CN114645001A - 一株副干酪乳杆菌及其在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用 - Google Patents

一株副干酪乳杆菌及其在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株副干酪乳杆菌及其在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用。本发明从3岁健康女孩粪便中分离出副干酪乳杆菌GforU‑7菌株，其具备调节皮肤微生态的作用，包括降低痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对比例、降低金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的相对比例、抑制臭汗症病原菌(包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌及干燥棒状杆菌)的生长并抑制其产异戊酸、降低NO释放量和/或下调炎症因子IL‑8和/或TRPV1的水平、上调屏障修护相关基因FLG和/或LOR的表达。本发明提供副干酪乳杆菌GforU‑7菌株在食品、药品、保养品、化妆品等领域具有较大市场潜力。

Description

一株副干酪乳杆菌及其在制备调节皮肤微生态系统的产品中 的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株副干酪乳杆菌及其在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用。
背景技术
作为人体最大的器官，皮肤直接与外界环境接触，是保护人体的第一道屏障。皮肤表面同时也聚集着大量的细菌，大约有1000种之多，主要可以分为四个门类，包括放线菌门(51.8％)，厚壁菌门(24.4％)，变形菌门(16.5％)和拟杆菌门(6.3％)，而已确定的属类为棒状杆菌，丙酸杆菌和葡萄球菌。皮肤微生物群能抵抗皮肤病原体的粘附和发展，也能与免疫系统对话，因此皮肤微生态系统失衡就会引起各种皮肤疾病，反之，皮肤疾病也会导致皮肤微生物的结构异常和菌群的进一步失调。
在人体皮肤不同的部位，由于皮肤结构、接触环境等差异造成了不同微生物群的分布。在皮肤潮湿地区，大汗腺分布较集中，大汗腺能够分泌蛋白质，脂质，类固醇物质，这些物质被细菌降解而产生气味。其中主要涉及葡萄球菌属和棒状杆菌属，尤其是前者将汗液中的营养物质代谢生成异戊酸等具有挥发性短支链脂肪酸，易造成臭汗症。
而在皮脂区如脸部T区，分布着较多的皮脂腺，是痤疮高发区域，在皮脂区分布的主要细菌为丙酸杆菌和葡萄球菌。痤疮是一种常见的慢性炎症性皮肤疾病，研究表明，痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne)是痤疮的主要病原菌，它诱导活化痤疮炎症的起始环节，同时产生蛋白酶、透明质酸酶及趋化因子，使毛囊过度角化形成痤疮。然而该区域常驻另一种细菌-表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，却能够抑制痤疮丙酸杆菌增殖，维持痤疮丙酸杆菌密度的相对平衡，在一定程度上抑制痤疮的发展。
皮脂区也是皮肤损伤的高发区，痤疮与皮肤损伤相互促进发展，容易造成皮肤免疫力下降，角质层变薄等问题，最终导致肌肤屏障功能薄弱。同时，皮肤屏障的受损使得金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)易定植增殖，造成皮肤发炎红肿。而另一方面，常驻的表皮葡萄球菌也能抑制金黄色葡萄球菌的增殖，与金黄色葡萄球菌相互拮抗，能在一定程度上缓解金黄色葡萄球菌带来的炎症。
随着化妆品科学的飞速发展，化妆品在维持、改善和促进皮肤健康以及提高人们生活质量方面的作用越来越受到人们的重视。皮肤微生态系统与皮肤健康紧密相关，成为研发的热点。
副干酪乳杆菌是革兰氏阳性兼性厌氧性杆状细菌，长期存在于人肠道中，能代谢宿主或其他肠道菌群吸收不良的底物。副干酪乳杆菌在人类营养方面和胃肠道健康方面有很大的益处，但是鲜有副干酪乳杆菌应用于调节皮肤微生态方面的报导。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一株副干酪乳杆菌及其在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用。
本发明提供了一株副干酪乳杆菌，其保藏编号为CCTCC NO：M20211531。
本发明还提供了保藏编号为CCTCC NO：M20211531的副干酪乳杆菌在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用。
所述调节皮肤微生态系统包括：调节痤疮相关菌群、改善敏感肌相关菌群、抑制臭汗症相关菌群的生长、抑制臭汗症相关菌群产生异戊酸、抗炎和/或修复皮肤屏障。
所述调节痤疮相关菌群包括降低痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对比例。
本发明中所述的菌株间的相对比例，在本发明的实施例中用菌株间的相对浓度比值来表征。
所述改善敏感肌相关菌群包括降低金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的相对比例。
具体的，所述改善敏感肌相关菌群包括对金黄色葡萄球菌显著抑制，对表皮葡萄球菌轻微抑制，从而降低金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的相对比例。
所述臭汗症相关菌群包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)和干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)中至少一种。
一些实施例中，本发明提供的副干酪乳杆菌GforU-7对所述臭汗症相关菌群抑制率达40.7％～77.1％。
一些实施例中，本发明提供的副干酪乳杆菌GforU-7抑制臭汗症相关菌群产生异戊酸，异戊酸降低率为69.77％。
所述抗炎包括降低NO释放量和/或下调炎症因子的水平，所述炎症因子包括IL-8和TRPV1中至少一种。
一些实施例中，本发明提供的副干酪乳杆菌GforU-7能下调HaCaT细胞受金黄色葡萄球菌刺激而表达的炎症因子，基因表达量下调达24.57％～63.14％；还能够降低脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7的一氧化氮(NO)生成量，降低率为46.31％～63.85％。
所述修复皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因表达；所述屏障修护相关基因包括FLG和LOR中至少一种。
一些实施例中，所述屏障修护相关基因表达量上调倍率为1.40～2.03倍。
本发明还提供了一种调节皮肤微生态系统的产品，其特征在于，其原料包括所述的副干酪乳杆菌；
本发明所述产品的原料包括所述副干酪乳杆菌菌株的活菌、灭活菌、裂解物、提取物、培养上清液、衍生物中至少一种；所述衍生物包括：代谢产物、代谢生物产物、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖和含有免疫原性成分的化合物中至少一种。
优选地，本发明所述的产品的原料为所述的副干酪乳杆菌菌株菌株的上清液或灭活菌体。
所述的产品包括医食品、药品、保养品或化妆品。
本发明从3岁健康女孩粪便中分离并鉴定出副干酪乳杆菌GforU-7菌株，其具备调节皮肤微生态的作用，包括降低痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对比例、降低金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的相对比例、抑制臭汗症病原菌(包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌及干燥棒状杆菌)的生长、抑制臭汗症病原菌产异戊酸、降低NO释放量和/或下调炎症因子IL-8和/或TRPV1的水平、上调屏障修护相关基因FLG和/或LOR的表达。本发明提供副干酪乳杆菌GforU-7菌株在食品、药品、保养品、化妆品等领域具有较大的市场潜力。
生物保藏证明
副干酪乳杆菌GforU-7 Lactobacillus paracasei GforU-7，于2021年12月03日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20211531。
附图说明
图1示GforU-7抑制臭汗症相关病原菌生长；
具体实施方式
本发明提供了一株副干酪乳杆菌GforU-7及其在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 GforU-7的分离
于3岁健康女孩粪便中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于MRS固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为GforU-7。
革兰氏染色镜检：菌株GforU-7为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在MRS平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
实施例2GforU-7的核酸鉴定
1、16s rRNA基因序列分析：
挑取单菌落置于MRS液体培养基中，37℃培养过夜后，离心收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作扩增菌体的序列。引物为细菌通用引物27F，1492R；PCR扩增体系为50μL体系，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。扩增后测定核酸的碱基序列。
2、结果
PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出GforU-7菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
实施例3：GforU-7降低Raw264.7细胞的NO生成量
1、GforU-7菌液制备
将GforU-7用MRS培养基培养过夜，检测OD600，调整菌液浓度至OD600＝0.2，离心后，菌体121℃高压灭菌30min得GforU-7灭活菌体，离心发酵液用0.22μm滤膜过滤得GforU-7上清液。
2、Raw264.7细胞制备
将Raw264.7细胞消化后以2×105个/孔的密度接种至24孔板，于5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、GforU-7添加及LPS刺激
将上清液以5％(V/V)、灭活菌体为10％(V/V)的比例分别加入不同组的培养过夜的Raw264.7细胞中，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导Raw264.7细胞发炎，20h后取细胞培养上清，NO含量检测试剂盒对培养上清进行NO含量检测。每次3个复孔，共进行三次实验。
表1 GforU-7降低Raw264.7细胞NO生成量
Figure BDA0003623508470000051
4、结果如表1所示，GforU-7具有抗炎作用，能够降低LPS诱导的Ra w264.7细胞NO生成量，与对照组相比，GforU-7上清液降低Raw264.7细胞63.85％的NO生成量，灭活菌体降低Raw264.7细胞46.31％的NO生成量。
实施例4 GforU-7下调HaCaT细胞炎症因子相关基因的表达
1、GforU-7样品制备
将GforU-7用MRS培养过夜，检测OD600，调整菌液浓度至OD600＝0.2，离心后，菌体121℃高压灭菌30min得GforU-7灭活菌体，离心发酵液用0.22μm滤膜过滤得GforU-7灭活上清液。
2、HaCaT细胞制备
将HaCaT细胞消化后以2×105个/孔的密度接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、金黄色葡萄球菌制备及添加
金黄色葡萄球菌接入营养肉汤培养基，37℃摇床培养过夜，用MEM无血清培养基调整菌液浓度至OD600＝6.0，然后以每孔100μl的量将金黄色葡萄球菌液添加入培养过夜的HaCaT细胞中，刺激细胞产生炎症因子，3h后弃去细胞培养基，PBS清洗5次，每孔重新加入1ml的MEM无血清培养基。
4、GforU-7样品添加
将GforU-7灭活上清液以5％(V/V)的比例加入金黄色葡萄球菌刺激过的HaCaT细胞中，每组3个复孔，培养过夜。
5、qPCR法检测细胞炎症因子mRNA相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，用RNA提取试剂盒提取RNA，检测RNA浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，用反转录试剂盒、SYBRGreen qPCR试剂盒进行RT-PCR及qPCR，计算炎症因子基因IL-8和TRPV1的相对表达倍数F。
公式：F＝2-ΔΔCT
结果见表2：
表2 GforU-7下调炎症因子基因的表达
Figure BDA0003623508470000061
结果如表2所示，GforU-7灭活上清液能够下调金黄色葡萄球菌诱导的HaCaT细胞炎症因子相关基因表达，使相关基因的表达量降低24.57％～63.14％。因此，GforU-7具有抗炎作用。
实施例5 GforU-7促进HaCaT屏障修复相关基因表达实验
GforU-7上清液和灭活菌体的制备方法见实施例3步骤1。接种人永生化角质形成细胞HaCaT(5×105个/孔)至6孔板，过夜培养至细胞贴壁。分别在不同孔中加入GforU-7上清液5％(V/V)或GforU-7灭活菌体10％(V/V，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，并反转录为cDNA，进行qPCR检测FLG和LOR基因的表达。根据公式进行计算表达变化倍数。
公式：F＝2-ΔΔCT
GforU-7上清液和灭活菌体调控屏障修护相关基因表达的结果分别见表3和表4：
表3 GforU-7上清液上调屏障修护相关基因表达
Figure BDA0003623508470000071
表4 GforU-7灭活菌体上调屏障修护相关基因表达
Figure BDA0003623508470000072
结果如表3、表4所示，加入GforU-7上清液或灭活菌体均具有促进皮肤屏障修护的作用。
实施例6 GforU-7抑制臭汗症病原菌实验-菌液浓度变化
1、副干酪乳杆菌GforU-7菌液制备：
将活化的副干酪乳杆菌GforU-7菌液以MRS液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整至OD600＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得GforU-7灭活上清液样品。
2、病原菌菌液制备：
将5种病原菌：金黄色葡萄球菌CGMCC 1.8721、表皮葡萄球菌CGMC C 1.4260、人葡萄球菌CGMCC 1.493、溶血葡萄球菌CGMCC 1.540和干燥棒状杆菌CGMCC 1.1919分别用BHI培养基37℃培养18h，检测并调整至OD600＝0.2。
3、抑制病原菌实验
将灭活上清液以10％(V/V)的比例分别加入不同的病原菌中，37℃培养2h，以菌液浓度(OD600)降低百分比为指标评价GforU-7灭活上清液对病原菌的抑制作用。
结果见表5：
表5 GforU-7对臭汗症病原菌抑制率
Figure BDA0003623508470000081
结果如表5所示，GforU-7对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌和干燥棒状杆菌等臭汗症病原菌均具有抑制作用。GforU-7对臭汗症病原菌抑制率的统计结果见图1。
实施例7 GforU-7降低异戊酸的产生实验
1、副干酪乳杆菌GforU-7菌液制备：
将活化的副干酪乳杆菌GforU-7菌液以MRS液体培养基培养于37℃培养箱，静置培养16～18h，检测并调整至OD600＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得GforU-7灭活上清液样品。
2、葡萄球菌混合菌液制备：
将4种葡萄球菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和溶血葡萄球菌分别用BHI培养基37℃培养18h，检测并调整至OD600＝0.2，然后将四种菌液等体积混合制得葡萄球菌混合菌液。
3、副干酪乳杆菌GforU-7上清液添加及异戊酸含量检测
将GforU-7灭活上清液以10％(V/V)的比例加入葡萄球菌混合菌液中，未添加该上清液的为对照，分别37℃培养2h，然后用气相色谱法测定样品和对照的异戊酸含量，并计算添加上清液后异戊酸含量降低率。
结果见表6：
表6 GforU-7的添加对异戊酸产量的降低率
Figure BDA0003623508470000082
Figure BDA0003623508470000091
结果如表6所示，GforU-7具有降低葡萄球菌产生异戊酸的作用，降低率为69.77％。
实施例8 GforU-7改变菌群比例治疗痤疮的作用
1、将活化的副干酪乳杆菌GforU-7菌液以MRS液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整至OD600＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得GforU-7灭活上清液样品。
2、皮肤菌群菌液制备：
将痤疮丙酸杆菌CGMCC 1.5003和表皮葡萄球菌CGMCC 1.4260分别用BHI培养基37℃培养18h，检测并调整至OD600＝0.2。
3、添加上清液影响皮肤菌群生长实验
将灭活上清液以10％(V/V)的比例分别加入两种皮肤菌群菌液中，37℃培养16h，以两种菌液的相对浓度(OD600)的比值为指标评价GforU-7对痤疮相关菌群生长的影响。
相对浓度比值计算公式为：相对浓度比值的计算公式为：A菌和B菌的相对浓度比值＝(实验组A菌的浓度/对照组A菌的浓度)/(实验组B菌的浓度/对照组B菌的浓度)。
结果见表7：
表7 GforU-7对痤疮相关菌群生长影响
Figure BDA0003623508470000092
结果如表7所示，GforU-7对痤疮丙酸杆菌有显著抑制作用，而对皮肤有益菌表皮葡萄球菌的抑制作用相对较弱。GforU-7能够明显降低痤疮丙酸杆菌与表皮葡萄球菌的相对浓度比值，降低痤疮丙酸杆菌与表皮葡萄球菌的相对比例，从而达到治疗痤疮的目的。
实施例9 GforU-7改变菌群比例从而改善敏感肌的作用
1、将活化的副干酪乳杆菌GforU-7菌液以MRS液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16～18h，检测并调整至OD600＝2.0，121℃，30min灭活，离心取上清液，0.22μm滤膜过滤，得GforU-7灭活上清液样品。
2、敏感肌相关菌群菌液制备：
将金黄色葡萄球菌CGMCC 1.8721和表皮葡萄球菌CGMCC 1.4260分别用BHI培养基37℃培养18h，检测并调整至OD600＝0.2。
3、添加上清液影响敏感肌相关菌群生长实验
将GforU-7灭活上清液以10％(V/V)的比例分别加入两种皮肤菌群菌液中，37℃培养2h，以两种菌液相对浓度(OD600)的比值为指标评价GforU-7对敏感肌相关菌群生长的影响。
相对浓度比值计算公式为：相对浓度比值的计算公式为：A菌和B菌的相对浓度比值＝(实验组A菌的浓度/对照组A菌的浓度)/(实验组B菌的浓度/对照组B菌的浓度)。
结果见表8：
表8 GforU-7对敏感肌相关菌群生长影响
Figure BDA0003623508470000101
结果如表8所示，GforU-7对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，而对皮肤有益菌表皮葡萄球菌的抑制作用相对较弱。GforU-7能够降低金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的相对浓度比值，降低金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的相对比例，从而有效改善敏感肌。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株副干酪乳杆菌，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M20211531。
2.保藏编号为CCTCC NO：M20211531的副干酪乳杆菌在制备调节皮肤微生态系统的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调节皮肤微生态系统包括：调节痤疮相关菌群、改善敏感肌相关菌群、抑制臭汗症相关菌群生长、抑制臭汗症相关菌群产生异戊酸、抗炎和/或修复皮肤屏障。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调节痤疮相关菌群包括降低痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对比例。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述改善敏感肌相关菌群包括降低金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的相对比例。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述臭汗症相关菌群包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌和干燥棒状杆菌中至少一种。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗炎包括降低NO释放量和/或下调炎症因子水平，所述炎症因子包括IL-8和TRPV1中至少一种。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修复皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因表达；所述屏障修护相关基因包括FLG和LOR中至少一种。
9.一种调节皮肤微生态系统的产品，其特征在于，其原料包括权利要求1所述的副干酪乳杆菌。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，包括医药品、食品、保养品或化妆品。
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