CN114806980B - 一种用于培养活体生物药的培养基及其应用 - Google Patents

一种用于培养活体生物药的培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于培养活体生物药的培养基及其应用，所述用于培养活体生物药的培养基中包含蛋白胨、牛肉膏、乳酮糖、低聚甘露糖、棉子糖、酵母浸膏、柠檬酸氢二铵、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、吐温‑80和L‑半胱氨酸；所述活体生物药包括罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、戊糖片球菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌或格氏乳杆菌中的任意一种或至少两种的组合。所述培养基对于活体生物药生长、增殖、代谢、以及功效发挥均具有预料不到的促进效果。所述功效例如对胃肠疾病、免疫性疾病、癌症、阴道炎等疾病的预防或治疗。

Description

一种用于培养活体生物药的培养基及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种用于培养活体生物药的培养基及其应用，具体涉及一种促进活体生物药生长增殖及功效发挥的培养基及其应用。
背景技术
活体生物药（Live biotherapeutic，LBPs）是指活的生物（细菌等），适用于预防、治疗或治愈人类某种疾病，其不属于疫苗也不是可过滤的病毒，一般来说是不会通过注射方式给药的，其是一种新兴的具有颠覆性的新型药物。例如，粪菌移植（FMT）是较早被研究开发的活体生物药，但其质量和安全性难以控制，粪便菌群不能长期保存，无法实现工业化和标准化生产，而且FMT过程和供体筛选流程较复杂，因此目前国内外学者关于LBPs的主要研究重心在功能型益生菌和二代益生菌上。
当前，国内外现有的活体生物药较少，绝大部分处于在研阶段，其研究的主要问题在于LBPs如何发挥其治疗疾病药效的有效性和稳定性。因此，对活体生物药进行优化培养，以保证功能型菌株的稳定生长，耐受性高，可产业化，保质期内活菌数高且稳定，使其成功通过临床前、临床各个阶段的研究。通过对人体微生态环境的纠正，使人体恢复健康。有别于抗生素疗法的时效性，微生态疗法会使人体保持长久的健康，这必然会是未来医疗的发展趋势。将活体生物药应用至胃肠道疾病、神经性疾病、免疫疾病、肿瘤和癌症以及女性健康等领域，使得众多患者摆脱药物治疗带来的恐惧和副作用，安全性高，具有极高的应用价值。
然而，现有技术中提出的改良的益生菌培养基仅限于对益生菌生长增殖的促进。一方面，这些改良培养基对于益生菌的增殖促进作用比较有限，另一方面，益生菌相应功能的提升仅通过活菌数的提升来实现，对于在活菌数一定时，能够通过改变培养条件进一步提高益生菌的功能还未见报道。
而对于要用于治疗的益生菌等，即活体生物药来说，其功效的发挥至关重要。因此，如何提供一种用于培养活体生物药的培养基，以实现既能促进活体生物药生长增殖，又能进一步促进其功效的发挥，成为了本领域目前迫切需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于培养活体生物药的培养基及其应用，具体提供一种促进活体生物药生长增殖及功效发挥的培养基及其应用。
所述功效是指对疾病的预防或治疗效果，所述疾病包括胃肠疾病、代谢相关疾病、呼吸性疾病、免疫性疾病、癌症、妇科疾病等，具体例如呼吸道过敏性疾病（如哮喘等）、高血压、乳腺癌、结肠癌、非酒精性脂肪性肝病、细菌性阴道炎等。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于培养活体生物药的培养基，所述用于培养活体生物药的培养基中包含蛋白胨、牛肉膏、乳酮糖、低聚甘露糖、棉子糖、酵母浸膏、柠檬酸氢二铵、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、吐温-80和L-半胱氨酸。
低聚甘露糖是由D-甘露糖通过β-1,4糖苷键连接形成主链，在主链或支链上连接葡萄糖而成，聚合度在2～10之间的寡糖。
所述活体生物药包括罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、戊糖片球菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌或格氏乳杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如副干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌的组合、詹氏乳杆菌和格氏乳杆菌的组合、戊糖片球菌和卷曲乳杆菌的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述活体生物药包括罗伊氏乳杆菌LR08、副干酪乳杆菌LC86、嗜酸乳杆菌LA88、鼠李糖乳杆菌LRa05、长双歧杆菌BL21、戊糖片球菌PP06、卷曲乳杆菌LCr86、詹氏乳杆菌LJe52或格氏乳杆菌LG08中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如罗伊氏乳杆菌LR08和副干酪乳杆菌LC86的组合、鼠李糖乳杆菌LRa05和长双歧杆菌BL21的组合、长双歧杆菌BL21和戊糖片球菌PP06的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述用于培养活体生物药的培养基中还含有核黄素和天冬酰胺。
优选地，所述用于培养活体生物药的培养基中的组分以质量百分含量计包括：蛋白胨0.1%-5%、牛肉膏0.1%-2%、乳酮糖0.1%-2%、低聚甘露糖0.1%-5%、棉子糖0.1%-2%、酵母浸膏0.1%-5%、柠檬酸氢二铵0.01%-1%、K2HPO4 0.01%-1%、MgSO4 0.01%-1%、MnSO4 0.01%-1%、吐温-80 0.01%-1%、L-半胱氨酸0.01%-1%、核黄素0.01%-1%、天冬酰胺0.01%-1%，余量为水。
上述0.1%-5%中的具体数值例如0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5%等。
上述0.1%-2%中的具体数值例如0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%等。
上述0.01%-1%中的具体数值例如0.01%、0.011%、0.012%、0.013%、0.014%、0.015%、0.016%、0.017%、0.018%、0.019%、0.02%、0.021%、0.022%、0.023%、0.024%、0.025%、0.026%、0.027%、0.028%、0.029%、0.03%、0.031%、0.032%、0.033%、0.034%、0.035%、0.036%、0.037%、0.038%、0.039%、0.04%、0.041%、0.042%、0.043%、0.044%、0.045%、0.046%、0.047%、0.048%、0.049%、0.05%、0.051%、0.052%、0.053%、0.054%、0.055%、0.056%、0.057%、0.058%、0.059%、0.06%、0.061%、0.062%、0.063%、0.064%、0.065%、0.066%、0.067%、0.068%、0.069%、0.07%、0.071%、0.072%、0.073%、0.074%、0.075%、0.076%、0.077%、0.078%、0.080%、0.085%、0.090%、0.095%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%等。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的用于培养活体生物药的培养基在促进活体生物药生长和/或增殖中的应用。
优选地，所述活体生物药包括罗伊氏乳杆菌LR08、副干酪乳杆菌LC86、嗜酸乳杆菌LA88、鼠李糖乳杆菌LRa05、长双歧杆菌BL21、戊糖片球菌PP06、卷曲乳杆菌LCr86、詹氏乳杆菌LJe52或格氏乳杆菌LG08中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的用于培养活体生物药的培养基在促进活体生物药代谢产胞外多糖中的应用。
优选地，所述活体生物药包括长双歧杆菌BL21和/或戊糖片球菌PP06。
第四方面，本发明提供如第一方面所述的用于培养活体生物药的培养基在促进活体生物药代谢产乳酸和/或过氧化氢中的应用。
优选地，所述活体生物药包括卷曲乳杆菌LCr86、詹氏乳杆菌LJe52或格氏乳杆菌LG08中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供由第一方面所述的用于培养活体生物药的培养基培养得到的活体生物药培养物在制备病原菌抑制剂中的应用，所述病原菌包括大肠杆菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌或金黄色葡萄球菌中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如大肠杆菌和阴道加德纳菌的组合、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的组合、阴道加德纳菌和白色念珠菌的组合等，其他任意的组合方式均可。所述活体生物药包括卷曲乳杆菌LCr86、詹氏乳杆菌LJe52或格氏乳杆菌LG08中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供如第一方面所述的用于培养活体生物药的培养基培养得到的活体生物药培养物在制备预防和/或治疗呼吸道过敏性疾病的药物中的应用，所述活体生物药包括罗伊氏乳杆菌LR08和/或副干酪乳杆菌LC86。
第七方面，本发明提供如第一方面所述的用于培养活体生物药的培养基培养得到的活体生物药培养物在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用，所述活体生物药包括嗜酸乳杆菌LA88和/或鼠李糖乳杆菌LRa05。
第八方面，本发明提供如第一方面所述的用于培养活体生物药的培养基培养得到的活体生物药培养物在制备预防和/或治疗结肠癌的药物中的应用，所述活体生物药包括长双歧杆菌BL21和/或戊糖片球菌PP06。
第九方面，本发明提供如第一方面所述的用于培养活体生物药的培养基培养得到的活体生物药培养物在制备预防和/或治疗细菌性阴道炎的药物中的应用，所述活体生物药包括卷曲乳杆菌LCr86、詹氏乳杆菌LJe52或格氏乳杆菌LG08中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如卷曲乳杆菌LCr86与詹氏乳杆菌LJe52的组合、詹氏乳杆菌LJe52与格氏乳杆菌LG08的组合、卷曲乳杆菌LCr86与格氏乳杆菌LG08的组合等，其他任意的组合方式均可。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提供的培养基具有显著地促进活体生物药生长增殖的作用，相较于常规培养基（改良MRS培养基），在温度、时间等培养条件相同的情况下，使活体生物药的生长速率提高了50%以上，使活体生物药的活菌数提高了7-9倍。
（2）本发明提供的培养基能够显著影响活体生物药的代谢过程，更显著地提升了活体生物药的产乳酸（与常规培养基相比，D-乳酸产量提高了40%以上）、产胞外多糖（与常规培养基相比，胞外多糖产量提高了60%以上）以及产过氧化氢（与常规培养基相比，过氧化氢产量提高了40%以上）的能力。
（3）令人意外的是，在给药量（活菌数）相同的情况下，由不同培养基配方得到的活体生物药的药效不同，这可能是因为，采用不同培养基配方进行培养时对菌株的代谢过程影响较大，从而导致代谢产物的成分及产量有差异，进而影响了活体生物药的药效。
例如，与常规培养基或其他培养基配方相比，由本发明提供的培养基培养得到的活体生物药LBPs1（罗伊氏乳杆菌LR08+副干酪乳杆菌LC86）培养物能够更加有效地抑制IL-5，IL-13、IL-17A等炎症因子的分泌，使炎症细胞在气道的浸润减少，减轻气道炎症反应，治疗哮喘等呼吸道过敏性疾病的效果更好。
与常规培养基或其他培养基配方相比，由本发明提供的培养基培养得到的活体生物药LBPs2（嗜酸乳杆菌LA88+鼠李糖乳杆菌LRa05）培养物治疗NAFLD（非酒精性脂肪性肝病）的药效更显著：具有良好的降血脂作用，能够降低因高脂饮食引起的NAFLD小鼠血清中胆固醇水平。同时能够降低小鼠血清中的LDL-C水平以及提高小鼠血清中HDL-C水平，从而实现更有效地预防或治疗非酒精性脂肪性肝病。
与其他培养基配方或常规培养基相比，由本发明提供的培养基培养得到的LBPs3（长双歧杆菌BL21+戊糖片球菌PP06）培养物的药效更显著：能够更有效抑制肿瘤微环境中IL-6和TNF-α促炎因子的表达，抑制癌症的发展，同时更有效促进抑炎细胞因子IL-4和IFN-γ的表达，发挥免疫调节作用，诱导肿瘤细胞的凋亡，从而显著减少结肠癌小鼠的肿瘤细胞个数并抑制了结肠的病理性缩短，从实现更有效地预防或治疗结肠癌。
与其他培养基配方或常规培养基相比，由本发明提供的培养基培养得到的LBPs4（卷曲乳杆菌LCr86+詹氏乳杆菌LJe52+格氏乳杆菌LG08）培养物的药效更显著：抑制大肠杆菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌等病原菌的能力更强（相较于常规培养基，抑菌效果提高了15-20%），能够显著降低患炎症小鼠阴道中致病菌的浓度，从而实现更有效地预防或治疗细菌性阴道炎。
本发明提供的培养基中，乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖三者的组合能够更好更充分地被活体生物药吸收利用，三者在促进活体生物药生长、增殖、代谢、以及提升自身功效方面具有意料不到的协同增效的作用。将乳酮糖、低聚甘露糖、棉子糖与酵母浸膏、柠檬酸氢二铵、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、吐温-80和L-半胱氨酸进行复配，形成本发明的整体培养基配方，配方中各组分相互配合，缺一不可，共同实现了促进活体生物药生长、增殖、代谢、以及提升功效的效果。在此基础上进一步添加核黄素与天冬酰胺，能够进一步促进活体生物药生长、增殖、代谢、以及提升功效（尤其是促进代谢、提升功效），由本发明所述的培养基培养得到的活体生物药培养物安全性高，无毒性，药效强，为后期临床前、临床阶段的研究奠定基础。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
下述实施例所涉及的原料信息如下：
低聚甘露糖购自山东龙力生物科技有限公司，分子量为342.3，棉子糖购自陕西嘉禾生物科技股份有限公司，乳酮糖购自杭州科田生物技术有限公司。
本发明所涉及的菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号：鼠李糖乳杆菌LRa05（Lactobacillus rhamnosus，CGMCC No. 1.12734，保藏日期为2020.07.20）、长双歧杆菌BL21（Bifidobacterium longum，CGMCC No. 10452，保藏日期为2015.01.27）、副干酪乳杆菌LC86（Lactobacillus paracasei，CGMCC No. 1.12731，保藏日期为2020.07.20）、嗜酸乳杆菌LA88（Lactobacillus acidophilus，CGMCC No. 24109，保藏日期为2021.12.15）、罗伊氏乳杆菌LR08（Lactobacillus reuteri，CGMCC No. 1.12733，保藏日期为2020.07.20）、詹氏乳杆菌LJe52（Lactobacillus jensenii，CGMCC No. 20194，保藏日期为2020.07.06）、卷曲乳杆菌LCr86（Lactobacillus crispatus，CGMCC No. 19758，保藏日期为2020.04.29）、格氏乳杆菌LG08（Lactobacillus gasseri，CGMCC No. 16131，保藏日期为2018.07.18）、戊糖片球菌PP06（Pediococcus pentosaceus，CGMCC No. 19249，保藏日期为2019.12.27）。
实施例1-培养基的制备
配方1：以质量百分含量计：蛋白胨1%、牛肉膏1%、乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO4·3H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸0.1%、核黄素0.1%、天冬酰胺0.1%，余量为水。
配方2：以质量百分含量计：蛋白胨0.6%、牛肉膏1.5%、乳酮糖0.4%、低聚甘露糖2%、棉子糖0.6%、酵母浸膏0.8%、柠檬酸氢二铵0.05%、K2HPO4·3H2O 0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、MnSO4 0.01%、吐温-80 0.3%、L-半胱氨酸0.03%、核黄素0.05%、天冬酰胺0.15%，余量为水。
配方3：以质量百分含量计：蛋白胨1.5%、牛肉膏0.5%、乳酮糖0.8%、低聚甘露糖1.2%、棉子糖1%、酵母浸膏1%、柠檬酸氢二铵0.3%、K2HPO4·3H2O 0.05%、MgSO4·7H2O 0.02%、MnSO4 0.08%、吐温-80 0.05%、L-半胱氨酸0.3%、核黄素0.15%、天冬酰胺0.05%，余量为水。
配方4：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“棉子糖和低聚甘露糖的组合3%”，其中棉子糖与低聚甘露糖的质量比为1:2，其他组分及含量不变。
配方5：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“乳酮糖和低聚甘露糖的组合3%”，其中乳酮糖与低聚甘露糖的质量比为3:8，其他组分及含量不变。
配方6：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“乳酮糖和棉子糖的组合3%”，其中乳酮糖与棉子糖的质量比为3:4，其他组分及含量不变。
配方7：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“乳酮糖3%”，其他组分及含量不变。
配方8：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“低聚甘露糖3%”，其他组分及含量不变。
配方9：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“棉子糖3%”，其他组分及含量不变。
配方10：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“乳糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”，其他组分及含量不变。
配方11：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“乳酮糖0.6%、葡萄糖1.6%、棉子糖0.8%”，其他组分及含量不变。
配方12：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、低聚果糖0.8%”，其他组分及含量不变。
配方13（常规培养基，即改良MRS培养基，MRSC）：与配方1的区别仅在于，将“乳酮糖0.6%、低聚甘露糖1.6%、棉子糖0.8%”替换为“葡萄糖2%、乳糖1%”，其他组分及含量不变。
配方14（无糖培养基，MRSN）：与配方1的区别仅在于，不含有低聚甘露糖、乳酮糖和棉子糖，缺少的量用水补足，其他组分及含量不变。
配方15：与配方1的区别仅在于，不含有核黄素和天冬酰胺，缺少的量用水补足，其他组分及含量不变。
YPD固体培养基：酵母粉10.0g、葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g以及琼脂20.0g，使用去离子水溶解，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。
将各组的培养基配方按总体积1L调配好，调整培养基pH至6.86左右，并按组分别吸取20 mL置于离心管中，灭菌待用。
实施例2
本实施例提供一种预防或治疗哮喘的活体生物药LBPs1（罗伊氏乳杆菌LR08和副干酪乳杆菌LC86的组合，重量比3:1）培养物，制备方法如下：
A. 活化：将置于-80℃冰箱于40%甘油管中保存的罗伊氏乳杆菌LR08、副干酪乳杆菌LC86取出，待甘油管化冻后，以3:1的重量比混匀样本并于无菌操作台中吸取2%的样本加到20 mL的改良MRS培养基中，于37℃培养18 h后，取出并离心（8000 g离心10 min）得到分离的菌泥，将其用9 mL无菌生理盐水重悬，并震荡均匀，得到菌液。
B. 培养：分别利用实施例1中的配方1-配方15的培养基来培养活体生物药LBPs1。使用前将培养基分装于离心管中，并于高压灭菌锅中121℃，20 min灭菌后，迅速冷却至室温（25℃），于无菌操作室中将其按顺序倒入Growth Profiler 960高通量筛选设备（荷兰公司Enzyscreen）中待用。将步骤A中得到的菌液按照1%比例分别接入对应的96孔板中，于37℃恒温条件下培养。
C 菌落生长速率对比：在步骤B的培养过程中，每隔一段时间拍照分析菌落的尺寸，各菌落尺寸（mm）随时间（h）变化的曲线即为其生长曲线，生长曲线的斜率为该菌的生长速率。各组的生长速率结果见表1。
表1
Figure 698132DEST_PATH_IMAGE001
结果显示，在总量一致的前提下，本发明将乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖进行组合，相较于三者分别单独使用或者任意两者进行组合，具有更显著地促进LBPs1生长的作用，而相较于常规培养基（MRSC），更是使生长速率提高了50%以上。此结果充分说明了三者的组合能够更好更充分地被LBPs1吸收利用，三者在促进LBPs1生长方面具有协同增效的作用。
D 菌体增殖能力对比：分别利用不同配方的培养基来培养活体生物药LBPs1，菌液接种量均为1%，37℃厌氧培养20 h后，测定培养液中的活菌数。
活菌数测定：取培养液直接进行梯度稀释测定，选择稀释梯度7，8，9，测定方法采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度，结果见表2（为了方便测算，表中数值为三组平行实验的培养液稀释5倍后测定值的平均值，表中的空白组指的是各组培养基中未接种菌液）。
表2
Figure 536644DEST_PATH_IMAGE002
结果显示，在总量一致的前提下，本发明将乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖进行组合，相较于三者分别单独使用或任意两者的组合，具有更显著地促进LBPs1增殖的作用，而相较于常规培养基（MRSC），更是使活菌数提高了7倍以上。此结果充分说明了乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖的组合能够更好更充分地被LBPs1吸收利用，二者在促进LBPs1增殖，提高活菌数方面具有协同增效的作用，这对LBPs1后期药物开发应用奠定了良好的基础。
E. LBPs1耐酸能力测试：分别利用实施例1中的配方1-3来培养活体生物药LBPs1，菌液接种量为1%，于37℃厌氧培养20 h后，分别取1 mL培养液并与不同pH（pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH5.0）的9.0 mL无菌PBS混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始（0 h）和处理（3h）后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：存活率（%）=N1/N0×100%，其中，N1为处理3 h后的活菌数；N0为0 h的活菌数。
结果显示，本发明提供的培养基在大幅度促进LBPs1生长增殖的同时，能够充分保证其具有优异的耐酸能力，在pH为2.0时孵育3 h，存活率达80.0%以上；在pH为3.0时孵育3h，存活率达94.5%以上；在pH为4.0时孵育3 h，存活率达95.2%以上；在pH为5.0时孵育3 h，存活率达96.5%以上。由此可知，正常健康肠道pH值范围内，由本发明培养基所培养得到的活体生物药LBPs1具有良好的耐受能力，可以在肠道中正常定植，这为其后期药物开发应用创造了有利条件。
F. LBPs1的安全性测试：
根据2010年版中国药典，选取6只SPF级小鼠（体重约20-25g），于小鼠的腹腔注射0.6 mL新鲜的配方1培养得到的LBPs1培养液（活菌数约2×109CFU/只小鼠），并于每天测量每只小鼠的体重变化，记录小鼠注射前后的精神状态、行为活动等生理变化情况。结果得到，一周内小鼠的体重轻微增长，未有明显中毒症状的发生，行为活动较为正常，无死亡现象，无不良反应，因此可认为LBPs1安全性高，属于正常无毒类活菌生物药。
G. LBPs1培养物治疗呼吸道过敏性疾病的药效验证：
试验药物LBPs1的制备：分别用不同配方的培养基培养LBPs1，37℃下培养17 h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于配方1的培养基中，37℃下培养17 h，得到菌液；将菌液在8000 g下离心10 min，得到LBPs1菌体；将菌体用保护剂（质量浓度为8%的脱脂奶粉和2%透明质酸钠，溶剂为水）重悬至浓度为1×1010 CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在37℃下预培养1 h后冻干，得到试验药物LBPs1。
造模与分组处理：购于上海斯莱克实验动物有限公司的SPF级雌性BALB/c小鼠被安置在特定的无病原体条件下。根据现有技术常规的造模方案，使用屋尘螨（HDM）提取液来制备呼吸道过敏性炎症小鼠模型。将小鼠饲养在上海斯莱克实验动物中心（普通饲料喂养）适应1周后，将小鼠分成7组，分别为对照组（CTL组）、模型组（MC组）和药物干预组（配方1-LBPs1组、配方4-LBPs1组、配方5-LBPs1组、配方6-LBPs1组、配方15-LBPs1组），每组6只小鼠。实验共进行6周，第1-6周，药物干预组每天灌胃0.25 mL（活菌数为1×108 CFU，用生理盐水溶解）的由对应培养基得到的试验药物LBPs1，CTL组和MC组每天灌胃0.25 mL无菌生理盐水作为对照。第2-6周进行造模，每天对MC组和LBPs1组小鼠均麻醉滴鼻25 μg/10 μL的HDM，CTL组仅滴10 μL无菌生理盐水作为对照。6周试验后，麻醉处死小鼠。
小鼠呼吸道过敏性炎症因子含量测定：实验结束后，麻醉处死小鼠，放于解剖盘上，固定头部和四只，解剖胸腔和颈部，使小鼠气管和双肺暴露，用留置针进行气管插管，以1 mL注射器吸取1 mL预冷的磷酸盐PBS，灌洗小鼠全肺，进行3次，回收量≥80%，收集灌洗液于干净的Eppendorf管中。4℃，1000 g，离心5 min，收集上清液，得肺泡灌洗液，分装，-20℃冻存，通过ELISA试剂盒，检测肺泡灌洗液中的IL-5，IL-13和IL-17A的水平。结果见表3。
小鼠粪便样品采集、短链脂肪酸含量测定：收集小鼠结肠、粪便于无菌试管中，快速冷冻于-80℃保存待用。使用快速DNA提取试剂盒提取粪便DNA，然后对细菌的16S rRNA基因进行PCR扩增。按照本领域常规方法测定小鼠盲肠内容物中的短链脂肪酸水平：将约50mg盲肠内容物样品与饱和氯化钠充分混合形成混悬液。再用乙醚提取短链脂肪酸，利用气相色谱仪和质谱检测器对其进行定量，结果见表3。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
结果显示：与正常小鼠（CTL组）相比，患有呼吸道过敏性炎症的小鼠（MC组）肺泡灌洗液中的IL-5、IL-13和IL-17A的水平显著升高。而活体生物药LBPs1的治疗显著降低了患病小鼠肺泡灌洗液中的IL-5、IL-13和IL-17A的水平，使其基本恢复至正常健康小鼠的水平。说明活体生物药LBPs1具有良好定植能力，能有效抑制IL-5、IL-13、IL-17A等炎症因子的分泌，使炎症细胞在气道的浸润减少，减轻气道炎症反应，从而有效发挥治疗哮喘等呼吸道过敏性疾病的作用。
另外，相较于CTL组和MC组，药物干预组小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的含量显著更高。说明活体生物药LBPs1在治疗哮喘的同时显著提高了肠道短链脂肪酸的含量，可以为机体提供能量并调节机体微生态环境的电解质，保护肠粘膜屏障，为机体提供健康的肠道微生态环境。
令人意外的是，在给药量（活菌数）相同的情况下，由不同培养基配方得到的LBPs1培养物的药效不同，这可能是因为，采用不同培养基配方进行培养时对菌株的代谢过程影响较大，从而导致代谢产物的成分及产量有差异，进而影响了活体生物药的药效。与常规培养基或其他培养基配方相比，由配方1的培养基培养得到的LBPs1培养物能够更加有效地抑制IL-5、IL-13、IL-17A等炎症因子的分泌，使炎症细胞在气道的浸润减少，减轻气道炎症反应，治疗哮喘等呼吸道过敏性疾病的效果更好。
实施例3
本实施例提供一种预防或治疗非酒精性脂肪性肝病的活体生物药LBPs2（嗜酸乳杆菌LA88和鼠李糖乳杆菌LRa05的组合，重量比1:1）培养物。
A. 活化：参照实施例2的步骤A。
B. 培养：参照实施例2的步骤B。
C 菌落生长速率对比：参照实施例2的步骤C，结果见表4。
表4
Figure 519643DEST_PATH_IMAGE004
D 菌体增殖能力对比：参照实施例2的步骤D，结果见表5。
表5
Figure 86758DEST_PATH_IMAGE005
由表4和表5的结果可知：在总量一致的前提下，本发明将乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖进行组合，相较于缺少一种组分的配方，具有更显著地促进LBPs2生长和增殖的作用，而相较于常规培养基（MRSC），更是使菌落生长速率提高了50%以上，使活菌数提高了8倍以上。此结果充分说明了乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖的组合能够更好更充分地被LBPs2吸收利用，三者在促进LBPs2生长与增殖，提高活菌数方面具有协同增效的作用，这对LBPs2后期药物开发应用奠定了良好的基础。
E. LBPs2耐酸能力测试：参照实施例2的步骤E。
结果显示，本发明提供的培养基在大幅度促进LBPs2生长增殖的同时，能够充分保证其具有优异的耐酸能力，在pH为2.0时孵育3 h，存活率达83.5%以上；在pH为3.0时孵育3h，存活率达93.8%以上；在pH为4.0时孵育3 h，存活率达94.5%以上；在pH为5.0时孵育3 h，存活率达95.9%以上。由此可知，正常健康肠道pH值范围内，由本发明培养基所培养得到的活体生物药LBPs2具有良好的耐受能力，可以在肠道中正常定植，这为其后期药物开发应用创造了有利条件。
F. LBPs2培养物治疗非酒精性脂肪性肝病的药效验证：
试验药物LBPs2的制备：分别用不同配方的培养基培养LBPs2，其他条件参照实施例2中试验药物LBPs1的制备。
采用国家食药监局FDA保健功能评价方法里的辅助降血脂功能评价方法进行非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠造模和培养。通过预实验确定最佳造模时间、活体生物药LBPs2对NAFLD小鼠干预剂量和干预时间。
将实验小鼠随机分为CTL组（6只，不建模，用正常饲料喂养）和模型组（42只），NAFLD模型建立成功后将模型组的42只小鼠随机分为高脂小鼠模型组（Model组）、配方1-LBPs2组（由配方1的培养基培养得到）、配方4-LBPs2组（由配方4的培养基培养得到）、配方5-LBPs2组（由配方5的培养基培养得到）、配方6-LBPs2组（由配方6的培养基培养得到）、配方15-LBPs2组（由配方15的培养基培养得到）和MRSC-LBPs2组（由MRSC培养得到），每组6只，7组小鼠继续用高脂饲料喂养。各LBPs2组的给药方式为：将各试验药物LBPs2溶解于蒸馏水后进行灌胃，给药量统一为：活菌数1×108 CFU；CTL组和Model组均以蒸馏水灌胃作为对照，每天15:00定时灌胃1次，连续28 d，实验期间各组小鼠均自由摄食和饮水，并对其体重进行实时监测，实验4周结束，后解剖取肝脏称重并做H&E染色、采集血清测TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）、HDL-C（高密度脂蛋白胆固醇）、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）等指标，结果见表6。
表6
Figure 697868DEST_PATH_IMAGE006
结果显示，活体生物药LBPs2在一定程度上能显效降低血脂和肝脂肪水平。令人意外的是，在给药量（活菌数）相同的情况下，由不同培养基配方得到的LBPs2培养物的药效不同。与常规培养基或其他培养基配方相比，由配方1的培养基培养得到的LBPs2培养物治疗NAFLD的药效更显著，具有良好的降血脂作用，能够降低因高脂饮食引起的NAFLD小鼠血清中胆固醇水平。同时能够降低小鼠血清中的LDL-C水平以及提高小鼠血清中HDL-C水平，从而改善非酒精性脂肪性肝病。
实施例4
本实施例提供一种预防或治疗结肠癌的活体生物药LBPs3（长双歧杆菌BL21和戊糖片球菌PP06的组合，重量比5:3）培养物。
A. 活化：参照实施例2的步骤A。
B. 培养：参照实施例2的步骤B。
C 菌落生长速率对比：参照实施例2的步骤C，结果见表7。
表7
Figure DEST_PATH_IMAGE007
D 菌体增殖能力对比：参照实施例2的步骤D，结果见表8。
表8
Figure 848226DEST_PATH_IMAGE008
由表7和表8的结果可知：在总量一致的前提下，本发明将乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖进行组合，相较于缺少一种组分的配方，具有更显著地促进LBPs3生长和增殖的作用，而相较于常规培养基（MRSC），更是使菌落生长速率提高了80%以上，使活菌数提高了8倍以上。此结果充分说明了乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖的组合能够更好更充分地被LBPs3吸收利用，三者在促进LBPs3生长与增殖，提高活菌数方面具有协同增效的作用，这对LBPs3后期药物开发应用奠定了良好的基础。
E. LBPs3耐酸能力测试：参照实施例2的步骤E。
结果显示，本发明提供的培养基在大幅度促进LBPs3生长增殖的同时，能够充分保证其具有优异的耐酸能力，在pH为2.0时孵育3 h，存活率达85.0%以上；在pH为3.0时孵育3h，存活率达95.0%以上；在pH为4.0时孵育3 h，存活率达95.7%以上；在pH为5.0时孵育3 h，存活率达97.0%以上。由此可知，正常健康肠道pH值范围内，由本发明培养基所培养得到的活体生物药LBPs3具有良好的耐受能力，可以在肠道中正常定植，这为其后期药物开发应用创造了有利条件。
F. LBPs3产胞外多糖的能力测试：分别利用不同配方的培养基来培养活体生物药LBPs3，菌液接种量均为1%，于37℃培养18 h后，取10 mL培养液，5000 g×15 min离心处理，取上清液，用氢氧化钠（浓度1 mol/L）调整上清液pH至7.5左右，加入10%质量浓度为3g/L的胰蛋白酶液（现用现配），40℃水浴酶解2.5 h后，加入1/3体积Sevag液（氯仿:正丁醇=3:1，体积比），振摇30 min，5000 g离心15 min，除去沉淀，重复一次。加入3倍体积的95%（v/v）的乙醇，充分振荡（多糖呈絮状沉淀析出），5000 g×15 min离心处理，得沉淀。将沉淀用丙酮洗涤脱水两次，干燥得白色粉末即为多糖，采用苯酚-硫酸法测定不同培养基培养下LBPs3产生胞外多糖的质量浓度，结果如表9所示。
表9
Figure 911997DEST_PATH_IMAGE009
胞外多糖是益生菌生长代谢过程中分泌到胞外且具有独特理化性质和功能的一类后生元，已有多项临床研究指出，胞外多糖具有抑制肿瘤细胞生长，增强机体免疫，调节胃肠道等功能。从表9结果得到，在总量一致的前提下，本发明将乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖进行组合，相较于缺少一种组分的配方，具有更显著地促进LBPs3产胞外多糖的作用，而相较于常规培养基（MRSC），更是使胞外多糖产量提高了60%以上。此结果充分说明了乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖的组合能够更好更充分地被LBPs3吸收利用，三者在促进LBPs3产胞外多糖方面具有协同增效的作用。这意味着由配方1的培养基得到的活体生物药LBPs3在抑制肿瘤细胞生长，增强机体免疫，调节胃肠道等方面的临床疗效可能得到显著的提高。
G. LBPs3培养物治疗结肠癌的药效验证：
试验药物LBPs3的制备：分别利用不同配方的培养基培养LBPs3，其他参照实施例2中试验药物LBPs1的制备。
购于上海斯莱克实验动物有限公司的雄性BALB/c小鼠，体重（22±3）g，实验前小鼠进行适应性饲养1周。将48只小鼠随机分为对照组（CTL组）、模型组（Model组）、配方1-LBPs3干预组（使用配方1的培养基培养得到的LBPs3）、配方4-LBPs3干预组（使用配方4的培养基培养得到的LBPs3）、配方5-LBPs3干预组（使用配方5的培养基培养得到的LBPs3）、配方6-LBPs3干预组（使用配方6的培养基培养得到的LBPs3）、配方15-LBPs3干预组（使用配方15的培养基培养得到的LBPs3）、MRSC-LBPs3干预组（使用MRSC培养的LBPs3），每组6只。其中，Model组与各LBPs3干预组小鼠于实验开始第1天向腹腔注射10 mg/kg氧化偶氮甲烷（购于美国Sigma公司），于第2、5、8周摄取含2.5%葡聚糖硫酸钠（购于美伦生物科技有限公司）的饮用水，以建立结肠癌模型，CTL组不建模。从实验第2周起，小鼠每天灌胃给药：CTL组和Model组给予纯化无菌水，各LBPs3干预组分别给予对应的LBPs3（活菌数2×108 CFU）。实验期间每周称取小鼠体重，实验结束后，收集小鼠的结肠组织，测其长度以及计算肿瘤数目，参考文献，检测指标采用免疫组化实验和HE染色等方法获取，采用Image-J图像分析系统（记录积分光密度IOD值），结肠长度（cm）、肿瘤个数（个）以及各炎症因子水平（IOD×105）的结果如表10所示。
表10
Figure 517422DEST_PATH_IMAGE010
表10的结果显示，与CTL组的健康小鼠相比，Model组的结肠癌小鼠的结肠长度病理性缩短，LBPs3的治疗显著地抑制了结肠的病理性缩短，同时显著减少结肠癌小鼠的肿瘤细胞个数。另外对结肠癌小鼠结肠组织的炎症因子IL-6、IL-4、IFN-γ、TNF-α进行测定，结果发现，相较于Model组，活体生物药LBPs3可以显著降低IL-6和TNF-α水平，同时提高IL-4和IFN-γ水平。
令人意外的是，在给药量（活菌数）相同的情况下，由不同培养基配方得到的LBPs3培养物的药效不同。与其他培养基配方或常规培养基相比，由配方1的培养基培养得到的LBPs3培养物的药效更显著，能够更有效抑制肿瘤微环境中IL-6和TNF-α促炎因子的表达，抑制癌症的发展，同时更有效促进抑炎细胞因子IL-4和IFN-γ的表达，发挥免疫调节作用，诱导肿瘤细胞的凋亡，从而显著减少结肠癌小鼠的肿瘤细胞个数并抑制了结肠的病理性缩短。
实施例5
本实施例提供一种预防或治疗细菌性阴道炎的活体生物药LBPs4（卷曲乳杆菌LCr86、詹氏乳杆菌LJe52和格氏乳杆菌LG08的组合，质量比3:1:2）培养物。
A. 活化：参照实施例2的步骤A。
B. 培养：参照实施例2的步骤B。
C 菌落生长速率对比：参照实施例2的步骤C，结果见表11。
表11
Figure 609137DEST_PATH_IMAGE011
D 菌体增殖能力对比：参照实施例2的步骤D，结果见表12。
表12
Figure DEST_PATH_IMAGE012
由表11和表12的结果可知：在总量一致的前提下，本发明将乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖进行组合，相较于缺少一种组分的配方，具有更显著地促进LBPs4生长和增殖的作用，而相较于常规培养基（MRSC），更是使菌落生长速率提高了60%以上，使活菌数提高了7倍以上。此结果充分说明了乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖的组合能够更好更充分地被LBPs4吸收利用，三者在促进LBPs4生长与增殖，提高活菌数方面具有协同增效的作用，这对LBPs4后期药物开发应用奠定了良好的基础。
E. LBPs4产乳酸能力测试：分别利用不同配方的培养基来培养活体生物药LBPs4，菌液接种量均为2%，于37℃厌氧培养24 h后，均用配方1的培养基稀释调节培养液中菌浓度为1×108CFU/mL。
取1mL稀释后的培养液进行8000 r/min离心5min，取上清，待检。
测定方法：采用乳酸（LD）测试盒（比色法）（购自南京建成生物工程研究所）按照标准操作手册检测上清中乳酸含量（g/L），结果见表13。
表13
Figure 727135DEST_PATH_IMAGE013
结果表明：在总量一致的前提下，本发明将乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖进行组合，相较于缺少一种组分的配方，具有更显著地促进LBPs4产乳酸的作用，尤其是D-乳酸的产量显著提高，相较于常规培养基（MRSC），更是使D-乳酸产量提高了40%以上。此结果充分说明了乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖的组合能够更好更充分地被LBPs4吸收利用，三者在促进LBPs4产乳酸方面具有协同增效的作用，良好的产酸能力为其抗致病菌创造了有利条件。
F. LBPs4产过氧化氢能力测试：分别利用实施例1中的不同配方的培养基来培养活体生物药LBPs4，菌液接种量均为2%，于37℃厌氧培养24 h后，均用配方1的培养基稀释，调节培养液中菌浓度为1×108CFU/mL。
取1mL稀释后的培养液进行8000 r/min离心5min，取上清，待检。
测定方法：用过氧化氢测定试剂盒（比色法）（购自南京建成生物工程研究所）按照标准操作手册测H2O2含量（mmol/L），结果见表14。
表14
Figure 278202DEST_PATH_IMAGE014
结果表明：在总量一致的前提下，本发明将乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖进行组合，相较于缺少一种组分的配方，具有更显著地促进LBPs4产过氧化氢的作用，相较于常规培养基（MRSC），更是使过氧化氢产量提高了40%以上。此结果充分说明了乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖的组合能够更好更充分地被LBPs4吸收利用，三者在促进LBPs4产过氧化氢方面具有协同增效的作用，良好的产酸能力为其抗致病菌，治疗细菌性阴道炎创造了有利条件。
G. LBPs4培养物的抑制致病菌能力测试：
（1）LBPs4平板的制备：吸取10 μL 步骤A得到的菌液，分别涂布于不同配方的固体培养基（在实施例1的相应配方中加入2%的琼脂）上，37℃培养22 h，获得LBPs4平板。
（2）LBPs4抑制大肠杆菌ATCC 25922的能力：吸取1 mL大肠杆菌菌液（1×106CFU/mL）涂布于步骤（1）中的LBPs4平板上，37℃培养22 h，测量抑菌圈大小。
（3）LBPs4抑制加德纳杆菌ATCC 14018的能力：吸取1 mL加德纳杆菌菌液（1×106CFU/mL）涂布于步骤（1）中的LBPs4平板上，37℃培养22 h，测量抑菌圈大小。
（4）LBPs4抑制金黄色葡萄球菌25923的能力：吸取1 mL金黄色葡萄球菌菌液（1×106CFU/mL）涂布于步骤（1）中的LBPs4平板上，37℃培养22 h，测量抑菌圈大小（mm），抑菌效果见表15。
表15
Figure 687318DEST_PATH_IMAGE015
结果表明：在总量一致的前提下，本发明将乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖进行组合，相较于缺少一种组分的配方，具有更显著地促进LBPs4培养物的抑制病原菌（大肠杆菌、阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌）的作用，相较于常规培养基（MRSC），抑菌效果提高了15-20%。此结果充分说明了乳酮糖、低聚甘露糖与棉子糖的组合能够更好更充分地被LBPs4吸收利用，三者在促进LBPs4抑制病原菌方面具有协同增效的作用，强大的抑菌能力为其治疗细菌性阴道炎创造了有利条件。
H. LBPs4培养物治疗细菌性阴道炎的药效验证：
试验药物LBPs4的制备：分别利用不同配方的培养基来培养LBPs4，其他条件参照实施例2中试验药物LBPs1的制备。
（1）小鼠的分组：取42只雌性、8周龄、体重20-25g的C57CL/6J小鼠，分成7组，每组6只，分别为模型组（Model组）、MRSC-LBPs4治疗组、配方1-LBPs4治疗组、配方4-LBPs4治疗组、配方5-LBPs4治疗组、配方6-LBPs4治疗组和配方15-LBPs4治疗组。
（2）白色念珠菌感染小鼠造模：所有小鼠均皮下注射100 μL戊酸雌二醇，诱导小鼠发情，每周一次，共2次。发情后各组小鼠均在阴道内接种20 μL菌浓度为1×107 CFU/mL的白色念珠菌，每天一次，连续接种3天。
（3）白色念珠菌感染小鼠的治疗：CTL组小鼠不作处理；模型组小鼠阴道内注射20μL生理盐水；各LBPs4治疗组小鼠阴道内分别接种20 μL菌浓度为1×107 CFU/mL对应的LBPs4菌液（将试验药物LBPs4溶解于生理盐水中），每天接种1次，连续接种10天。
（4）治疗效果的评价：在治疗的第10天用40 μL无菌PBS缓冲液灌洗各组小鼠阴道3次，收集灌洗液并充分混匀，用PBS缓冲液进行梯度稀释后用涂布于YPD固体培养基上，于37℃培养48 h后进行平板计数，获得各组小鼠阴道内的白色念珠菌浓度，结果如表16所示。
表16
Figure 896189DEST_PATH_IMAGE016
结果显示，与Model组相比，经LBPs4治疗后，小鼠灌洗液中的白色念珠菌浓度显著下降，充分说明了LBPs4在预防或治疗细菌性阴道炎方面效果优异。令人意外的是，在给药量（活菌数）相同的情况下，由不同培养基配方得到的LBPs4培养物的药效不同。与其他培养基配方或常规培养基相比，由配方1的培养基培养得到的LBPs4培养物的药效更显著，能够显著降低患炎症小鼠阴道中致病菌的浓度，从而预防或治疗细菌性阴道炎。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种用于培养活体生物药的培养基及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (4)

1.一种用于培养活体生物药的培养基，其特征在于，所述用于培养活体生物药的培养基的配方为蛋白胨、牛肉膏、乳酮糖、低聚甘露糖、棉子糖、酵母浸膏、柠檬酸氢二铵、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、吐温-80、L-半胱氨酸、核黄素和天冬酰胺；
所述活体生物药为罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、戊糖片球菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌或格氏乳杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
2.如权利要求1所述的用于培养活体生物药的培养基，其特征在于，所述活体生物药为罗伊氏乳杆菌LR08、副干酪乳杆菌LC86、嗜酸乳杆菌LA88、鼠李糖乳杆菌LRa05、长双歧杆菌BL21、戊糖片球菌PP06、卷曲乳杆菌LCr86、詹氏乳杆菌LJe52或格氏乳杆菌LG08中的任意一种或至少两种的组合。
3. 如权利要求1所述的用于培养活体生物药的培养基，其特征在于，所述用于培养活体生物药的培养基中的组分以质量百分含量计为：蛋白胨0.1%-5%、牛肉膏0.1%-2%、乳酮糖0.1%-2%、低聚甘露糖0.1%-5%、棉子糖0.1%-2%、酵母浸膏0.1%-5%、柠檬酸氢二铵0.01%-1%、K2HPO4 0.01%-1%、MgSO4 0.01%-1%、MnSO4 0.01%-1%、吐温-80 0.01%-1%、L-半胱氨酸0.01%-1%、核黄素0.01%-1%、天冬酰胺0.01%-1%，余量为水。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用于培养活体生物药的培养基在培养活体生物药中的应用。
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Denomination of invention: A culture medium for cultivating live biopharmaceuticals and its application

Effective date of registration: 20230705

Granted publication date: 20221104

Pledgee: China Construction Bank Corporation Suzhou Yangtze River Delta integration Demonstration Zone Branch

Pledgor: Weikang probiotics (Suzhou) Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980047337

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