능을 가지고 있기 때문에 천연물로써 현재 여러 위해성이 존재하는 화학 합성 성분의 대체물질로 각광받고 있다. 또한, 조작이 쉽고 대량 배양이 가능하기 때문에 경제성 및 효용성 측면에서 장점을 갖고 있다.

이에 본 발명자들은 영유아 피부로부터 분리한 미생물을 배양하여 그 배양액에 포함된 성분을 가스크로마토그래피를 통해 분석한 결과 2,4-펜탄디올(2, 4-pentanediol) 성분이 포함된 것을 확인하였다. 이에 알칸디올계 화합물의 생산능을 가진 미생물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1로 명명하였다. 현재 항균 활성이 알려진 알칸디올계 물질인 1, 2-헥산디올(1,2-hexanediol) 및 1, 2-펜탄디올(1,2-pentanediol)은 화장품 내에서의 항균 기능을 하는 성분으로 이용되고 있으며, 2, 4-펜탄디올 역시 항균 활성을 가진 저자극성 화장품 방부제로 이용되고 있다. 이에, 상기 2, 4-펜탄디올이 포함된 미생물 배양액을 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 등에 처리하여 생장이 저해됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 분리한 미생물이 생산하는 항균 활성을 지닌 2, 4-펜탄디올을 포함한 천연대사산물은 화장품 보존기간을 증가시키기 위한 천연방부제로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 항균 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 수탁번호 KACC81096BP로 기탁된 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KACC81096BP로 기탁된 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 및 상기 배양액의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 수탁번호 KACC81096BP로 기탁된 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1를 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 배양 후, 얻어진 균체 배양액을 원심 분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 및

3) 상기에서 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 완전히 제거하는 단계; 를 포함하는 2,4-pentanediol을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주는 저자극성 화장품 보존제로 널리 사용되는 2,4-펜탄디올의 생산능 및 항균 활성을 가지므로 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 및 상기 배양액의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물은 의약품, 식품 및 화장품에 첨가되어 상기 제품의 보존 기간을 증가시키는 방부제의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 분리한 미생물의 16s rRNA 서열을 데이터베이스와 비교하여 그 유사도를 나타낸 도이다.
도 2는 분리한 미생물의 16s rRNA 서열과 가장 유사도가 높은 Lactobacillus paracasei subsp. tolerans JCM1171 균주와의 서열을 비교한 도이다.
도 3은 분리한 미생물의 배양액에 포함된 성분을 분석하기 위해 가스 크로마토그래피를 수행한 도이다.
도 4는 분리한 미생물의 배양 농축액을 농도별로 균주가 포함된 배지에 처리하여 분리한 미생물의 항균 활성을 나타낸 도이다.
MRS broth : MRS 배지
EC : 대장균(Escherichia coli KCCM40271)
PA : 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa KCCM11802)
SA : 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCCM40881)

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 기탁된 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주(이하, SW1 균주)는 영유아 피부로부터 분리 배양을 통해 동정하였다.

상기 SW1 균주는 16S rRNA 유전자 상동성 검색에서, 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 JCM1171과 99.18%의 상동성을 나타내는 신규한 균주로 확인되었는바, 이는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) 균주로 분류되었다.

본 발명자들은 상기 신규한 균주를 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주로 명명하여 한국농용미생물보존센터에 2019년 5월 27일 자로 기탁하여 수탁번호 KACC81096BP를 부여받았다.

상기 SW1 균주는 서열번호 3의 16s rRNA 서열을 가질 수 있다.

상기 SW1 균주는 2,4-펜탄디올(2,4-pentanediol) 생산능을 가질 수 있다.

2,4-펜탄디올(2,4-pentanediol)은 하기 화학식 1의 구조를 가지고, 2,4-아밀렌글리콜(2,4-amylen glycol), 디메틸트리메틸렌글리콜(dimethyl trimethylene glycol), 2,4-디히드록시펜탄(2,4-dihydroxypentane)로도 불리며 무색의 액체로 끓는점은 197 내지 201℃ 이고 몰질량은 104.15g/mol이다. 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 세 종류의 테스트 균주가 도말된 배지에서 1 g/L 의 2,4-펜탄디올을 처리한 경우, 클리어존이 형성되는 것을 확인하여 2,4-펜탄디올이 항균 활성을 가진 것으로 확인되었다.

[화학식 1]

상기 SW1 균주는 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대해 항균 활성을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

대장균 (Escherichia coli KCCM40271)은 주요 병원성 균으로 그람 음성 간균이며 대장균 자체는 인체에 해롭지 않지만 항원형 대장균은 식중독을 일으킬 수 있다.

슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa KCCM11802)는 내구력과 적응력이 뛰어난 세균으로 가정의 배관에서 채소에 이르기까지 다양한 환경 조건에서 서식할 수 있는 특성을 보인다. 보통의 건강한 사람에게는 큰 영향이 없지만 면역계가 약화된 사람에게는 유해한 영향을 미쳐 낭포성섬유증을 비롯해 화상 환자에게 특히 위험한 감염증을 유발할 수 있다.

스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus KCCM40881)는 황색포도상구균으로서 그람 양성균인 포도상구균의 한 종이다. 식중독을 일으키고 환경에 대한 적응력이 뛰어나 자연계에 널리 분포되어 있다. 황색포도상구균은 기온이 높은 여름철에 증식을 잘하는 특성이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항균" 또는 "항균 활성"이란, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 대해 저항하는 성질을 의미하며, 보다 상세하게는 항생물질 등이 병원성 곰팡이의 성장 또는 증식을 억제하는 특성을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항균용 조성물"은 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 생육을 저해하는 활성을 가진 조성물로서, 항균 효과가 요구되는 다양한 분야에 사용되는 모든 형태가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 의약품, 의약외품, 화장품, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제 등의 형태일 수 있다. 구체적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 화장품이나 생활용품에는 부패를 방지하는 목적으로 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균 목적으로 사용될 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다.

상기 배양액은 균주를 배양한 MRS 액체 배지일 수 있으나 이에 제한되지 않으며 통상의 미생물 배양 배지일 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양한 배양액 또는 상기 배양액을 물리적으로 여과한 배양액일 수 있으며, 상기 배양액은 희석하지 않거나 희석하여 항균용 조성물 제조에 사용할 수 있다. 상기 배양액은 항균 활성을 나타내는 한, 여과, 농축, 희석 등의 처리 과정을 거쳐 항균용 조성물 제조에 사용할 수 있다.

상기 배지의 pH는 SW1 균주에 양립할 수 있는 범위라면 크게 제한되지 않으며, 바람직하게는 pH 4.5 내지 7.0일 수 있다.

상기 SW1 균주를 배양하기 위한 배양 온도 또한 SW1 균주와 양립할 수 있는 범위라면 크게 제한되지 않으며 바람직하게는 25 내지 45℃일 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물은 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 배양 현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 SW1 균주, 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.

담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 트레할로스(Trehalose), 옥수수 전분(cornstarch), 콩기름(soybean oil), 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitorl)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesiumstearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP:polyvinyipyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starchglycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone)중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐 (aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulosesodium), 베타-싸이크로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KACC81096BP로 기탁된 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 및 상기 배양액의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로서 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주의 배양물, 배양액의 농축물 또는 배양액의 건조물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨데 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

상기 화장료 조성물의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

3)상기에서 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 완전히 제거하는 단계; 를 포함하는 2,4-pentanediol을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 배양은 MRS 액체 배지에서 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않으며 통상의 미생물 배양 배지에서 이루어질 수 있다.

상기 배지의 pH는 SW1 균주에 양립할 수 있는 범위라면 크게 제한되지 않으며, 바람직하게는 pH4.5 내지 7.0일 수 있다.

상기 단계 1)은 순수 분리된 균주를 얻기 위하여 단계 1)의 앞에 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주를 고채 배지에 도말하고 배양하여 순수 분리된 것이 확인된 집락(colony)을 취하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 단계 2)는 고속 원심분리기를 이용하여 1℃ 내지 7℃, 구체적으로 2℃ 내지 6℃, 보다 구체적으로 3℃ 내지 5℃의 온도에서 500rpm 내지 5000rpm, 구체적으로 1,000rpm 내지 4500rpm, 보다 구체적으로 2,200rpm 내지 4300rpm의 회전력으로 10분 내지 30분, 구체적으로 15분 내지 25분, 보다 구체적으로 17분 내지 23분 동안 원심분리하는 것일 수 있다.

상기 단계 3)은 여과된 상등액을 동결 건조기를 이용하여 분말화 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주의 배양액에서 2,4-펜탄디올이 포함된 것을 확인하였고, 세 종류의 테스트 균주에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).

따라서, 본 발명의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 및 상기 배양액의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물은 의약품, 식품 및 화장품에 첨가되어 상기 제품의 보존 기간을 증가시키는 방부제의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 영유아 피부로부터 신규한 균주의 분리

항균 활성을 가지는 신규한 균주를 분리하기 위하여, 멸균한 팁(tip)을 영유아의 얼굴 피부에 문지른 뒤 MRS 고체 배지 MRS (1% 펩톤(peptone), 1% 비프 추출물, 0.4% 효모 추출물, 2% 글루코오스, 0.5% 아세트산나트륨 수화물(sodium acetate hydrate), 0.1% tween 80(polyoxyethylene sorbitan monooleate), 0.2% 제일인산칼륨(potassium phosphate monobasic), 0.2% 트리암모늄구연산(triammonium citrate), 0.02% 황산마그네슘(magnesium sulfate), 0.005% 황산망간제일수화물(manganese(II) sulfate monohydrate), 1.5% 한천) 고체 배지에 도말하고 30℃에서 7일 동안 정치 배양하였다.

<실시예 2> 분리한 균주의 동정

상기 실시예 1에서 분리한 균주의 분류학적 동정을 위하여 하기와 같이 16s rRNA 염기 서열 분석을 수행하였다.

<2-1> 분리한 균주의 16s rRNA 유전자 구간의 분리 및 정제

MRS 고체 배지에 형성된 단일 집락(single colony)을 재도말하여 순수 배양한 뒤, 동일한 성분의 MRS 액체 배지에 접종하여 30℃에서 3일 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 배양액을 4,000 rpm, 4 ℃에서 20 분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. DNA isolation kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 회수한 균체로부터 게놈 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 주형으로 하고 하기 표 1에 기재된 염기 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 16s rRNA 염기 서열을 증폭시켰다.

서열번호	서열(5'-3')
서열번호 1	agagtttgatcmtggctcag
서열번호 2	tacggytaccttgttacgactt

구체적으로, 1 ㎕의 추출한 DNA, 2 ㎕의 프라이머(10 pmole/㎕) 및 17 ㎕의 멸균증류수의 혼합물을 pfu 폴리머라아제 믹스(Bioneer)에 첨가한 뒤, 이를 T-100 Thermal cycler DNA 증폭기(Bio-rad)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분 동안 반응시킨 뒤, 95℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 3분의 반응과정을 1회로 하여 이를 25회 반복함으로써 수행되었다. 수득된 PCR 산물을 1% 아가로오스 겔에서 120V의 전압을 걸어 20분 동안 전기영동하여 확인하고, 이를 1.5ml 튜브에 넣고 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다.

<2-2> 16s rRNA 염기 서열 분석을 통한 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주의 동정

정제된 유전자의 염기서열과 기존 균주의 16s rRNA 염기 서열(서열번호 3)을 비교하여 그 유사도를 NCBI의 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)와 EZ-Taxon 데이터베이스(http://www.eztaxon.org)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 분리한 균주는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 JCM1171 균주와 99.18%의 상동성을 가지는 것으로 나타났다(도 1). 이에 상기 균주를 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주로 명명하고 2019년 5월 27일 자로 한국농용미생물보존센터(KACC)에 수탁번호 KACC81096BP로 기탁하였다.

<실험예 1> 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주의 배양액에 포함된 성분 분석

락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주의 배양액에 포함된 성분을 분석하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 배양한 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주의 집락(colony) 하나를 3ml MRS 액체 배지에서 24시간 동안 진탕 배양하고, 배양액을 MRS 액체 배지 50ml에 첨가하여 3일 동안 추가 배양하였다. 그 후, 배양액을 4,000 rpm, 4 ℃에서 20 분간 원심분리하여 균체와 완전히 분리하고, 0.45㎛ 공극을 가진 셀룰로오스 아세테이트 필터(cellulose acetate filter)(CA045047A, 현대마이크로사)로 여과하였다. 그 후, 여과된 배양액을 동결 건조하고, 동결 건조된 배양액에 3ml의 100% 에탄올을 첨가하여 현탁하였다. 상기 현탁액에 포함된 성분을 가스크로마토그래피(Agilent 5977B MSD GC system, Agilent 사)를 통해 분석하였다. 칼럼은 Agilent 19091S-433UI HP-5ms을 이용하였으며, 이동상 기체(carrier gas)로 헬륨을 사용하고 유속은 1ml/min 였으며 80℃에서 2분, 80℃에서 320℃까지 10℃/min의 구배 용출(gradient elution)을 적용하였다.

그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이, 추출 용매 피크를 제외하고 약 3.2분의 피크 머무름 시간 (Retention time)에서 가장 높은 농도의 물질이 검출되었고, 이를 선택적 이온 모니터링 모드 및 Agilent MassHunter 워크스테이션 소프트웨어에 포함된 화합물의 라이브러리를 통해 분석한 결과 검출된 피크는 2, 4-펜탄디올과 높은 매칭율을 나타내었다. 따라서, 배양액에 2,4-펜탄디올이 포함되어 본 발명의 균주는 2,4-펜탄디올 생산능이 있는 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).

<실험예 2> 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주의 항균 활성 확인

락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스 SW1 균주의 항균 활성을 확인하기 위해 대장균(Escherichia coli KCCM40271), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa KCCM11802) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCCM40881) 세 종류의 테스트 균주에 대하여 SW1 균주의 항균 활성을 클리어존 형성 유무를 통해 확인하였다.

구체적으로, 항균활성테스트를 위한 대장균 (Escherichia coli KCCM40271), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa KCCM11802) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCCM40881) 균주의 단일 집락(single colony)을 각각 3 mL의 LB (1% 염화나트륨, 0.5% 효모 추출물, 1% 트립톤) 액체 배지에 접종하고 24시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, LB(1% 염화나트륨, 0.5% 효모 추출물, 1% 트립톤)에 1%의 한천을 포함하여 고체 배지를 제조하고 고체 배지에 상기 세 종류의 항균 활성 테스트 균주를 도말하였다. 본 발명의 SW1 균주를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 배양 및 동결 건조하여 균주의 동결 건조물을 수득하였다. 그 후 동결 건조물을 3ml의 멸균증류수로 현탁하여 배양 농축액을 제조하였다. 제조한 배양 농축액을 2분의 1씩 3회 희석하여 50%, 10%, 1% 배양 농축액을 제조하였다. 100%, 50%. 10% 및 1% 의 배양농축액과 표준시료로 1 g/L 의 2, 4-펜탄디올을 10㎕를 세 종류의 테스트 균주가 도말된 LB 고체 배지에 떨어뜨려 건조한 뒤 37℃에서 24시간 동안 정치 배양하고 클리어존 형성 유무를 관찰 하였다.

그 결과, 50% 농축액을 떨어뜨린 곳과 100% 농축액을 떨어뜨린 곳에서 상기 세 종류의 테스트 균주가 도말된 배지에서 클리어존이 형성되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 100% SW1 균주 농축액은 세 종류의 테스트 균주 배지에서 2,4-펜탄디올과 비슷한 크기의 클리어존을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, SW1 균주의 배양농축액은 상기 세 종류의 테스트 균주에 대해 항균 활성을 가지는 것을 확인하였다(도 4).

시료	대장균	슈도모나스 에루지노사	스타필로코커스 아우레우스
2,4-펜탄디올	1.6cm	1.6cm	1.6cm
100% SW1 균주 농축액	1.3cm	1.25cm	1.4cm

한국농용미생물보존센터

KACC81096BP

20190527

<110> University of Seoul Industry Cooperation Foundation <120> Lactobacillus paracasei subsp. tolerans SW1 having antibacterial activities and uses thereof <130> 19p-05-020 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SW1 16s rRNA <400> 3 tttagagttt gatcatggct caggatgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg 60 aacgagttct cgttgatgat cggtgcttgc accgagattc aacatggaac gagtggcgga 120 cgggtgagta acacgtgggt aacctgccct taagtggggg ataacatttg gaaacagatg 180 ctaataccgc atagatccaa gaaccgcatg gttcttggct gaaagatggc gtaagctatc 240 gcttttggat ggacccgcgg cgtattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcga 300 tgatacgtag ccgaactgag aggttgatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac 360 tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg 420 ccgcgtgagt gaagaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttggagaa gaatggtcgg 480 cagagtaact gttgtcggcg tgacggtatc caaccagaaa gccacggcta actacgtgcc 540 agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga tttattgggc gtaaagcgag 600 cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa gccctcggct taaccgagga agcgcatcgg 660 aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc 720 gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga 780 ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga 840 tgaatgctag gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgccg cagctaacgc attaagcatt 900 ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 960 gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc 1020 ttttgatcac ctgagagatc aggtttcccc ttcgggggca aaatgacagg tggtgcatgg 1080 ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1140 gactagttgc cagcatttag ttgggcactc tagtaagact gccggtgaca aaccggagga 1200 aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1260 tggatggtac aacgagttgc gagaccgcga ggtcaagcta atctcttaaa gccattctca 1320 gttcggactg taggctgcaa ctcgcctaca cgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc 1380 agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag 1440 tttgtaacac ccgaagccgg tggcgtaacc cttttaggga gcgagccgtc taaggtggga 1500 caaatgatta gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtaaac 1540

Claims

수탁번호 KACC81096BP로 기탁된 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 3의 16s rRNA 서열을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 하기 [화학식 1]로 표시되는 2,4-펜탄디올(2,4-pentanediol) 생산능을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주.
[화학식 1]
제 1항에 있어서, 상기 균주는 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대해 항균 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1 균주.
제 1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 및 상기 배양액의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 항균용 조성물은 화장료 조성물인 항균용 조성물.
1) 수탁번호 KACC81096BP로 기탁된 락토바실러스 파라카세이 아종 톨러란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) SW1를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배양 후, 얻어진 균체 배양액을 원심 분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 및
3)상기 단계 3)에서 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 완전히 제거하는 단계; 를 포함하는 2,4-펜탄디올(2,4-pentanediol)을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제조하는 방법.