CN110964655B - 一种乳双歧杆菌bl-99及其应用 - Google Patents

一种乳双歧杆菌bl-99及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有调节胃肠道菌群功效的乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)及其用途，属于微生物技术领域。本发明提供的乳双歧杆菌具有耐胃酸性能，在pH2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上。该菌能显著促进双歧杆菌和乳酸菌的生长，能够抑制肠道中脱硫弧菌和/或肠杆菌属，特别是可治病性抑制幽门螺旋杆菌和/或埃希氏菌‑志贺菌属，可以用于制备具有调节胃肠道菌群的食品、药物及饲料等，具有广泛的应用前景。

Description

一种乳双歧杆菌BL-99及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种具有耐胃酸和耐肠液性能、能显著促进双歧杆菌和乳酸菌的生长的乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)及其用途。
背景技术
肠道菌群的平衡与人体健康息息相关，肠道菌群包括有益菌、中性菌和有害菌。健康的人体肠道中有益菌占据优势地位，并且与有害菌不断相互作用，维护人体健康。如果由于各种因素影响使肠道中有益菌减少，有害菌便会大量繁殖，肠内微生态平衡被打破，引起肠炎、腹泻等多种临床症状。同时，临床上通常使用大量的抗生素，虽然能有效的杀害有害菌，但同时杀灭有益菌，造成肠道菌群失调，引起疾病。
对于肠道菌群失调者，经口补充益生菌是调节肠道菌群直接有效的办法。经口补充益生菌制剂或含益生菌产品可以直接或间接调节肠道菌群组成，激活宿主内源性微生物群或者免疫系统活性来实现益生作用。
世界卫生组织对益生菌产品的定义为食品中含有充足数量的活的微生物，经过食品加工的各个过程，以及进入人体肠道以后，仍能保持适当的活菌数量和菌活性。因此通常认为菌株在菌粉的制作、产品的生产加工以及经人体胃肠道的胃酸、肠液胁迫后，菌株应能够保持较为稳定的活菌数量是有必要的。此外，即便乳酸菌是公认的安全菌株，但近年来的研究表明，很多乳酸菌，尤其是食源性乳酸菌和肠道乳酸菌，也出现了毒性因子与抗生素抗性，对人类的健康造成了潜在风险。因此，在评价菌株益生特性的同时，也应全面考量其在食用过程的安全性与生产加工过程中的稳定性。
不抗酸、不耐受胃肠液是双歧杆菌属的普遍性能，这将导致双歧杆菌很难通过胃液到达肠道并在肠道中定殖。因此，筛选具有肠道菌群平衡功效的双歧杆菌益生菌是领域中的一个重要研究方向。
发明内容
本发明的一个目的在于提供了一种新的乳双歧杆菌及其用途。
一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)，该菌株单菌即具有显著促进肠道双歧杆菌和乳酸菌增长的能力，能够抑制肠道中脱硫弧菌和/或肠杆菌属的生长，特别是可治病性抑制幽门螺旋杆菌和/或埃希氏菌-志贺菌属的生长，具有显著的调节胃肠道菌群功效。并且，该菌具有良好的耐胃酸和耐肠液性能。
具体而言，本发明提供了一种乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)，其具有耐胃酸性能，在pH2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上。
本发明提供的乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)还具有耐肠液性能，在pH6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。
本发明中将所提供的乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)命名为BL-99。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)；保藏编号为CGMCC No.15650。
本发明提供的乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)，其可以耐受体外模拟胃肠液胁迫环境，通过胃液到达肠道并在肠道中定殖，从而发挥其促进肠道双歧杆菌和乳酸菌增长的能力，能够抑制肠道中脱硫弧菌和/或肠杆菌属的生长，特别是可治病性抑制幽门螺旋杆菌和/或埃希氏菌-志贺菌属的生长。并且，小鼠实验表明该菌株无口服急性毒性，无抗生素耐受，安全可以用于食品加工。
本发明的乳双歧杆菌BL-99，其可在领域中常用的乳双歧杆菌培养基(例如TPY培养基、BBL培养基等)中厌氧发酵培养。最佳发酵温度35～38℃，最佳发酵时间7～24h。本发明同时提供了一种乳双歧杆菌BL-99菌制剂的制作方法，其是将所述的菌株在液态发酵培养基中厌氧培养，获得包含菌体的发酵液。发酵液可直接或进一步浓缩后作为液态菌制剂，也可将发酵液干燥后制备菌粉，或是从发酵液中分离出菌体制备菌粉。本发明的液态菌制剂也可以是将菌体重悬于培养液、缓冲液或去离子水等溶剂后的液态制剂。本发明的BL-99液态菌制剂或固态菌制剂(菌粉)可以以活菌形式保存，在保藏期具有较好的稳定性。本发明的BL-99液态菌制剂或固态菌制剂(菌粉)也可以以灭活的死菌形式保存。所述的菌制剂可以用于食品、饲料或药品的生产。
从而，另一方面，本发明还提供了一种乳双歧杆菌菌制剂，该菌制剂中含有所述的乳双歧杆菌BL-99，其为活菌形式或灭活形式的固态菌粉，或者为活菌形式或灭活形式的液态态菌制剂。
另一方面，本发明还提供了所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备具有调节肠道菌群功效的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
另一方面，本发明还提供了所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备具有增加肠道中双歧杆菌和/或乳酸菌数量的功效的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
另一方面，本发明还提供了所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备具有抑制肠道中脱硫弧菌(Desulfovibrio)和/或肠杆菌属(Enterorhabdus)功效的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
另一方面，本发明还提供了所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备具有抑制幽门螺旋杆菌(Helicobacter)和/或埃希氏菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)功效的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
本发明的组合物可使用于动物或是人类。所述组合物还可包括所属领域中的常规用料组分。例如，对于药物组合物，可包括适量的辅料，所述辅料可以为赋型剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂等。对于食品组合物，本发明的乳双歧杆菌可以按照现有技术中含乳双歧杆菌的食品进行生产，所述组合物可根据受施予者的需要，而采用不同形态。例如粉剂、锭剂、造粒、微胶囊、液体制剂等。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明还提供了一种食品，其中包含所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂；优选地，所述食品为发酵乳制品(例如发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等)、乳酪、含乳饮料、固体饮料或乳粉。食品的具体配方和生产方法可参照现有技术中含乳双歧杆菌的食品进行。
在本发明的另一些具体实施方案中，本发明还提供了一种药物，其中包含所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂。药物的具体配方和生产方法可参照现有技术中含乳双歧杆菌的药物进行。
在本发明的另一些具体实施方案中，本发明还提供了一种饲料，其中包含所述的乳双歧杆菌或所述的乳双歧杆菌菌制剂。饲料的具体配方和生产方法可参照现有技术中含益生菌的饲料进行，本发明的乳双歧杆菌或菌制剂作为益生菌补充剂添加即可。
优选地，在所述食品、药物或饲料中，乳双歧杆菌BL-99以菌体的重量计，供动物或人类使用的建议剂量可为0.001μg～100mg/kg体重/天，更优选为0.01μg～10mg/kg体重/天。本发明的食品、药物或饲料，因包含所述的乳双歧杆菌BL-99而具有相应的调节胃肠道菌群的功效。
综上所述，本发明提供了一种乳双歧杆菌BL-99，其保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌，该乳双歧杆菌具有耐胃酸和耐肠液性能，并具有调节胃肠道菌群功效，特别是能够抑制肠道中脱硫弧菌和/或肠杆菌属，治病性抑制幽门螺旋杆菌和/或埃希氏菌-志贺菌属，可以用于制备具有调节肠道菌群的食品、药物及饲料等，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明一具体实施例中的发酵工艺流程示意图。
用于专利程序的微生物保存：
本发明的乳双歧杆菌BL-99：
保藏日期：2018年04月26日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏编号：CGMCC No.15650；
分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非另有说明，本发明中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。
本发明的各实施例中，除特别说明外，实验数据表示为Mean±S.E.M.数据采用PRISM version 5.0(GraphPad,San Diego,CA,USA)进行统计。组间差异采用one-wayANOVA跟随Tukery’s multiple comparison test的方法进行统计。P<0.05时具有显著的统计学差异。
实施例1：乳双歧杆菌BL-99及其性能测定
本发明的乳双歧杆菌BL-99，来自上海交大昂立股份有限公司，是自婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)；保藏编号为CGMCC No.15650。
1.乳双歧杆菌BL-99的分类学特征
理化试验结果：
Figure GDA0002975853040000051
16S rRNA基因序列测序结果(SEQ ID No.1)：
GCTCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACT
2.乳双歧杆菌BL-99的人工胃液、肠液耐受性
双歧杆菌为通常不抗酸的菌属。本实施例中，测试了本发明的乳双歧杆菌BL-99的人工胃液、肠液耐受性，同时以目前领域中公认耐酸性能极好、可以通过胃肠道存活的乳双歧杆菌
Figure GDA0002975853040000061
作为对比。
测试方法：将乳双歧杆菌BL-99菌株于MRS液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。
将待测菌株分别在人工胃液、人工小肠液中培养，37℃处理0、30min、2h后进行活菌计数分析，以存活率评价菌株的耐酸及耐肠液性能。存活率＝(处理后的活菌数/0时刻活菌数)×100％。
菌株在人工胃酸(pH2.5)中的存活率检测结果如表1所示，BB-12在人工胃酸(pH2.5)中处理30min时活菌存活率7.04％，处理2小时活菌存活率仅1.64％；而本发明的乳双歧杆菌BL-99在人工胃酸(pH2.5)中处理30min时活菌存活率62.60％，处理2小时活菌存活率61.83％。表明本发明的乳双歧杆菌BL-99具有优异的耐胃酸能力，能较为顺利地通过胃到达肠道发挥益生作用。
表1、菌株在人工胃酸(pH2.5)中的存活率
Figure GDA0002975853040000071
菌株在人工小肠液(pH6.8)中的存活率检测结果参见表2。数据显示，BB-12在人工小肠液(pH6.8)中处理2小时活菌存活率仅28.95％；而本发明的乳双歧杆菌BL-99在人工胃酸(pH2.5)中处理2小时活菌存活率70.23％。表明本发明的乳双歧杆菌BL-99具有优异的耐肠液能力，可以在肠道内存活并定殖。
表2、菌株在人工小肠液(pH6.8)中的存活率
Figure GDA0002975853040000072
3.乳双歧杆菌BL-99的的毒力实验及安全性检测
将本发明的乳双歧杆菌BL-99接种于BBL液体培养基中，36±1℃厌氧培养48±2小时，计数培养液中乳双歧杆菌BL-99活菌数为3.7×108cfu/mL，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0mL/kg BW给受试小鼠连续灌胃3天，观察7天。试验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。试验结果表明：乳双歧杆菌BL-99的BBL培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的影响无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。
采用SN/T 1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定》方法，评估乳双歧杆菌BL-99的抗生素敏感性能。评价结果显示，乳双歧杆菌BL-99对氨苄西林Ampicillin、青霉素G PenicillinG、红霉素Erythromycin、氯霉素Chloramphenicol、克林霉素Clindamycin、万古霉素Vancomycin和四环素Tetracycline等敏感。符合欧洲食品安全委员会(EuropeanFood Safety Authority)对食用细菌耐药性评价规范中的要求。乳双歧杆菌BL-99不含外源抗生素耐药基因，食用安全。
实施例2：活性乳双歧杆菌肠道菌群调节效果分析
本实施例意图证实本发明的乳双歧杆菌在肠道调节方面的效果，其原理和步骤参见“保健食品检验与评价技术规范-调节肠道菌群功能判定标准”。
将乳双歧杆菌BL-99菌株于MRS液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后冷冻干燥，所得菌粉-18℃以下保存。用于本实施例的各项实验研究。
取36只健康SPF级BABL/c小鼠，体重18-22g(由北京华阜康生物科技有限责任公司提供)。适应性饲养3天后，将其随机分为3组，每组12只，即空白对照组，样品组。向每组动物分别灌胃溶解了乳双歧杆菌BL-99菌粉的无菌水(灌胃体积0.2mL/10g)，空白对照组灌胃相同体积的无菌水。每天1次，连续饲喂或灌胃14天。灌胃计量：1.3×107CFU/ml(按人体需要量为2×109CFU/d，人体和小鼠换算系数0.0026进行换算)。取灭菌离心管，编号，适应性喂养后于无菌条件下采集小鼠粪便，每只2-3粒，约100mg，低温条件转移至无菌操作间进行菌群的检测。实验结束时，再次采集小鼠粪便。使用苦味酸对小鼠进行分组编号后，分别于给予受试物第8天、第14天称重，计算小鼠灌胃量，实验结束时称重1次。菌落计数：根据待鉴定菌种配制选择性培养基，待测菌种及相应培养基如表3，灭菌，摇匀，冷至45℃-50℃倾注平板，备用。
表3、待测菌种及对应选择性培养基
待测菌种 选择性培养基
肠杆菌 伊红美蓝(EMB)琼脂
肠球菌 叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂
双歧杆菌 BBL琼脂
乳酸杆菌 LBS琼脂
产气荚膜梭菌 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂
将采集的小鼠粪便，置于装有0.5mL生理盐水的灭菌管中，配制成菌悬液，使用前震荡1min。使用0.1mL微量移液器吸取0.1mL菌悬液，缓慢注于0.9mL灭菌生理盐水中，震荡或反复吹打使其混匀，制成1:10的菌悬液。另取0.1mL微量移液器吸头，依此方法，进行10倍梯度稀释，直至10-7g/ml。根据待鉴定菌种的活菌数，选择两个连续的适宜稀释度，每个稀释度使用10μL微量移液器吸取10μL菌悬液，在选择性琼脂平板上进行表面涂布，按表4所示培养条件进行培养。菌落计数方法参考《GB 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行。
表4、肠道菌群检验用培养基及鉴定方法
Figure GDA0002975853040000091
采用SPSS17.0进行数据统计。比较实验前后自身及组间双歧杆菌、乳酸菌、肠球菌、肠杆菌的变化情况，试验组实验前后自身比较变化有显著性，符合以下任意一项，可以判定该受试样品动物实验结果阳性。第一、粪便中双歧杆菌或者乳酸菌明显增加，梭菌减少或无明显变化，肠球菌、肠杆菌无明显变化。第二、粪便中双歧杆菌或者乳酸菌明显增加，梭菌减少或无明显变化，肠球菌、肠杆菌明显增加，但增加的幅度低于双歧杆菌或者乳酸菌增加的幅度。
实验期间动物的体重变化结果如表5所示。在实验期内，动物表征正常，给予受试物后未出现任何不良反应，实验周期内，两组动物体重并未出现显著差异。
表5、动物的体重变化
编号 分组 动物数 初始体重(g) 中期体重(g) 终末体重(g)
1 对照组 14 21.89±1.25 22.14±0.87 21.24±0.87
2 BL-99 14 23.36±0.77 22.41±0.93 22.59±1.53
3 BB-12 14 22.31±1.07 22.00±1.55
表6～表10分别记录了受试前后动物肠道不同菌的变化。从表6～表10可以看出，乳双歧杆菌BL-99能显著促进双歧杆菌和乳酸菌的生长，对于肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌无显著影响，根据保健食品检验与评价技术规范-调节肠道菌群功能判定标准可以判定，本研究中乳双歧杆菌BL-99具有调节肠道菌群的功效。
表6、受试前后动物肠道双歧杆菌的变化(LgCFU/g)
Figure GDA0002975853040000101
表7、受试前后动物肠道乳杆菌的变化(LgCFU/g)
Figure GDA0002975853040000102
表8、受试前后动物肠道肠杆菌的变化(LgCFU/g)
Figure GDA0002975853040000103
表9、受试前后动物肠道肠球菌的变化(LgCFU/g)
Figure GDA0002975853040000104
表10、受试前后动物肠道荚膜梭菌的变化(LgCFU/g)
Figure GDA0002975853040000111
实施例3：不同剂量活性乳双歧杆菌及灭活菌种的肠道菌群调节效果比较
本实施例中，分别检测了不同剂量活性乳双歧杆菌BL-99及灭活菌种的肠道菌群调节效果。
活菌样品：依据样品规格，称取1g活菌样品，使用PBS溶液悬浮至40ml，即活菌浓度均为2.5x109 CFU/ml。
高剂量组：按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，高剂量组小鼠灌胃剂量为109CFU/20g。
中剂量组：分别取5ml高剂量悬浮液加入PBS定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，中剂量组小鼠灌胃剂量为108CFU/20g。
低剂量组：分别取5ml中剂量组悬浮液加入PBS定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，低剂量组小鼠灌胃剂量为107CFU/20g。
死菌样品：依据样品规格，称取1g活菌样品，使用PBS溶液悬浮至40ml，即活菌浓度为2.5x109 CFU/ml。将浓度为2.5x109 CFU/ml的活菌样品菌液100℃热杀死20min。其高、中、低剂量组样品配置方法与上述活菌组相同。
6周龄BABL/c小鼠饲养于清洁级动物房，温度22℃，湿度10-60％，12小时明暗交替照明，标准饲料喂养，自由饮水。适应性喂养5天，182只小鼠随机分为13组，每组14只，分组情况见表11。
表11、调节肠道菌群实验分组
Figure GDA0002975853040000112
开始灌胃前，无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。实验按照0.2ml/10g灌胃量给予各受试物，对照组1-14天给予PBS，实验组分别依据表2灌胃给予相应剂量的受试物。小鼠每周称重一次，根据体重调整灌胃量。14天后无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。
实验前后，各组小鼠体重无显著差异。在门的水平，补充不同剂量的益生菌后，小鼠肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度增加而拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)相对丰度降低。研究表明，厚壁菌门与拟杆菌门的比值与人体肠道疾病具有较强的相关性，肥胖病人倾向于二者比值降低。而肠炎、肠应激综合症患者则倾向于具有较高的变形菌门(Proteobacteria)丰度。
BL-99在属的水平对肠道菌群的影响参见表12。
表12、BL-99对肠道菌群的影响
Figure GDA0002975853040000121
在属的水平，控制组相比，益生菌组小鼠肠道菌群中BL-99可显著增加小鼠肠道中的乳酸杆菌属(Lactobacillus)相对丰度，且BL-99低剂量组对乳酸杆菌(Lactobacillus)的增加程度最为显著。而BL-99死菌高剂量组对脱硫弧菌(Desulfovibrio)、肠杆菌属(Enterorhabdus)具有显著抑制作用。
BL-99对致病菌幽门螺杆菌、埃希氏菌-志贺氏菌属的抑制效果参见表13。
表13、BL-99对致病菌的抑制效果
Figure GDA0002975853040000122
Figure GDA0002975853040000131
对致病菌进行分析，结果同样表明，BL-99低剂量组对幽门螺旋杆菌(Helicobacter)具有显著抑制作用，所有组别均对埃希氏菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)具有抑菌作用，且死菌效果更优。
上述实验表明，补充低剂量组的BL-99即可以调节肠道菌群平衡，促进有益菌生长，抑制有害菌甚至是致病菌，且死菌同样有效，表明补充低剂量组的BL-99或BL-99死菌既可以起到潜在的健康的功效。
实施例4：BL-99菌粉的制备及其用于食品的生产
参照图1所示的发酵工艺流程，将本发明提供的乳双歧杆菌BL-99(即保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌)在TPY液体培养基中进行厌氧培养。TPY液体培养基(g/L)：水解酪蛋白10.0，大豆胨5.0，酵母粉2.0，葡萄糖5.0，L-半胱氨酸0.5，磷酸氢二钾2.0，氯化镁0.5，硫酸锌0.25，氯化钙0.15，氯化铁0.0001，吐温80 1.0，pH值6.5±0.1。经一级、二级并扩大培养后的发酵液，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。所收集的菌体经冷冻干燥，得到BL-99活性菌粉，-18℃以下保存。所收集的菌体也可经热处理灭活，得到灭菌菌粉。
本实施例所制得的BL-99菌粉，可以用于食品、饲料或医药用途。所述食品例如可以是发酵乳、乳酪、含乳饮料、固体饮料、乳粉等普通食品或保健食品。乳双歧杆菌BL-99可以以活菌或灭活形式存在于所述食品、饲料或药品中。优选地，在所述食品中，乳双歧杆菌BL-99供人类使用的建议的剂量可为0.001μg～100mg/kg体重/天，更优选为0.01μg～10mg/kg体重/天，进一步优选为0.01μg～1mg/kg体重/天。
序列表
<110> 内蒙古伊利实业集团股份有限公司
<120> 一种可调节胃肠道菌群的乳双歧杆菌BL-99及其应用
<130> GAI18CN4310
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)
<400> 1
gctcccccac aagggtcggg ccaccggctt cgggtgctac ccactttcat gacttgacgg 60
gcggtgtgta caaggcccgg gaacgcattc accgcggcgt tgctgatccg cgattactag 120
cgactccgcc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc gaactgagac cggttttcag 180
cgatccgccc cacgtcaccg tgtcgcaccg cgttgtaccg gccattgtag catgcgtgaa 240
gccctggacg taaggggcat gatgatctga cgtcatcccc accttcctcc gagttgaccc 300
cggcggtccc acatgagttc ccggcatcac ccgctggcaa catgcggcga gggttgcgct 360
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacgaccat gcaccacctg 420
tgaaccggcc ccgaagggaa accgtgtctc cacggcgatc cggcacatgt caagcccagg 480
taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg cgggcccccg 540
tcaatttctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcgggatgc ttaacgcgtt 600
ggctccgaca cgggacccgt ggaaagggcc ccacatccag catccaccgt ttacggcgtg 660
gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagtgac 720
ggcccagaga cctgccttcg ccattggtgt tcttcccgat atctacacat tccaccgtta 780
caccgggaat tccagtctcc cctaccgcac tccagcccgc ccgtacccgg cgcagatcca 840
ccgttaggcg atggactttc acaccggacg cgacgaaccg cctacgagcc ctttacgccc 900
aataaatccg gataacgctc gcaccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960
cggtgcttat tcgaacaatc cactcaacac ggccgaaacc gtgccttgcc cttgaacaaa 1020
agcggtttac aacccgaagg cctccatccc gcacgcggcg tcgctgcatc aggcttgcgc 1080
ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgta tctcagtccc 1140
aatgtggccg gtcaccctct caggccggct acccgtcaac gccttggtgg gccatcaccc 1200
cgccaacaag ctgataggac gcgaccccat cccatgccgc aaaagcattt cccaccccac 1260
catgcgatgg agcggagcat ccggtattac cacccgtttc caggagctat tccggtgcac 1320
agggcaggtt ggtcacgcat tactcacccg ttcgccactc tcaccccgac agcaagctgc 1380
cagggatccc gttcgact 1398

Claims (20)

1.一种乳双歧杆菌菌制剂，该菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌，其为活菌形式的固态菌粉，或者为活菌形式的液态菌制剂。
2.一种乳双歧杆菌菌制剂，该菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌，其为灭活形式的固态菌粉，或者为灭活形式的液态菌制剂。
3.保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌或权利要求1所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备具有调节胃肠道菌群功效的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
4.保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌或权利要求1所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备具有增加肠道中双歧杆菌和/或乳酸菌数量的功效的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
5.保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌或权利要求1所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备具有抑制肠道中脱硫弧菌(Desulfovibrio)和/或肠杆菌属(Enterorhabdus)功效的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
6.保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌或权利要求1所述的乳双歧杆菌菌制剂在制备具有抑制幽门螺旋杆菌(Helicobacter)和/或埃希氏菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)功效的组合物中的应用，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。
7.一种具有调节胃肠道菌群功效的食品，其中包含活菌形式的保藏编号为CGMCCNo.15650的乳双歧杆菌或权利要求1所述的乳双歧杆菌菌制剂。
8.根据权利要求7所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为发酵乳制品。
9.根据权利要求7所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为乳酪。
10.根据权利要求7所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为含乳饮料。
11.根据权利要求7所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为固体饮料。
12.根据权利要求7所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为乳粉。
13.一种具有调节胃肠道菌群功效的食品，其中包含灭活形式的保藏编号为CGMCCNo.15650的乳双歧杆菌或权利要求2所述的乳双歧杆菌菌制剂。
14.根据权利要求13所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为发酵乳制品。
15.根据权利要求13所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为乳酪。
16.根据权利要求13所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为含乳饮料。
17.根据权利要求13所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为固体饮料。
18.根据权利要求13所述的具有调节胃肠道菌群功效的食品，所述食品为乳粉。
19.一种具有调节胃肠道菌群功效的药品，其中包含活菌形式的保藏编号为CGMCCNo.15650的乳双歧杆菌或权利要求1所述的乳双歧杆菌菌制剂。
20.一种具有调节胃肠道菌群功效的药品，其中包含灭活形式的保藏编号为CGMCCNo.15650的乳双歧杆菌或权利要求2所述的乳双歧杆菌菌制剂。
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Application publication date: 20200407

Assignee: Inner Mongolia yijiahao cheese Co.,Ltd.

Assignor: INNER MONGOLIA YILI INDUSTRIAL GROUP Co.,Ltd.

Contract record no.: X2021990000638

Denomination of invention: Bifidobacterium lactis bl-99 and its application

Granted publication date: 20210511

License type: Common License

Record date: 20211019

Application publication date: 20200407

Assignee: Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.,Ltd. Jinshan Branch

Assignor: INNER MONGOLIA YILI INDUSTRIAL GROUP Co.,Ltd.

Contract record no.: X2021990000637

Denomination of invention: Bifidobacterium lactis bl-99 and its application

Granted publication date: 20210511

License type: Common License

Record date: 20211019

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Application publication date: 20200407

Assignee: Inner Mongolia Jinhai Yili Dairy Industry Co.,Ltd.

Assignor: INNER MONGOLIA YILI INDUSTRIAL GROUP Co.,Ltd.

Contract record no.: X2023990000122

Denomination of invention: A Bifidobacterium lactis BL-99 and its application

Granted publication date: 20210511

License type: Common License

Record date: 20230112