CN117801981A - 一株促进肉鸡生长的益生乳酸菌的筛选及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业微生物应用领域，具体涉及一株促进肉鸡生长的益生乳酸菌的筛选及应用，与肉鸡胃肠道消化相关的益生菌添加剂的筛选和应用有关。从粪菌移植阳性(受体为高体重表型)肉鸡的空肠中，筛选到一株对肉鸡有显著促生长作用的罗伊氏乳杆菌，通过分离鉴定、益生性能检测、安全性评价、抗逆性能的鉴定以及饲养试验，表明该菌株可以作为促生长饲料添加剂应用于肉鸡养殖。本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CLR‑31菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023676。该菌株具有产蛋白酶、产脂肪酶能力和抑菌能力。可在家禽饲用微生态添加剂中应用。

Description

一株促进肉鸡生长的益生乳酸菌的筛选及应用
技术领域
本发明属于农业微生物应用技术领域，具体涉及一株促进肉鸡生长的益生乳酸菌的筛选及应用。本发明与肉鸡胃肠道消化相关的益生菌添加剂的筛选和应用有关。本发明从粪菌移植阳性(高体重表型)肉鸡的空肠中，筛选得到一株对肉鸡有显著促生长作用(包括具有产蛋白酶、产脂肪酶能力和抑菌能力)的罗伊氏乳杆菌，通过分离鉴定、益生性能检测、安全性评价、抗逆性能的鉴定以及肉鸡饲养试验的验证，表明该菌株可以作为促生长饲料微生态添加剂应用于肉鸡养殖。
背景技术
在家禽集约化规模化养殖中，为提高经济效益和防止群体性疾病的发生，常使用抗生素预防和治疗疾病，提高动物的生产性能，但不恰当使用抗生素对家禽本身以及人类的健康构成了巨大的威胁(Nhung et al,2017)。针对此问题，畜牧兽医工作者开始挖掘益生菌作为饲料添加剂来替代抗生素。益生菌不但能够维持宿主健康、促进机体的生产性能，而且不会削弱免疫系统功能、无毒副作用。有研究表明，乳酸菌在肠道中可以产生多种消化酶(如淀粉酶、脂肪酶等)，或通过提高肠道中原有消化酶的活性，促进营养物质的消化吸收，进而促进机体的生长(郭云霞等,2013)。不仅如此，乳酸菌还能抑制肠道中致病菌的生长，增加乳杆菌属的相对丰度，改善机体的生产性能(柳成东等,2022)。由此可见，开发具有产消化酶能力和抑菌能力的鸡源益生菌，对肉鸡养殖业的发展具有重要的意义。
肉鸡肠道中的微生物数量远高于机体细胞的数量，在整个微生物群落中，细菌类群占据主导作用(Schwarzer et al.,2018)。肠道菌群的组成对宿主的健康和生长起着不可或缺的作用，粪菌移植技术将供体的粪便微生物菌群移植到受体的肠道中，可以改善或重构受体的肠道菌群组成。有研究表明，将高体重猪和低体重猪的粪便微生物分别移植给新生仔猪，发现高体重猪移植组能够显著促进仔猪的生长发育，改善仔猪断奶前的肠道功能(Qi et al,2021)。
本发明申请人利用粪菌移植技术，选取高体重健康肉鸡的粪便，进行了粪菌移植试验，并发现供体鸡的粪菌能够借助肠道菌群移植将高体重性状传递给受体鸡，本发明以该受体鸡作为菌株分离的动物来源，提高了获得具有促生长作用的益生菌株的概率。基于空肠是鸡最长且是营养物质吸收的关键部位、其中的微生物与营养消化吸收及系统免疫关系密切的事实(Salanitro et al,1978)，本发明采用从阳性的受体肉鸡肠道空肠腔中，来获取具有抑制致病菌作用和促生长作用的乳酸菌的策略，最终获得了具有抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、且具有显著促进肉鸡生长作用的罗伊氏乳杆菌CLR-31(Lactobacillusreuteri CLR-31)，(中国典型培养物保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2023676)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的技术缺陷，从粪菌移植阳性肉鸡空肠内容物中分离筛选出产消化酶能力和抑菌能力强的菌株，以提高肉鸡养殖业的生产效益，该分离菌安全、高效且环保。经16S rDNA鉴定，本发明分离得到的益生菌株为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，本发明对该分离菌的抑菌能力、产酶(脂肪酶、蛋白酶)活性、安全性、抗逆性，以及作为饲料微生态添加剂促进肉鸡生长的效果进行了相关验证。
具体地，本发明的技术方案如下：
本发明以益生菌产酶性能、抑菌能力为标准，从粪菌移植阳性(高体重)的健康肉鸡空肠内容物中，分离筛选得到一株产蛋白酶和脂肪酶能力强和抑菌效果明显的益生菌，发明人经过鉴定，将所得益生菌株命名为罗伊氏乳杆菌CLR-31(Lactobacillus reuteriCLR-31)，于2023年05月04日送到中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2023676。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CLR-31菌株的菌学特性：
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CLR-31为革兰氏阳性菌，属于专性异型发酵菌种，呈轻微不规则、圆形末端的弯曲杆菌(见图1)。在乳酸菌筛选平板(MRS)上，长成圆形、乳白色凸起，表面光滑，有黏性的菌落(见图2)。克隆其16S rRNA基因并进行测序，在NCBI进行Blast比较，发现本发明筛选的菌株的16S rDNA序列与罗伊氏乳杆菌(OM763681.1)的同源性最高，为99.90％。
罗伊氏乳杆菌CLR-31的繁殖能力较强，0-6h处于迟缓期，6h后进入对数生长期，持续到12h后进入稳定期。罗伊氏乳杆菌CLR-31可以耐受酸性环境和胆盐环境，在pH 2.5的培养基中孵育2h，存活率为39.65％。在含0.25％胆盐的培养基中孵育2h，存活率为207.89％。在50℃环境下孵育3min，存活率为36.92％。表明该菌株对酸性环境和高胆盐环境具有较好的抵抗能力，能够顺利在胃肠环境中生存。
罗伊氏乳杆菌CLR-31在以牛奶为唯一氮源的平板上点种，菌苔周围产生透明水解圈(见图3)，提示该菌株能够水解蛋白质，外分泌蛋白酶。将罗伊氏乳杆菌CLR-31接种在三丁酸甘油酯平板上，发现菌落周围产生透明圈(见图4)，说明该菌株产脂肪酶。
罗伊氏乳杆菌CLR-31对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌O157、大肠杆菌O139具有明显的抑制能力(见图5)。对常用兽用抗生素如四环素、氨苄西林、青霉素、头孢唑林、氯霉素、红霉素敏感，而对庆大霉素表现中度敏感；对诺氟沙星、环丙沙星、丁胺卡那、万古霉素、复方新诺明表现为耐药。
申请人将本发明的CLR-31菌株通过饮水饲喂的方式进行了肉鸡饲养试验，发现其对肉鸡具有明显的促进生长作用，达到了预期的效果，从而完成了本发明的任务。
本发明的罗伊氏乳杆菌具有如下优点：
(1)本发明的菌株是从粪菌移植阳性(高体重)肉鸡空肠中分离得到，产蛋白酶和脂肪酶的能力强，提高肉鸡日粮利用率的效果显著。
(2)本发明CLR-31菌株对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抑制作用，提示其具有抗病潜力。
(3)本发明CLR-31菌株繁殖能力较强，可耐受酸性环境和高胆盐环境，在pH为2.5的培养基中孵育2h，存活率为39.65％；在含0.25％胆盐的培养基中孵育2h，存活率为207.89％。在50℃环境下孵育3min，存活率为36.92％。
(4)动物试验证明，本发明CLR-31菌株对肉鸡具有显著的促生长作用，达到了本发明最终目的。
更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。
附图说明
图1：是本发明分离筛选的罗伊氏乳杆菌CLR-31革兰氏染色结果(×1000)。
图2：罗伊氏乳杆菌CLR-31在乳酸菌筛选平板(MRS)上的生长情况。
图3：是本发明菌株CLR-31产蛋白酶检测结果。
图4：是本发明菌株CLR-31产脂肪酶检测结果。
图5：是本发明菌株CLR-31体外抑菌结果。图5中从左至右，从上至下所用的指示菌株依次为：大肠杆菌O139、O157、K88、K99，金黄色葡萄球菌ATCC25923，沙门氏菌C78-1。
图6：是本发明菌株罗伊氏乳杆菌CLR-31菌株的生长曲线。
图7：是本发明菌株CLR-31对肉鸡空肠绒毛形态的影响。
图8：是本发明菌株CLR-31通过邻接法(Neighbor-Joining)构建的细菌系统进化树，图8中S31为本发明菌株CLR-31。
具体实施方式
对序列表的说明：
SEQ ID NO:1是本发明分离株罗伊氏乳杆菌CLR-31的16S rRNA基因序列。
实施例1：罗伊氏乳杆菌CLR-31菌株的分离、鉴定
1.菌株的分离
样品取自49日龄粪菌移植阳性肉鸡(品种为三黄鸡与白羽肉鸡的杂交肉鸡)的空肠内容物，将收集的样品置于4℃冰箱暂时保存备用。取1mL采集的样品进行10倍梯度稀释(100μL培养液加入900μL灭菌水中进行梯度稀释)，稀释至10-7，从10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释梯度，分别取100μl菌悬液，均匀涂布于MRS固体培养基(蛋白胨10g，牛肉浸粉8g、酵母提取物4g、葡萄糖20g、K2HPO4 2g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温-80 1ml、MgSO4·7H200.58g、MnSO4·7H2O 0.25g，再添加1.5％琼脂粉，蒸馏水定容至1000ml。)上，之后置于37℃培养箱中倒置培养36-48h，挑取形态不同的单菌落进行纯培养。将纯培养菌株接种在以牛奶为唯一氮源的平板、三丁酸甘油酯平板上依次进行筛选。该发明菌株在以牛奶为唯一氮源的平板上长成乳白色、光滑、周边整齐、直径5mm左右的菌落，其周围产生直径约6.18mm的透明圈(见图3)；在三丁酸甘油酯平板上长成4.5mm左右的透明菌落，其周围产生8.16mm左右的水解透明圈(见图4)。革兰氏染色呈阳性，呈轻微不规则、圆形末端的弯曲杆菌(见图1)。
2.菌株种属鉴定
在上述鉴定的基础上，进一步对本发明的分离株罗伊氏乳杆菌CLR-31进行16SrRNA基因序列检测，对罗伊氏乳杆菌CLR-31所属的种进行确证鉴定，具体步骤如下：
(一)16S rRNA基因的扩增：
应用细菌通用引物扩增分离株罗伊氏乳杆菌CLR-31的16S rRNA序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物的DNA序列如下：正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，
反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
PCR扩增体系见表1，扩增条件：94℃预变性5min，94℃1min，50℃30s，72℃1.5min，30个循环，72℃延伸10min。取PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测，扩增的片段大小与预期相符，约1500bp。
表1罗伊氏乳杆菌CLR-31菌株PCR扩增体系
(二)构建细菌进化树确定种属：
提取细菌基因组DNA送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI上进行Blast，用MEGA7.0软件通过邻接法(Neighbor-Joining)构建细菌系统进化树(见图8)，分析结果显示菌株CLR-31为罗伊氏乳杆菌。
实施例2：罗伊氏乳杆菌CLR-31的益生特性检测
1.产酶试验
(1)产蛋白酶活性检测
将罗伊氏乳杆菌CLR-31刺种在以牛奶为唯一氮源的平板上，放入37℃培养箱培养48h，若产生蛋白酶，菌落周围蛋白就会分解，平板上会出现透明圈，结果如图3所示，菌株产蛋白酶活性检测结果见表2。
表2罗伊氏乳杆菌CLR-31产蛋白酶检测结果
(2)产脂肪酶活性检测
将罗伊氏乳杆菌CLR-31刺种在三丁酸甘油酯平板上，放入37℃培养箱培养48h，若产生脂肪酶，平板上会出现透明圈，结果如图4所示，菌株产脂肪酶活性检测结果见表3。
表3罗伊氏乳杆菌CLR-31产脂肪酶检测结果
2.罗伊氏乳杆菌CLR-31的抑菌活性试验
以大肠杆菌O157、O139、K88、K99，沙门氏菌C78-1，金黄色葡萄球菌ATCC25923为指示菌(均由华中农业大学兽医微生物与免疫实验室保存,本领域常用菌株。)，以本发明菌株的发酵液为抑菌剂，检测菌株的体外抑菌活性，具体操作步骤如下：
(1)指示菌(大肠杆菌O157、O139、K88、K99，沙门氏菌C78-1，金黄色葡萄球菌ATCC25923)悬液的准备：指示菌菌种平板划线，36℃培养20h；挑取单菌落于LB液体培养基，置37℃振荡培养16h，复苏指示菌。将培养好的指示菌菌液调整到细菌数为1.0×107CFU/mL。(注：在稀释过程中需用0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS，8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L)进行稀释)
(2)细菌发酵液的制备和处理：将本发明菌株平板画线，37℃培养16h。挑取分离菌株于50mL的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养24h后作为种子液。将种子液以1％的质量比接种量接种到100mL的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养48h作为发酵液。
(3)抑菌试验：取200μL指示菌菌悬液，滴于LB平板上，用无菌棉签涂布均匀，直至无可见水滴，再用无菌镊子取灭菌牛津杯，轻轻放于LB固体培养基表面，每个培养基上放置1只牛津杯。用移液枪吸取菌株发酵液各200μL，注入到放置平稳的牛津杯内(小心加入，切勿滴洒牛津杯之外的培养基上)。
(4)培养：将上述加有上清液的培养基放置4℃冰箱5h，然后再将扩散处理完全后的平皿放入37℃的恒温培养箱内，培养8-12h后，观察并记录试验结果。
本发明菌株对大肠杆菌O139、沙门氏菌的抑制能力较强，对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌的抑制能力较弱，培养结果见图5和表4。
表4供试菌株发酵上清液体外抑菌试验
实施例3：罗伊氏乳杆菌CLR-31的安全性评价
药敏试验
选取青霉素类、头胞类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类等15种药敏纸片(购自杭州微生物试剂有限公司)进行药敏试验。试验判断标准参照世界卫生组织(WHO)提供的NCCLS最新版本的标准(2018版)进行。具体步骤如下：
(1)菌液以1％的量接入MRS液体培养基中(蛋白胨10g，牛肉浸粉8g、酵母提取物4g、葡萄糖20g、K2HPO4 2g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温-80 1ml、MgSO4·7H20 0.58g、MnSO4·7H2O 0.25g，蒸馏水定容至1000ml)。，37℃200rpm/min摇床过夜培养。
(2)以有黑字的白纸为背景，调整浊度至0.5麦氏标准比浊管浊度。若菌液浓度太浓时，可用生理盐水稀释。
(3)用灭菌棉签蘸取菌液，抵在管壁上挤去多余的菌液后涂布于MRS琼脂平板上，每次将平板旋转60度，最后涂布平板内侧边缘两圈，反复几次，保证涂均匀。
(4)待平板上的水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子夹取药敏纸片贴在平板表面，纸片一旦贴上就不可再拿起。每个平板贴3张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。(5)平板放置于37℃恒温培养箱培养12-16h观察结果。
试验结果见表5。本发明的罗伊氏乳杆菌CLR-31菌株对常用兽药如四环素、氨苄西林、青霉素、头孢唑林、氯霉素、红霉素敏感，而对庆大霉素表现中度敏感；对诺氟沙星、环丙沙星、丁胺卡那、万古霉素、复方新诺明表现耐药。
表5罗伊氏乳杆菌CLR-31的抗生素敏感性试验结果
(续表5)
注：S表示敏感，M表示中敏，R表示耐药。
实施例4：罗伊氏乳杆菌CLR-31的抗逆特性及生长特性
1.抗逆性试验
(1)耐酸试验
1)配制酸性MRS液体培养基，用氢氧化钠溶液和稀盐酸将pH值调至2.5。
2)制备菌液：用无菌接种环挑取少量分离保存的菌株于MRS琼脂平板上划线，37℃培养箱培养24h，挑取单菌落，接种到MRS液体培养基中，37℃培养至细菌对数生长期，平板计数，菌液浓度为9.5×107CFU/mL，待用。
3)取上述培养好的菌液100μL于900μL pH 2.5的MRS液体培养基中混匀，培养2h后取出。
4)将取出的菌液涡旋40s，以10倍梯度稀释至10-6，取10-5、10-6两个梯度各100μL进行平板浇注，同样每个菌重复三次以上操作。
5)培养36-48h后，进行平板计数，计算存活率。
2.耐胆盐试验
(1)配制含2.5％胆盐的MRS液体培养基。
(2)制备菌液：用无菌接种环挑取少量分离保存的菌株于MRS琼脂平板上划线，37℃培养箱培养24h，挑取单个菌落，接种到MRS液体培养基中，37℃培养至细菌对数生长期，平板计数，菌液浓度为9.5×107CFU/mL，待用。
(3)取上述培养好的菌液100μL于900μL含2.5％胆盐的MRS液体培养基中混匀，培养2h后取出。
(4)将取出的菌液涡旋40s，以10倍梯度稀释至10-6，取10-5、10-6两个浓度梯度各100μL进行平板浇注，同样每个菌重复三次以上操作。
(5)培养36-48h后，进行平板计数，计算存活率。
菌株耐酸/胆盐存活率按照如下公式计算：存活率(％)＝处理后的活菌数/未处理活菌数×100％。结果见表6。
表6菌株耐酸/胆盐检测结果
3.生长曲线的测定
(1)种子液的制备：挑取单菌落接种至3mL的MRS液体培养基中，37℃振荡培养12h，得到种子液；
(2)生长曲线的测定：将种子液以1％的接种量接种至装有200μL MRS液体培养基的蜂窝板孔中，做5个重复，放入全自动生长曲线分析仪中。将仪器设置为从0h起，每隔1h测定其在OD600下的吸光值，测定至24h。以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。
试验表明，本发明所分离菌株繁殖能力较强，0-6h处于迟缓期，6h进入对数生长期持续到12h，12h后进入稳定期。其生长曲线见图6。
实施例5：制作微生态制剂的应用
液体发酵：
营养盐溶液的组成(g/L)：蛋白胨10g，牛肉浸粉8g、酵母提取物4g、葡萄糖20g、K2HPO4 2g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温-80 1ml、MgSO4·7H20 0.58g、MnSO4·7H2O0.25g。
培养条件：往50ml离心管中装入营养盐溶液30ml，接种300μL罗伊氏乳杆菌CLR-31悬液，100rpm旋转式振摇，在37℃下培养12h。
发酵液处理：将所得发酵液以12000r/min，15min离心，弃上清，加入30ml生理盐水重悬，获得液体发酵制剂，活菌数为9.75×107CFU/ml。
制备微生态制剂是本领域常规方法。
实施例6：肉鸡饲喂试验
将本发明的益生菌株CLR-31的液体发酵制剂以饮水的方式饲喂肉鸡，目的是验证本发明的益生菌株对肉鸡的促生长作用。
1.试验动物与分组
选取1日龄健康肉鸡(三黄鸡与白羽肉鸡的杂交)共72只，采用单因素完全随机设计随机分成2组，每组4个重复，每个重复9只鸡。C组为空白对照组，饲喂基础日粮；CLR-31组为罗伊氏乳杆菌组，饲喂基础日粮+CLR-31液体发酵制剂1ml/(只·天)。液体发酵制剂由菌体和生理盐水重悬所得，活菌数为9.75×107CFU/ml。共饲养28天，1-21日龄饲喂育雏期日粮，22-28日龄饲喂育成期日粮，日粮采用肉用鸡配合饲料(510、511)，购自正大集团有限公司。
2.试验过程
肉鸡饲喂试验在湖北省武汉市华中农业大学试验鸡场进行，试验肉鸡养于四层叠式鸡笼，饲喂具体时间为2022年12月10日开始到2023年1月7日结束，共28天。试验期间肉鸡自由饮水和采食，每天喂料2次(为上午10:30，下午16:00)。开始饲养时温度保持于35℃左右，每周降2～3℃，直至第四周至25℃，温度和湿度根据实际生长情况做相应调整。
3.测定指标
(1)生产性能
分别于7d、14d、21d、28d统计肉鸡的生产性能指标，包括平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、饲料转化率(FCR)。
(2)器官指数
第28d处死肉鸡，采集肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊，称重并分别计算其器官指数。采集十二指肠、空肠、回肠、盲肠进行长度测量。
(3)肠道组织形态
制作石蜡切片并进行HE染色，在电子显微镜下观测肠道组织形态，测量肠道绒毛高度、肠道隐窝深度，计算绒毛高度和隐窝深度的比值。
4.结果分析
(1)生产性能
在7d、14d、21d、28d日龄时，CLR-31组的平均日增重均显著高于空白对照组(p＜0.05)，经过28天的试验，空白对照组平均日增重为41.93g，试验组平均日增重为45.26g。见表7。
表7肉鸡生产性能比较
注：同行字母肩标相同或未标注表示差异不显著(P＞0.05)，肩标不同小写字母者表示差异显著(p＜0.05)，肩标不同大写字母者表示差异极显著(p＜0.01)。下表同。
(2)器官指数
经过28天的试验，试验组的胸腺指数和空肠长度均显著高于空白对照组(p＜0.05)(见表8)。
表8肉鸡屠宰性能比较
(3)肠道组织形态
经过28天的试验，试验组的空肠绒隐比(V/C)显著高于空白对照组(p＜0.05)(见表9，图7)。
表9肉鸡空肠绒隐比
在整个试验期中，与空白对照组相比，益生菌株的添加使得试验组平均日增重提高了7.94％，胸腺重量提高了24.92％，空肠长度提高了8.44％，空肠绒隐比提高了29.44％。说明日粮中添加本发明的益生菌株CLR-31对于提高肉鸡生产性能作用显著。
主要参考文献
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Claims (2)

1.一种分离筛选的具有产蛋白酶、产脂肪酶能力和抑菌能力的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CLR-31菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023676。
2.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌菌株CLR-31在家禽饲用微生态添加剂中的应用。
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