CN114657108A - 一种用于皮肤抗菌和屏障修复的副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

一种用于皮肤抗菌和屏障修复的副干酪乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种用于皮肤抗菌和屏障修复的副干酪乳杆菌及其应用。本发明从八岁健康女孩粪便中分离鉴定的副干酪乳杆菌ProfMIC‑208具备抑菌作用，包括：抑制葡萄球菌产生异戊酸、抑制臭汗症病原菌的生长；抑制常见皮肤病原菌铜绿假单胞菌和白色念珠菌的增殖。同时，所述副干酪乳杆菌ProfMIC‑208还具备屏障修护和抗炎功能。因此，本发明筛得的副干酪乳杆菌在食品、药品、化妆品等领域具有极大的市场潜力。

Description

一种用于皮肤抗菌和屏障修复的副干酪乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种用于皮肤抗菌和屏障修复的副干酪乳杆菌及其应用。
背景技术
皮肤作为人体最大的器官生活着广泛的微生物，人体皮肤常见的菌就有二十多种，其中又分为皮肤常驻菌和皮肤暂住菌。皮肤常驻菌是指在皮肤上生长繁殖，完成生命周期的菌，常见常驻菌有表皮葡萄球菌、痤疮棒状杆菌、类白喉杆菌等。皮肤暂住菌是指来自于周围环境，暂时寄居在皮肤上的菌，一段时间后可消失，如黄色葡萄球菌，链球菌等。正常情况下，皮肤上的微生物和皮肤环境处于平衡的关系，当皮肤或这皮肤环境发生变化，或者某些菌株过度繁殖或者死亡，容易使得皮肤微生态失衡，造成皮肤问题。
如相关病原菌过度繁殖易造成臭汗症：汗腺充沛的局部皮肤处(如腋下)高温高湿且营养供给充沛，非常适合皮肤细菌生存和繁殖。当相关细菌过度增殖、大量地分解皮肤表面的秽物或汗液中的有机物，继而产生有气味的不饱和脂肪酸、散发难闻的臭味，就会对患者的生活造成困扰，这就是臭汗症。
皮肤上也存在一些病原菌，当人体免疫力下降时，它们容易侵染皮肤造成疾病。如白色念珠菌，它是一种真菌，通常情况下几乎没有致病力然而当宿主机体免疫力下降，或者抗生素药物的使用影响到口腔的微生态平衡时，白色念珠菌可过量增殖并形成利于粘附在宿主细胞粘膜的生物膜，继而侵染宿主引起疾病。白色念珠菌常侵犯皮肤黏膜，白色念珠菌感染常发生于口腔和生殖器处的表皮。又如铜绿假单胞菌，或者称为绿脓杆菌，它是临床上最难治疗的细菌之一。它产生各种形式的病理病症：眼部感染、伤口感染(尤其烧伤和手术感染)、尿路感染(尤其在导尿管之后)、胃肠道和肺部感染(例如在支气管镜检查之后)患者等中的并发症。正常情况下，这些病原菌与皮肤环境处于平衡，当皮肤被损伤或者人体免疫下降的时候，这些病原菌容易入侵皮肤，造成疾病。
皮肤感染通常还伴随有皮肤炎症的发生。炎症是针对损伤因子所发生的防御反应在炎症过程中，一方面损伤因子可直接或间接损伤机体的细胞和组织；另一方面通过炎症充血和炎症渗出，可稀释、杀伤和包围损伤因子，同时机体通过实质和间质细胞的再生使受损伤的组织得以修复和愈合。可以说炎症是损伤、抗损伤和修复三位一体的综合过程。如果炎症状态持续不能消退，这些过度释放的自由基还会攻击皮肤的胶原和角质细胞，让胶原提早硬化变脆弱，皮肤变硬，也让角质细胞凋亡失衡，这些结果不仅会造成皮肤脱皮，同时也会造成皮肤缺水的外观，甚至细纹松弛。皮肤在炎症的状态下难以恢复。当皮肤长期受到损伤，长期处于炎症的状态，容易损伤到皮肤屏障，使得皮肤的免疫力继续下降。
皮肤上除了常见的病原菌，还存在益生菌。益生菌在维持宿主机体稳态，激活免疫系统、维持机体免疫平衡等方面具有重要作用，研究发现益生菌能通过调节巨噬细胞的吞噬能力以及细胞因子的释放来控制全身免疫状态，从而预防和治疗各种炎症疾病。益生菌外用可以使皮肤表面的微生物菌群达到平衡，促进皮肤屏障的修护。
现如今人们对皮肤健康的需求越来越大，然而皮肤问题的诱因错综复杂，现有的皮肤疾病治疗和护理技术不能完全满足人们的需求，有必要进一步研究皮肤治疗和护理的方案和药物。
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)属于乳杆菌属中的干酪乳杆菌群，广泛存在于奶酪、泡菜等发酵食品。它具有干酪乳杆菌属调节肠道和增强免疫力等益生功能，代谢产生的细菌素具有优良的抑菌性能。因此，在食品、医疗保健等领域发挥重要作用。但是少有副干酪乳杆菌用于直接用于皮肤抗菌和屏障修复方面的报导。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的问题在于提供一株副干酪乳杆菌及其在制备用于皮肤抗菌和屏障修复的产品中的应用。
本发明提供了保藏编号为CCTCC NO：M20211553的副干酪乳杆菌Prof MIC-208。
本发明还提供了所述的副干酪乳杆菌菌株在制备抑制常见皮肤病原菌的药物中的应用，所述的皮肤病原菌包括：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerug inosa)和白色念珠菌(Candida albicans)中至少一种。
一些实施例中，所述的副干酪乳杆菌对铜绿假单胞菌和白色念珠菌的抑制率为15.7％～20.3％。
本发明还提供了所述的副干酪乳杆菌菌株在制备修复皮肤屏障的药物中的应用.
所述修复皮肤屏障包括上调屏障修复相关基因的表达，所述基因包括FLG、OVOL1中至少一种。
一些实施例中，所述的副干酪乳杆菌上调屏障修护相关因子丝聚合蛋白的基因FLG和OVO样转录因子1的基因OVOL1的表达，基因表达量上调1.48～2.03倍。
本发明还提供了所述的副干酪乳杆菌菌株在制备治疗臭汗症的药物中的应用。
所述治疗臭汗症包括抑制葡萄球菌产生异戊酸和/或抑制臭汗症病原菌的生长。
所述臭汗症病原菌包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)和干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)中的至少一种。
一些实施例中，所述的副干酪乳杆菌菌株降低葡萄球菌产生异戊酸，降低率为64.06％。
一些实施例中，所述的副干酪乳杆菌对臭汗症病原菌的抑制率为43.1％～65.5％。
本发明还提供了所述的副干酪乳杆菌菌株在制备皮肤抗炎药物中的应用。
所述皮肤抗炎包括促进炎症因子基因IL-8的表达和/或抑制NO的产生。
一些实施例中，所述副干酪乳杆菌菌株下调金黄色葡萄球菌诱导的HaCa T细胞炎症因子IL-8基因的表达，基因表达量下调32.19％；所述的副干酪乳能够降低脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7的一氧化氮(NO)生成量50.89％～77.48％。
本发明还提供了一种益生菌菌剂，其特征在于，其原料包括所述的副干酪乳杆菌菌株。
具体的，本发明所述产品的原料包括所述副干酪乳杆菌ProfMIC-208菌株的活菌、灭活菌、裂解物、提取物、培养上清液、衍生物中至少一种；所述衍生物包括：代谢产物、代谢生物产物、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖和含有免疫原性成分的化合物中至少一种。
优选地，本发明所述的产品的原料为所述副干酪乳杆菌ProfMIC-208菌株的上清液或灭活菌体。
本发明从八步健康女孩粪便中分离鉴定的副干酪乳杆菌ProfMIC-208具备抑菌作用，包括：抑制葡萄球菌产生异戊酸、抑制臭汗症病原菌的生长；抑制常见皮肤病原菌铜绿假单胞菌和白色念珠菌的增殖。同时，所述副干酪乳杆菌ProfMIC-208还具备屏障修护和抗炎功能。因此，本发明筛得的副干酪乳杆菌在食品、药品、化妆品等领域具有极大的市场潜力。
生物保藏说明
副干酪乳杆菌ProfMIC-208 Lactobacillus paracasei ProfMIC-208，于2021年12月06日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20211553。
附图说明
图1示ProfMIC-208抑制臭汗症相关病原菌生长；
具体实施方式
本发明提供了一种用于皮肤抗菌和屏障修复的副干酪乳杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 ProfMIC-208的分离
于八步健康女孩粪便中采样。将样品经适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于MRS固体平板，于37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ProfMIC-208。
革兰氏染色镜检：菌株ProfMIC-208为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在MRS平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
实施例2 ProfMIC-208的核酸鉴定
1、16s rRNA基因序列分析。
挑取单菌落置于MRS液体培养基中，于37℃培养过夜后，离心收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。PCR扩增引物为细菌通用引物27F和1492R；PCR扩增体系为50μL体系，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。扩增后测定核酸的碱基序列。
2、结果。
PCR产物的测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出ProfMIC-208菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
实施例3 ProfMIC-208抑制臭汗症病原菌生长实验-菌液浓度变化
1、副干酪乳杆菌ProfMIC-208菌液制备：
将活化的副干酪乳杆菌ProfMIC-208菌液以MRS液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整使得OD600＝2.0，然后将培养菌液于121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得灭活上清液。
2、病原菌菌液制备：
将5种病原菌：金黄色葡萄球菌CGMCC 1.8721、表皮葡萄球菌CGMCC 1.4260、人葡萄球菌CGMCC 1.493、溶血葡萄球菌CGMCC 1.540和干燥棒状杆菌CGMCC 1.1919分别用BHI培养基37℃培养18h，检测并调整至OD600＝0.2。
3、抑制臭汗症病原菌实验
将灭活上清液以10％(V/V)的比例加入病原菌中，37℃培养2h，以菌液浓度(OD600)降低百分比为指标评价ProfMIC-208对病原菌生长的抑制作用。
4、结果。结果如表1所示，ProfMIC-208对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌和干燥棒状杆菌等臭汗症病原菌均具有抑制作用。ProfMIC-208对臭汗症病原菌抑制率的统计结果见图1。
表1 ProfMIC-208对臭汗症病原菌抑制率
Figure BDA0003623838390000061
实施例4 ProfMIC-208降低异戊酸的产生实验
1、副干酪乳杆菌ProfMIC-208菌液制备：
将活化的副干酪乳杆菌ProfMIC-208菌液用MRS液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整至OD600＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得ProfMIC-208灭活上清液样品。
2、葡萄球菌混合菌液制备：
将4种葡萄球菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和溶血葡萄球菌分别用BHI培养基37℃培养18h，检测并调整至OD600＝0.2，然后将四种菌液等体积混合制得葡萄球菌混合菌液。
3、副干酪乳杆菌PROFMIC-208上清液添加及异戊酸含量检测
将灭活上清液以10％(V/V)的比例加入葡萄球菌混合菌液中，未添加上清液的实验组为对照组，37℃培养2h，分别用气相色谱法测定样品和对照的异戊酸含量，计算添加上清液后异戊酸含量降低率。
4、结果。结果如表1所示，ProfMIC-208具有降低葡萄球菌产生异戊酸的作用，降低率为64.06％。
表2 ProfMIC-208添加对异戊酸产生的降低率
Figure BDA0003623838390000071
实施例5ProfMIC-208抑制皮肤病原菌生长实验-菌液浓度变化
1、副干酪乳杆菌ProfMIC-208菌液制备：
将活化的副干酪乳杆菌ProfMIC-208菌液以MRS液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整至OD600＝2.0，于121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得待测样品。
2、病原菌菌液制备：
将铜绿假单胞菌CGMCC 1.1785和白色念珠菌CGMCC 2.4550分别用BHI培养基37℃培养18h，检测并调整至OD600＝0.2。
3、抑制病原菌实验
将灭活上清液以10％(V/V)加入病原菌中，37℃培养12～16h，以菌液浓度(OD600)降低百分比为指标评价对病原菌生长的抑制作用。
4、结果结果如表3所示，显示ProfMIC-208对铜绿假单胞菌和白色念珠菌等常见皮肤病原菌均具有抑制作用。
表3 ProfMIC-208对皮肤病原菌抑制率
Figure BDA0003623838390000072
实施例6 ProfMIC-208降低Raw264.7细胞NO生成量
1、ProfMIC-208菌液制备。
将ProfMIC-208用MRS培养基培养过夜，检测OD600，调整菌液浓度至OD600＝0.2，离心后，菌体于121℃高压灭菌30min得菌体，离心上清用0.22μm滤膜过滤得ProfMIC-208灭活上清液。
2、Raw264.7细胞制备.
将Raw264.7细胞消化后以2×105个/孔接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、ProfMIC-208添加及LPS刺激。
将上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)分不同组加入培养过夜的Raw264.7细胞中，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导Raw264.7细胞发炎，20h后取细胞培养上清，用NO含量检测试剂盒进行NO含量检测，每次3个复孔，共进行3次实验。
4、结果。结果如表4所示，ProfMIC-208具有抗炎作用，能够降低LPS诱导的Raw264.7细胞NO生成量，与对照组相比，ProfMIC-208灭活上清液降低NO生成量77.48％，ProfMIC-208灭活菌体降低NO生成量50.89％。
表4 ProfMIC-208降低Raw264.7细胞NO生成量
Figure BDA0003623838390000081
实施例7 ProfMIC-208下调HaCaT细胞炎症因子相关基因的表达
1、ProfMIC-208样品制备.
将ProfMIC-208用MRS培养过夜，检测OD600，调整菌液浓度至OD600＝0.2，离心后，菌体121℃高压灭菌30min得菌体，离心上清用0.22μm滤膜过滤得ProfMIC-208上清液。
2、HaCaT细胞制备。
将HaCaT细胞消化后以2×105个/孔接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、金黄色葡萄球菌制备及添加。
金黄色葡萄球菌接入营养肉汤培养基，37℃摇床培养过夜，用MEM无血清培养基调整菌液浓度至OD600＝6.0，然后以每孔100μl的量添加入培养过夜的HaCaT细胞中，刺激细胞产生炎症因子，3h后弃去细胞培养基，PBS清洗5次，每孔重新加入1ml的MEM无血清培养基。
4、ProfMIC-208样品添加。将ProfMIC-208上清液以5％(V/V)的比例加入金黄色葡萄球菌刺激过的HaCaT细胞中，每组3个复孔，培养过夜。
5、qPCR法检测细胞炎症因子mRNA相对表达倍数。
将上述细胞弃去培养基后，用RNA提取试剂盒提取RNA，检测RNA浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，用反转录试剂盒、SYBRGreen qPCR试剂盒进行RT-PCR及qPCR，计算炎症因子基因IL-8的相对表达倍数F。
公式：F＝2-ΔΔCT
6、结果。结果显示ProfMIC-208能够下调金黄色葡萄球菌诱导的HaCaT细胞炎症因子相关基因表达，表达量降低32.19％。因此，ProfMIC-208具有抗炎作用。
表5 ProfMIC-208下调炎症因子基因的表达
Figure BDA0003623838390000091
实施例8 ProfMIC-208促进HaCaT屏障修复相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT(5×105个/孔)至6孔板，过夜培养至细胞贴壁。分别加入菌株上清液5％(V/V，体积比)、灭活菌体10％(V/V，体积比)，分别培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，并反转录为cDNA，进行qPCR检测FLG和LOR基因的表达。根据公式进行计算表达变化倍数。
公式：F＝2-ΔΔCT
ProfMIC-208灭活上清液和灭活菌体对屏障修护相关基因的影响结果分别如表6和表7所示，加入ProfMIC-208灭活菌体和上清液均具有促进皮肤屏障修护的作用。
表6 ProfMIC-208上清液上调屏障修护相关基因表达
Figure BDA0003623838390000092
表7 ProfMIC-208灭活菌体上调屏障修护相关基因表达
Figure BDA0003623838390000093
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.保藏编号为CCTCC NO：M20211553的副干酪乳杆菌ProfMIC-208。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株在制备抑制常见皮肤病原菌的药物中的应用，所述的皮肤病原菌包括：铜绿假单胞菌、白色念珠菌中至少一种。
3.权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株在制备修复皮肤屏障的药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述修复包括上调屏障修复相关基因的表达，所述基因包括FLG和OVOL1中至少一种。
5.权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株在制备治疗臭汗症的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述治疗臭汗症包括抑制葡萄球菌产生异戊酸和/或抑制臭汗症病原菌的生长。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述臭汗症病原菌包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌和干燥棒状杆菌中至少一种。
8.权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株在制备皮肤抗炎药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗炎包括促进炎症因子基因IL-8的表达和/或抑制NO的产生。
10.一种益生菌菌剂，其特征在于，其原料包括权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株。
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CN115725469B (zh) * 2022-11-28 2024-05-14 广西大学 一株副干酪乳杆菌及其应用

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