CN117126788B - 鼠李糖乳杆菌vb255及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）VB255及其应用，于2023年03月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26968。本发明的鼠李糖乳杆菌VB255具有较好的稳定性，能够在胰液中稳定存在，而不影响肠道微生态环境，且对白色念珠菌和/或志贺氏菌具有较好的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌VB255，及鼠李糖乳杆菌VB255在抑制白色念珠菌和/或志贺氏菌中的应用。
背景技术
白色念珠菌（Candidaalbicans）又名白假丝酵母菌，是一种自然界中广泛存在的可以造成体表或深部感染的条件致病性真核微生物。该菌是人类共生菌，通常寄生在人体不同的部位，如体表、口腔、咽喉、肠道、阴道粘膜等部位。当人体免疫力下降或者有合并症时，如糖尿病、慢性消耗性疾病或是长期使用广谱抗生素及免疫抑制剂等，体内菌群就容易失调，导致念珠菌感染，引起念珠菌病。
志贺氏菌(Shigella)是目前致肠道感染的主要病原菌之一，属于肠杆菌科的志贺氏菌(Shigella)属，又称痢疾杆菌，为革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧。人类对痢疾杆菌有很高的易感性，幼儿可引起急性中毒，死亡率甚高。
因此，针对白色念珠菌和志贺氏菌的双重感染引起的肠道疾病，筛选出一株能够同时抑制这两种致病菌的活性益生菌具有重要意义和应用价值。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌，该鼠李糖乳杆菌对白色念珠菌和/或志贺氏菌具有较好的抑制效果，可用于预防和/或缓解和/或治疗白色念珠菌和/或志贺氏菌引起的相关疾病。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。根据本发明的实施例，所述鼠李糖乳杆菌于2023年03月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26968，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的鼠李糖乳杆菌具有较好的稳定性，能够在胰液中稳定存在，而不影响肠道微生态环境，且对白色念珠菌和/或志贺氏菌具有较好的抑制效果。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种发酵上清液。根据本发明的实施例，所述发酵上清液包括：第一方面所述的鼠李糖乳杆菌；和/或第一方面所述的鼠李糖乳杆菌的代谢产物。如前所述，本发明的鼠李糖乳杆菌具有较好的稳定性，能够在胰液中稳定存在，而不影响肠道微生态环境，且对白色念珠菌和/或志贺氏菌具有较好的抑制效果，因此，所述发酵上清液也具有相同的优点。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种发酵液。根据本发明的实施例，所述发酵液含有第一方面所述的鼠李糖乳杆菌。如前所述，本发明的鼠李糖乳杆菌具有较好的稳定性，能够在胰液中稳定存在，而不影响肠道微生态环境，且对白色念珠菌和/或志贺氏菌具有较好的抑制效果，因此，所述发酵液也具有相同的优点。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种微生物菌剂。根据本发明的实施例，所述微生物菌剂含有第一方面所述的鼠李糖乳杆菌、第二方面所述的发酵上清液和第三方面所述的发酵液中的至少之一。如前所述，本发明的鼠李糖乳杆菌具有较好的稳定性，能够在胰液中稳定存在，而不影响肠道微生态环境，且对白色念珠菌和/或志贺氏菌具有较好的抑制效果，因此，所述微生物菌剂也具有相同的优点，且能够用于预防和/或缓解和/或治疗白色念珠菌和/或志贺氏菌引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述微生物菌剂还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述鼠李糖乳杆菌以活细胞和/或非活细胞的形式存在。
根据本发明的实施例，所述微生物菌剂中还可以含有食品、药品、保健食品和饲料中的至少之一可接受的菌株。
根据本发明的实施例，所述微生物菌剂进一步包括药学、食品或保健食品上可接受的辅料或载体。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种单剂量制剂。根据本发明的实施例，所述单剂量制剂包括109~1011CFU第一方面所述的鼠李糖乳杆菌作为活性成分。本发明所述的单剂量制剂能够通过单次给药实现对白色念珠菌和/或志贺氏菌的抑制效果。
根据本发明的实施例，所述单剂量制剂包括1010CFU第一方面所述的鼠李糖乳杆菌作为活性成分。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种食品、保健食品或饲料。根据本发明的实施例，所述食品、保健食品或饲料含有第一方面所述的鼠李糖乳杆菌、第二方面所述的发酵上清液、第三方面所述的发酵液和第四方面所述的微生物菌剂中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述食品、保健食品或饲料还可以进一步包括食品或保健食品上可接受的辅料或载体。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的鼠李糖乳杆菌、第二方面所述的发酵上清液、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的微生物菌剂或第五方面所述的单剂量制剂在制备药物中的用途，所述药物具有下列至少一种用途：用于抑制白色念珠菌和/或志贺氏菌的生长；用于预防和/或缓解和/或治疗白色念珠菌和/或志贺氏菌引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述相关疾病选自口腔念珠菌病、念珠菌性唇炎、念珠菌性口角炎、消化系念珠菌病和细菌性痢疾的至少之一。
本发明的第八个方面，本发明提出了一种药物，所述药物包括第一方面所述的鼠李糖乳杆菌、第二方面所述的发酵上清液、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的微生物菌剂或第五方面所述的单剂量制剂中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述药物还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物进一步含有赋形剂和/或载体。
根据本发明的实施例，所述赋形剂包括选自粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂、稀释剂、缓释剂中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述载体包括选自糖类、纤维素及其衍生物、磷酸钙类、硬脂酸碱土金属盐、植物油类、非离子、阳离子和负离子表面活性剂、脂肪醇类、谷物水解固形物中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述药物的剂型包括选自口服液、散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、滴丸剂中的至少之一。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的鼠李糖乳杆菌VB255的扫描电镜照片。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“含有”、“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，“预防”和“防止”可互换使用。这些术语指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将发酵粘液乳杆菌或含有其的产品给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使可能该疾病的诊断尚未作出。
在本文中，术语“治疗”和“缓解”均是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
本发明提出了一种鼠李糖乳杆菌、发酵上清液、发酵液、微生物菌剂、单剂量制剂、及其它们的用途，下面将分别对其进行详细描述。
菌种
在本发明的一个方面，本发明提出了一种鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。根据本发明的实施例，所述鼠李糖乳杆菌于2023年03月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26968。本发明的鼠李糖乳杆菌具有较好的稳定性，能够在胰液中稳定存在，而不影响肠道微生态环境，且能够显著抑制白色念珠菌和/或志贺氏菌的生长。
在本文中，“鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）”和“鼠李糖乳杆菌”同义。
发酵上清液
在本发明的另一方面，本发明提出了一种发酵上清液。根据本发明的实施例，所述发酵上清液包含：前述的鼠李糖乳杆菌；和/或前述的鼠李糖乳杆菌的代谢产物。
需要说明的是，“发酵上清液”是指发酵液经离心、过滤后的上层清液，其主要包含鼠李糖乳杆菌的代谢产物。
发酵液
在本发明的又一方面，本发明提出了一种发酵液。根据本发明的实施例，所述发酵液包括前述的鼠李糖乳杆菌。
需要说明的是，所述“发酵液”指的是将鼠李糖乳杆菌在培养基中经过一段时间的培养后，鼠李糖乳杆菌利用培养基中的营养成分，合成菌体及分泌产物。
微生物菌剂
在本发明的又一方面，本发明提出了一种微生物菌剂。根据本发明的实施例，所述的微生物菌剂含有前述的鼠李糖乳杆菌，和/或前述的发酵上清液，和/或前述的发酵液。本发明的微生物菌剂用于预防和/或治疗白色念珠菌和/或志贺氏菌引起的相关疾病。
需要说明的是，本发明的微生物菌剂可为微生物液体菌剂，包括但不限于发酵液等；也可为微生物固体菌剂，包括但不限于冻干粉等。
根据本发明的实施例，所述鼠李糖乳杆菌以活细胞和/或非活细胞的形式存在。
在本文中，“活细胞”是指是鼠李糖乳杆菌具有新陈代谢、繁殖或复制能力。
示例性地，所述活细胞可为固定化的细胞。本文中，“固定化的细胞”是指鼠李糖乳杆菌固定在载体上，可在一定的空间范围进行生长、发育、繁殖、遗传和新陈代谢等生命活动。
在本文中，“非活细胞”是指不具有新陈代谢、繁殖和复制能力的细胞，包括但不限于干菌体。示例性地，所述微生物菌剂为冻干粉。
作为一种具体的实施方式，所述鼠李糖乳杆菌是以活细胞、干菌体、固定化的细胞或者以其他任何形式存在的。
作为一种具体的实施方式，所述干菌体是所述鼠李糖乳杆菌经冷冻干燥处理获得的。
作为一种具体的实施方式，所述微生物菌剂中还可以含有食品、药品、保健食品和饲料中的至少之一可接受的菌株。
作为一种具体的实施方式，所述微生物菌剂进一步包括药学上可接受的辅料或载体、或者食品或保健食品上可接受的辅料或载体。
在本文中，“食品中可接受的”是指可被人类食用的物质或组合物，其可根据不同国家的食品要求进行调整。
在本文中，“保健食品中可接受的”是指可被人类食用的物质或组合物，其可根据不同国家的保健食品要求进行调整。
在本文中，“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本文中，术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂，药物稳定剂，或其组合物，这些载体都是所属技术领域技术人员已知的。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况外，涵盖其在治疗或药物组合物中的用途。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本公开的鼠李糖乳杆菌不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本公开所考虑的范围。
单剂量制剂
在本发明的又一方面，本发明提出了一种单剂量制剂。根据本发明的实施例，所述单剂量制剂包括109~1011CFU前述的鼠李糖乳杆菌作为活性成分。本发明所述的单剂量制剂能够通过单次给药实现对白色念珠菌和/或志贺氏菌的抑制效果。
根据本发明的实施例，所述单剂量制剂包括1010CFU前述的鼠李糖乳杆菌作为活性成分。
用途
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的鼠李糖乳杆菌、前述的发酵上清液、前述的发酵液、前述的微生物菌剂或前述的单剂量制剂在制备药物中的用途，所述药物具有下列至少一种用途：用于抑制白色念珠菌和/或志贺氏菌的生长；用于预防和/或缓解和/或治疗白色念珠菌和/或志贺氏菌引起的相关疾病。
作为一种具体的实施方式，所述相关疾病选自口腔念珠菌病、念珠菌性唇炎、念珠菌性口角炎、消化系念珠菌病和细菌性痢疾的至少之一。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1菌株的分离与鉴定
1.菌株的分离纯化方法如下所示：
（1）取一月龄婴儿粪便0.1 g置于无菌试管内加入0.9 mL无菌水，充分震荡摇匀；
（2）按倍比稀释法稀释菌液，共7个梯度：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7；
（3）分别从各梯度中取出100 μl菌液涂布于灭菌的MRS固体平板，放置于37 ℃培养箱厌氧培养48 h；
（4）挑取单个菌落传带，划线于MRS固体平板，放置于37 ℃培养箱厌氧培养48 h，连续传代5次至菌落形态单一；
（5）将获得的单菌落进行16S rRNA鉴定，将鉴定为鼠李糖乳杆菌的菌株接入MRS液体培养基（购买自青岛海博生物科技有限公司），37ºC厌氧培养48 h；
（6）取100 µl 培养液稀释至10-3后在MRS平板上进行涂布，37ºC厌氧培养24 h；
（7）挑取单菌落至MRS液体培养基中37ºC厌氧培养24 h获得目的菌株，并用终浓度20%的甘油存菌，置于-80℃保存备用。
2.菌株的分子生物学鉴定
16S rRNA序列与GenBank中菌株进行同源性比较，本发明菌株与鼠李糖乳杆菌6551（Lactobacillus rhamnosus）同源性最高为99%，被鉴定为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌VB255，于2023年03月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.26968。鼠李糖乳杆菌VB255的扫描电镜如图1所示，可以看出该菌呈杆状，该菌株16S rRNA序列如下：
CAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGTGGTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGGAGTACGACCGCAAGGTGAAACTCAAGGGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGACAAAA（SEQ ID NO：1）
实施例2菌株生理生化特征的检测
配制检测鼠李糖乳杆菌VB255生理生化特征所需的培养基，即MRS琼脂培养基配制方法如下：蛋白胨10.0（g/L）、牛肉浸粉8.0（g/L）、酵母浸粉4.0（g/L）、葡萄糖20.0（g/L）、磷酸氢二钾2.0（g/L）、柠檬酸氢二铵2.0（g/L）、乙酸钠 5.0（g/L）、硫酸镁0.2（g/L）、硫酸锰0.04（g/L）、琼脂20（g/L）、吐温80 1.0（g/L），pH 6.7，121℃高压灭菌15 min。
生理生化特征分析参照伯杰氏细菌鉴定手册进行，检测内容如下详细所述：
（1）接触酶
将培养24 h后的鼠李糖乳杆菌VB255用无菌接种环取一小环涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上，立即观察，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。
（2）氧化酶
将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿，用细玻璃棒挑取单个鼠李糖乳杆菌VB255菌落，涂在试纸上，在30 s内变为蓝色或蓝紫色为强阳性，2 min内不变色为阴性。
（3）牛奶分解
取一内盛2 ml无菌水的试管，用接种针从平板上挑取1-3个鼠李糖乳杆菌VB255菌落至无菌水中仔细研磨制成菌悬液，滴加100 μl菌悬液至牛奶管中。放置37 ℃培养24-48h，培养结束后进行观察，若分层变粉红色、凝固为阳性，不变色为阴性。
（4）水解马尿酸
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养4 h。培养结束后，沿着试管壁缓缓加入0.2 ml茚三酮溶液，不要震荡，37 ℃放10 min后观察。若出现深紫色为阳性，若出现淡紫色或没有颜变化则为阴性。
（5）吲哚试验
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至蛋白胨水，37 ℃培养24 h后，加Kovacs靛基质试剂0.2 ml～0.3 ml，若上层出现红色为靛基质阳性反应，否则为阴性。
（6）脲酶
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养24 h。若上层出现玫红色为阳性，否则为阴性。
（7）硫化氢产生
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养18-24 h。若出现黑色为阳性，否则为阴性。
（8）葡萄糖半固体
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养18-24 h。若出现黄色为阳性，若出现灰紫色、紫色或紫红色为阴性。
（9）精氨酸双水解酶
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养18-24 h。接种后需加无菌液体石蜡覆盖培养基液面。若出现紫色或紫红色为阳性，若出现黄色为阴性。
（10）苦杏仁甙/鼠李糖
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养18-24 h。若出现黄色为阳性，若出现淡红色或红色为阴性。
（11）葡萄糖/木糖/蜜二糖/松二糖/海藻糖/半乳糖/阿拉伯糖/山梨醇
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养18-24 h。若出现黄色为阳性，若出现蓝色或蓝绿色为阴性。
（12）D-核糖/松三糖/甘露糖/果糖
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养24-48 h。若出现黄色为阳性，若出现灰紫色、紫色或紫红色为阴性。
（13）纤维二糖/麦芽糖/甘露醇/水杨苷/蔗糖/棉子糖/菊糖/乳糖
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养24-48 h。若出现黄色为阳性，紫色或紫灰色为阴性。
（14）硝酸盐还原
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养18-24 h。培养结束后需滴加硝酸盐还原试剂A液和B液各2-3滴，立即观察。若变红，则为阳性；若不变色，则为阴性。
（15）葡萄糖酸盐
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养24-48 h。培养结束后，按体积比1:1加入班氏试剂，混匀煮沸10 min，冷却后观察结果。若出现黄色、橙色或橙红色沉淀为阳性，若出现蓝色或绿色为阴性。
（16）V-P测定
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养2-4 d。滴加V-P试剂盒充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，放37 ℃继续培养4 h再进行观察。
（17）甲基红（M.R）
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养2-4 d，滴加甲基红试剂一滴，立即观察。若出现鲜红色为阳性，黄色为阴性。
（18）明胶液化
滴加100μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养24-72h。取出后放2-8度冰箱30min后观察，如果仍为液体，实验结果为阳性，否则为阴性。
（19）淀粉水解
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养48-96 h。培养结束后需滴加碘液，若不变蓝为阳性，蓝色为阴性。
（20）七叶苷
滴加100 μl步骤（3）中的菌悬液至生化管内，37 ℃培养24-48 h。接种后需加无菌液体石蜡覆盖培养基液面，若出现黑色为阳性，紫色或紫灰色为阴性。
表1 鼠李糖乳杆菌VB255生理生化实验结果
注：+为阳性；-为阴性。
实施例3 菌株稳定性
鼠李糖乳杆菌VB255耐胆碱稳定性实验方法如下：
菌悬液的制备过程：取已计数的菌悬液（活菌计数需达到约109-1010/ml），解冻后，分为三组（0h组、2h组和4h组），分别加入已分装好的各模拟胰液、胃液和肠液中，其中加入10 μl菌悬液和990 μl模拟液，混匀后，将0h组在0时刻即时计活菌数，将2h组和4h组的菌悬液放入厌氧袋中，置于37 ℃培养箱培养，待培养2 h和4 h时分别取出计活菌数。
（1）人工模拟胰液的配制：将生理盐水（氯化钠：0.9%）先配制成1%浓度的氯化钠溶液，然后将牛胆碱按0.033%、0.066%、0.11%、0.22%、0.33%浓度分别添加在不同的1%浓度的氯化钠溶液中，在121 ℃下消毒灭菌30 min，等温度降至室温后在灭菌后的溶液中分别加入0.1%浓度的胰蛋白酶溶液（0.1%浓度的胰蛋白酶溶液配制：1%浓度胰蛋白酶溶液，无菌膜过滤后，和生理盐水按1:9加入）。
耐胆碱稳定性实验结果如表2，在4h内，鼠李糖乳杆菌VB255在0.033-0.33%浓度的胆碱溶液中的存活率都高达95%以上，说明鼠李糖乳杆菌VB255能够在0.033-0.33%浓度的胆碱溶液，即鼠李糖乳杆菌VB255能够在胰液中稳定存在，进一步说明该菌株能够适应肠道环境。
表2 鼠李糖乳杆菌VB255胆碱存活率
（2）人工模拟胃液配制：将生理盐水（氯化钠：0.9%）先配制成1%浓度的氯化钠溶液，然后分别调不同的pH（pH=1、pH=2、pH=3、pH=4）后分装，在121 ℃下消毒灭菌30 min，等温度降至室温后在灭菌后的溶液中分别加入0.3%浓度的胃蛋白酶溶液（0.3%浓度的胃蛋白酶溶液配制：3%浓度的胃蛋白酶溶液，无菌膜过滤后，和生理盐水按1:9加入）。
胃液稳定性结果如表3，鼠李糖乳杆菌VB255在pH=1-2的胃液中即时死亡，在pH=3的胃液中2 h死亡率100%，在pH=4的胃液中2 h死亡率99%，4 h死亡率100%，因此在后续剂型的开发过程中，需考虑鼠李糖乳杆菌VB255在胃液中不稳定这一特性。
表3 鼠李糖乳杆菌VB255胃液存活率
（3）人工模拟肠液配制：人工模拟肠液购买自北京酷来搏科技有限公司，商品货号SL66102，肠液模拟液按照产品说明书配制。
肠液稳定性结果如表4，在pH 8.0的肠液中处理8 h后，菌株存活率为100%，该菌株能够在肠液中稳定存在。
表4 鼠李糖乳杆菌VB255肠液存活率
实施例4 抑菌试验
鼠李糖乳杆菌VB255菌株培养基为MRS琼脂培养基，配制方法如下：蛋白胨10.0（g/L）、牛肉浸粉8.0（g/L）、酵母浸粉4.0（g/L）、葡萄糖20.0（g/L）、磷酸氢二钾2.0（g/L）、柠檬酸氢二铵2.0（g/L）、乙酸钠 5.0（g/L）、硫酸镁0.2（g/L）、硫酸锰0.04（g/L）、琼脂20（g/L）、吐温80 1.0（g/L），pH 6.7，121℃高压灭菌15 min。培养条件为37 ℃厌氧培养1天。
抑菌实验采用双层平板培养法，优化评估后具体抑菌模型制备方法如下：
下层平板益生菌的制备：将活化好的鼠李糖乳杆菌VB255冷冻管解冻后，取2 μl（活菌量为106）点种于MRS固体平板中，每个菌株点两点，培养条件为37 ℃厌氧过夜培养。
上层致病菌层的制备：高温灭菌后的上层培养基冷却至40-50℃，将不同的致病菌按需求加入，致病菌最终浓度为108/ml，将7ml含致病菌的培养基加入上述已长好鼠李糖乳杆菌VB255的平板中，待平板凝固后，根据不同致病菌生长条件置于合适培养条件下培养，待上层平板长好后观察鼠李糖乳杆菌VB255菌落周围是否形成抑菌圈，并测量抑菌圈大小，判断鼠李糖乳杆菌VB255的抑菌能力，所有抑菌实验测量菌株抑菌圈直径并取三组数据平均值。
对照菌株为鼠李糖乳杆菌VB162（保藏编号为ATCC NO.7469）、鼠李糖乳杆菌LGG（来源于康萃乐儿童益生菌，筛选获得）和鼠李糖乳杆菌LRa05（购于微康益生菌股份有限公司），四株鼠李糖乳杆菌的抑菌能力如表5，相比于鼠李糖乳杆菌VB162，鼠李糖乳杆菌LGG和鼠李糖乳杆菌LRa05，鼠李糖乳杆菌VB255对白色念珠菌和志贺氏菌的抑菌能力都明显提升，表明本发明的鼠李糖乳杆菌VB255能够同时抑制白色念珠菌和志贺氏菌的生长，其抑制能力明显优于对照菌株。
表5 抑菌实验结果（抑菌圈直径单位mm）
实施例5鼠李糖乳杆菌抑制白色念珠菌和志贺氏菌生物膜的形成
采用96孔微量板定量检测法：用PBS缓冲液将指示菌浓度调为108CFU/ml，8000 r/min，4 ℃离心5 min收集菌体，用新鲜LB培养基复溶后备用。使用PBS缓冲液将不同的鼠李糖乳杆菌菌液浓度调整为109CFU/ml。取200 μl的LB培养基加入96孔微量板边缘一圈的孔中，其余每孔加入100 μl指示菌复溶液和100 μl鼠李糖乳杆菌菌液，以加入100 μl指示菌和100 μl PBS缓冲液的孔作为对照。将96孔微量板置于37℃培养箱静置孵育24 h后丢弃培养液，每孔用200 μl的PBS缓冲液清洗三次去除粘附的菌体，去除PBS缓冲液后室温干燥。每孔加入200 μl 95%的甲醇固定15 min，去除甲醇后室温干燥。每孔加入200 μl 1%的结晶紫染色5 min，用去离子水洗去多余染料，室温干燥。每孔加入160 μl 33%的冰醋酸溶解染料30 min，取125 μl加入新的96孔微量板中，用酶标仪检测590 nm处的吸光度。生物膜抑制率/%=1-OD实验组/OD对照组。
不同鼠李糖乳杆菌对志贺氏菌和白色念珠菌生物膜形成的抑制率结果如表6，与鼠李糖乳杆菌VB162（保藏编号为ATCC NO.7469）、鼠李糖乳杆菌LGG、鼠李糖乳杆菌LRa05相比，鼠李糖乳杆菌VB255对志贺氏菌和白色念珠菌生物膜形成抑制效果较好，对志贺氏菌生物膜抑制率达到了47.1%，对白色念珠菌抑制率达到了54.24%。
表6不同鼠李糖乳杆菌对志贺氏菌和白色念珠菌生物膜形成的抑制
注：同一行数据右上角标示字母表示差异显著（P<0.05）
实施例6 肠道细胞粘附实验
取2 mL DMEM不完全细胞培养液和1 mL各时期(延滞生长期、对数生长期、平稳和衰亡期)鼠李糖乳杆菌VB255菌液加入Caco-2细胞，以等体积无菌PBS缓冲液替代鼠李糖乳杆菌VB255菌液作为对照组，每组重复3孔，置于37℃，5％CO2培养箱培养2 h后，PBS漂洗5次，自然晾干后用甲醇固定20 min，革兰氏染色后在油镜下随机选取25个视野，计数100个细胞上黏附的鼠李糖乳杆菌个数，细胞黏附细菌数与加入细菌总数比值的百分数为鼠李糖乳杆菌VB255黏附率。鼠李糖乳杆菌VB255对Caco-2细胞的黏附作用结果如表7所示。不同生长阶段的鼠李糖乳杆菌VB255对Caco-2细胞黏附率差异显著（P<0.05）。对数期鼠李糖乳杆菌VB255的黏附性能最佳，黏附率达70.05%，表明该菌株能有效粘附肠道细胞。
表7鼠李糖乳杆菌肠道粘附效率
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种鼠李糖乳杆菌，其特征在于，于2023年03月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26968。
2.一种发酵液，其特征在于，含有权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌和权利要求2所述的发酵液中的至少之一。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌以活细胞的形式存在。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂进一步包括药学或食品上可接受的辅料。
6.一种单剂量制剂，其特征在于，含有109~1011CFU权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌作为活性成分。
7.一种食品或饲料，其特征在于，含有权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌、权利要求2所述的发酵液和权利要求3~5任一项所述的微生物菌剂中的至少之一。
8.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌、权利要求2所述的发酵液、权利要求3~5任一项所述的微生物菌剂或权利要求6所述的单剂量制剂在制备药物中的用途，所述药物具有下列至少一种用途：
抑制白色念珠菌和/或志贺氏菌的生长；
预防和/或缓解和/或治疗白色念珠菌和/或志贺氏菌引起的相关疾病。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述相关疾病选自口腔念珠菌病、念珠菌性唇炎、念珠菌性口角炎、消化系念珠菌病和细菌性痢疾的至少之一。
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