CN115927122A - 副干酪乳酪杆菌制备的具有促进宿主ha合成并增强ha应用效果的后生元 - Google Patents
副干酪乳酪杆菌制备的具有促进宿主ha合成并增强ha应用效果的后生元 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了副干酪乳酪杆菌制备的具有促进宿主HA合成并增强HA应用效果的后生元，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供的副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元具有促进宿主HA合成并增强HA应用效果的作用：促进肠道细胞、皮肤细胞的HA合成；增加衰老小鼠皮肤、关节、脑等组织的HA合成；增加衰老小鼠皮肤、关节、脑等组织的HA水平；增强HA提升小鼠背部皮肤的角质层含水量、提升小鼠背部的皮肤弹性、提升衰老小鼠皮肤的GSH含量和CAT、GSH‑Px的活性，因此，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元具有促进宿主HA合成和/或增强HA在预防和/或缓解皮肤衰老相关症状的作用，具有巨大应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及副干酪乳酪杆菌制备的具有促进宿主HA合成并增强HA应用效果的后生元，属于微生物技术领域及医药技术领域。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid,HA)又名玻尿酸，是一种由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸的双糖重复单位组成的一种线性糖胺聚糖。广泛存在哺乳动物机体内，尤其在皮肤、眼、关节、心、脑等组织含量丰富。HA以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如抗氧化、保湿、润滑关节、眼球等，调节血管壁的通透性、调节蛋白质、水电解质的扩散及转运、缓解疼痛、促进创伤愈合等。随着机体的年龄增长，体内的HA含量逐渐下降，导致机体出现许多不舒服症状，如眼花、皮肤干燥、有细纹，关节僵硬等问题，所以需要通过一些手段增加组织内的HA含量。
CN111902149A公开了一种促进HA合成的方法，其方法是利用多糖衍生物或其盐与透明质酸产生细胞接触，从而可实现促进该透明质酸产生细胞中透明质酸的合成。CN115068377A提供了一种蝉花提取物在促进成纤维细胞合成透明质酸中的应用，将其制备得到的蝉花提取物用于化妆品中，可提高皮肤中HA的含量。CN 113081878A公开了一种用于促进皮肤HA合成的组合物，所述组合物包括0.01-5.0重量份L-乳酸。CN 105582036B发明了一种利用蒲公英提取物或者其分馏物有效促进HA的生成以及HAS的表达的方法。上述专利都是利用常规物质直接刺激细胞，实现细胞HA合成的目的。
HA是由定位于细胞质膜内表面的透明质酸合成酶(Hyaluronic acid synthase，HAS)通过交替连接UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)和UDP-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)，从而产生分子量约为3-4×103kDa的HA聚集体。随后，新合成的HA聚合物通过硫酸化或部分异构化为葡萄糖醛酸而没有进一步的修饰，并通过各自膜整合域形成的通道分泌到细胞表面。在这个过程中，HAS的活性和UDP-GlcNAc和UDP-GlcA前体的供应是影响HA的合成的两个关键因素。在哺乳动物体内，HAS包含3种同工酶：HAS1、HAS2和HAS3，这些HAS亚型具有相似的结构和氨基酸序列，都能催化合成不同大小的HA，是HA合成过程的限速酶。另外，UDP-GlcNAc和UDP-GlcA两个前体的合成是通过糖酵解副产物G6P开始合成经由一系列酶催化合成的，其中UDP-GlcA合成过程的受UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-Glucose dehydrogenase,UGDH)限速酶调控。由此可知，调控UGDH、HAS1、HAS2、HAS3的酶活性可促进HA的合成，从而达到提升宿主HA水平的目的。
发明内容
本发明要提供一种能由副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)制备的促进宿主HA合成并增强HA应用效果的后生元。
本发明通过细胞实验筛选能够调控UGDH、HAS1、HAS2、HAS3酶活性的后生元，有针对性地筛选能够刺激HA合成的后生元，从外源性补充HA以提升组织部位的HA含量转变为促进内源性HA的合成使其直在组织部位发挥作用，避免了陷入HA的吸收难题，另外，后生元是一类灭活的益生菌，比活益生菌具有更广泛、安全的应用，可与不同分子或受体相互作用产生抗氧化、免疫调节、抗菌作用等，也能够影响宿主代谢和信号通路，从而产生特定的生理反应。
本发明提供了一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293，所述副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293已于2022年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62971，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
所述副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293是从健康人体粪便中分离得到的，该菌株经测序分析，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，得到比对结果后，鉴定结果为副干酪乳酪杆菌。
所述副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293在显微镜下细胞呈现轻微不规则、圆形末端、非运动的弯曲杆菌，接种于MRS培养基上培养48h后的菌落一般呈乳白色，光滑凸起，直径为0.5-2mm的圆形。
所述副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，喜温，最适生长温度为35～40℃，最适生长pH为6.0-7.0。
本发明提供了一种组合物，所述组合物包含上述副干酪乳酪杆菌CCFM1293和/或上述副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元。
在本发明的一种实施方式中，所述后生元包括死细胞、发酵上清液、菌体裂解物和/或发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵液的制备方法为将上述副干酪乳酪杆菌CCFM1293接种于发酵培养基中培养获得菌液，进行热处理后获得发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述热处理的条件为为60～95℃，25～35min。
在本发明的一种实施方式中，所述菌体裂解物的制备方法为，将所述副干酪乳酪杆菌CCFM1293接种于发酵培养基中培养获得的菌液进行高压均质，离心得到菌体裂解物。
在本发明的一种实施方式中，所述死细胞为，将所述副干酪乳酪杆菌CCFM1293接种于发酵培养基中培养获得的菌液进行离心获得的菌泥沉淀，经热处理或冻干后得到的灭活菌体细胞。
在本发明的一种实施方式中，将所述副干酪乳酪杆菌CCFM1293接种于发酵培养基中培养获得的菌液离心获得的上清。
在本发明的一种实施方式中，所述粉剂为将制备得到的副干酪乳酪杆菌CCFM1293液态后生元经喷雾干燥、真空冷冻干燥、流化床干燥、真空干燥制备的固态粉剂后生元。
本发明提供了上述副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293和/或在制备调控宿主HA含量的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的调控宿主HA含量主要包括皮肤、关节、脑等组织部位的HA水平。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用方式有局部外用和口服使用。
本发明还提供含有所述副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元的食品、保健品、药品、化妆品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、保健品、药品、化妆品中还含有HA。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、药品、化妆品中含有的HA可适用于任何分子量。
本发明提供了上述组合物在制备预防和/或缓解皮肤衰老相关症状的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述与皮肤衰老相关的症状包含皮肤干燥、松弛、皱纹产生、氧化损伤。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括食品、保健品、药品或化妆品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括上述组合物及常规辅料，
在本发明的一种实施方式中，所述常规辅料包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂、以及营养强化剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述保健品包括上述组合物及常规辅料，
在本发明的一种实施方式中，所述常规辅料包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂、以及营养强化剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述药品包含上述组合物、药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂以及附加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
在本发明的一种实施方式中，所述化妆品包括上述组合物、基质原料和/或常规辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述基质原料包括油脂类原料、蜡类原料、合成油脂原料、粉质原料、胶质原料、凝剂、表面活性剂。
在本发明的一种实施方式中，所述常规辅料包括保湿剂、美白剂、矫味剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、薄膜剂、抗氧化剂、乳化剂以及化妆品营养添加剂中的一种或多种。
本发明提供了一种产品，所述产品包含上述副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293和/或上述组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为用于通过调控宿主HA含量和/或与HA联合可预防和/或缓解皮肤衰老相关症状的复合产品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品具有促进宿主HA合成的应用，以及增强HA在预防和/或缓解皮肤衰老相关症状的作用；所述的促进宿主自身HA合成的应用方式主要包括局部外用或口服应用。所述的促进宿主HA合成主要包括皮肤、关节、脑等组织部位的HA合成。所述的增强HA应用主要通过调控UGDH mRNA和HAS2 mRNA的表达。所述与皮肤衰老相关的症状包含皮肤干燥、松弛、皱纹产生、氧化损伤。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括如下至少一种作用：
(1)促进肠道细胞(HT29)的HA合成；
(2)促进皮肤细胞(HaCaT)的HA合成；
(3)显著增加衰老小鼠皮肤、关节、脑等组织的HA合成；
(4)显著增加衰老小鼠皮肤、关节、脑等组织的HA水平；
(5)增强HA提升小鼠背部皮肤的角质层含水量的效果；
(6)增强HA提升小鼠背部的皮肤弹性的效果；
(7)增强HA提升衰老小鼠皮肤的GSH含量和CAT、GSH-Px的活性的效果；
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述副干酪乳酪杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFM1293制备的后生元的剂量不低于60mg/kg体重。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、保健品、药品或化妆品。
在一种实施方式中，所述食品包括上述组合物及常规辅料。
在一种实施方式中，所述常规辅料包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂、以及营养强化剂中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述保健品包括上述组合物及常规辅料。
在一种实施方式中，所述常规辅料包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂、以及营养强化剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述药品包含组合物、药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒以及脂质体。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂以及附加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素以及精制卵磷脂。
在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包含颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
在本发明的一种实施方式中，所述化妆品包括上述组合物、基质原料和/或常规辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述基质原料包括油脂类原料、蜡类原料、合成油脂原料、粉质原料、胶质原料、凝剂、表面活性剂。
在本发明的一种实施方式中，所述常规辅料包括保湿剂、美白剂、矫味剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、薄膜剂、抗氧化剂、乳化剂以及化妆品营养添加剂中的一种或多种。
有益效果
本发明筛选得到了一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293，此副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293制备的后生元外用和口服皆具有促进宿主HA合成和/或增强HA在预防和/或缓解皮肤衰老相关症状的能力，具体体现在：
(1)促进肠道细胞(HT29)的HA合成；
(2)促进皮肤细胞(HaCaT)的HA合成；
(3)显著增加衰老小鼠皮肤、关节、脑等组织的HA合成；
(4)显著增加衰老小鼠皮肤、关节、脑等组织的HA水平；
(5)增强HA提升小鼠背部皮肤的角质层含水量的效果；
(6)增强HA提升小鼠背部的皮肤弹性的效果；
(7)增强HA提升衰老小鼠皮肤的GSH含量和CAT、GSH-Px的活性的效果；
因此，副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293制备的后生元在制备促进宿主HA合成和/或预防和/或缓解皮肤衰老相关症状的产品中，具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293，分类学命名为Lacticaseibacillus paracasei，已于2022年11月13日藏于保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62971，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
附图说明
图1：不同后生元对HT29细胞增殖的影响。
图2：不同后生元对HT29细胞中UGDH mRNA、HAS2 mRNA表达的影响。
图3：不同后生元对HaCaT细胞增殖的影响。
图4：不同后生元对HaCaT细胞中UGDH mRNA、HAS3 mRNA表达的影响。
图5：小鼠实验流程图。
图6：不同后生元对小鼠皮肤组织HA含量以及UGDH mRNA、HAS2 mRNA表达的影响。
图7：不同后生元对小鼠关节组织HA含量以及UGDH mRNA、HAS2 mRNA的影响。
图8：不同后生元对小鼠脑组织HA含量以及HAS2 mRNA的影响。
图9：小鼠实验流程图。
图10：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元协同HA对皮肤角质层含水量的影响。
图11：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元协同HA对皮肤弹性的影响。
图12：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元协同HA对小鼠皮肤GSH含量、GSH-Px、CAT活性的影响。
“*”表示与Model组具有统计学差异(P<0.05)，“**”表示与Model组具有显著性统计学差异(P<0.01)，“***”表示与Model组具有极其显著的统计学差异(P<0.001)。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的人结肠癌细胞株(HT29)和人永生化角质形成细胞(HaCaT)购自：上海细胞库。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的BALB/c小鼠购自维通利华公司。下述实施例中所涉及的副干酪乳酪杆菌CQ-BS-2-1、植物乳杆菌23、植物乳杆菌QS6-1、副干酪乳酪杆菌FFJND15-L2、副干酪FJS-CZ-D2-L-3、副干酪乳酪杆菌FXJWS3M2、植物乳杆菌FZJTZ29M8来自江南大学食品生物技术中心自筛菌株。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L以及吐温-80 1mL/L，pH 6.2～6.4。
MRS固体培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、吐温-80 1mL/L以及琼脂20.0g/L，pH 6.2～6.4。
细胞培养基：89％(v/v)DMEM培养基+10％(v/v)胎牛血清+1％(v/v)100×青霉素和链霉素混合溶液(混合溶液中青霉素含量10000U/mL，链霉素浓度10mg/mL)。
实施例1：副干酪乳酪杆菌的筛选和鉴定
具体步骤如下：
1、筛选
样本来源于健康人体粪便，将样本经预处理后，在30％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀并吸取0.5mL样本加到4.5mL生理盐水中，以含有9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取副干酪乳酪杆菌的典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到副干酪乳酪杆菌CCFM1293；其中，副干酪乳酪杆菌的典型菌落呈圆形、乳白色、光滑凸起。
2、鉴定
提取菌株CCFM1293的基因组，将菌株CCFM1293的16S rDNA进行扩增和测序(由苏州金唯智生物科技有限公司进行)，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为副干酪乳酪杆菌，命名为副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293。
实施例2：细胞复苏和培养
首先取出冻存的人结肠癌细胞株(HT29)和人永生化角质形成细胞(HaCaT)，迅速在37℃水浴锅中快速融化，然后1000r/min离心3min，弃去上清，加入适当体积的细胞培养基重悬细胞后置于培养皿中,放入含有5％ CO2的37℃培养箱进行培养，当细胞恢复活力生长1～2d达到70％～80％融合时进行细胞传代。
实施例3：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备后生元
(1)利用MRS固体培养基在37℃隔水式恒温培养箱中培养24-48h，得到单菌落；挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，于37℃培养12-18h，得到培养液1；
将培养液1以2％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养12h，得到种子液；
将种子液以3-5％(v/v)接种于MRS液体培养基中进行扩培，于温度为37℃培养18-24h得到菌液，其浓度为4.8×1010CFU/ml。
将菌液热处理(65℃，30min)，再于高压均质机高压均质(800～1200MPa，3次)获得菌体裂解物，冻干得到后生元冻干粉备用，制备得到副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元。
(2)按照步骤(1)的方法制备得到副干酪乳酪杆菌CQ-BS-2-1后生元、植物乳杆菌23后生元、植物乳杆菌QS6-1后生元、副干酪乳酪杆菌FFJND15-L2后生元、副干酪FJS-CZ-D2-L-3后生元、副干酪乳酪杆菌FXJWS3M2后生元、植物乳杆菌FZJTZ29M8后生元。
实施例4：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元对HT29细胞增殖的影响
具体步骤如下：
(1)取对数生长期的HT29细胞100μl以5×105个细胞/孔的浓度接种于96孔板，其中最外圈用PBS溶液填充，防止边缘效应，培养24h待其贴壁后，设置空白组、对照组和后生元处理组；
空白组为，只含有细胞培养基而不含有HT29细胞；
对照组为，含有细胞培养基和HT29细胞，而不含有后生元；
处理组为，采用细胞培养基重悬后生元(重悬后的后生元的量与发酵至浓度为1.0×107CFU/ml的菌液制备的后生元的量相当)，加入100μl副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元、副干酪乳酪杆菌CQ-BS-2-1后生元、植物乳杆菌23后生元、植物乳杆菌QS6-1后生元、副干酪乳酪杆菌FFJND15-L2后生元、副干酪乳酪杆菌FJS-CZ-D2-L-3后生元。
(2)分别将上述孔板在温度为：37℃的培养箱孵育4h，孵育结束后每孔加入10μlCCK8溶液孵育2h测450nm处的吸光值(OD)。
按下列公式计算细胞的增殖率：细胞的增殖率(％)＝(处理组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。
对细胞增殖的影响如图1所示，与对照组(细胞增殖率100％)相比，添加副干酪乳酪杆菌CCFM1293、副干酪乳酪杆菌CQ-BS-2-1、植物乳杆菌23、植物乳杆菌QS6-1、副干酪乳酪杆菌FFJND15-L2、副干酪FJS-CZ-D2-L-3制备的后生元在灭活菌体浓度为1.0×107CFU/ml时的细胞增殖率分别为132％、107％、101％、103％、109％、103％，对HT29细胞的增殖没有抑制作用，可选为合适的后生元浓度用于后续的细胞实验。
实施例5：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元对HT29细胞中UGDH mRNA和HAS2mRNA表达的影响
具体步骤如下：
(1)将HT29细胞以2.5×106个/ml接种于12孔板上，培养细胞过夜待细胞贴壁。弃去旧培养基，使用PBS冲洗3遍，设置对照组和处理组；
对照组为，不加后生元的组别，只含有HT29细胞和细胞培养基；
处理组为，副干酪CCFM1293、副干酪乳酪杆菌CQ-BS-2-1、植物乳杆菌23、植物乳杆菌QS6-1、副干酪乳酪杆菌FFJND15-L2、副干酪FJS-CZ-D2-L-3制备的后生元，用细胞培养基重悬后生元(重悬后的后生元的量与发酵至浓度为1.0×107CFU/ml的菌液制备的后生元的量相当)，分别吸取2ml副干酪乳酪杆菌CCFM1293、副干酪乳酪杆菌CQ-BS-2-1、植物乳杆菌23、植物乳杆菌QS6-1、副干酪乳酪杆菌FFJND15-L2、副干酪FJS-CZ-D2-L-3制备的后生元到含有HT29细胞的孔板中，分别将上述各组孔板在温度为：37℃的培养箱孵育4h，每个样品三个平行。
(2)待后生元与细胞共培养结束后，弃去培养上清，每孔用PBS迅速洗涤3次，每孔加1mL细胞裂解液，反复吹打，吸取细胞裂解液提取RNA，并使用RT-PCR反转录试剂盒逆转录为cDNA，通过实时荧光定量法检测HT29细胞中基因的表达情况，利用2-△△Ct公式计算UGDHmRNA和HAS2 mRNA表达，其中内参为GAPDH，所述的引物描述于下表1中。结果如图2所示。
表1：引物序列
| 低聚(Oligo)名称 | 序列 | 描述 |
| F-qPCR-hUGDH | CTTGCCCAGAGAATAAGCAG | UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH) |
| R-qPCR-hUGDH | CAAATTCAGAACATCCTTTTGGA | UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH) |
| F-qPCR-hHAS2 | TCCTGGATCTCATTCCTCAGC | 透明质酸合成酶2(HAS2) |
| R-qPCR-hHAS2 | TGCACTGAACACACCCAAAATA | 透明质酸合成酶2(HAS2) |
由图2可知，相较于对照组，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元显著地促进了HT29细胞中UGDH mRNA、HAS2 mRNA的表达。
通过实验结果可知，以对照组的表达量为1，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元能够上调HT29细胞中的UGDH mRNA、HAS2 mRNA的表达，相对表达量分别为：1.58和3.78。其它后生元处理组均未表现出对UGDH mRNA表达的上调作用，在对HAS2 mRNA表达影响中，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元组的相对表达量比上调HAS2 mRNA表达最高的其它后生元组(后生元CQ-BS-2-1)表达量(1.35)提高了1.8倍。
UGDH和HAS2都是HA合成过程中的关键酶，通过调控UGDH mRNA的表达可以控制UDP-GlcA的含量，而UDP-GlcA又是HA合成过程中的前体物质，进而可影响HA的含量。HA的两个前体UDP-GlcA和UDP-GlcNAc在HAS2的作用下在细胞质膜上通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接成线性糖胺聚糖，通过调控HAS2 mRNA的表达可控制细胞中HA的水平。
由此可说，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元通过在肠道中具有通过调控UGDH mRNA、HAS2 mRNA的表达影响HA的合成，进而可影响宿主的HA含量的潜在能力。
实施例6：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元对HaCaT细胞增殖的影响
具体步骤如下：
(1)取对数生长期的HaCaT细胞100μl以5×105个细胞/孔的浓度接种于96孔板，其中最外圈用PBS溶液填充，防止边缘效应，培养24h待其贴壁后，设置空白组、对照组和后生元处理组；
空白组为，只含有细胞培养基而不含有HaCaT细胞的组别的空白组；
对照组为，含有细胞培养基和HaCaT细胞，而不含有后生元的组别；
处理组，采用细胞培养基重悬后生元(重悬后的后生元的量与发酵至浓度为1.0×107CFU/ml的菌液制备的后生元的量相当)，加入100μl副干酪CCFM1293、副干酪乳酪杆菌FXJWS3M2、植物乳杆菌FZJTZ29M8、植物乳杆菌23制备的后生元。
(2)分别将上述孔板在培养箱孵育4h，对照组为不加后生元的组别，孵育结束后每孔加入10μl CCK8溶液孵育2h测450nm处的吸光值(OD)。
按下列公式计算细胞的增殖率：细胞的增殖率(％)＝(处理组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。
对细胞增殖的影响如图3所示，与对照组相比，副干酪乳酪杆菌CCFM1293、副干酪乳酪杆菌FXJWS3M2、植物乳杆菌FZJTZ29M8、植物乳杆菌23制备的后生元的增殖率分别为131％、116％、104％、108％，对HaCaT细胞的增殖具有促进作用，可选为合适的后生元浓度用于后续的细胞实验。
实施例7：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元对HaCaT细胞中UGDH mRNA和HAS3 mRNA的影响
具体步骤如下：
(1)将HaCaT细胞以2.5×106个/ml接种于12孔板上，培养细胞过夜待细胞贴壁。弃去旧培养基，使用PBS冲洗3遍，设置对照组和处理组；
对照组为不加后生元的组别；
处理组分组为副干酪乳酪杆菌CCFM1293、副干酪乳酪杆菌FXJWS3M2、植物乳杆菌FZJTZ29M8、植物乳杆菌23，采用细胞培养基重悬后生元(重悬后的后生元的量与发酵至浓度为1.0×107CFU/ml的菌液制备的后生元的量相当)，分别吸取2ml副干酪乳酪杆菌CCFM1293、副干酪乳酪杆菌FXJWS3M2、植物乳杆菌FZJTZ29M8、植物乳杆菌23加入到12孔板里，培养4h，每个样品三个平行。
(2)待后生元与细胞共培养结束后，弃去培养上清，每孔用PBS迅速洗涤3次，每孔加1mL细胞裂解液，反复吹打，吸取细胞裂解液提取RNA，并使用RT-PCR反转录试剂盒逆转录为cDNA，通过实时荧光定量法检测HaCaT细胞中基因的表达情况，利用2-△△Ct公式计算UGDHmRNA和HAS3 mRNA的表达量，其中内参为GAPDH，所述的引物描述于下表2中，结果如图4所示。
表2：引物序列
| 低聚(Oligo)名称 | 序列 | 描述 |
| F-qPCR-hUGDH | CTTGCCCAGAGAATAAGCAG | UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH) |
| R-qPCR-hUGDH | CAAATTCAGAACATCCTTTTGGA | UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH) |
| F-qPCR-hHAS3 | GAGATGTCCAGATCCTCAACAA | 透明质酸合成酶3(HAS3) |
| R-qPCR-hHAS3 | CCCACTAATACACTGCACAC | 透明质酸合成酶3(HAS3) |
结果显示，由图4可知，以对照组的表达量约为1，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元显著地促进了HaCaT细胞中UGDH mRNA、HAS3 mRNA的表达，表达量分别为：2.19、2.06。
其它后生元(FXJWS3M2、FZJTZ29M8)处理后的UGDH mRNA表达量约为1.21、1.21，与对照组相比均未表现出对UGDH mRNA表达的上调作用，在对HAS3 mRNA表达影响中，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元组表达量比上调HAS3 mRNA表达最高的后生元组表达量(1.24)提高了66％。
通过实验结果可知，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元能够上调HaCaT细胞中的UGDH mRNA、HAS3 mRNA的表达。其中UGDH是合成UDP-GlcA的限速酶，UDP-GlcA是HA合成过程中的前体物质，HAS3是HA合成酶系的一种，其表达变化直接影响HA的分子量和含量。由此可知，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元在组织部位具有通过促进UGDH mRNA、HAS2mRNA的表达增加HA的合成，进而增加宿主HA水平的潜在能力。
实施例8：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元对衰老小鼠皮肤HA水平的影响
下述实施例中所涉及的副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌的制备方法同实施例3，区别在于，获得菌液后离心后收集菌泥，不进行热处理及高压均质。对照组植物乳杆菌、副干酪乳酪杆菌的活菌的制备方法同副干酪乳酪杆菌CCFM1293。
具体步骤如下：
(1)取8周龄健康雄性BALB/c小鼠45只，随机分为9笼，每笼5只，9笼分别为：除模型组(Model)为2笼，空白组和其余组各1笼，分别为：
空白组(Control)：使用生理盐水作为对照；
CCFM1293-L组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
CCFM1293-D组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
23-L组：使用植物乳杆菌23活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
23-D组：使用植物乳杆菌23后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
3M2-L组：使用副干酪FXJWS3M2活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
3M2-D组：使用副干酪FXJWS3M2后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
其中，以上各组中后生元：相应活菌等菌体量发酵后的菌液制备得到的后生元。
实验共9周：小鼠适应一周后，除空白组外，其余组0.2mL/只/天皮下注射D-半乳糖(500mg/kg)，从第二周开始，各干预组用相应菌株的冻干粉或菌株制备的后生元冻干粉(以相应剂量溶于生理盐水)以0.2mL/只/天的量对小鼠进行灌胃，空白组与模型组灌胃等量生理盐水作为对照，直至实验结束。所有分组均为自由饮水和摄食，其实验流程如图5所示。
实验结束后处死小鼠，剪取小鼠背部皮肤组织按与预冷PBS 1:9的重量体积比制备匀浆，通过ELISA HA试剂盒检测皮肤的HA含量，并检测皮肤组织HA合成过程中的关键酶UGDH、HAS1-3的基因表达水平，所用内参为小鼠GAPDH，所述的引物描述于下表3中。
表3：引物序列
| 低聚(Oligo)名称 | 序列 | 描述 |
| F-qPCR-hUGDH | AGTAGTCGAATCCTGTCGAGG | UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH) |
| R-qPCR-hUGDH | CTCCGTGACAATTTTGTACCCA | UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH) |
| F-qPCR-hHAS2 | TGTGAGAGGTTTCTATGTGTCCT | 透明质酸合成酶2(HAS2) |
| R-qPCR-hHAS2 | ACCGTACAGTCCAAATGAGAAGT | 透明质酸合成酶2(HAS2) |
通过图6可知，与对照组的HA含量相比(7.89ng/mg)，模型组皮肤的HA含量显著降低为6.24ng/mg皮肤组织，副干酪CCFM1293活菌组未影响皮肤HA含量(6.22ng/mg)，在口服由副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元后，显著地增加衰老小鼠皮肤组织中的HA含量到7.02ng/mg，比其它增加皮肤后生元较高组别(后生元FXJWS3M2，数值为6.28ng/mg)高了11.78％。
进一步检测相关HA合成酶的表达发现，后生元CCFM1293组的UGDH mRNA和HAS2mRNA的相对表达量分别为2.75和3.0，而其它组后生元并未提高UGDH mRNA(后生元23数值较高，较高值为1.03)和HAS2 mRNA的表达(后生元FXJWS3M2数值较高，较高值为1.33)，这说明由副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元显著地上调了UGDH mRNA和、HAS2 mRNA的表达，从而增加了皮肤地HA含量。
通过细胞实验结果和动物实验结果综合可知，在HT29细胞和HaCaT细胞中得到的可促进UGDH mRNA、HAS2 mRNA、HAS3 mRNA表达的副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元在口服动物实验中抑制了衰老小鼠中的HA流失，说明副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元可通过上调UGDH mRNA、HAS2 mRNA的表达促进HA合成过程来维持宿主的HA水平。
实施例9：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元对衰老小鼠关节HA合成的影响
下述实施例中所涉及的副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌的制备方法同实施例3，区别在于，获得菌液后离心后收集菌泥，不进行热处理及高压均质。对照组植物乳杆菌、副干酪乳酪杆菌的活菌的制备方法同副干酪乳酪杆菌CCFM1293。
具体步骤如下：
(1)取8周龄健康雄性BALB/c小鼠45只，随机分为9笼，每笼5只，9笼分别为：除模型组(Model)为2笼，空白组和其余组各1笼，分别为：
空白组(Control)：使用生理盐水作为对照；
CCFM1293-L组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
CCFM1293-D组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
23-L组：使用植物乳杆菌23活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
23-D组：使用植物乳杆菌23后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
3M2-L组：使用副干酪FXJWS3M2活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
3M2-D组：使用副干酪FXJWS3M2后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
其中，以上各组中后生元：相应活菌等菌体量发酵后的菌液制备得到的后生元。
实验共9周：小鼠适应一周后，除空白组外，其余组0.2mL/只/天皮下注射D-半乳糖(500mg/kg)，从第二周开始，各干预组用相应菌株的冻干粉或菌株制备的后生元冻干粉(以相应剂量溶于生理盐水)以0.2mL/只/天的量对小鼠进行灌胃，空白组与模型组灌胃等量生理盐水作为对照，直至实验结束。所有分组均为自由饮水和摄食，其实验流程如图5所示。
实验结束后处死小鼠，收集关节组织按与PBS 1:6的重量体积比制备匀浆，通过ELISA HA试剂盒检测关节的HA含量，并检测关节组织HA合成过程中的关键酶UGDH、HAS1-3的基因表达水平，所述的引物描述于下表4中。
表4：引物序列
| 低聚(Oligo)名称 | 序列 | 描述 |
| F-qPCR-hUGDH | AGTAGTCGAATCCTGTCGAGG | UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH) |
| R-qPCR-hUGDH | CTCCGTGACAATTTTGTACCCA | UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH) |
| F-qPCR-hHAS2 | TGTGAGAGGTTTCTATGTGTCCT | 透明质酸合成酶2(HAS2) |
| R-qPCR-hHAS2 | ACCGTACAGTCCAAATGAGAAGT | 透明质酸合成酶2(HAS2) |
通过图7可知，与对照组相比(0.91ng/mg)，模型组关节的HA含量显著降低为0.70ng/mg关节组织，副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌组未显著影响关节HA含量(0.71ng/mg)在与模型组相比，口服由副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元后，显著地增加了衰老小鼠关节组织中的HA含量到0.83ng/mg，比其它增加关节HA含量的后生元较高组别(后生元FXJWS3M2组较高，数值为0.77ng/mg)高了7.8％。
进一步检测相关HA合成酶的表达发现，后生元CCFM1293组的UGDH mRNA和HAS2mRNA的相对表达量分别为2.09和2.15，而其它组后生元并未提高UGDH mRNA(后生元FXJWS3M2数值较高，较高值为0.89)和HAS2 mRNA的表达(后生元FXJWS3M2数值较高，为1.10)，这说明与模型组相比，口服由副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元显著地增加了衰老小鼠关节组织中的HA含量，且显著地促进了关节组织中的UGDH mRNA、HAS2mRNA的表达。
通过细胞实验结果和动物实验结果综合可知，在HT29细胞和HaCaT细胞中得到的可促进UGDH mRNA、HAS2 mRNA表达的副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元在口服动物实验中抑制了衰老小鼠中的HA流失，说明副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元可通过上调UGDH mRNA、HAS2 mRNA的表达促进HA合成过程来维持宿主的HA水平。
实施例10：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元对衰老小鼠脑HA合成的影响
下述实施例中所涉及的副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌的制备方法同实施例3，区别在于，获得菌液后离心后收集菌泥，不进行热处理及高压均质。对照组植物乳杆菌、副干酪乳酪杆菌的活菌的制备方法同副干酪乳酪杆菌CCFM1293。
具体步骤如下：
(1)取8周龄健康雄性BALB/c小鼠45只，随机分为9笼，每笼5只，9笼分别为：除模型组(Model)为2笼，空白组和其余组各1笼，分别为：
空白组(Control)：使用生理盐水作为对照；
CCFM1293-L组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
CCFM1293-D组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
23-L组：使用植物乳杆菌23活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
23-D组：使用植物乳杆菌23后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
3M2-L组：使用副干酪FXJWS3M2活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
3M2-D组：使用副干酪FXJWS3M2后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
其中，以上各组中后生元：相应活菌等菌体量发酵后的菌液制备得到的后生元。
实验共9周：小鼠适应一周后，除空白组外，其余组0.2mL/只/天皮下注射D-半乳糖(500mg/kg)，从第二周开始，各干预组用相应菌株的冻干粉或菌株制备的后生元冻干粉(以相应剂量溶于生理盐水)以0.2mL/只/天的量对小鼠进行灌胃，空白组与模型组灌胃等量生理盐水作为对照，直至实验结束。所有分组均为自由饮水和摄食，其实验流程如图5所示。
实验结束后处死小鼠，剪取脑组织按与PBS 1:3的重量体积比制备匀浆，通过ELISA HA试剂盒检测脑部的HA含量，并检测脑组织HA合成过程中的关键酶UGDH、HAS1-3的基因表达水平，所述的引物描述于下表5中。
表5：引物序列
| 低聚(Oligo)名称 | 序列 | 描述 |
| F-qPCR-hHAS2 | TGTGAGAGGTTTCTATGTGTCCT | 透明质酸合成酶2(HAS2) |
| R-qPCR-hHAS2 | ACCGTACAGTCCAAATGAGAAGT | 透明质酸合成酶2(HAS2) |
通过图8可知，与对照组相比(0.61ng/mg)，模型组脑的HA含量显著降低为0.47ng/mg脑组织，副干酪CCFM1293活菌组未影响脑HA含量(0.49ng/mg)在与模型组相比，口服由副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元后，显著地增加了衰老小鼠关节组织中的HA含量到0.54ng/mg，比其它增加脑HA含量的后生元较高组别(植物乳杆菌23组较高，数值为0.49ng/mg)提高了10.2％。
进一步检测相关HA合成酶的表达发现，后生元CCFM1293组对HAS2 mRNA的相对表达量为2.31，而其它组后生元并未提高HAS2 mRNA的表达(后生元FXJWS3M2数值较高，较高值为1.03)，这说明与模型组相比，口服由副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元显著地增加了衰老小鼠脑组织中的HA含量，且显著地促进了脑组织中的HAS2 mRNA的表达。
通过细胞实验结果和动物实验结果综合可知，在HT29细胞中得到的可促进HAS2mRNA表达的副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元在口服动物实验中抑制了衰老小鼠脑HA流失，说明副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元可通过上调HAS2 mRNA的表达促进HA合成过程来维持宿主的HA水平。
实施例11：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元与HA使用对衰老小鼠皮肤角质层含水量的影响
具体步骤如下：
(1)HA溶液的配制：将HA以4.1g/ml的终浓度溶于无菌生理盐水中，经0.22μm过滤器过滤除菌后分装并保存于-4℃直至使用。
(2)取8周龄健康雄性BALB/c小鼠50只，随机分为10笼，每笼5只，10笼分别为：除模型组(Model)有2笼外，其余各组为1笼，其余各组分别为：
空白组(Control)：使用生理盐水作为对照；
HA组：使用浓度为4.1g/ml透明质酸；
CCFM1293-D组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
CCFM1293-DH组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元+HA；后生元冻干粉以相应剂量溶于生理盐水得到的后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃；剂量为：后生元为500mg/kg小鼠体重，透明质酸浓度为4.1g/ml；
23-D组：使用植物乳杆菌23后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
23-DH组：使用植物乳杆菌23后生元组+HA；后生元冻干粉以相应剂量溶于生理盐水得到的后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃；剂量为：后生元为500mg/kg小鼠体重，透明质酸浓度为4.1g/ml；
3M2-D组：使用副干酪FXJWS3M2后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
3M2-DH组：使用副干酪FXJWS3M2后生元组+HA；后生元冻干粉以相应剂量溶于生理盐水得到的后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃；剂量为：后生元为500mg/kg小鼠体重，透明质酸浓度为4.1g/ml；
其中，以上各组中后生元：相应活菌等菌体量发酵后的菌液制备得到的后生元。
实验共9周：小鼠适应一周后，除空白组外，其余组0.2mL/只/天皮下注射D-半乳糖(500mg/kg)，从第二周开始，各纯菌或后生元组用相应菌株的冻干粉或菌株制备的后生元冻干粉(以相应剂量溶于生理盐水)以0.2mL/只/天的量对小鼠进行灌胃，后生元协同HA组以后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃，空白组与模型组灌胃等量生理盐水作为对照，直至实验结束。所有分组均为自由饮水和摄食，其实验流程如图9所示。
实验终点时采用德国CK公司的皮肤水分测试仪检测各小鼠背部的角质层含水量，结果如图10所示。
由图10可知，与空白组(20.98)相比，模型组的角质层含水量显著降低(12.61)，HA组的角质层含水量(16.23)相比模型组升高了28.71％左右，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元组的含水量(15.93)比模型组增加了26.33％左右，CCFM1293制备的后生元与HA协同组的背部含水量(18.88)比模型组升高了49.72％，比单一灌胃HA或副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元表现出更高的含水量升高，比其它后生元协同HA较高组(后生元FXJWS3M2+HA组较高，数值为14.67)升高了16.34％。
通过实验结果可知，由副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元可以增加衰老小鼠背部的水分含量，在衰老过程中，HA浓度逐渐降低，导致其持水能力下降，外源性补充HA和促进内源性HA的合成能够缓解衰老过程中的皮肤水分流失，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元与HA一同口服在阻止衰老过程中的皮肤干燥具有协同增效的作用。
实施例12：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元与HA使用对衰老小鼠皮肤弹性的影响
具体步骤如下：
(1)HA溶液的配制：将HA以4.1g/ml的浓度溶于无菌生理盐水中，经0.22μm过滤器过滤除菌后分装并保存于-4℃直至使用。
(2)取8周龄健康雄性BALB/c小鼠50只，随机分为10笼，每笼5只，10笼分别为：除模型组(Model)有2笼外，其余各组为1笼，其余各组分别为：
空白组(Control)：使用生理盐水作为对照；
HA组：使用浓度为4.1g/ml透明质酸；
CCFM1293-D组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
CCFM1293-DH组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元+HA；后生元冻干粉以相应剂量溶于生理盐水得到的后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃；剂量为：后生元为500mg/kg小鼠体重，透明质酸浓度为4.1g/ml；
23-D组：使用植物乳杆菌23后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
23-DH组：使用植物乳杆菌23后生元组+HA；后生元冻干粉以相应剂量溶于生理盐水得到的后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃；剂量为：后生元为500mg/kg小鼠体重，透明质酸浓度为4.1g/ml；
3M2-D组：使用副干酪FXJWS3M2后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
3M2-DH组：使用副干酪FXJWS3M2后生元组+HA；后生元冻干粉以相应剂量溶于生理盐水得到的后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃；剂量为：后生元为500mg/kg小鼠体重，透明质酸浓度为4.1g/ml；
其中，以上各组中后生元：相应活菌等菌体量发酵后的菌液制备得到的后生元。
实验共9周：小鼠适应一周后，除空白组外，其余组0.2mL/只/天皮下注射D-半乳糖(500mg/kg)，从第二周开始，各纯菌或后生元组用相应菌株的冻干粉或菌株制备的后生元冻干粉(以相应剂量溶于生理盐水)以0.2mL/只/天的量对小鼠进行灌胃，后生元协同HA组以后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃，空白组与模型组灌胃等量生理盐水作为对照，直至实验结束。所有分组均为自由饮水和摄食，其实验流程如图9所示。
实验终点未处死小鼠前，麻醉小鼠后采用德国CK公司的皮肤弹性测试仪检测各小鼠背部的皮肤弹性。
由图11可知，与空白组(0.74)相比，与模型组的皮肤弹性显著降低(0.42)，相比较，HA组的皮肤弹性(0.56)相比模型组升高了33.33％左右，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元组的皮肤弹性(0.52)比模型组增加了23.81％左右，CCFM1293制备的后生元与HA协同组的弹性(0.62)比模型组升高了47.62％，比单一灌胃HA或副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元表现出更高的弹性增加，比其它后生元协同HA较高组(后生元23+HA组较高，数值0.47)的皮肤弹性增加了了11.90％。
通过实验结果可知，由副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元与HA协同使用可以显著地增加衰老小鼠背部的皮肤弹性，在衰老过程中，HA浓度逐渐降低，支撑细胞骨架和细胞空间的弹性能力下降，而外源性补充HA与促进内源性HA的合成协同缓解了衰老过程中的皮肤弹性降低，因此与HA协同使用比单一灌胃HA或副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元的显著地增加了衰老小鼠的背部皮肤弹性。
实施例13：副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元与HA使用对衰老小鼠皮肤抗氧化水平的影响
下述实施例中所涉及的副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌的制备方法同实施例3，获得菌液后离心后收集菌泥，不进行热处理及高压均质；对照组副干酪乳酪杆菌、植物乳杆菌的活菌的制备方法同副干酪乳酪杆菌CCFM1293。
具体步骤如下：
(1)HA溶液的配制：将HA以4.1g/ml的浓度溶于无菌生理盐水中，经0.22μm过滤器过滤除菌后分装并保存于-4℃直至使用。
(2)取8周龄健康雄性BALB/c小鼠40只，随机分为8笼，每笼5只，8笼为：、除模型组(Model)2笼外，其余各组皆1笼其余各组分别为：
空白组(Control)：使用生理盐水作为对照；
HA组：使用浓度为4.1g/ml透明质酸；
CCFM1293-L组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1224活菌，剂量为：5×109CFU/kg小鼠体重；
CCFM1293-LH组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌+HA；将副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃；剂量为：CCFM1293活菌5×109CFU/kg小鼠体重，透明质酸浓度为4.1g/ml；
CCFM1293-D组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元，剂量为：500mg/kg小鼠体重；
CCFM1293-DH组：使用副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元+HA；后生元冻干粉以相应剂量溶于生理盐水得到的后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃；剂量为：后生元为500mg/kg小鼠体重，透明质酸浓度为4.1g/ml；
其中，以上各组中后生元：相应活菌等菌体量发酵后的菌液制备得到的后生元。
实验共9周：小鼠适应一周后，除空白组外，其余组0.2mL/只/天皮下注射D-半乳糖(500mg/kg)，从第二周开始，各纯菌或后生元组用相应菌株的冻干粉或菌株制备的后生元冻干粉(以相应剂量溶于生理盐水)以0.2mL/只/天的量对小鼠进行灌胃，纯菌或后生元协同HA组以菌或后生元的溶液与HA溶液等体积混合后，以0.4mL/只/天的量对小鼠进行灌胃，空白组与模型组灌胃等量生理盐水作为对照，直至实验结束。所有分组均为自由饮水和摄食，实验流程如图9所示。
处死小鼠前，取小鼠背部皮肤与PBS以1:10的重量体积比制备皮肤匀浆，通过相应试剂盒检测GSH的含量和CAT、GSH-Px的活性。
结果如图12所示，对皮肤的GSH含量影响方面，相比较模型组(GSH含量约为21μmol/gprot)、HA组的GSH含量约为32μmol/gprot；副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌组的GSH含量约为27.46μmol/gprot；副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元组的GSH含量约为27μmol/gprot)，活菌与HA协同组(GSH含量约为31μmol/gprot)，而CCFM1293制备的后生元组与HA协同组(GSH含量约为41μmol/gprot)的GSH含量较高，更接近空白组的GSH含量(48.39μmol/gprot)。
在对皮肤抗氧化酶CAT活力影响方面，相比较模型组(分别为57U/mgprot)，副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌组和副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌组协同HA组的CAT数值分别为51U/mgprot、70U/mgprot，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元与HA协同组(110U/mgprot)比HA组(89U/mgprot)和CCFM1293制备的后生元组(82U/mgprot)更显著的升高了衰老小鼠皮肤的CAT活性。
在对皮肤抗氧化酶GSH-Px的活力影响方面，相比较模型组(156U/mgprot)，副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌组和副干酪乳酪杆菌CCFM1293活菌协同HA组的GSH-Px数值分别为174U/mgprot、206U/mgprot，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元与HA协同组(256U/mgprot)比HA组(218U/mgprot)和CCFM1293制备的后生元组(188U/mgprot)更显著的升高了衰老小鼠皮肤的GSH-Px的活性。
通过实验结果可知，副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元协同HA显著地增加了衰老小鼠皮肤的GSH含量和抗氧化酶CAT、GSH-Px的活性，两者的协同使用增强了衰老皮肤的抗氧化能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1293，已于2022年11月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62971，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
2.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述副干酪乳酪杆菌CCFM1293和/或含有权利要求1所述副干酪乳酪杆菌CCFM1293制备的后生元。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述后生元包括死细胞、发酵上清液、菌体裂解物和/或发酵液，或其经任意干燥方式制备的粉剂。
4.一种制备副干酪乳酪杆菌CCFM1293后生元的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌CCFM1293接种于发酵培养基中培养获得菌液，再将菌液进行热处理和均质裂解后获得后生元。
5.权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌CCFM1293或权利要求2～3任一所述组合物在促进细胞HA合成中的应用，或在制备预防和/或缓解皮肤衰老的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、化妆品、护肤品、药品。
7.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌CCFM1293或权利要求2～3任一所述组合物。
8.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品包括食品、保健品、化妆品或药品。
9.一种用于促进细胞HA合成和/或增强HA在预防和/或缓解皮肤衰老相关症状方面作用的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述副干酪乳酪杆菌CCFM1293或权利要求2～3任一所述组合物。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品包括如下至少一种作用：
(1)促进肠道细胞的HA合成；
(2)促进皮肤细胞的HA合成；
(3)增加衰老小鼠皮肤、关节、脑等组织的HA合成；
(4)增加衰老小鼠皮肤、关节、脑等组织的HA水平；
(5)增强HA提升小鼠背部皮肤的角质层含水量的效果；
(6)增强HA提升小鼠背部的皮肤弹性的效果；
(7)增强HA提升衰老小鼠皮肤的GSH含量和CAT、GSH-Px的活性的效果。
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