CN110373342B - 罗伊氏乳杆菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种罗伊氏乳杆菌，该罗伊氏乳杆菌于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15062。该罗伊氏乳杆菌具有广谱的抑菌作用、良好的黏附特性以及很强的耐酸和耐胆盐能力，显著优于现有商业菌株，是一株新分离发现的具有良好益生功能的活性菌。

Description

罗伊氏乳杆菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及罗伊氏乳杆菌及其用途，更具体地，本发明涉及罗伊氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌在抑制病原菌或养生保健方面的用途、药物、罗伊氏乳杆菌片剂、复合益生菌片、食品、酸牛乳、保健品、食品添加剂、组合物、以及罗伊氏乳杆菌在制备药物、食品、保健品、食品添加剂或组合物中的用途。
背景技术
抗生素滥用是目前全世界面临的严重问题，专家指出滥用抗生素不仅会造成耐药性问题，还会引起人体菌群失调，破坏微生态平衡，对人的听力、肝、肾等产生危害。因此，减少抗生素的使用已经成为世界潮流。
益生菌指“活的微生物，通过摄入充足的数量，对宿主产生一种或多种特殊且经过论证的功能性健康益处的一类微生物的总称(WHO，2011)”。目前益生菌已广泛应用于生物工程、农业、食品安全及生命健康领域，其中乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)是应用最广泛和重要的两个益生菌菌属。乳杆菌能代谢产生有机酸、双乙酰、过氧化氢、细菌素及类细菌素等物质，有效地抑制病原菌和腐败菌，维持肠道微生态平衡且安全无毒副作用，是抗生素的合理替代品。
研究表明，益生菌要想发挥保健功能，前提条件之一是到达人体肠道的活菌数应在106CFU/mL以上。人体胃肠为高酸、高胆盐环境，益生菌在进入人体后，能否顺利通过胃肠道环境，是决定其能否发挥保健功能的关键因素所在。
乳杆菌的抑菌功能具有菌株特异性，因此，对不同菌株的抑菌功能需作系统和进一步地深入研究。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
本申请的发明人经过无数实验探索，筛选获得了的一株新的罗伊氏乳杆菌，于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15062，在开展功能验证实验后惊喜地发现，该罗伊氏乳杆菌具有广谱的抑菌作用、良好的黏附特性以及很强的耐酸和耐胆盐能力，显著优于现有商业菌株，是一株新分离发现的具有良好益生功能的活性菌。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种罗伊氏乳杆菌。根据本发明的实施例，所述罗伊氏乳杆菌于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15062，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri。为了便于描述，本专利中将本申请发现的该菌株称为罗伊氏乳杆菌WX-94。根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌，具有广谱的抑菌作用、良好的黏附特性以及很强的耐酸和耐胆盐能力，显著优于现有商业菌株，是一株新分离发现的具有良好益生功能的活性菌。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括上述罗伊氏乳杆菌。由于本申请的罗伊氏乳杆菌WX-94具有良好的抑菌功能，并且可以食用，因此，可以将其制成各种药物，用于抑制病原菌。需要说明的是，本申请的药物，可以是单独活性成份的罗伊氏乳杆菌WX-94的各种制剂，也可以与其他活性成份配合使用，只要相互之间不影响活性即可。
根据本发明的实施例，上述药物还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物进一步包括：药学上可接受的载体或辅料。可以理解的是，药物在制成具体的制剂时，通常都需要添加载体或辅料，只要添加的载体或辅料与罗伊氏乳杆菌WX-94之间没有相互抑制或不良副作用即可。
根据本发明的实施例，所述药学上可接受的载体或辅料包括选自稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂的至少之一。
根据本发明的实施例，所述药学上可接受的载体或辅料包括选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理食盐水的至少之一。
根据本发明的实施例，所述药物呈片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的至少之一。可以理解的是，本申请的罗伊氏乳杆菌WX-94作为活性菌药物，只要不影响其菌株活性，药物可以采用现有的各种剂型。进而，根据本发明实施例的药物方便给药，适于保持罗伊氏乳杆菌的较优活性。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种罗伊氏乳杆菌片剂。根据本发明的实施例，所述罗伊氏乳杆菌片剂包括：罗伊氏乳杆菌冻干粉、膳食纤维、山梨糖醇、微晶纤维素以及硬脂酸镁，其中，所述罗伊氏乳杆菌如上述所限定的。根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌片剂，抑菌作用更优，且方便给药，适于保持罗伊氏乳杆菌的更高活性。
根据本发明的实施例，上述罗伊氏乳杆菌片剂还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述罗伊氏乳杆菌冻干粉中所述罗伊氏乳杆菌的含量为1.0×109CFU/g。根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌片剂，抑菌作用更优。
根据本发明的实施例，所述罗伊氏乳杆菌冻干粉为20重量份，所述膳食纤维为60重量份，所述山梨糖醇为10重量份，所述微晶纤维素为5重量份，所述硬脂酸镁为5重量份。根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌片剂，抑菌作用更优，适于保持罗伊氏乳杆菌的最优活性。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种复合益生菌片。根据本发明的实施例，所述复合益生菌片包括上述罗伊氏乳杆菌。根据本发明实施例的复合益生菌片，将本申请的罗伊氏乳杆菌WX-94与其它益生菌组合，实现了更好或更多的活性功能，例如除抑制病原菌以外，与其它益生菌组合，还可以起到调节肠胃功能、提高免疫力等作用。具体地，可以根据复合益生菌片的各组分而定，在此不做限定。需要说明的是，本申请的罗伊氏乳杆菌WX-94与其它益生菌或者益生材料组合使用时，只要各组分之间没有抑制作用或者不良反应即可，可以理解的是，最优的情况是各组分之间能够功能互补或相互促进。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种食品。根据本发明的实施例，所述食品包括上述罗伊氏乳杆菌。由于本申请的罗伊氏乳杆菌WX-94具有良好的抑菌功能，并且可以食用，因此，可以将其制成各种食品，用于抑制病原菌，发挥养生保健作用。需要说明的是，本申请对食品中的罗伊氏乳杆菌WX-94活性菌量或者摄取量不做具体限定，实际应用中，可以根据实际状况灵活选择。本申请的研究显示，每天摄入1.0×109CFU单位的活性罗伊氏乳杆菌WX-94，可以作为食品的参考用量或参考摄取量。此外，还需要说明的是，本申请的食品，是广义上的以任何形态存在的可食用物品，并不仅限于乳酸饮品或豆乳饮品，例如还可以是发酵食品，发酵食品也包括动物饲料等。
根据本发明的实施例，上述食品还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述食品进一步包括：食品学上可接受的添加剂或辅料。进而所述食品的口感更佳。
根据本发明的实施例，所述食品为乳酸饮品或豆乳饮品。根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌可在乳酸饮品或豆乳饮品中保持较佳的活性，适于在机体中发挥抑菌作用。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种酸牛乳。根据本发明的实施例，所述酸牛乳包括：罗伊氏乳杆菌粉、奶粉以及发酵剂，其中，所述罗伊氏乳杆菌如上述所限定的。根据本发明实施例的酸牛乳具有较强的抑菌效果。
根据本发明的实施例，上述酸牛乳还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述发酵剂包括保加利亚乳杆菌粉以及嗜热乳杆菌粉。根据本发明实施例的酸牛乳的口感好，营养价值高，易于保藏。
根据本发明的实施例，所述罗伊氏乳杆菌粉中所述罗伊氏乳杆菌的含量为1.0×1010CFU/g。根据本发明实施例的酸牛乳具有显著更优的抑菌效果。
根据本发明的实施例，基于所述酸牛乳的总重量，所述保加利亚乳杆菌粉和所述嗜热乳杆菌粉的总重量为0.4％。根据本发明实施例的酸牛乳的口感更好，营养价值更高，更易于保藏。
根据本发明的实施例，基于所述酸牛乳的总重量，所述罗伊氏乳杆菌粉的总重量为1％。根据本发明实施例的酸牛乳具有显著更优的抑菌作用。
根据本发明的实施例，所述酸牛乳是通过如下方式获得的：1)将所述奶粉与水进行混合、均质、灭菌以及冷却处理，其中，所述灭菌是在121℃的条件下进行300s，所述冷却处理后的温度为42℃，2)向冷却处理产物中接入活化好的发酵剂并进行发酵处理，所述发酵剂包括所述保加利亚乳杆菌粉和所述嗜热乳杆菌粉，所述发酵处理是在42℃的条件下进行10h，3)将发酵处理产物进行冷却处理，并将冷却后产物与所述罗伊氏乳杆菌粉进行混合，以便获得所述酸牛乳。通过上述方式获得的酸牛乳营养价值高、益生菌含量高、罗伊氏乳杆菌活性高。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种保健品。根据本发明的实施例，所述保健品包括上述罗伊氏乳杆菌。由于本申请的罗伊氏乳杆菌WX-94具有良好的抑菌功能，并且可以食用，因此，可以将其制成各种保健品，用于抑制病原菌。本申请的研究显示，每天摄入1.0×109CFU单位的活性罗伊氏乳杆菌WX-94，可以作为保健品的参考用量或参考摄取量。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种食品添加剂。根据本发明的实施例，所述食品添加剂包括上述罗伊氏乳杆菌。由于本申请的罗伊氏乳杆菌WX-94具有良好的抑菌功能，并且可以食用，因此，可以将其制成各种食品添加剂，用于抑制病原菌。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括上述罗伊氏乳杆菌。需要说明的是，本申请的组合物是指除药物、食品、保健品、食品添加剂以外的其他类型的含有本申请的罗伊氏乳杆菌WX-94的食用或药用组合物，该组合物可以用于抑制病原菌。
在本发明的第十方面，本发明提出了上述罗伊氏乳杆菌在抑制病原菌方面的用途。根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94，具有很强的耐酸和耐胆盐能力，且具有广谱的抑菌作用和良好的黏附特性。需要说明的是，该用途不限于治疗目的，还包括非治疗目的方面的用途，如保健等。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述病原菌包括选自大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、铜绿假单胞菌的至少之一。发明人发现，所述罗伊氏乳杆菌对上述病原菌的抑菌效果更优。
在本发明的第十一方面，本发明提出了上述罗伊氏乳杆菌在制备药物、食品、保健品、食品添加剂或组合物中的用途，所述药物、食品、保健品、食品添加剂或组合物用于抑制病原菌。由于本申请的罗伊氏乳杆菌WX-94具有良好的抑菌功能，并且可以食用，因此，可以将其制成各种药物、食品、保健品或食品添加剂，用于抑制病原菌。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述病原菌包括选自大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、铜绿假单胞菌的至少之一。发明人发现，所述药物、食品、保健品、食品添加剂或组合物对上述病原菌的抑菌效果更优。
附图说明
图1是根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94革兰氏染色光学显微镜检示意图；
图2是根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94在体外抗胆盐实验的生长曲线示意图；
图3是根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94黏附人结肠癌细胞系HT-29的示意图；
图4是根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94黏附人阴道上皮细胞系VK2/E6E7的示意图；
图5是根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94MRS发酵液抑制大肠杆菌生长示意图；
图6是根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94MRS发酵液抑制金黄色葡萄球菌生长示意图；
图7是根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94MRS发酵液抑制铜绿假单胞菌生长示意图；
图8是根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94抑制光滑念珠菌生长示意图；以及
图9是根据本发明实施例的罗伊氏乳杆菌WX-94抑制白色念珠菌生长示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：菌株的来源及鉴定
以健康成人粪便样品为研究对象，从中分离筛选乳酸菌的疑似菌落，然后采用16SrDNA扩增对挑取的疑似菌株进行鉴定。详细如下：
(1)培养基配方
发明人配制了优化的MRS固体培养基和MRS培养液。
MRS固体培养基，简称MRS培养基，1L的配方为：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温80 1.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂17.5g。
MRS肉汤培养基，即MRS培养液的配方较MRS培养基仅仅是不添加琼脂，其余相同。
配置的培养基和培养液，调整pH至6.5，121℃灭菌20min，然后4℃冷藏备用。
(2)罗伊氏乳杆菌WX-94菌株的来源及鉴定
以健康人体粪便为样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，将样品稀释至10-3，将其涂布于本例配制的MRS培养基表面，置于37℃培养箱中培养24-48h，观察菌落形态特征。从中挑取疑似乳酸菌的单菌落划线分离至新的MRS培养基上，37℃过夜培养后，再次进行划线分离纯化。采用无菌牙签从第二划线分离的培养基上挑取若干个单菌落，分别进行编号。选取其中20株单菌落进行16s DNA测序。
本例16s rDNA扩增的引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列。
5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQ ID NO：1)。
5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO：2)。
引物由深圳华大基因研究院合成。
PCR反应体系为，50μL的反应液中包括：10mM dNTPs 1μL、10×buffer 5μL、10mM的上下游引物各1μL、菌液PCR模板1μL、5U/μL的Taq酶1μL，补充ddH2O补充至50μL。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后进入35个循环：94℃30s、60℃30s、72℃1min，循环结束后，72℃延伸5min，4℃待机。
对PCR扩增产物进行切胶回收，并对回收的PCR产物进行测序。本例采用试剂盒TaKaRa MiniBEST agarose GeL DNA Extraction kit进行切胶回收，详细步骤参见试剂盒说明书。本例的PCR产物由深圳华大基因研究院测序。
测序结果显示，编号为WX-94的菌株，其16s rDNA测序结果为SEQ ID NO：3所示序列。
5’-GGAGGGGCGTTGCTATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATTACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAGACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAGCGTCCCTCGGGACGCATGACAGTGTGCATGTCGTCGTCAGCTCGTGTCTGAGATGTGGGTAGTCCGCACGAGCGCACTGTACTAGTGCAGCATAGTGGGCCTCTAGTGGACTGCGGTGACAACGAGAGGTGGGGACGACGTCGATCATCATGCCCTTATGA-3’(SEQ ID NO：3)。
用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，比对结果显示，WX-94菌株与罗伊氏乳杆菌亲缘关系最近，相似性达到99％，因此，鉴定WX-94菌株为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌WX-94，即本例筛选获得的罗伊氏乳杆菌。
将罗伊氏乳杆菌WX-94的单菌落转接到MRS培养液中进行纯培养，37℃培养18h，以备后续使用。
此外，对该菌株进行革兰氏染色并于光学显微镜下观察罗伊氏乳杆菌WX-94，参考图1，结果显示，罗伊氏乳杆菌WX-94呈杆菌形态、长度约2μm、不含质粒、无芽孢、胞壁结构完整，符合罗伊氏乳杆菌的形态结构。
将本例筛选获得的罗伊氏乳杆菌WX-94于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.15062。
(3)细菌安全性
1)抗生素敏感性测试
发明人测试了罗伊氏乳杆菌WX-94对Gentamicin、Kanamycin、Streptomycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、Chloramphenicol、Amplicilin、Neomycin、Trimethoprim、Ciprofoxacin、Rifampicin、Vancomycin等13种抗生素的抗性。具体测试方法如下：
先采用2倍比稀释法配置13种抗生素系列梯度浓度药物，然后将抗生素系列稀释液分别加入96孔板对应孔中，按等体积比向对应孔加入含罗伊氏乳杆菌WX-94的MRS培养液，混匀后，37℃厌氧培养48h，0D625分光光度计扫描检测。以菌株L.casei ATCC 334为质控，阴性对照组添加100μL去离子水和100μLMRS培养液，阳性对照组添加100μL去离子水和100μL待测菌株的MRS菌液。当检测值低于阴性对照组的2倍即可视为抑制生长。读取抑制生长孔抗生素浓度为该实验菌株的最小抑制浓度(MIC)。本例以最小抑制浓度(缩写MIC)表征罗伊氏乳杆菌WX-94的抗生素敏感性，测试结果如下表1所示。
表1：罗伊氏乳杆菌WX-94对13种抗生素敏感性测定结果
Figure BDA0001628268260000081
备注：上表1中NR表示欧洲食品药品监督局对此不作要求
上表1的结果显示，本例分离获得的罗伊氏乳杆菌WX-94对庆大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、四环素(Tetracycline)、红霉素(Erythromycin)、克林霉素(Clindamycin)、氯霉素(Chloramphenicol)、氨苄西林(Amplicilin)、新霉素(Neomycin)、甲氧苄啶(Trimethoprim)、环丙沙星(Ciprofoxacin)、利福平(Rifampicin)的最小抑制浓度都符合欧洲食品药品监督局(缩写EFSA)的规定，可见本例的罗伊氏乳杆菌WX-94对抗生素具有较好的敏感性。
2)代谢物毒性检测
乳酸旋光性检测：使用爱尔兰Megazyme公司的D-/L-乳酸检测试剂盒进行检测。结果显示，本例的罗伊氏乳杆菌WX-94不产生D-乳酸。
硝酸盐还原酶活性检测：将本例的罗伊氏乳杆菌WX-94转接于MRS液体培养基中，于37℃培养24h，在无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入硝酸盐培养基中37℃培养5d后，滴加碘化钾溶液和淀粉溶液各10滴，观察实验结果。同时做阳性对照试验。实验结果显示菌液没有变蓝，为阴性反应，而阳性对照有变蓝，说明本例的罗伊氏乳杆菌WX-94不表达硝基还原酶。
吲哚实验：无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水培养基中，37℃培养72h，然后加入吲哚试剂8～10滴，观察实验结果。同时做阳性对照试验。实验结果显示，菌液没有出现红色圆环，而阳性对照显示红色，表明本例的罗伊氏乳杆菌WX-94代谢不产生吲哚。
氨基脱羧酶活性检测：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱性，例如将赖氨酸分解为尸胺，鸟氨酸分解为腐胺，精氨酸分解为精胺；滴加指示剂，例如溴甲酚紫，呈黄色为阴性，呈紫色为阳性。因此，本例在无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水培养基中，37℃培养72h，然后加入溴甲酚紫8～10滴，观察实验结果。滴定结果呈黄色，为阴性，说明本例的罗伊氏乳杆菌WX-94不具备产生物胺的能力。
实施例2：体外耐酸、耐胆盐实验
发明人对实施例1分离获得的罗伊氏乳杆菌WX-94的体外耐酸、耐胆盐能力进行了评估，具体如下：
配制模拟胃液SGF：在1000mL模拟胃液中，胃蛋白酶3.2g，NaCl 2.0g，HCl调pH值至pH3.0及pH2.0，然后用0.2μm微孔滤膜过滤后，即获得本例的SGF液，待用。
挑取罗伊氏乳杆菌WX-94斜面菌种于MRS培养液中，37℃培养16～18h。菌悬液4000r/min离心15min，去上清，称量菌体湿重，按照0.1g/mL的比例重新悬浮菌体于生理盐水中，再按照1:10的比例加入到SGF液中，充分混匀后置于37℃恒温培养箱中培养，分别对培养0h和2h进行细胞计数，计算细菌存活率(2h后细菌数量/0h细菌数量)，实验结果见下表2。
表2：WX-94对人工胃液SGF的耐受性结果
Figure BDA0001628268260000091
Figure BDA0001628268260000101
发明人对上表2的实验结果进行了显著性检验，结果显示WX-94在pH3.0及pH2.0的环境处理2h存活率显著高于299v，p<0.05，WX-94和299v对人工胃液SGF的耐受性结果具有显著性差异。
上表2的结果显示，实施例1的罗伊氏乳杆菌WX-94，在pH2.0条件下培养2h后，WX-94存活率高于299v，在pH3.0条件下培养2h后存活率高达95.91％，表明与对照299v(商业菌株)相比，罗伊氏乳杆菌WX-94体外有较强的耐酸能力。
进一步地，将活化两次的菌液按1％量接入含0.3％胆盐的MRS培养液进行培养，商业菌株299v为对照，测定罗伊氏乳杆菌WX-94在培养液中的生长曲线，结果如图2所示，结果显示，在胆盐的培养基中罗伊氏乳杆菌WX-94能够正常生长且生长情况比299v更好，说明实施例1的罗伊氏乳杆菌WX-94体外有较强的抗胆盐能力。
实施例3：粘附实验
定植和黏附是菌株发挥益生功能的前提；发明人以HT-29人结肠癌细胞来近似模拟机体结肠细胞，以VK2/E6E7模拟女性阴道上皮细胞，以研究WX-94对机体肠道和生殖道的黏附能力。
黏附试验过程如下：首先，将各细胞系进行消化，用不含双抗的1640培养基稀释将细胞浓度调整至1×106cell/mL；然后，滴加1mL上述浓度的细胞于含细胞爬片的12孔板中，静置培养使其长成致密单层细胞。同时，将待测菌株培养活化2代，用1640培养液将菌液重悬至2×108CFU/mL的浓度。最后，取1mL菌悬液加入到12孔板中，取代原来的1640培养基，共孵育90min，孵育结束后用PBS漂洗除去未黏附的细菌，漂洗4次。然后甲醇固定细胞爬片上的贴壁细胞与黏附的WX-94菌体，20min后用潘红染色，进行显微镜观察并统计黏附指数。粘附指数＝细菌/细胞数(即平均每个细胞粘附的细菌个数)
随机选取20个视野，对视野中的细胞上粘附的细菌的总数和细胞数进行计数并测定粘附率，实验结果显示WX-94对人结肠癌细胞系HT-29粘附率为35.4CFU/cell，高于对照299v菌株26.2CFU/cell；对人阴道上皮细胞系VK2/E6E7粘附率为26.3CFU/cell，高于对照299v菌株15.7CFU/cell，具体黏附情形图参考图3及图4。实验结果表明，WX-94对HT-29及VK2/E6E7细胞系粘附数量显著高于299v，p<0.05。WX-94具有较好的细胞粘附能力。
实施例4：抑菌实验
发明人对实施例1分离获得的罗伊氏乳杆菌WX-94进行体外抑菌能力评估，具体如下：
罗伊氏乳杆菌WX-94接种到MRS液体培养基中，37℃活化18h，再以1％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，并离心收集上清液。采用牛津杯法定量测定其发酵上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑制作用。以抑菌圈直径(mm)作为抑制病原菌效果的指标，实验结果见下表3以及图5～7。
表3：WX-94菌液对致病菌的抑菌圈直径(mm)结果
Figure BDA0001628268260000111
上表3的结果显示，WX-94发酵液对三种病原病抑菌能力显著高于GR-1及299v发酵液(p<0.05)，以GR-1(罗伊氏乳杆菌商业菌株，购置于丹麦Chr.Hansen公司)菌液及299v(植物乳杆菌商业菌株，购置于瑞典Probi公司)为对照，结果显示WX-94具有广谱的体外抑菌功能，效果优于商业菌株GR-1及299v。
采用平板划线法定性测定WX-94对白色念珠菌和光滑念珠菌的抑菌效果，平板培养基制备方法：MRS与YM培养基配制好后按1:1体积比例混合，然后加1.75％的琼脂与0.022g/L的溴甲酚绿，高压灭菌后到平板至冷凝待用。先将病原指示菌涂布于混合固体平板，然后接种环挑取WX-94菌液划线于平板，置于37℃恒温箱培养24h后观察结果，结果显示WX-94具有广谱的体外抑菌功能，抑菌作用效果图参考图8和图9。其中，在图8和图9中，椭圆内为黄色区，椭圆外为绿色区。
实施例5：药物及食品的制备
发明人将实施例1分离获得的罗伊氏乳杆菌WX-94制成常用的药品和食品，具体如下：
(1)罗伊氏乳杆菌片剂
配方：CFU为109的罗伊氏乳杆菌WX-94的冻干粉20％、膳食纤维60％、山梨糖醇10％、微晶纤维素5％、硬脂酸镁5％；以上组分均为重量份，将各组分混合均匀后，压片制成片剂。其中，罗伊氏乳杆菌WX-94的冻干粉为采用冻干机将其菌悬液在无菌环境下冷冻抽真空干燥而成。
(2)罗伊氏乳杆菌发酵酸牛乳
将奶粉和水进行混合，均质，以121℃超高温灭菌300s杀菌，冷却到42℃，接入活化好的发酵剂：保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌菌粉总共接入量为重量份0.4％。在42℃下发酵10h，冷却后加入重量份1％CFU为1010的罗伊氏乳杆菌WX-94，搅拌，灌装即可。
其中，奶粉为酸奶制备中常规使用的奶粉。
(3)以上药品及食品的药效试验
试验方案：采用牛津杯法(同实施例4)，其中菌液样品改为以上两种药品及食品捣碎后加无菌水制成的悬液，调整罗伊氏乳杆菌数至1.0×108CFU/mL。用上述药品或食品进行体外抑菌实验，结果见下表4。
表4：含WX-94的食品或药品对致病菌的抑菌圈直径(mm)结果
Figure BDA0001628268260000121
上表4的结果显示，上述药品或食品均有抑菌的功能。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包括于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市华大农业应用研究院
深圳华大三生园科技有限公司
<120> 罗伊氏乳杆菌及其用途
<130> PIDC3181336
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 16s rDNA扩增的引物序列
<400> 1
agagtttgat catggctcag 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 16s rDNA扩增的引物序列
<400> 2
tagggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1176
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 16s rDNA测序结果
<400> 3
ggaggggcgt tgctatacat gcaagtcgta cgcactggcc caactgattg atggtgcttg 60
cacctgattg acgatggatt accagtgagt ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc 120
tgccccggag cgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcataa caacaaaagc 180
cacatggctt ttgtttgaaa gatggctttg gctatcactc tgggatggac ctgcggtgca 240
ttagctagtt ggtaaggtaa cggcttacca aggcgatgat gcatagccga gttgagagac 300
tgatcggcca caatggaact gagacacggt ccatactcct acgggaggca gcagtaggga 360
atcttccaca atgggcgcaa gcctgatgga gcaacaccgc gtgagtgaag aagggtttcg 420
gctcgtaaag ctctgttgtt ggagaagaac gtgcgtgaga gtaactgttc acgcagtgac 480
ggtatccaac cagaaagtca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540
gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttgct taggtctgat 600
gtgaaagcct tcggcttaac cgaagaagtg catcggaaac cgggcgactt gagtgcagaa 660
gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720
ggcgaaggcg gctgtctggt ctgcaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac 780
aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggagggttt 840
ccgcccttca gtgccggagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag 900
gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960
gaagctacgc gagaccttac caggtcttga catcttgcgc taaccttaga gatagcgtcc 1020
ctcgggacgc atgacagtgt gcatgtcgtc gtcagctcgt gtctgagatg tgggtagtcc 1080
gcacgagcgc actgtactag tgcagcatag tgggcctcta gtggactgcg gtgacaacga 1140
gaggtgggga cgacgtcgat catcatgccc ttatga 1176

Claims (22)

1.一种罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 15062。
2.一种药物，其特征在于，包括：权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，进一步包括：药学上可接受的载体或辅料。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体或辅料包括选自稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂的至少之一。
5.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体或辅料包括选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理食盐水的至少之一。
6.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物呈片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的至少之一。
7.一种罗伊氏乳杆菌片剂，其特征在于，包括：罗伊氏乳杆菌冻干粉、膳食纤维、山梨糖醇、微晶纤维素以及硬脂酸镁，其中，所述罗伊氏乳杆菌如权利要求1所限定的。
8.根据权利要求7所述的罗伊氏乳杆菌片剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌冻干粉中所述罗伊氏乳杆菌的含量为1.0×109 CFU/g。
9.根据权利要求7所述的罗伊氏乳杆菌片剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌冻干粉为20重量份，所述膳食纤维为60重量份，所述山梨糖醇为10重量份，所述微晶纤维素为5重量份，所述硬脂酸镁为5重量份。
10.一种复合益生菌片，其特征在于，包括：权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌。
11.一种食品，其特征在于，包括：权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌。
12.根据权利要求11所述的食品，其特征在于，进一步包括：食品学上可接受的添加剂或辅料。
13.根据权利要求11所述的食品，其特征在于，所述食品为乳酸饮品或豆乳饮品。
14.一种酸牛乳，其特征在于，包括：罗伊氏乳杆菌粉、奶粉以及发酵剂，其中，所述罗伊氏乳杆菌如权利要求1所限定的。
15.根据权利要求14所述的酸牛乳，其特征在于，所述发酵剂为保加利亚乳杆菌粉以及嗜热乳杆菌粉。
16.根据权利要求14所述的酸牛乳，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌粉中所述罗伊氏乳杆菌的含量为1.0×1010 CFU/g。
17.根据权利要求15所述的酸牛乳，其特征在于，基于所述酸牛乳的总重量，所述保加利亚乳杆菌粉和所述嗜热乳杆菌粉的总重量为0.4%。
18.根据权利要求14所述的酸牛乳，其特征在于，基于所述酸牛乳的总重量，所述罗伊氏乳杆菌粉的总重量为1%。
19.根据权利要求14所述的酸牛乳，其特征在于，所述酸牛乳是通过如下方式获得的：
1）将所述奶粉与水进行混合、均质、灭菌以及冷却处理，
其中，所述灭菌是在121℃的条件下进行300s，
所述冷却处理后的温度为42℃，
2）向冷却处理产物中接入活化好的发酵剂并进行发酵处理，所述发酵剂包括所述保加利亚乳杆菌粉和所述嗜热乳杆菌粉，所述发酵处理是在42℃的条件下进行10h，
3）将发酵处理产物进行冷却处理，并将冷却后产物与所述罗伊氏乳杆菌粉进行混合，以便获得所述酸牛乳。
20.一种保健品或食品添加剂，其特征在于，包括：权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌。
21.一种组合物，其特征在于，包括：权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌。
22.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在制备药物、食品、保健品、食品添加剂或组合物中的用途，所述药物、食品、保健品、食品添加剂或组合物用于抑制病原菌；
所述病原菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、铜绿假单胞菌的至少之一。
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