CN114836349A - 拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌la16及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA16及其应用，属于微生物技术领域。所述嗜酸乳杆菌LA16分类命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏编号为CGMCC NO.22771，保藏日期为2021年6月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。本发明通过分离获得的嗜酸乳杆菌LA16具有高耐胃酸存活率，有效抑制幽门螺旋杆菌的定植和生长活力，对胃肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等均有有很好的疗效，并有较好的临床效果。

Description

拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA16及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA16及其应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori，Hp)是一种螺旋弯曲、多鞭毛、末端钝圆、单极的革兰阴性细菌，能通过共用碗筷、水源、唾液等多种途径传染，是引起消化性溃疡、十二指肠炎等多种胃肠道疾病的主要致病因素。对于幽门螺旋杆菌感染消化性溃疡患者治疗的关键在于根除幽门螺旋杆菌，四联疗法是目前临床治疗本病的常用手段，能够有效根除幽门螺旋杆菌感染，改善病情。但随着临床治疗发现，受幽门螺旋杆菌耐药、抗菌药物不良反应等因素影响，幽门螺旋杆菌根除率有所下降，影响治疗效果。
乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生乳酸的细菌的通称。乳酸菌自身在代谢过程中能够产生多种抑菌物质，这些物质在细菌体内的核糖体中合成具有抑菌活性的多肽类物质，能够对多种细菌产生抑制作用。同时，乳酸菌也被认为是人体肠道中的重要微生物之一，与人体的健康息息相关。嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中的重要成员，具有维持肠道的微生态平衡，降低肠道内的pH值，预防和抑制病原菌及肿瘤的发生等功能特性，还可以增强机体免疫力、促进消化。
从中医角度给出的建议是，在医院查出了幽门螺旋杆菌感染，一般不建议使用药物去除，做到规律作息健康饮食即可。并且临床上常见的治疗方法“抗生素三联/四联”法长期服用会使患者造成一定的耐药性。基于此以及幽门螺旋杆菌较强的传染性，故需要研发一种含乳酸菌的保健性食品，此种乳酸菌既可在人体内存活，其本身或发酵产物又可以抑制幽门螺旋杆菌的生长，以此达到以“食疗”来治病的目的。
目前市面上已经有可以抑制幽门螺旋杆菌的益生菌产品，并且作为临床治疗的辅助手段结合抗生素一同食用已经初见成效。考虑到幽门螺旋杆菌潜在感染群体较大且定期体检意识弱，研发此类乳酸菌并作为日常食品来降低感染程度非常必要。
发明内容
本发明的目的在于提出拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA16及其应用，具有高耐胃酸存活率，有效抑制幽门螺旋杆菌的定植和生长活力，对胃肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等均有有很好的疗效，并有较好的临床效果。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA16，所述嗜酸乳杆菌LA16分类命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏编号为CGMCC NO.22771，保藏日期为2021年6月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明进一步提供如上述嗜酸乳杆菌LA16在制备抑制幽门螺旋杆菌生长的产品以及尿素酶活性抑制剂中的应用。
本发明进一步提供如上述嗜酸乳杆菌LA16在制备治疗由于幽门螺旋杆菌感染而导致的胃肠部疾病的药品中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述胃肠部疾病包括胃肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡。
本发明进一步提供一种包含上述嗜酸乳杆菌LA16的活菌制剂，所述活菌制剂中，嗜酸乳杆菌LA16的活菌数为109-1012cfu/g。
本发明进一步提供一种治疗胃溃疡的产品，包含上述嗜酸乳杆菌LA16粉，所述嗜酸乳杆菌LA16的活菌数为109-1012cfu/g。
作为本发明的进一步改进，包含罗伊氏乳杆菌LR06粉、凝结芽孢杆菌BC01粉和嗜酸乳杆菌LA16粉，质量比为(3-7)：(1-3)：(2-5)。
作为本发明的进一步改进，还包含益生元组合物和有益酸组合物，所述益生元组合物为大豆低聚糖、乳酮糖的复配混合物，质量比为(3-5)：2；所述有益酸组合物为α-硫辛酸和乳酸的复配混合物，质量比为(5-7)：5。
作为本发明的进一步改进，所述嗜酸乳杆菌LA16粉的制备方法如下：将嗜酸乳杆菌LA16接种到MRS液体培养基中，接种量为2-4wt％，在35-40℃条件下，兼性厌氧培养12-24h，菌液经过离心，真空冷冻干燥，获得嗜酸乳杆菌LA16粉。
作为本发明的进一步改进，所述MRS液体培养基由以下原料按重量份制备而成：蛋白胨5-15份、牛肉粉2-7份、酵母粉2-6份、磷酸氢二钾1-3份、柠檬酸三铵1-3份、乙酸钠3-7份、葡萄糖15-25份、吐温80 0.5-2mL、硫酸镁0.1-0.3份、硫酸锰0.02-0.07份、琼脂10-20份、蒸馏水1000份。
本发明具有如下有益效果：
本发明通过分离获得的嗜酸乳杆菌LA16具有高耐胃酸存活率，有效抑制幽门螺旋杆菌的定植和生长活力，对胃肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等均有有很好的疗效，并有较好的临床效果。
本发明提供的治疗胃溃疡的产品，含有丰富的包含嗜酸乳杆菌LA16的益生菌组合物，存储携带方便，使用效果好，可以用于预防及治疗胃溃疡等因幽门螺旋杆菌感染而引起的疾病。
本发明通过加入罗伊氏乳杆菌LR06粉、凝结芽孢杆菌BC01粉和嗜酸乳杆菌LA16粉得到益生菌组合物，起到很好的抑制幽门螺旋杆菌的效果，其中，罗伊氏乳杆菌LR06粉能够与幽门螺杆菌竞争糖脂类受体，减少其定植，减少胃黏膜的炎症反应，从而保护胃黏膜，同时，罗伊氏乳杆菌LR06粉分泌的罗氏菌素能够下调如空泡毒素A基因(Va-cA)、鞭毛蛋白A基因(flaA)等毒力基因的表达水平，抑制幽门螺旋杆菌的生长，显著减少幽门螺旋杆菌菌落数量。凝结芽孢杆菌BC01能够影响核因子-κB(NF-κB)等信号通路，降低致炎因子包括白介素-8(IL-8)等的水平，减少胃黏膜炎性细胞浸润，同时促进抗炎因子的生成，包括白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)等，多途径减轻局部炎症反应；嗜酸乳杆菌LA16的添加能够抑制幽门螺杆菌生长，降低尿素酶活性，抑制幽门螺杆菌胃上皮细胞黏附，同时具有高耐胃酸性，三种益生菌协同组合能起到很好的预防和减轻幽门螺杆菌感染，治疗和预防胃肠炎、胃溃疡以及十二指肠溃疡等疾病的作用。
益生元组合物为大豆低聚糖、乳酮糖的复配混合物，通过选择性的刺激本发明添加的益生菌菌落中的生长与活性，从而抑制幽门螺旋杆菌的生长，减少其定植，降低尿素酶的分泌，减少炎症因子的产生，促进抗氧化反应，从而进一步抑制幽门螺旋杆菌的生长和活性。
α-硫辛酸酸是一种超强的抗氧化剂，可以被各组织脏器吸收，促进体内清除自由基反应，增加谷胱甘肽的合成，起到抗氧化调节的效果；乳酸不仅可以通过降低幽门螺杆菌值起到抑制作用，还能够抑制尿素酶活性实现抗菌作用，其代谢产物有机酸还可通过三羧酸循环使幽门螺杆菌失去生长繁殖所必需的能量，从而抑制幽门螺杆菌的活性与增殖，两者均为有益酸类，两者组合能起到更好的抑制幽门螺旋杆菌感染的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为嗜酸乳杆菌LA16的菌落形态图；
图2为嗜酸乳杆菌LA16的菌体形态图；
图3为实施例6中各组菌在模拟胃酸中的存活率对比图；
图4为实施例7中各组菌对幽门螺旋杆菌的抑制活性对比图；
图5为实施例9中各组小鼠溃疡抑制率对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
罗伊氏乳杆菌LR06粉，凝结芽孢杆菌BC01粉均由本公司提供，活菌数均为50亿cfu/g。
本发明一种嗜酸乳杆菌LA16，分类命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus，保藏编号为CGMCC NO.22771，保藏日期为2021年6月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
实施例1嗜酸乳杆菌LA16的筛选及鉴定
1、嗜酸乳杆菌LA16的筛选
1.1样品来源
本发明所使用的菌株均收集自内内蒙古呼伦贝尔草原发酵羊奶制品——自制酸奶，即本发明来自于内蒙古的自制酸奶作为样品。
1.2培养基的配制
样品分离和菌株筛选所用的培养基为MRS液体培养基，成分如下：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。
1.3菌株的分离
将1g样品放入10mL步骤1.2制得的MRS液体培养基中，混匀后于36℃下培养，然后在超净台中吸取富集液1mL，进行十倍梯度稀释，选取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度的菌液100μL涂于含有无菌MRS固体培养基(购于北京路桥公司)的培养皿上，于有氧条件下36℃静置培养24-48h，至有明显单菌落形成后，从培养基中选择生长有70-120个单菌落的平板，挑取典型菌落，在MRS固体平板培养基上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，得培养，物做菌株鉴定。
1.4菌株的保藏
挑选单菌落到MRS液体培养基中，于36℃下进行增殖培养36h，吸取500μL菌液加入0.8mL 60％(v/v)的甘油管中，于-80℃冷冻保藏。
2、嗜酸乳杆菌LA16的鉴定
2.1菌落特征
嗜酸乳杆菌LA16在MRS固体培养基中培养24h后，菌落呈白色，圆形，不透明，边缘整齐，见图1。
2.2显微镜下形态
嗜酸乳杆菌LA16菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，菌体呈杆状，0.6-0.8μm×0.9-2.8μm，单个、成对或呈链状排列，见图2。
2.3 16S rDNA鉴定
鉴定单位：上海美吉生物医药科技有限公司。
鉴定序列：
GACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGCAGTCGAGTTGCAGACTGCAGTCCGAACTGAGAACAGCTTTAAGAGATTCGCTTGCCTTCGCAGGCTTGCTCCTCGTTGTACTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTTAGTGTCCCCGAAGGGAACTCCGTATCTCTACGGATTGCACTAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTCCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGAAAAACAGTTTCCGATGCAGTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTATTCTTCCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTTCACCAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATTGCCTTGGTAGGCCGTTACCCTACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGGCCATCCCATAGCGACAGCTTACGCCGCCTTTTATAAGCTGATCATGCGATCTGCTTTCTTATCCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGGTATCCCAGACTATGGGGCAGGTTCCCCACGTGTTACTCACCCATCCGCCG。
鉴定结果：根据菌株的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的菌株为Lactobacillus acidophilus(嗜酸乳杆菌)。
实施例2嗜酸乳杆菌LA16粉的制备
MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。
制备方法：将装有嗜酸乳杆菌LA16的甘油管从-80℃取出，活化培养，得到含菌量为108cfu/g的菌种种子液，稀释100倍后，接种到MRS液体培养基中，接种量为3wt％，在36℃条件下，兼性厌氧培养24h(氧气浓度8％、二氧化碳浓度7％、氮气浓度85％的环境，该％为体积％)，菌液经过离心，真空冷冻干燥，获得嗜酸乳杆菌LA16粉，测得嗜酸乳杆菌LA16菌株的活菌数为1010cfu/g。
实施例3治疗胃溃疡的产品
原料组成(重量份)：罗伊氏乳杆菌LR06粉3份、凝结芽孢杆菌BC01粉1份、实施例2制得的嗜酸乳杆菌LA16粉2份、大豆低聚糖0.3份、乳酮糖0.2份、α-硫辛酸0.05份、乳酸0.05份。
将各组分混合后搅拌混合30min，得到治疗胃溃疡的产品。
实施例4治疗胃溃疡的产品
原料组成(重量份)：罗伊氏乳杆菌LR06粉7份、凝结芽孢杆菌BC01粉3份、实施例2制得的嗜酸乳杆菌LA16粉5份、大豆低聚糖0.5份、乳酮糖0.2份、α-硫辛酸0.07份、乳酸0.05份。
将各组分混合后搅拌混合30min，得到治疗胃溃疡的产品。
实施例5治疗胃溃疡的产品
原料组成(重量份)：罗伊氏乳杆菌LR06粉5份、凝结芽孢杆菌BC01粉2份、实施例2制得的嗜酸乳杆菌LA16粉3.5份、大豆低聚糖0.4份、乳酮糖0.2份、α-硫辛酸0.06份、乳酸0.05份。
将各组分混合后搅拌混合30min，得到治疗胃溃疡的产品。
对比例1
与实施例5相比，未添加罗伊氏乳杆菌LR06粉，其他条件均不改变。
对比例2
与实施例5相比，未添加凝结芽孢杆菌BC01粉，其他条件均不改变。
对比例3
与实施例5相比，未添加嗜酸乳杆菌LA16粉，其他条件均不改变。
对比例4
与实施例5相比，未添加α-硫辛酸，其他条件均不改变。
对比例5
与实施例5相比，未添加乳酸，其他条件均不改变。
实施例6嗜酸乳杆菌LA16菌株耐酸能力测试
模拟胃酸的配制：取NaCl 2g、胃蛋白酶3.2g、36.5％浓盐酸7mL，然后加水至1000mL，混匀，0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。
取实施例2制得的嗜酸乳杆菌LA16粉1g，转移到37℃预热的装有10mL模拟胃液试管中，37℃、70r/min处理0.5h、1.5h、2h。对样品溶液进行稀释后进行活菌计数，每个处理3个重复。
相同条件下以嗜酸乳杆菌La28(Lactobacillus acidophilus La28)、植物乳杆菌LP45(Lactobacillus plantarum LP45)(均由河北一然生物科技有限公司提供)对对照，菌株溶液、活菌量与嗜酸乳杆菌LA16相同。
模拟胃酸存活率的结果如图3。由图可知，嗜酸乳杆菌LA16在体外模拟胃酸实验时，存活率远超过其他对照菌株。
实施例7嗜酸乳杆菌LA16对幽门螺旋杆菌的抑制试验
1、菌株培养：将幽门螺旋杆菌接种在含有羊血清(10％)的布氏肉汤培养基中，在微氧条件下(氧气浓度8％、二氧化碳浓度7％、氮气浓度85％的环境，该％为体积％)，37℃下培养24h，取5mL菌液，5000r/min离心5min，用生理盐水(0.8％，w/v)重悬菌体，将菌液浓度调整至约108cfu/mL，再稀释300倍。
2、采用单层琼脂平板扩散法，稀释控制菌数在106cfu/mL。吸取幽门螺旋杆菌菌液0.2mL于固体培养基平板上，涂布均匀，放置1h待表面的菌液固定在平板的表面后打孔，孔的直径8mm，孔深3mm，将0.01g(108cfu/mL左右)嗜酸乳杆菌LA16、嗜酸乳杆菌La28(Lactobacillus acidophilus La28)、植物乳杆菌LP45(Lactobacillus plantarum LP45)加入0.1mL无菌水中，然后注入孔内，于37℃培养8h观察结果，测定抑菌圈直径，结果如图4所示。每个平板三个孔，做两个平板平行。
由图可知，嗜酸乳杆菌LA16在抑制幽门螺旋杆菌方面远超过其他对照菌株。
实施例8嗜酸乳杆菌LA16对尿素酶的抑制能力测试
1、菌株培养：将幽门螺旋杆菌接种在含有羊血清(10％)的布氏肉汤培养基中，在微氧条件下(氧气浓度8％、二氧化碳浓度7％、氮气浓度85％的环境，该％为体积％)，37℃下培养24h。
2、幽门螺旋杆菌尿素酶的提取：取50mL培养好的幽门螺旋杆菌菌液(含菌量为108cfu/mL)，4℃下5000r/min离心20min，收集幽门螺旋杆菌，用pH7.4的磷酸缓冲溶液洗涤3次，将幽门螺旋杆菌置于-80℃下保存1d，取出恢复至室温，加入3mL去离子水和蛋白酶抑制剂，1000W超声60s，4℃下，15000r/min离心10min，上层清液经SephadexG-25层析柱除盐，向粗酶中加入等体积的甘油，4℃下储存备用
3、受试溶液的配制：将实施例2中的嗜酸乳杆菌LA16粉和实施例3-5和申报了1-5制得的治疗胃溃疡的产品溶于去离子水中，配制成不同浓度的受试溶液。
4、抑制尿素酶活性的试验：在96孔板中加入25μL尿素酶溶液(10U/mL)，25μL受试溶液，在37℃下培养45min，加入50μL含尿素25mmol的PBS缓冲溶液(pH＝2.4)，在37℃下培养15min，然后加入50μL甲试剂(含有127mmol/L苯酚和0.168mmol/L硝普钠)和50μL乙试剂(125mmol/L NaOH和11.3mmol/LNaOCl)，在37℃下培养25min，测定620nm吸光度，并根据以下公式计算抑制率：
抑制率(％)＝[1-(OD受试-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100
空白组中，25μL受试溶液替换为25μL去离子水-PBS缓冲液(去离子水：PBS缓冲液＝1:5，PBS缓冲液的pH＝2.5)，50μL含尿素25mmol的PBS缓冲溶液(pH＝2.5)替换为50μLPBS缓冲溶液(pH＝2.5)，其他条件与测试组相同。
对照组中，25μL受试溶液替换为25μL去离子水-PBS缓冲液(去离子水：PBS缓冲液＝1:5，PBS缓冲液的pH＝2.5)，其他条件与测试组相同。
计算尿素酶的IC50。结果见表1。
表1
Figure BDA0003643454180000121
Figure BDA0003643454180000131
由上表可知，本发明实施例2制得的嗜酸乳杆菌LA16粉具有很好的抑制尿素酶活性，实施例3-5制得的治疗胃溃疡的产品抑制尿素酶的活性更好。
实施例9动物实验
造模：将除了空白组外其他组大鼠灌胃2wt％吲哚美辛水溶液，3mL/kg，每日1次，共灌胃2次，第6天灌胃2mL饱和碳酸氢钠，15min后灌胃1mL幽门螺旋杆菌菌液(含菌量为1012cfu/mL)，每2天1次，共灌胃4次。
分组与给药：SD大鼠96只，雌雄各半，随机分为12组，每组8只，设立模型组(等量生理盐水)，实施例2-5组、对比例1-5组(1g·kg-1)和阳性组(丽珠得乐0.8g·kg-1)和空白组(等量生理盐水)，丽珠得乐剂量根据《药理实验方法学》中动物和人的等效剂量换算而来。
干预8天后，处死小鼠，剪取小鼠的胃组织，显微镜下测量溃疡面积，将每只鼠溃疡面积的总和分为5个等级，作为溃疡指数用于溃疡程度的评价。
评分如下：
溃疡面积1-12mm2，溃疡指数1；
溃疡面积13-25mm2，溃疡指数2；
溃疡面积26-37mm2，溃疡指数3；
溃疡面积38-50mm2，溃疡指数4；
溃疡面积>50mm2或穿孔，溃疡指数1。
溃疡抑制率(％)＝(模型组溃疡指数-模型组溃疡指数)/模型组溃疡指数×100％
结果见图5。
由上表可知，本发明实施例2制得的嗜酸乳杆菌LA16粉以及实施例3-5制得的治疗胃溃疡的产品能明显改善大鼠的溃疡情况，对溃疡起到很好的抑制作用。
取大鼠胃黏膜组织匀浆后，根据ELISA法检测TNF-α、IL-8含量。结果见表2。
表2
组别 TNF-α(pg/mL) IL-8(pg/mL)
空白组 0.65±0.09 11.57±1.12
模型组 1.64±0.11<sup>*</sup> 24.72±4.21<sup>*</sup>
阳性组 0.77±0.10<sup>#</sup> 14.56±1.82<sup>#</sup>
实施例2 0.91±0.14<sup>#</sup> 15.73±1.92<sup>#</sup>
实施例3 0.82±0.12<sup>#</sup> 14.82±1.78<sup>#</sup>
实施例4 0.78±0.07<sup>#</sup> 14.47±1.45<sup>#</sup>
实施例5 0.72±0.12<sup>#</sup> 13.82±1.67<sup>#</sup>
对比例1 1.07±0.14 17.75±1.48
对比例2 1.32±0.17 20.38±1.58
对比例3 1.21±0.16 18.82±1.62
对比例4 0.99±0.13 16.23±1.79
对比例5 0.96±0.12 16.47±1.85
注释：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。
由上表可知，本发明实施例2制得的嗜酸乳杆菌LA16粉以及实施例3-5制得的治疗胃溃疡的产品能明显降低幽门螺旋杆菌阳性大鼠TNF-α、IL-8含量，降低胃黏膜组织中炎症因子水平，减缓胃部炎症，从而缓解胃溃疡的发生。
对比例1、2、3中与实施例5相比，分别未添加罗伊氏乳杆菌LR06粉、凝结芽孢杆菌BC01粉和嗜酸乳杆菌LA16粉，其对尿素酶的抑制作用和缓解小鼠溃疡、减少炎症因子水平明显下降，本发明通过加入罗伊氏乳杆菌LR06粉、凝结芽孢杆菌BC01粉和嗜酸乳杆菌LA16粉得到益生菌组合物，起到很好的抑制幽门螺旋杆菌的效果，其中，罗伊氏乳杆菌LR06粉能够与幽门螺杆菌竞争糖脂类受体，减少其定植，减少胃黏膜的炎症反应，从而保护胃黏膜，同时，罗伊氏乳杆菌LR06粉分泌的罗氏菌素能够下调如空泡毒素A基因(Va-cA)、鞭毛蛋白A基因(flaA)等毒力基因的表达水平，抑制幽门螺旋杆菌的生长，显著减少幽门螺旋杆菌菌落数量。凝结芽孢杆菌BC01能够影响核因子-κB(NF-κB)等信号通路，降低致炎因子包括白介素-8(IL-8)等的水平，减少胃黏膜炎性细胞浸润，同时促进抗炎因子的生成，包括白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)等，多途径减轻局部炎症反应；嗜酸乳杆菌LA16的添加能够抑制幽门螺杆菌生长，降低尿素酶活性，抑制幽门螺杆菌胃上皮细胞黏附，同时具有高耐胃酸性，三种益生菌协同组合能起到很好的预防和减轻幽门螺杆菌感染，治疗和预防胃肠炎、胃溃疡以及十二指肠溃疡等疾病的作用。
对比例4、5与实施例5相比，分别未添加α-硫辛酸酸或乳酸，其对尿素酶稍有下降，溃疡抑制率下降，炎症因子水平稍有上升。α-硫辛酸酸是一种超强的抗氧化剂，可以被各组织脏器吸收，促进体内清除自由基反应，增加谷胱甘肽的合成，起到抗氧化调节的效果；乳酸不仅可以通过降低幽门螺杆菌值起到抑制作用，还能够抑制脲酶活性实现抗菌作用，其代谢产物有机酸还可通过三羧酸循环使幽门螺杆菌失去生长繁殖所必需的能量，从而抑制幽门螺杆菌的活性与增殖，两者均为有益酸类，两者组合能起到更好的抑制幽门螺旋杆菌感染的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA16，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌LA16分类命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏编号为CGMCC NO.22771，保藏日期为2021年6月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
2.如权利要求1所述嗜酸乳杆菌LA16在制备抑制幽门螺旋杆菌生长的产品以及尿素酶活性抑制剂中的应用。
3.如权利要求1所述嗜酸乳杆菌LA16在制备治疗由于幽门螺旋杆菌感染而导致的胃肠部疾病的药品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胃肠部疾病包括胃肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡。
5.一种包含权利要求1所述嗜酸乳杆菌LA16的活菌制剂，其特征在于，所述活菌制剂中，嗜酸乳杆菌LA16的活菌数为109-1012cfu/g。
6.一种治疗胃溃疡的产品，其特征在于，包含权利要求1所述嗜酸乳杆菌LA16粉，所述嗜酸乳杆菌LA16的活菌数为109-1012cfu/g。
7.根据权利要求6所述治疗胃溃疡的产品，其特征在于，包含罗伊氏乳杆菌LR06粉、凝结芽孢杆菌BC01粉和嗜酸乳杆菌LA16粉，质量比为(3-7)：(1-3)：(2-5)。
8.根据权利要求6所述治疗胃溃疡的产品，其特征在于，还包含益生元组合物和有益酸组合物，所述益生元组合物为大豆低聚糖、乳酮糖的复配混合物，质量比为(3-5)：2；所述有益酸组合物为α-硫辛酸和乳酸的复配混合物，质量比为(5-7)：5。
9.根据权利要求6所述治疗胃溃疡的产品，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌LA16粉的制备方法如下：将嗜酸乳杆菌LA16接种到MRS液体培养基中，接种量为2-4wt％，在35-40℃条件下，兼性厌氧培养12-24h，菌液经过离心，真空冷冻干燥，获得嗜酸乳杆菌LA16粉。
10.根据权利要求9所述治疗胃溃疡的产品，其特征在于，所述MRS液体培养基由以下原料按重量份制备而成：蛋白胨5-15份、牛肉粉2-7份、酵母粉2-6份、磷酸氢二钾1-3份、柠檬酸三铵1-3份、乙酸钠3-7份、葡萄糖15-25份、吐温80 0.5-2mL、硫酸镁0.1-0.3份、硫酸锰0.02-0.07份、琼脂10-20份、蒸馏水1000份。
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