CN109576165B - 一种贝酵母菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种贝酵母菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏编号为：CGMCC No.16127。本发明提供的贝酵母菌，耐受力强、活性好、能替代抗生素，且能够调整肠道菌群平衡，制为冻干粉后存活率高。

Description

一种贝酵母菌及其应用
技术领域
本发明属于人体微生态学技术领域，尤其涉及一种贝酵母菌及其应用。
背景技术
随着人们对抗生素的认识的深入，抗生素得到了大规模的生产和广泛的应用，同时抗生素所带来的负面影响得到人们越来越多的关注，科学家们发现滥用抗生素能引起机体的正常菌群失调、机体产生耐药性，药物残留还通过畜产品威胁人类健康。而且耐药性可通过耐药因子(R因子)经细菌传递给人类，使保健和治疗更趋困难、这将对人类的生存和发展产生严重负面的影响。于是，出现了很多代替抗生素的新药物，其中益生菌效果较好。益生菌是一种能够直接口服的微生物添加剂，在消化道内通过竞争性排斥作用，抑制病原菌，维持肠道微生物区系的平衡。益生素以其安全高效、环保等功能正发挥着巨大的潜能，益生菌无毒副作用、无耐药性；能替代抗生素、调整肠道菌群平衡预防二重感染、提高机体免疫力、提高综合抗病力、降低发病率，并能分泌多种酶、提高消化率、促生长剂、益生菌必将具有十分广阔的发展的空间。双岐杆菌和乳酸菌具有更好的作用，但耐高温和耐酸碱等耐受力差，活性易下降。另外，目前将益生菌制为冻干菌粉的冻干工艺直接关系到冻干后菌粉的存活率，其制为冻干菌粉后，活菌数量较低，影响其效用。
因此，针对上述问题，目前亟待提出一种耐受力强、活性好的益生菌，并提供一种菌株存活率高的益生菌冻干粉的制备方法。
发明内容
为此，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种耐受力强、活性好、能替代抗生素、调整肠道菌群平衡且制为冻干粉后存活率高的贝酵母菌。
本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中的冻干菌粉工艺得到的贝酵母菌菌粉的存活率低的问题，进而提供一种菌株存活率高的贝酵母菌冻干粉的制备方法。
本发明的贝酵母菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏编号为：CGMCC No.16127。
所述的贝酵母菌，其26S rDNA序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列结构。所述SEQID NO.1的序列结构具体如下：
atgcttagtacggcgagtgagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacg。
所述的贝酵母菌在制备调理胃肠道健康和/或提高免疫力的保健品、乳制品、药物中的应用。
优选地，所述的贝酵母菌在制备治疗和/或预防腹泻或便秘的保健品、药物中的应用。
本发明还提供一种分离贝酵母菌的方法，采用包括如下成分的酵母菌培养基培养得到所述贝酵母菌：蛋白胨、麦芽糖、酒石酸、牛肉粉、氯化钠与琼脂。
优选地，所述酵母菌培养基pH值为5.8-6.0，且包括如下重量份的原料：5重量份蛋白胨、5重量份麦芽糖、10重量份酒石酸、5重量份牛肉粉、3重量份氯化钠、16重量份琼脂。
本发明所述的贝酵母菌的发酵方法，包括如下步骤：将一级种子液按照4-10％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为150-200rpm的条件下，培养24-36h，得到发酵液；其中，所述一级种子液为所述贝酵母菌培养6h-12h后得到的对数生长期的菌液。
优选地，所述发酵培养基的pH值为6.0-6.5，且包括如下成分：酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖与微量盐。
进一步优选地，所述发酵培养基包括如下重量份的原料：5重量份酵母浸粉、10重量份蛋白胨、5重量份葡萄糖、5重量份氯化钠、1重量份微量盐。
进一步优选地，所述微量盐包括氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中的一种或多种。
进一步优选地，所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中按照1:2:6:4:1:2的重量比混合而成。
由所述的贝酵母菌制备得到的贝酵母菌冻干粉。
本发明的贝酵母菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
向所述的贝酵母菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30～-50℃的温度下预冻1-3h，然后置于-10～-20℃的温度下升华10-20h，再置于-10～-25℃的温度下升华10-20h，再在20-30℃的温度下二次升华1-5h，在真空下放置1-5h后，即得贝酵母菌冻干粉。
优选地，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
优选地，所述的贝酵母菌冻干粉的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)取所述的贝酵母菌培养，得到发酵液；
(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于转速为8000-12000r/min下，离心10-30min，收集菌泥；
(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂与所述菌泥的重量比为3:1，混合均匀，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得贝酵母菌冻干粉。
优选地，取所述贝酵母菌培养6h-12h后得到的对数生长期的菌液，作为一级种子液，将一级种子液按照4-10％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为150-200rpm的条件下，培养24-36h，得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照4-10％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为100-180rpm的条件下，培养4-6h，得到二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照4-10％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为150-250rpm的条件下，培养14-16h，得到三级发酵液。
优选地，所述发酵培养基的pH值为6.0-6.5，且包括如下成分：酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖与微量盐。
进一步优选地，所述发酵培养基包括如下重量份的原料：5重量份酵母浸粉、10重量份蛋白胨、5重量份葡萄糖、5重量份氯化钠、1重量份微量盐。
进一步优选地，所述微量盐包括氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中的一种或多种。
进一步优选地，所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中按照1:2:6:4:1:2的重量比混合而成。
本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的贝酵母菌，是从人体分离到的贝氏酵母菌，其特性是独特的，是文献和资料中未见报道和生产中未见使用过的。所述贝酵母菌能保证其在人体肠道定植和迅速生长繁殖形成一定数量，其作为微生态制剂，在生产中有培养基底物成本低廉、应用方便等优点。
(2)本发明所述的贝酵母菌，从人体消化道内分离出既能助消化促生长又能防治人体腹泻的贝氏酵母菌，其好培养，耐受性强，在体内同源菌种好定植，发酵成本低，适合液体培养和固体高密度培养；很有生产价值和经济效益。在人的胃肠道疾病中，特别是腹泻和便秘发挥了很好的预防和治疗作用，并且通过多种途径弥补了抗生素和疫苗的不足，为人类的健康和获得安全的食品开辟了新的途径。另外，具有较强的抑制病原菌能力。
另外，由于人和动物为了维持生命必须摄入食物，当食物进入消化道后，除了机体本身分泌的唾液、胃液、胆汁、胰液等的消化作用外还需要有大量的肠道菌群去分解和消化食物。如果大量的服用抗生素会破坏菌群的微生态平衡，食物得不到充分消化。我们通过对草、叶、纸、淀粉、玉米、肉渣、蛋白进行消化试验，筛选出的所述贝酵母菌不但抑制病原菌能力强，而且在消化蛋白、肉渣、玉米、淀粉、草、树叶等方面具有较强的功能。
(3)本发明所述的贝酵母菌，耐酸耐胆盐性良好，且经过冻干粉等工艺操作后菌株活性仍然较为理想、种子的保存期长。且通过本发明所述的贝酵母菌冻干粉的制备方法制备，制备过程中，采用特定的保护剂，使制为冻干粉后贝酵母菌的保持较高的存活率。
附图说明
图1是本发明所述的贝酵母菌的菌液镜检结果图；
图2是本发明所述的贝酵母菌的基因序列的结果图；
图3是本发明所述的贝酵母菌的基因序列与已知酵母菌相应序列的相似程度的比对结果图；
图4所示为菌液OD600值变化曲线图；
图5所示为培养基还原糖含量变化曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例的贝酵母菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏编号为CGMCC No.16127。
实施例1贝酵母菌的分离筛选
本发明的保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌从人体的粪便中分离，并通过如下方法分离得到：
一、菌种来源：
将人体肠道粪便1克，装入放由30个玻璃球的灭菌瓶内加生理盐水作100倍稀释充分打均后，再作10-3、10-4、依次到10-8稀释度，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8五个稀释度的菌液分别接种于LYT(自制的)通用琼脂平板、伊红、美兰琼脂、BB(BS)双歧杆菌选择性培养基、LBS(LC)乳酸杆菌选择性培养基、EC肠球菌择基和Sb酵母菌择基。每种培养基接6个平板，接种后立即上下翻转培养皿使接种液在平皿表面均匀扩散。其中3个作需氧培养，24小时后即观察。另3个作厌氧培养48小时。经过肉眼观察和解剖显微镜45℃角折射光观察。将每种菌落再移植到LYT琼脂一个菌落及液体培养基一个菌落，分别做厌氧和需氧，同时涂片作革兰氏染色镜检，分离出138个菌株，进行鉴定结果属于8个科，11个属的36种菌，其中所分离筛选出的菌种每月继代一次，5代前冻干保存。
二、菌种的筛选：
按照如下标准进行种子菌株的筛选：⑴.无内外毒素、无毒、无害、安全、无副作用；⑵.有利于促进体内菌群平衡或预防生态失调；⑶.高产抗菌活性物质、产酸能力强；⑷.来源于自身肠道的益生菌才具有较好的粘附性能。得到具有抑制病原菌、调节肠道微生态平衡、提高机体免疫力的贝酵母菌。
所述贝酵母菌的分离及选育具体方法如下：
取1g样品，加入100ml PTYG培养基中，于恒温摇床中培养，培养温度30℃，转速180r/min，培养时间为24h。
将富集后的样品，取1ml进行10倍梯度稀释，取3个适宜的稀释度在改良SB平板上进行涂布，30℃培养36h，挑取典型菌落进一步用改良SB平板划线纯化2～3次。
其中，酵母菌则未见选择特性，故无从配制选择性培养基。因其对万古霉素的耐受特性，并结合其特有的菌落形态，在有氧条件下培养后，即可与其他菌落区分开。因此，采用的所述改良SB培养基包括如下原料：蛋白胨(Oxoid)1％，麦芽糖4％，10％酒石酸1.4％，牛肉粉0.35％，氯化钠0.5％，万古霉素10ug/ml，琼脂2％；其培养条件如下：pH值为5.8-6.0，温度为30℃，培养36h。
经过验证，该方法能有效地分离出所述贝酵母菌。
其验证方法如下：
(1)菌落特征的观察：将待检菌用平板稀释法在麦芽汁琼脂平板上30℃条件下培养24h，选择单个菌落观察其颜色、形状、透明、光滑、湿润和边缘整齐等特征。麦芽汁液体培养则用于观察其是否发酵、培养液清浊、是否形成醭(浮膜)、环或岛、沉淀物的疏松或紧密度等。
(2)细胞形态的观察：挑取单菌落涂片，观察细胞形状、大小和无性生殖方式。
(3)生理生化鉴定：选取有酵母典型形态的单菌落，进行生理生化试验，包括葡萄糖发酵试验、乙醇同化试验、KNO3同化试验、类淀粉化合物形成的测定。
(4)分子鉴定：采用引物NL1和引物NL4进行26S rDNA D1/D2区的扩增。其中，所述引物NL1具有如SEQ ID NO.2所示的序列结构，所述SEQ ID NO.2的序列结构具体如下：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’；所述引物NL4具有如SEQ ID NO.3所示的序列结构，所述SEQ ID NO.3的序列结构具体如下：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。扩增片段长度约为500～610bp。将PCR扩增后所得产物使用凝胶回收试剂盒进行纯化后，进行测序。测序结果利用BLAST工具，将所测菌株的26S rDNA的D1/D2区序列，与Genbank核酸数据库中的序列进行同源性分析，比较供试菌株的目的基因序列与已知酵母菌相应序列的相似程度。菌株S1072比对结果如图2-3所示。
根据形态学特征、生理生化特征和26s rDNA序列分析，确定S1072菌株为贝氏酵母菌，且是一种新的贝酵母菌。具体而言，鉴定结果如下：
本发明所述的贝酵母菌的形态及染色特征：为革兰氏阳性菌，大小3～6×5～14μm，呈卵圆形，见图1。其菌落特征为中等大菌落，呈白色，粗糙，圆形或不规则。所述贝酵母菌为专性需氧，最适宜生长初始pH值为6.0，最适宜培养温度为30℃，摇瓶培养最适宜接种量为3％，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和甘露醇，不发酵半乳糖、棉子糖、乳糖，硝酸还原阳性。
结论：通过上述的分离和选育过程，获得1株贝氏酵母N9046，即本发明所述的贝酵母菌。
将所述贝酵母菌的基础种子分别接种至培养基，静置培养18h制备生产种子。将生产种子在培养基中连传13代，观察和测定不同代次菌种的形态、培养特性、和活菌数，以确定生产菌种的代次。
其测试结果如下：
表1不同传代次数的贝酵母菌的OD值及活菌数
Figure BDA0001943248320000081
上述结果显示生产种子传至13代时，所述贝酵母菌不低于1.0×108CFU/mL，其能够保证生物制品生产的正常进行，表明保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌的生产种子在1-13代活力稳定。所述贝酵母菌的第1代、第10代、第13代生产种子的菌液均为组成均一的菌株，其形态特征与原始种子一致，其菌液镜检结果均如图1所示，表明其生产种子在1-13代内其形态特征稳定。
所述的贝酵母菌，其26S rDNA序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列结构。所述SEQID NO.1的序列结构具体如下：Atgcttagtacggcgagtgagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgt gggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacg。
实施例2贝酵母菌冻干粉的制备
本实施例的贝酵母菌为保藏编号为CGMCC No.16127的菌株，其通过如下方法制备为贝酵母菌冻干粉：
(1)取所述贝酵母菌培养6h-12h后得到的对数生长期的菌液，作为一级种子液，将一级种子液按照4-10％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为150-200rpm的条件下，培养24-36h，得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照4-10％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为100-180rpm的条件下，培养4-6h，得到二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照4-10％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为150-250rpm的条件下，培养14-16h，得到三级发酵液。
其中，所述发酵培养基的pH值为6.0-6.5，且包括如下成分：酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖与微量盐。作为本实施例的优选实现方式，所述发酵培养基包括如下重量份的原料：5重量份酵母浸粉、10重量份蛋白胨、5重量份葡萄糖、5重量份氯化钠、1重量份微量盐。所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中按照1:2:6:4:1:2的重量比混合而成。
(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于离心机中，转速为8000r/min，离心30min，收集菌泥；
(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得贝酵母菌冻干粉。
实施例3贝酵母菌冻干粉的制备
本实施例的贝酵母菌为保藏编号为CGMCC No.16127的菌株，其通过如下方法制备为贝酵母菌冻干粉：
(1)取所述贝酵母菌，在温度为37℃下，在发酵培养基中培养，得到发酵液；其中，所述发酵培养基包括如下重量份的原料：5重量份酵母浸粉、10重量份蛋白胨、5重量份葡萄糖、5重量份氯化钠、1重量份微量盐；
(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于离心机中，转速为8000r/min，离心30min，收集菌泥；
(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得贝酵母菌冻干粉。
实施例4贝酵母菌冻干粉的制备
本实施例的贝酵母菌为保藏编号为CGMCC No.16127的菌株，其通过如下方法制备为贝酵母菌冻干粉：
向所述的贝酵母菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30℃的温度下预冻1h，然后置于-20℃的温度下升华10h，再置于-10℃的温度下升华20h，再在30℃的温度下二次升华5h，在真空下放置1h后，即得贝酵母菌冻干粉。
本实施例中，所述保护剂为脱脂奶粉，作为本实施例可替换的实现方式，所述保护剂还可替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
实施例5贝酵母菌发酵液的制备
本实施例的贝酵母菌为保藏编号为CGMCC No.16127的菌株，按照实施例2中的方法制备出发酵液，并将得到的发酵液按照常规技术手段制为口服液。
作为本实施例可替换的实现方式，所述贝酵母菌还和按照常规技术手段制为酸奶或食品添加剂。
效果试验例
为验证本发明的技术效果，进行以下实验：
实验一、保藏编号为CGMCC No.16127的贝酵母菌种子的制备保存期试验
取保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌，将基础种子冻干粉于-80℃条件下保存，保存期为2年，每两年检测一次。
其中，活菌计数的方法具体如下：
无菌称取3g所述贝酵母菌制剂，加入27mL液体培养基或生理盐水，充分摇匀(用数个玻璃球摇打)后作10倍系列稀释，选择适宜稀释度进行接种。采用LBS选择性培养基，细菌的每个稀释度按0.2mL接种3个平板，并迅速转动平板，使菌液在培养基表面流匀。培养48小时后，观察每个平板上的细菌生长情况，并计数。当每个平皿上的菌落数小于10或大于300时，应重新调整最后稀释度，重新测定。根据3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数：
Figure BDA0001943248320000111
检测结果如下：
表2菌株在-80℃保存不同时间的活菌数
Figure BDA0001943248320000112
表3菌株在4℃保存不同时间的活菌数
Figure BDA0001943248320000121
表4菌株在25℃保存不同时间的活菌数
Figure BDA0001943248320000122
表4所述贝酵母菌生产种子不同保存期的培养特性
Figure BDA0001943248320000123
本发明所述的贝酵母菌生产种子不同保存期的培养特性如图4-5所示，其中，图4所示为菌液OD600值变化曲线图，图5所示为培养基还原糖含量变化曲线图。经试验表明，所述的贝酵母菌的发酵液在冰箱的冷藏室内放置一年，拿出后做抑制病原菌试验，抑制病原菌能力仍然很强。
实验二、菌株的耐酸耐胆盐特性实验
为了模拟动物体内的胃肠道环境，配制人工胃液和人工肠液，进行体外的耐酸耐胆性能的研究。此外作用时间也是进行此类试验时应考虑的重要问题之一。由于胆盐的存在改变了菌体外膜的通透性，所以对益生菌产生抑制、杀灭作用，进而影响益生菌的存活。
耐胃酸试验：取保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌，按10％接种量接入人工胃液中，37℃静置培养0h、1h、2h、4h，取样测定活菌数，并计算存活率。
其实验结果如下：
Figure BDA0001943248320000131
耐胆酸盐试验：取保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌，以人工肠液为基础，，再向其中加入0.3％的胆盐，然后所述贝酵母菌按照10％的接种量接入其中，在37℃静置培养0h、1h、2h、4h，取样测定活菌数，并计算存活率。
其实验结果如下：
Figure BDA0001943248320000132
本实验中还采用上述方法对市售的三种贝酵母菌进行实验，市售的三种贝酵母菌在模拟胃酸、胆酸盐的环境中培养4h后，活菌率均低于51％。由此可见，本发明的保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌的耐酸和耐胆盐性能优良。
实验三、安全性临床实验——动物增重试验
取本发明的保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌，对10只白鼠进行施用，作为实验组；取另外10只白鼠，作为对照组。试验期间小白鼠全部健活，精神良好，食欲旺盛，皮毛肤色正常，排便排尿色泽形态正常，无其他异常临床症状、无生病及死亡现象。
分别于给药前当天、第二次给药前当天(第18天)以及试验结束的第34天对每组小白鼠进行称重，并计算各组平均日增重。实验过程中小白鼠的日增重分析结果见下表。
Figure BDA0001943248320000141
从表中可知，实验组的小白鼠单剂量重复实验结束后日均增重与对照组略高。
实验四、安全性临床实验——血常规与血液生化指标
取小白鼠灌胃施用保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌，进行重复给药实验，并对其血液中的白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和血小板数目(PLT)检测结果见下表。
Figure BDA0001943248320000142
Figure BDA0001943248320000151
注：*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)(X±SD，n＝4)
经方差分析表明，所述贝酵母菌给药后与对照组相比，小白鼠的血常规各项指标变化差异不显著(P>0.05)。所述贝酵母菌对小白鼠血常规各项指标没有产生不良反应。
实验五、保护剂对冻干粉工艺的影响实验
本实验以存活率为指标，考察对保护剂的冻干保护作用。按照实施例2中的方式制备贝酵母菌冻干粉，区别仅在于：将保护剂分别替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶、甘露醇，制备得到贝酵母菌，分别测试得到的贝酵母菌冻干粉在常温下保存30天后的存活率。
Figure BDA0001943248320000152
Figure BDA0001943248320000161
由此可见，单一的成分作为保护剂的效果并不理想，且保护剂对所述贝酵母菌的保护效果差异较大。为了验证该工艺的稳定性，对实施例2中的方案进行三次实验验证，活菌率结果分别为93.6、92.5、95.9，误差率＜4％，证实结果稳定可靠。
按照实施例2中的方式制备贝酵母菌冻干粉，区别仅在于：将保护剂分别替换为将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:1:1的重量比混合，并将其记为第一组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:3:2的重量比混合，并将其记为第二组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:5:3的重量比混合，并将其记为第三组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:1:2的重量比混合，并将其记为第四组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:3:3的重量比混合，并将其记为第五组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:5:1的重量比混合，并将其记为第六组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照3:1:3的重量比混合，并将其记为第七组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照3:3:2的重量比混合，并将其记为第八组；将实施例2制备得到的贝酵母菌冻干粉，记为第九组。分别测试上述各组得到的贝酵母菌冻干粉在常温下保存30天后的存活率。
其检测结果如下：
Figure BDA0001943248320000162
实验六、所述贝酵母菌对犬肠道菌群失调腹泻模型的改善效果实验
本试验采用头孢氨苄作为诱导药物，通过持续给药导致比格犬肠道菌群紊乱，构建试验犬抗生素相关性腹泻，具体包括如下步骤：取3.5～4月龄，体重5.0～6.5kg的普通级试验用比格犬25只，其中5只，作为对照组，另外20只以梯度增加诱导药物剂量的方式，连续给予抗生素诱导，构建试验犬肠道菌群失调腹泻模型，抗生素诱导15～20天，构模成功。将经抗生素诱导的20只比格犬分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组，对高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予高、中、低剂量的本发明所述的贝酵母菌的活菌制剂，模型组不给药，给药周期为6～8天，给药结束后，观察所有犬只的临床症状。
其实验结果如下：
比格犬体重是一个直观、易考察的指标，且与多种因素密切相关。对治疗前后比格犬的体重进行分析。造模后对不同组的比格犬体重进行两两比较，组间试验犬的平均体重P＞0.05，说明使用抗生素造模对比格犬体重变化影响不大。连续给予所述贝酵母菌剂制剂7天后，将模型组、低、中、高剂量组两两比较P＞0.05，说明不同剂量贝酵母菌对试验犬的体重影响不显著。由于本试验中试验犬为幼犬，其体重尚处于增长状态中，且受多方面因素的影响，故该指标无法反应真实的体重恢复程度，仅可作为间接指标。贝酵母菌制剂对菌群紊乱比格犬体重的影响结果如下：
造模后平均体重 治疗后平均体重
对照组 7.25±0.272 8.13±0.232
模型组 8.13±0.252 8.90±0.547
贝酵母菌低剂量组 7.70±0.635 7.98±0.812
贝酵母菌中剂量组 7.04±0.533 8.16±1.057
贝酵母菌高剂量组 8.03±0.427 8.93±0.801
其中，单位：kg，n＝2或5。
造模前，各组比格犬活泼好动，被毛平整光滑、粪便干燥成形，较为正常。造模结束时，对照组比格犬饮食正常，行动活跃，排便次数规律，粪便干燥成形。经抗生素诱导的试验犬逐步出现大便稀湿、机敏性降低、偶有厌食或乏力、呕吐等症状，属于抗生素过量致肠道菌群失调所导致的典型症状。
贝酵母菌制剂对试验犬粪便状态的影响检测结果如下表：
Figure BDA0001943248320000181
其中，粪便状态：--成形便；+成形但水分稍多；++粘稠的溏稀便；+++水样便。
所述贝酵母菌制剂对稀便犬只治疗效果统计结果，如下表所示：
Figure BDA0001943248320000182
连续给贝酵母菌活菌制剂10天后，通过犬只临床症状、粪便情况及菌群检测结果，统计不同剂量组对幼犬肠道菌群失调症的疗效。其检测结果如下：
Figure BDA0001943248320000183
贝酵母菌活菌制剂以2.0g/只/次，每天2次，连续喂服10天，可以缓解幼犬因肠道菌群失调症所致腹泻症状，促进犬只恢复菌群平衡。由此可见，本发明所述的贝酵母菌具有调理胃肠道健康，提高免疫力的功能。
实验七、所述贝酵母菌发酵条件的对比实验
(一)所述贝酵母菌的一级种子培养基生长情况
取本发明所述的贝酵母菌，并采用实施例2中所述的发酵培养基，每2小时取样检验OD600值。得到一级种子培养基中菌体的生长情况如下：
Figure BDA0001943248320000191
由上表结果可知，菌体在0h-4h为延滞期，在6h-12h为对数生长期，在14h达到稳定期，在18h进入衰亡期，转种最佳时间为12h。
(二)酵母菌发酵培养基的优化实验
取对数生长期的一级种子培养液，按照3％的接种量接入1#～8#发酵培养基中，初始pH为6.5，500mL三角瓶装液量为200mL，32℃，200rpm条件下培养12h，检测活菌计数。
1#：400mL：酵母浸出粉4.00g，胰蛋白胨2.00g，示蛋白胨2.01g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；
2#：400mL：安琪酵母浸粉4.00g，安琪蛋白胨4.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；
3#：400mL：安琪酵母浸粉4.00g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；
4#：400mL：安琪酵母浸粉4.00g，安琪蛋白胨8.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；
5#：400mL：安琪酵母浸粉6.01g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；
6#：400mL：安琪酵母浸粉8.01g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖4.00g，微量盐16mL；
7#：400mL：安琪酵母浸粉6.01g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖8.00g，微量盐16mL；
8#：400mL：安琪酵母浸粉6.01g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖12.00g，微量盐16mL；
9#：400mL：安琪酵母浸粉6.01g，安琪蛋白胨6.00g，葡萄糖12.00g，微量盐16mL。
其中，7#中，所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中按照1:2:6:4:1:2的重量比混合而成。8#中，所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中按照1:1:1:1:1:1的重量比混合而成。9#中，所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中按照1:1:3:1:2:1的重量比混合而成
组别 活菌数(cfu/mL)
1 2.8×10<sup>8</sup>
2 1.1×10<sup>8</sup>
3 1.7×10<sup>8</sup>
4 1.5×10<sup>8</sup>
5 2.3×10<sup>8</sup>
6 1.9×10<sup>8</sup>
7 3.6×10<sup>8</sup>
8 3.5×10<sup>8</sup>
9 3.0×10<sup>8</sup>
由上述试验结果可知，7#和8#培养基的活菌数最高。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 谭瑛
<120> 一种贝酵母菌及其应用
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 571
<212> DNA
<213> 贝酵母菌
<400> 1
atgcttagta cggcgagtga gcggcaaaag ctcaaatttg aaatctggta ccttcggtgc 60
ccgagttgta atttggagag ggcaactttg gggccgttcc ttgtctatgt tccttggaac 120
aggacgtcat agagggtgag aatcccgtgt ggcgaggagt gcggttcttt gtaaagtgcc 180
ttcgaagagt cgagttgttt gggaatgcag ctctaagtgg gtggtaaatt ccatctaaag 240
ctaaatattg gcgagagacc gatagcgaac aagtacagtg atggaaagat gaaaagaact 300
ttgaaaagag agtgaaaaag tacgtgaaat tgttgaaagg gaagggcatt tgatcagaca 360
tggtgttttg tgccctctgc tccttgtggg taggggaatc tcgcatttca ctgggccagc 420
atcagttttg gtggcaggat aaatccatag gaatgtagct tgcctcggta agtattatag 480
cctgtgggaa tactgccagc tgggactgag gactgcgacg taagtcaagg atgctggcat 540
aatggttata tgccgcccgt cttgaaacac g 571
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (9)

1.一种贝酵母菌，其保藏编号为CGMCC NO.16127。
2.权利要求1所述的贝酵母菌在制备调理胃肠道健康和/或提高免疫力的保健品、乳制品、药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的贝酵母菌在制备治疗和/或预防腹泻或便秘的保健品、药物中的应用。
4.一种贝酵母菌的培养方法，其特征在于，采用包括如下成分的酵母菌培养基培养得到权利要求1所述的贝酵母菌：蛋白胨、麦芽糖、酒石酸、牛肉粉、氯化钠与琼脂。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于：所述酵母菌培养基的pH值为5.8-6.0，且包括如下重量份的原料：5重量份蛋白胨、5重量份麦芽糖、10重量份酒石酸、5重量份牛肉粉、3重量份氯化钠、16重量份琼脂。
6.一种权利要求1所述的贝酵母菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：将一级种子液按照4-10％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为150-200rpm的条件下，培养24-36h；其中，所述一级种子液为所述贝酵母菌培养6h-12h后得到的对数生长期的菌液。
7.根据权利要求6所述的贝酵母菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为6.0-6.5，且包括如下成分：酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖与微量盐。
8.一种由权利要求1所述的贝酵母菌制备得到的贝酵母菌冻干粉。
9.一种贝酵母菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：向权利要求1所述的贝酵母菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30～-50℃的温度下预冻1-3h，然后置于-10～-20℃的温度下升华10-20h，再置于-10～-25℃的温度下升华10-20h，再在20-30℃的温度下二次升华1-5h，在真空下放置1-5h后，即得贝酵母菌冻干粉；所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
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