KR20180056896A - 한국인 모유로부터 분리한 락토바실러스 가세리 제이12피4 와 스타필로코커스 에피더미디스 제이4피1로 제조한 인공영양아용 미생물제제 및 이를 사용한 장염 억제 방법 - Google Patents
한국인 모유로부터 분리한 락토바실러스 가세리 제이12피4 와 스타필로코커스 에피더미디스 제이4피1로 제조한 인공영양아용 미생물제제 및 이를 사용한 장염 억제 방법Info
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Abstract
본 발명은 모유 수유가 어려운 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)에게 모유의 유익한 미생물을 공급하여 모유영양아와 유사한 장내세균 조성을 유도하기 위해 한국인 산모의 유두와 모유(초유 포함)에서 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)와 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)를 분리하고, 이를 쉽게 사용할 수 있도록 개발한 미생물 제제(분말제제)에 관한 것이다. 본 발명의 두 미생물들 중 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)의 항균성 검색을 위해 대장염 유발균 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922에 대한 생육 억제 효과는 시험관에서, 장염 발생 억제 효과는 마우스를 사용한 생체실험에서, 각각 확인한 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 모유수유가 어려운 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)에게 모유영양아가 섭취하는 것과 같은 모유 미생물을 공급하기 위해 한국인 산모들의 유두와 모유(초유 포함)의 미생물들을 분석하고, 분리된 미생물들 중 안전하고 유익한 균 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)와 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)를 선정, 생산하고, 이를 쉽게 사용할 수 있는 형태로 개발한 미생물제제(분말제제)에 관한 것이다.
신생아는 무균상태로 태어나지만, 분만 시 엄마의 질벽으로부터 또는 출생 후 젖을 빨 때 유두와 모유로부터 처음으로 미생물들을 섭취하게 된다(Martin 등, 2004). 이렇게 섭취한 미생물들은 신생아의 장내에 정상 미생물상 형성을 유도하고, 이 미생물상은 장에 침투하는 병원성 미생물의 착생 및 증식을 못 하도록 방해하며, 숙주를 감염으로부터 보호하는 미생물 방벽 (microbial barrier)의 역할을 수행한다 (Tannock, 1984). 또한 이 미생물상은 유아의 선천성 및 후천성 면역기능 형성에 중요한 역할을 수행하여 일생에 걸쳐 건강에 영향을 미칠 수 있다 (Jakaitis 등, 2014). 그러나 제왕절개아는 분만 후 엄마에게 투여된 항생물질로 인하여 모유를 섭취할 수 없어, 모유가 아닌 다른 경로의 미생물들에 노출되어 장내세균 이상증 등의 문제를 지닐 수 있다. 영유아가 장내세균 이상증을 가지게 되면 아토피와 천식 등의 여러 가지 자가면역질환을 나타낼 수 있다(Walker 등, 2014).
따라서 본 발명은 모유수유가 어려운 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)에게 모유영양아가 섭취하는 것과 같은 모유 미생물을 공급하기 위해, 모유 미생물들 중 유익한 균을 선별하여 미생물제제(분말제제)화한 것이다.
본 발명의 미생물 및 미생물제제는 프로바이오틱이라 불리우며, 생명공학, 산업미생물학 및 발효미생물학에 속하는 기술을 바탕으로 개발한 것이다. ‘프로바이오틱(probiotic)’이라 함은 숙주의 건강에 도움되는 생균을 말하며, 적정량의 섭취로 장내균총에 영양을 주는 유익한 미생물로 정의한다. 따라서 본 발명의 미생물제제는 그 효과가 숙주(신생아, 제왕절개아 및 영유아)의 영양과 건강에 영향을 미치므로 영양학 및 보건학과도 관련이 된다.
본 발명과 유사한 국외의 기술들을 살펴보면 다음과 같다. 출원번호 PCT/EP2003/006752<프로바이오틱 균주, 그 선택을 위한 방법, 그 조성물과 그들 사용/Probiotic strains, a process for the selection of them, compositions there of, and their use>는 락토바실러스 가세리외 락토바실라이를 포함한 프로바이오틱 제제가 소화기, 감염, 신경에 대한 예방 또는 치료에 관한 효과와 알레르기, 또는 염증성 질환으로 인한 퇴행성, 면역관련 질환 예방에 관한 것이다. 출원번호PCT/BG2010/000021<새로운 유산균과 그것을 조합한 미생물제제/New strain of lactic acid bacteria and its combinations producing probiotic preparations>은 모유영양아의 변에서 분리한 락토바실러스 가세리 K7을 포함한 다른 균주와 조합하여 만든 식품보충제로서 인간 또는 동물의 건강에 대한 효과와 생성된 항균물질의 감염예방에 관한 것이다.
국내의 기술을 살펴보면, 농촌진흥청 윤동열의 <항산화 활성을 갖는 락토바실러스 가세리 NLRI312>(출원번호10-2005-0028021)는 모유영양아의 분변에서 분리한 미생물이 인체에서 안전하고 세포를 보호하는 항산화 활성을 설명하고 있다. 또 한국야쿠르트에서 특허출원한 <지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리 에이치>(출원번호 1020100096005)는 김치에서 락토바실러스 가세리 에이치를 분리하고 캡슐화하고, 이를 이용한 발효유 및 기능성 음료 제조 등의 건강기능성 식품을 제조하는 방법과 비만 예방 또는 억제에 대해 기술한 것이다.
그러나 위의 특허 균주는 모두 모유로부터 분리한 프로바이오틱이 아님이 본 발명과 다른 점이다.
모유로부터 분리한 균주로 국내 특허 출원한 것에는 (주)바이오니아의 <락토바실러스 가세리 BNR17 균주를 포함하는 당뇨병예방 및 치료용 조성물>(출원번호10-2007-0122948) 과 <인간의 모유에서 분리한 프로바이오틱 활성 및 체중 증가억제 효과를 갖는 유산균>(출원번호1020077011080)이 있다.
그러나 이 기술들도 본 발명과 같이 인공영양아에게 모유영양아와 같은 모유 미생물을 공급하기 위한 미생물 제제가 아니다.
위의 내용을 살펴본 결과 본 발명은 기존의 국내외 연구와 특허에 존재하지 않는 신규 기술이다.
이런 배경하에서, 본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)와 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)등을 한국인 산모의 유두와 모유(초유포함)로부터 분리하고, 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)가 사용할 수 있는 미생물제제(분말제제)로 개발하여, 발명을 완성한 것을 특징으로 한다.
Martin, Rocio, et al. "The commensal microflora of human milk: new perspectives for food bacteriotherapy and probiotics." Trends in Food Science & Technology 15.3 (2004): 121-127.
Tannock, G. W. "Control of gastrointestinal pathogens by normal flora." Current perspectives in microbial ecology. American Society for Microbiology, Washington, DC (1984): 374-382.
Jakaitis, Brett M., and Patricia W. Denning. "Human breast milk and the gastrointestinal innate immune system." Clinics in perinatology 41.2 (2014): 423-435.
Walker, W. Allan, and Rajashri Shuba Iyengar. "Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis." Pediatric research 77.1-2 (2014): 220-228.
[문헌5]Parvez, S., et al. "Probiotics and their fermented food products are beneficial for health." Journal of applied microbiology 100.6 (2006): 1171-1185.
Altuntas, Evrim Gunes. "Isolation, identification and characterization of Staphylococcus epidermidis in human milk." LWT-Food Science and Technology 60.1 (2015): 36-41.
Solis, Gonzalo, et al. "Establishment and development of lactic acid bacteria and bifidobacteria microbiota in breast-milk and the infant gut." Anaerobe 16.3 (2010): 307-310.
현재 한국에서는 모유 수유가 어려운 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)에게 모유영양아가 섭취하는 것과 같이 모유 중의 미생물을 전달하고자 하는 어떠한 시도도 없다.
본 발명의 하나의 기술적 과제는 한국인 산모의 모유로부터 분리한 유익한 미생물을 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)에게 제공하여 모유영양아와 유사한 장내세균 조성을 유도하는 것이다.
본 발명의 또 다른 기술적 과제는 분리, 선정한 미생물의 안전성과 효과를 확인하는 것이다.
본 발명의 또 다른 기술적 과제는 상기 미생물을 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)에게 쉽고 저렴하게 공급할 수 있도록 산업적 생산과 미생물제제(분말제제)화 방법을 제공하는 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해, 먼저 50여명의 건강한 한국의 산모들을 선정하고, 이들로부터 초유 등 모유를 채유하고, 미생물 조성을 평판배양 및 계수법으로 분석하고, 30종의 미생물을 분리하였다. 그리고 이들 모유 미생물들 중에서 여러산모들에게 가장 흔한 빈도로 나타나며, 여러 문헌적 자료(Parvez 등, 2006)를 바탕으로 프로바이오틱으로 사용하기 가장 적합하며, 실험에 의해 안전하고 유익한 작용을 하는 최종 선정된 미생물 2종은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)와 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)이다. 그리고 이를 쉽고, 안전하고, 저렴하게 사용할 수 있는 미생물제제로 만들기 위해 미생물을 배양하는 여러 조건들과 제제화 조건 등을 검토하고, 가장 적합한 방법을 선정하였다.
하나의 양태로서, 본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)와 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP) 및 이들을 배양하여 제조한 미생물제제(분말제제)에 관한 것이다.
본 발명의 미생물들은, 한국인 산모 50명 모유에서 분리한 유산균들로서, ‘장염 유발 원인균 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 생육 억제 미생물제제(분말제제)’임을 특징으로 한다.
본 발명에서 2종의 미생물, 즉 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)J4P1 (KCTC 13066BP)와 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP) 중에서 전자는 모유 표본들 중 가장 높은 검출 빈도를 나타낸다(도 1). 따라서 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)는 모유영양아가 출생 후 최초 섭취하게 되는 가장 흔한 미생물로 생각되며, 대장균과 병원성균에 항균작용이 있으며, 모유가 가지는 유익한 작용에도 같이 기여한다(Altuntas, 2015).
모유 표본들 중 검출 빈도가 두번째로 높았던 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)는 장염 유발 원인균 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 생육을 억제함을 알 수 있다(도 2, 표 2). 또 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 유도 장염 마우스에서 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4의 효과를 조사한 결과, 마우스의 체중, 마우스 대장의 길이, (대장의 길이/체중)의 변화에서 락토바실러스 가세(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)를 섭취한 장염 마우스가 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)를 섭취하지 않은 장염 마우스보다 좋은 결과를 나타냈다(표 3, 4, 5).
이를 통하여, 본 발명의 프로바이오틱 유산균 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)는 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 유도 장염 모델 마우스에서 염증억제 기능을 나타냈으므로, 검출빈도가 가장 높은 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)J4P1 (KCTC 13066BP)와 함께 모유수유가 어려운 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)의 건강을 위한 미생물제제(분말제제)에 포함시키기에 적합하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 미생물제제(분말제제)의 산업적 생산 방법에 관한 것이다(도 3, 4). 균주를 배양하는 방법은 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 미생물제제의 제형은 액상, 분말 제제 등 특별히 제한되지는 않지만, 바람직하게는 분말제제이다. 액상 제제는 보관이 어렵고 유통 중 품질유지가 어려운 단점이 있으나, 분말 제제는 공급, 품질유지 및 사용이 용이하다는 장점이 있다. 배지에서 배양된 각각의 균주를 원심분리 등의 방법으로 수집하여, 동결건조시켜 분말형태의 미생물제제(분말제제)를 얻을 수 있다. 본 발명의 분말제제 등은 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)용 분유 등에 첨가하여 쉽게 사용할 수 있다.
본 발명은 하기 실시 예를 참고로 하여 더욱 상세히 설명될 것이다.
본 발명의 미생물들, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)와 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)는 첫째, 한국인 산모들로 분리하였기 때문에 모유수유가 어려운 신생아 및 제왕절개아를 포함한 인공영양아에게 공급될 때 모유영양아와 유사한 장내세균 조성을 유도할 수 있고, 둘째, 본 발명의 미생물제제는 장에서 염증성 장질환을 일으키는 미생물에 대한 항균 작용을 가지므로, 감염에 취약한 인공영양아들에 공급될 때, 각종 유사 병원균로부터 보호할 수 있으며, 셋째, 인공영양아에게 잦은 아토피 및 천식과 같은 장내미생물 이상증으로 인한 각종 자가면역질환을 예방할 수 있다.
제 1도는 모유 표본(50개)에서 검출된 미생물 조성과 검출 빈도를 나타낸 것이다.
[검출균종: 30종, 검출 빈도:락토바실러스 가세(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)(48%), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP) (92%)]
제2도는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP) 배양 여액의 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 생육 억제를 나타낸 것이다.
제3도는 유청에 이스트추출물을 0.1%씩 증가시킨 배지를 사용하여 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)의 생산조건을 나타낸 것이다.
제4도는 6종류의 배지를 사용하여 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP) 의 생산조건을 나타낸 것이다.
[1:15% 스킴밀크, 2:10% 스킴밀크, 3:0.5% 스킴밀크 + 3% 당밀, 4:유청 + 0.5% 당밀, 5:유청 + 3.0% 당밀, 6:유청 + 3.0% 당밀 + 0.6% 이스트추출물]
[검출균종: 30종, 검출 빈도:락토바실러스 가세(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)(48%), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP) (92%)]
제2도는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP) 배양 여액의 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 생육 억제를 나타낸 것이다.
제3도는 유청에 이스트추출물을 0.1%씩 증가시킨 배지를 사용하여 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)의 생산조건을 나타낸 것이다.
제4도는 6종류의 배지를 사용하여 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP) 의 생산조건을 나타낸 것이다.
[1:15% 스킴밀크, 2:10% 스킴밀크, 3:0.5% 스킴밀크 + 3% 당밀, 4:유청 + 0.5% 당밀, 5:유청 + 3.0% 당밀, 6:유청 + 3.0% 당밀 + 0.6% 이스트추출물]
한국인 모유 중의 미생물 조성 분석 및 프로바이오틱 균주 선정
한국인 모유 중의 미생물 조성을 분석하기 위해 만기 출산하고 모유 수유하는 50인의 산모를 대상으로 하였다. 대상자는 출산 후 1~25일 사이의 건강한 산모로 출산 전.후에 유산균 제제를 전혀 섭취하지 않았다. 모유 원액을 평판배지(BHY, RBC, TCG, MRS)에 도말하고 37℃에서 2~4일 혐기 또는 호기 배양하여 미생물을 분류하였다. 모유 표본 중에서 분리 동정된 미생물은 총 30종이었으며, 검출빈도가 가장 높은 것은 스타필로코커스 에피더미디스 J4P1 이며, 두 번째로 검출빈도가 높은 것은 락토바실러스 가세리 J12P4 였다. 미생물 조성 결과는 표 1과 같다. 또 본 발명에서 분리 동정된 30종의 균들 중에서 4종은 프로바이오틱 유산균으로 잘 알려져 있으며, 그 중에서 락토바실러스 가세리 J12P4의 검출빈도가 가장 높았다.
본 발명의 연구 결과와 마틴(Martin) 등(2004)과 쏠리스(Solis) 등(2010)의 연구결과를 바탕으로 모유 중에서 검출빈도가 가장 높은 스타필로코커스 에피더미디스 J4P1와 락토바실러스 가세리 J12P4를 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)를 위한 미생물제제(분말제제) 후보로 선정하였다.
| 번호 |
균 주 |
모유 표본 (50) | |||||
| 검출 빈도(%) |
총균수 (log10CFU/ml) |
사용 배지 |
배양 조건 |
||||
| 1 | B1B1 | Bacillus cereus | 3 | (6) | 1.73 | BHY | 호기성 |
| 2 | B3R2 | Bifidobacterium logum | 1 | (2) | 2.30 | TCG | 혐기성 |
| 3 | B38B3 | Burkholderia fungorum | 6 | (12) | 2.15 | BHY | 호기성 |
| 4 | B7B6 | Candidatus thiopilula | 4 | (8) | 1.61 | MRS | 호기성 |
| 5 | B13T2 | Corynebacterium kroppenstedtii | 8 | (16) | 1.90 | TCG | 호기성 |
| 6 | B21R7 | Corynebacterium tuberculostearicum | 1 | (2) | 1.90 | RBC | 혐기성 |
| 7 | B46B2 | Corynebacterium variable | 1 | (2) | 3.00 | TCG | 호기성 |
| 8 | B2B2 | Chyseobacterium sp. | 3 | (6) | 1.81 | BHY | 혐기성 |
| 9 | B9B3 | Dermacoccus sp. | 5 | (10) | 1.84 | BHY | 호기성 |
| 10 | B14B5 | Enterobacterium sp. | 2 | (4) | 2.08 | BHY | 호기성 |
| 11 | B3T3 | Enterococcus faecalis | 2 | (4) | 4.58 | RBC | 혐기성 |
| 12 | B16R2 | Klebsiella sp. | 1 | (2) | 2.00 | TCG | 호기성 |
| 13 | B21R4 | Kocuria kristinae | 2 | (4) | 2.31 | RBC | 혐기성 |
| 14 | B49B2 | Kocuria rosea | 1 | (2) | 2.57 | BHY | 호기성 |
| 15 | J12P4 | Lactobacillus gasseri | 24 | (48) | 3.07 | MRS | 혐기성 |
| 16 | B9R5 | Moraxella osloensis | 2 | (4) | 1.90 | BHY | 호기성 |
| 17 | B3M1 | Propionibacterium acnes | 7 | (14) | 3.15 | BHY | 혐기성 |
| 18 | B16B4 | Propionibacterium granulosum | 3 | (6) | 2.42 | BHY | 혐기성 |
| 19 | B1T2 | Pseudomonas sp. | 4 | (8) | 1.66 | TCG | 호기성 |
| 20 | B24T1 | Rothia amarae | 3 | (6) | 2.86 | TCG | 호기성 |
| 21 | B42B2 | Rothia terrae | 1 | (2) | 6.34 | RBC | 호기성 |
| 22 | B5R4 | Rothia mucilaginosa | 4 | (8) | 1.84 | TCG | 혐기성 |
| 23 | B8B5 | Staphylococcus aureus | 2 | (4) | 2.26 | TCG | 혐기성 |
| 24 | B20R3 | Staphylococcus capitis | 1 | (2) | 1.78 | RBC | 혐기성 |
| 25 | J4P1 | Staphylococcus epidermidis | 46 | (92) | 4.75 | BHY | 호기성 |
| 26 | B39M4 | Staphylococcus lugdurensis | 1 | (2) | 2.00 | MRS | 혐기성 |
| 27 | B26R1 | Staphylococcus pasteuri | 2 | (4) | 2.45 | RBC | 혐기성 |
| 28 | B13M2 | Streptococcus lactarius | 4 | (8) | 1.30 | MRS | 혐기성 |
| 29 | B16B2 | Streptococcus salivarius | 8 | (16) | 3.20 | RBC | 혐기성 |
| 30 | B5B4 | Streptococcus sp. | 40 | (80) | 2.53 | BHY | 호기성 |
각 균은 16S rRNA gene의 염기서열을 바탕으로 BLAST(NCBI)를 사용하여 동정하였고, 선정된 균주 락토바실러스 가세리 J12P4와 스타필로코커스 에피더미디스 J4P1의 염기서열은 후면에 첨가하였다.
락토바실러스 가세리 J12P4 배양여액의 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 생육 억제 효과
MRS 평판배지의 락토바실러스 가세리 J12P4 집락을 백금이를 이용해 MRS broth에 접종하고, TSA 평판배지의 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 집락은 TSB에 접종하여 각각 37℃에서 24시간 배양하였다. 두 균주는 각각 2.0%(v/v)씩 접종하여 3회 계대 배양한 후 종배양액으로 사용하였다.
유청에 락토바실러스 가세리 J12P4 종배양액을 2.0%(v/v) 접종하고 24시간 배양한 후 배양액을 원심 분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 배양여액과 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 종배양액 2.0%(v/v)를 TSB에 첨가하고 총 부피 5mL가 되게 하여 배양하였다. 이때 회수한 배양여액은 표 2와 같이 농도별로 첨가하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 이 배양액을 TSA 평판배지에 도말하고 배양한 후 생성된 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 집락을 계수하여 억제 농도를 판정하였다. 결과는 도 2, 표 2와 같다. 락토바실러스 가세리 J12P4의 배양여액의 농도가 높을수록 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922의 생육이 억제되었다.
따라서 락토바실러스 가세리 J12P4의 배양여액은 시험관(in vitro) 실험에서와 같이 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922에 대해 항균성이 있다.
| 락토바실러스 가세리 J12P4 의 배양여액 (μL) | ||||||||
| 25 | 50 | 00 | 200 | 300 | 400 | 500 | 600 | |
| 총 균 수 (log10CFU/mL) |
6.68 |
6.42 |
6.20 |
6.05 |
5.77 |
5.70 |
5.41 |
5.09 |
락토바실러스 가세리 J12P4의 마우스에서 장염 억제 효과
락토바실러스 가세리 J12P4를 섭취하지 않은 대조군 마우스(이하 ‘대조군')와 락토바실러스 가세리 J12P4를 섭취한 실험군 마우스(이하 ‘실험군')를 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922로 대장염을 유발시키고 장염 억제 효과를 관찰하였다. 실험군 어미마우스는 임신 후기(1주간)부터 출생 후 모유수유 기간(3주간)까지 락토바실러스 가세리 J12P4를 음용수에 희석하여 섭취하게 했다. 실험군과 대조군의 새끼 마우스는 출생 3주 후에 어미로부터 분리하여 일반 사료와 음용수를 섭취하였다. 실험군의 새끼 마우스는 락토바실러스 가세리 J12P4를 희석한 음용수를 섭취하였다. 섭취 균수는 105~107 colony forming unit (CFU)/day 였다. 대조군과 실험군의 마우스는 분리 후 11, 12일째에 각각 1번씩 총 2회 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922를 경구 투여하여 감염을 유발시켰다. 1회 투여 균수는 105~107 colony forming unit (CFU)/day 이었다. 13일째 대장적출을 위해 희생시켰다.
3-1:체중의 변화
에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 처리 전과 처리 후의 체중 변화를 비교한 결과는 표 3과 같다. 처리전과 처리 후의 체중이 실험군이 대조군에 비해 증가했다. 일반적으로 프로바이오틱 유산균은 장내에서의 유해균 감염 억제와 설사 예방 및 개선에 대한 효과가 알려져 있으며, 장내에서 유산을 생성하여 pH를 저하시키며, 박테리오신을 생성하여 병원성 및 부패성 세균의 생육을 억제하여 숙주를 보호한다.
본 발명에서 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922로 처리 후 락토바실러스 가세리 J12P4로 처리한 실험군이 대조군에 비해 체중 증가율이 높은 것은 락토바실러스 가세리 J12P4가 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 증식을 억제하여 정상적인 체중 증가가 이루어졌으며, 대조군의 체중 증가율이 낮은 것은 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922로 인한 장 조직 손상으로 영양흡수에 장애가 있었기 때문이다.
| 그룹 |
n |
에셔리키아 콜리 ATCC 25922 처리 | (처리후-처리전)/ 처리전 | |
| 처리 전 체중(g) | 처리 후 체중(g) | |||
| 대조군 | 7 | 8.31 ±0.44 * | 13.66 ±1.39 * | 0.64 ±0.14 * |
| 실험군 | 7 | 9.93 ±0.84 * | 18.36 ±1.29 * | 0.85 ±0.07 * |
* 평균값을 나타낸다
3-2:대장길이의 변화
대조군과 실험군 마우스를 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 처리 후 2일째 희생시켜 맹장과 직장을 포함한 대장을 적출하고 회장에서 직장까지의 길이(이하 '대장길이')와 무게(이하 '대장무게')를 측정하였다. 대조군과 실험군의 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 처리된 마우스의 대장 길이 변화는 표 4와 같으며, 대조군이 실험군에 비해 많이 짧았다.
일반적으로 대장염 유발 마우스에서 대장의 길이는 염증으로 인해 정상군과 비교했을 때 짧아지고 무게는 증가한다. 또한 유산균 투여한 대장염 마우스보다 유산균 투여하지 않은 대장염 마우스가 대장의 염증, 대장 조직의 두께 증가 및 대장 길이가 더 많이 감소 된다.
| 대장 |
n |
에셔리키아 콜리 ATCC 25922 처리 | |
| 대조군 | 실험군 | ||
| 길이(cm) | 7 | 9.19 ±0.73 * | 11.03 ±0.49 * |
* 평균값을 나타낸다
3-3:대장 무게/체중 비율의 변화
에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 처리된 대조군과 실험군의 마우스 대장무게/체중 비율 변화는 표 5과 같다. 본 발명에서 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922 처리로 염증을 유발시킨 마우스의 평균 대장무게/체중 비율은 대조군이 실험군에 비하여 높았다. 대조군이 체중에 따른 대장의 무게가 증가하였다는 것은 염증으로 인해 대장 조직의 두꺼워지고, 부종이 있음을 나타낸다.
| 대장 |
n | 에셔리키아 콜리 ATCC 25922 처리 | |
| 대조군 | 실험군 | ||
| 대장무게/체중 | 7 | 0.00895 ±0.0008 * | 0.00623 ±0.00234 * |
* 평균값을 나타낸다
상기 연구 결과에 의하면 본 발명에서 선정된 락토바실러스 가세리 J12P4는 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922를 생육을 억제하여 대장염의 증상을 완화하였다. 따라서 본 발명에서 선정된 락토바실러스 가세리 J12P4는 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922의 생육을 억제하는 항균성이 우수한 프로바이오틱이다.
락토바실러스 가세리 J12P4 및 스타필로코커스 에피더미디스 J4P1의 산업적 생산 및 동결건조 조건
산업적 생산조건을 찾기위해 스타필로코커스 에피더미디스 J4P1는 표 6과 같이 6개 영양배지를 구성하여 종배양액을 2.0%(v/v) 접종하였다. 락토바실러스 가세리 J12P4는 표 7과 같이 6개 영양배지를 구성하여 종배양액을 2.0%(v/v) 접종하였다. 각각 37℃에서 24시간 배양한 다음 생균수를 비교하고 총균수가 높은 배지를 선정하였다. 스타필로코커스 에피더미디스 J4P1의 최종 선정 배지는 유청(milk whey)에 0.3% 이스트추출물(yeast extract)을 보강한 배지였으며(표 6, 도 3), 락토바실러스 가세리 J12P4의 최종 선정 배지는 유청(milk whey)에 3% 당밀과 0.6% 이스트추출물(yeast extract)을 보강한 배지였다(표 7, 도 4). 락토바실러스 가세리 J12P4의 최종 선정 배지는 최대 생육 배지인 스킴 밀크(skim milk) 15%와 비교했을 때 균수가 비슷하면서도, 스킴 밀크(skim milk) 15%보다 값싼 배지이므로 최적의 생육 배지로 선정되었다.
| 영 양 원 | 총균수 (log10CFU/mL) |
| 유청 + 이스트추출물 0.0% | 8.90 |
| 유청 + 이스트추출물 0.1% | 9.04 |
| 유청 + 이스트추출물 0.2% | 8.96 |
| 유청 + 이스트추출물 0.3% | 9.13 |
| 유청 + 이스트추출물 0.4% | 9.03 |
| 유청 + 이스트추출물 0.5% | 8.99 |
| 영 양 원 | 총균수 (log10CFU/mL) |
| 스킴밀크 15% | 9.14 |
| 스킴밀크 10% | 9.10 |
| 스킴밀크 0.5% + 당밀 3% | 8.13 |
| 유청 + 당밀 0.5% | 8.38 |
| 유청 + 당밀 3.0% | 8.90 |
| 유청 + 당밀 3.0% + 이스트 추출물 0.6% | 9.12 |
상기 선정된 배지에서 배양한 균체를 원심분리하여 회수한 후, 동결보호제로 10% 스킴밀크에 현탁한 다음 동결 건조하여 미생물제제(분말제제)를 얻는다. 그리고 상기 분말제제 등을 안정적 장내세균 조성을 위해 신생아 및 제왕절개아에 사용할 때는 락토바실러스 가세리 J12P4 및 스타필로코커스 에피더미디스 J4P1의 단독, 또는 혼합 제품을, 총 미생물균수가 액상 분유에 105~107 colony forming unit (CFU)/mL가 되게 첨가한다.
<110> PARK, Soon Hi
JIN, Hyo Sang
<120> Microbial preparation(powder) for formula-fed babies produced
with Lactobacillus gasseri J12P4 and Staphylococcus epidermidis
J4P1 isolated from Korean breast milk
<130> JP-12441
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1100
<212> DNA
<213> Lactobacillus gasseri
<400> 1
aaggtaacgg cttaccaagg caatgatgca tagccgagtt gagagactga tcggccacat 60
tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 120
gacgcaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaagctc 180
tgttggtagt gaagaaagat agaggtagta actggccttt atttgacggt aattacttag 240
aaagtcacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 300
ggatttattg ggcgtaaagc gagtgcaggc ggttcaataa gtctgatgtg aaagccttcg 360
gctcaaccgg agaattgcat cagaaactgt tgaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 420
ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 480
ctctggtctg caactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc 540
ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttgg gaggtttccg cctctcagtg 600
ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa 660
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 720
gaaccttacc aggtcttgac atccagtgca aacctaagag attaggagtt cccttcgggg 780
acgctgagac aggtgggcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 840
ccgcaacgag cgcaaccctt gtcattagtt gccatcatta agttgggcac tctaatgaga 900
ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgac 960
ctgggctaca cacgtgctac aatggacggt acaacgagaa gcgaacctgc gaaggcaagc 1020
ggatctttga aagccgttct cagttcggac tgtaggctgc aactcgccta cacgaagccg 1080
gaatccctag taatcgcgga 1100
<210> 2
<211> 1355
<212> DNA
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 2
ggcggacggg tgagtaacac gtggataacc tacctataag actgggataa cttcgggaaa 60
ccggagctaa taccggataa tatattgaac cgcatggttc aatagtgaaa gacggttttg 120
ctgtcactta tagatggatc cgcgccgcat tagctagttg gtaaggtaac ggcttaccaa 180
ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actggaactg agacacggtc 240
cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tgggcgaaag cctgacggag 300
caacgccgcg tgagtgatga aggtcttcgg atcgtaaaac tctgttatta gggaagaaca 360
aatgtgtaag taactatgca cgtcttgacg gtacctaatc agaaagccac ggctaactac 420
gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggaattat tgggcgtaaa 480
gcgcgcgtag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagccca cggctcaacc gtggagggtc 540
attggaaact ggaaaacttg agtgcagaag aggaaagtgg aattccatgt gtagcggtga 600
aatgcgcaga gatatggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctttctggtc tgtaactgac 660
gctgatgtgc gaaagcgtgg ggatcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 720
aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa 780
gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cggggacccg 840
cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaaatcttg 900
acatcctctg acccctctag agatagagtt ttccccttcg ggggacagag tgacaggtgg 960
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020
cccttaagct tagttgccat cattaagttg ggcactctaa gttgactgcc ggtgacaaac 1080
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgatttggg ctacacacgt 1140
gctacaatgg acaatacaaa gggtagcgaa accgcgaggt caagcaaatc ccataaagtt 1200
gttctcagtt cggattgtag tctgcaactc gactatatga agctggaatc gctagtaatc 1260
gtagatcagc atgctacggt gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc 1320
acgagagttt gtaacacccg aagccggtgg agtaa 1355
Claims (4)
- 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP) 또는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)를 포함하는 미생물제제를 인공영양아(신생아, 제왕절개아 및 영유아)에게 제공하여 모유영양아와 유사한 장내세균 조성을 유도하는 방법
- 제1항에 있어서, 액상, 분말 또는 정제 형태의 미생물제제(분말제제)
- 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) J12P4 (KCTC 13067BP)
- 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) J4P1 (KCTC 13066BP)
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160154811A KR20180056896A (ko) | 2016-11-21 | 2016-11-21 | 한국인 모유로부터 분리한 락토바실러스 가세리 제이12피4 와 스타필로코커스 에피더미디스 제이4피1로 제조한 인공영양아용 미생물제제 및 이를 사용한 장염 억제 방법 |
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|---|---|---|---|
| KR1020160154811A KR20180056896A (ko) | 2016-11-21 | 2016-11-21 | 한국인 모유로부터 분리한 락토바실러스 가세리 제이12피4 와 스타필로코커스 에피더미디스 제이4피1로 제조한 인공영양아용 미생물제제 및 이를 사용한 장염 억제 방법 |
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|---|---|
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| DE202019005298U1 (de) | 2018-05-18 | 2020-03-18 | Seoul Semiconductor Co., Ltd. | Leuchtdiode, Leuchtdiodenmodul und Anzeigevorrichtung mit dem Leuchtdiodenmodul |
| WO2021066585A1 (ko) * | 2019-10-02 | 2021-04-08 | 연세대학교 산학협력단 | 면역 증강 활성 및 병원성 세균에 대한 항균 활성을 갖는 스타필로코커스 에피데르미데스 균주 및 이의 용도 |
-
2016
- 2016-11-21 KR KR1020160154811A patent/KR20180056896A/ko active Search and Examination
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE202019005298U1 (de) | 2018-05-18 | 2020-03-18 | Seoul Semiconductor Co., Ltd. | Leuchtdiode, Leuchtdiodenmodul und Anzeigevorrichtung mit dem Leuchtdiodenmodul |
| WO2021066585A1 (ko) * | 2019-10-02 | 2021-04-08 | 연세대학교 산학협력단 | 면역 증강 활성 및 병원성 세균에 대한 항균 활성을 갖는 스타필로코커스 에피데르미데스 균주 및 이의 용도 |
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