CN109679879B - 一种菌株、菌剂及应用 - Google Patents

一种菌株、菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种菌株、菌剂及应用，涉及微生物技术领域。本发明的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018398，保藏日期为2018年6月25日。本发明的上述菌株可抑制5种致病微生物，对15种抗生素表现为敏感，具有非特异性粘附潜力，对酸和胆盐具有耐受性，具有产果胶酶与纤维素酶的特性，具有无溶血特性；本发明发现的上述菌株具有优秀的益生菌作用，可用于控制和调节动物肠道菌群平衡，用于制备动物饲料添加剂以保护动物免疫系统和肠胃健康。

Description

一种菌株、菌剂及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种菌株、菌剂及应用。
背景技术
世界日益增长的人口与不断减少的可利用土地资源间的矛盾越来越尖锐，为了满足人们对动物蛋白的需求，动物的集约化养殖方式在过去的几十年不断发展。在此期间，抗生素因用于治疗动物的感染性疾病，为集约化的养殖带来了巨大的贡献。同时，抗生素自发现不久被广泛用于动物生长促进剂，引发了多重耐药基因在病原微生物中富集和传播，从而严重威胁人类和动物的健康。因此，欧盟于2006年禁止了所有的抗生素作为生长促进剂在饲料中添加。伴随着抗生素生长促进剂的禁用，集约化养殖的动物出现了一系列由“菌群失调”引起的并发症，集约化养殖产业因此受到很大的冲击，抗生素生长促进剂替代品的研发引起广大学者的关注。
近几年，国内外研究发现，诸如益生菌、有机酸、精油、益生元等具有替代抗生素生长促进剂的潜力。研究表明，益生菌可以提高动物的饲料转化率，拮抗病原微生物的入侵，促进免疫系统的发育及维持肠道菌群的平衡，具有很大的开发价值。然而，以乳杆菌、双歧杆菌等为主的益生菌由于其对不良环境的耐受性差，导致产品活菌数量少，保质期短，在宿主体内很难达到益生效果。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种菌株、菌剂及其应用，主要目的是提供一种具有益生菌作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis LTNo.1)菌株。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种菌株，所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018398，保藏日期为2018年6月25日。
作为优选，所述致病微生物包括肠道致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coliEPEC O127:K63)、产肠毒素大肠埃希氏菌(Escherichia coli ETEC O78:K80)、肠道出血性大肠埃希氏菌(Escherichia coli EHEC O157:H7)、单核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes) 及肠沙门氏菌肠亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)。
另一方面，本发明实施例提供了上述菌株在制备益生菌中的应用。
又一方面，本发明实施例提供了一种用于调节动物肠道菌群平衡的益生菌菌剂，所述益生菌菌剂的活性成分包括上述菌株。
又一方面，本发明实施例提供了一种动物饲料添加剂，所述添加剂含有上述益生菌菌剂。
再一方面，本发明实施例提供了一种动物饲料，其中含有添加剂，所述添加剂为上述动物饲料添加剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种菌株，命名LTNo.1，经过基因鉴定确定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；经过生理生化验证，发现上述菌株可抑制5种致病微生物，对15种抗生素表现为敏感，具有非特异性粘附潜力，对酸和胆盐具有耐受性，具有产果胶酶与纤维素酶的特性，具有无溶血特性；因此，可确定本发明发现的上述菌株具有优秀的益生菌作用，可用于控制和调节动物肠道菌群平衡，可用于制备动物饲料添加剂以保护动物免疫系统和肠胃健康。
生物保藏信息说明：
本发明提供的菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018398，保藏日期为2018年6月25日。
附图说明
图1为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis LTNo.1的16SrRNA基因序列的进化分析拓扑结构图；
图2为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis LTNo.1对5种病原指示菌的抑菌圈直径柱状图；
图3为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis LTNo.1的细胞电子显微镜图 (左)和菌落形态图(右)；
图4为本发明实施例提供的15种抗生素对枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilisLTNo.1的抑菌圈直径柱状图；
图5为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis LTNo.1的生长曲线图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1(分离筛选菌株)
从新疆塔城地区沙湾县西戈壁镇白滩村某农户处购买其散养的健康乌鸡，禁食12h(期间自由饮水)后静脉放血处死，无菌取其消化道内容物及表皮粘膜混匀，称取10.0g溶于90mL 无菌生理盐水，振荡均匀，85℃水浴30min；采用梯度稀释涂布法在LB固体培养基上，37℃培养24h。根据菌落颜色、大小、形态等表型差异进行初步筛选，连续转接划线培养3次后，转接至斜面试管，4℃冷藏；挑取单菌落接种至液体培养基37℃、150r/min振荡富集18h， 5600r/min离心10min，弃掉上清液后加入新鲜培养基重悬，补充25％的灭菌甘油冷冻保藏在 -80℃，分离得到的菌株命名为LTNo.1；其中，LB液体培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，LB固体培养基是在上述配方加琼脂18.0g/L。
实施例2(鉴定抑菌性)
检测分离菌株抑菌性：将富集菌液浓度调整至(2.0-2.5)×108CFU/mL，移取150μL于LB 固体培养基均匀涂布，37℃倒置培养24h；用打孔器打出直径为6mm的菌饼待用；指示菌以相同的浓度涂布于相应的培养基，将3份菌饼等距倒置于指示菌表面，LB琼脂块作空白对照，适宜的温度培养18h，测定抑菌圈直径；菌株CCTCC LTNo.1的抑菌直径见图2；指示菌Escherichia coli EPEC O127:K63CICC 10411(肠道致病性大肠埃希氏菌)、Escherichiacoli ETEC O78:K80CICC 10421(产肠毒素大肠埃希氏菌)、Escherichia coli EHEC O157:H7 CICC21530(肠道出血性大肠埃希氏菌)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，Listeria monocytogenes CGMCC 1.9136(单核增生李斯特氏菌)和Salmonella entericasubsp.Enterica CGMCC 1.10754(肠沙门氏菌肠亚种)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例3(鉴定菌株)
1.菌落、细胞形态：将菌株LTNo.1在LB琼脂培养基上划线，37℃培养24h，菌落形状不规则，边缘呈灰白色且平整，中部呈白色凸起，菌落直径为3-5mm；革兰氏染色呈阳性，细胞形态为短杆状，菌落、细胞形态见图3。
2.生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》中的方法对菌株LTNo.1进行生理生化鉴定，结果见表1。
表1.菌株LTNo.1生理生化特征
Figure BDA0001957387390000031
注：“+”：阳性，“-”：阴性.
3.分子鉴定：采用16S rRNA基因测序的分子生物学方法对上述菌株进行鉴定；将上述菌株16S rRNA基因序列(见SEQ.ID.NO.1，使用通用引物27F和1492R)与GenBank中已知序列比对发现，LTNo.1与Bacillus subtilis PgBe154、Bacillus subtilis CEB5等多株枯草芽孢杆菌的相似性达到99％以上，结合菌落形态，生理生化结果及系统发育分析(见图1)，可确定该菌株为Bacillus subtilis LTNo.1。
实施例4(鉴定抗生素敏感性)
选用常见的15种抗生素药敏纸片(英国Oxoid公司)对Bacillus subtilis LTNo.1的安全性进行评估：将菌液浓度调整至(2.0-2.5)×108CFU/mL，移取150μL用无菌棉签均匀涂布，等距贴上药敏纸片，37℃培养18h，测定抑菌圈直径；结果(图4)表明，菌株LTNo.1对15种抗生素均敏感。
注：LEV:Levofloxacin(5μg),CN:Gentamicin(120μg),S:Streptomycin(300μg),E: Erythromycin(15μg),CIP:Ciprofloxacin(5μg),C:Chloramphenicol(30μg),RD:Rifampicin (5μg),NOR:Norfloxacin(10μg),AMP:Ampicillin(10μg),F:Nitrofurantoin(300μg),TE: Tetracycline(30μg),LZD:Linezolid(30μg),QD:Quinupristin/Dalfopristin(15μg),VA: Vancomycin(30μg),P:Penicillin G(10μg).
实施例5(评估粘附能力)
1.疏水性：采用微生物粘着碳烃化合物法(microbial adhesion tohydrocarbons,MATH)测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis LTNo.1)表面疏水性，具体操作为：上述菌株在LB液体培养基中150r/min摇床37℃振荡富集24h，5600r/min离心10min，弃上清液，选用无菌PBS (pH7.4)缓冲液洗涤两次后调整菌液浓度至(2.0-2.5)×108CFU/mL并测定OD600值，记为A0；移取3mL上述菌液加入1mL二甲苯，对照组不加，振荡30s，停顿10s后再振荡30s，室温静置20min；移取水相测定OD600值，记为A，细胞疏水性按照：CSH％＝[(A0－A)/A0]×100 计算，三组平行，结果以平均值±标准差表示(见表2)。
2.表面电荷测定：选用氯仿和乙酸乙酯分别作为路易斯酸和路易斯碱，应用MATH法测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis LTNo.1)表面酸碱性质及所带电荷。
表2.菌株LTNo.1疏水性、表面电荷
Figure BDA0001957387390000041
益生菌细胞粘附性对于其在消化道的上皮细胞的定殖及维持肠道菌群的平衡非常关键。表2中菌株Bacillus subtilis LTNo.1在二甲苯中的疏水性为60.552％，表明上述菌株对烃类化合物具有较好的粘附性；菌株对乙酸乙酯的粘附性相对高于氯仿，说明菌株接受电子的能力强于提供电子对的能力；由上述结果可以看出本发明菌株具有较好的非特异性粘附潜力。
实施例6(鉴定耐受性)
按实施例5中方法富集菌液，用PBS洗涤2次留菌体；实验组用0.1％胃蛋白酶溶液(pH2.0)重悬，37℃震荡2h(150r/min)后5600r/min离心10min，弃上清液；同上述条件洗涤2次后用0.5％的牛胆盐(pH7.4)溶液重悬，同上述条件震荡12h后再次离心并用无菌蒸馏水洗涤2次后重悬，移取200μL于LB固体培养基计数；对照组用无菌PBS处理，实验设三个重复；
益生菌对酸和胆盐的耐受性是决定菌株能否在动物体内存活、发挥益生作用的主要因素；本发明中上述菌株经过酸、胆盐溶液处理后，与对照组相比存活率为74.70％。
实施例7(鉴定产酶定性)
动物饲料中含有纤维素、果胶等非淀粉多糖，不易被动物吸收利用；产纤维素酶、果胶酶的益生菌可辅助动物将饲料中难于消化吸收的大分子物质降解为易吸收的营养物质，从而提高饲料利用率，促进动物生长；本发明将菌株Bacillus subtilis LTNo.1在LB液体培养基中活化后点种至添加特殊底物的培养基上，37℃倒置培养24h，用相应的染色液染色15min后弃染色液，观察结果，阳性产酶菌株周围出现透明圈，每种培养基三个重复；上述实验结果表明菌株Bacillus subtilis LTNo.1明显具有产纤维素酶、果胶酶的特性。
产纤维素酶培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖1.0g/L，羧甲基纤维素钠5.0g/L，琼脂18.0g/L (染色液：1.0mg/mL刚果红)；
产果胶酶培养基：YNB 6.7g/L，果胶10.0g/L，琼脂18.0g/L(染色液：10.0g/L十六烷基三甲基溴化铵)；
实施例8(鉴定溶血性)
挑取菌株Bacillus subtilis LTNo.1划线接种至7％绵羊血琼脂，37℃倒置培养48h，观察结果；如果菌落周围产生绿色圈为α溶血，形成透明圈为β溶血，菌落周围没变化为γ溶血 (无溶血性)；细菌溶血性是益生菌安全性评估的一项重要指标；通常认为α、γ溶血是安全的，β溶血性细菌可产生细胞毒性磷脂酶，降低宿主血红蛋白的数量。
本发明中菌株Bacillus subtilis LTNo.1在7％绵羊血琼脂上培养48h后，菌落周围培养基没有变化，没有溶血性，因此是安全的。
7％绵羊血琼脂：绵羊血70ml，胰蛋白胨14g，蛋白胨4.5g，酵母提取物4.5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。
实施例9(测定生长曲线)
挑取斜面保藏的菌株接种至10mL液体LB培养基中震荡(37℃，150r/min)活化24h后，以2％接种量转接至250mL锥形瓶(100mL液体LB培养基)中，以相同条件培养，按时移取200μL均匀的培养液在酶标仪上测定OD600实验设三个平行，结果求平均值。
本发明菌株Bacillus subtilis LTNo.1的生长曲线如图5所示，生长曲线为菌株工业化生产和实践应用提供理论指导。
本发明发现的上述菌株，命名LTNo.1，经过实施例1-8鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且发现上述菌株可抑制5种致病微生物，对15种抗生素表现为敏感，具有非特异性粘附潜力，对酸和胆盐具有耐受性，具有产果胶酶与纤维素酶的特性，具有无溶血特性；因此，可确定本发明发现的上述菌株具有优秀的益生菌作用，可用于控制和调节动物肠道菌群平衡，可用于制备动物饲料添加剂以保护动物免疫系统和肠胃健康。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。
Figure BDA0001957387390000071
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种菌株、菌剂及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1062
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccattgcgg cgtgctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat 60
gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc 120
gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcaaac ataaaaggtg 180
gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240
tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360
gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg 420
aagaacaagt accgttcgaa tagggcggta ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg 540
ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg 600
ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg 720
taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac 1020
aggtgtgcat gggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tt 1062

Claims (6)

1.一种菌株，其特征在于，所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018398，保藏日期为2018年6月25日。
2.权利要求1所述的菌株在抑制致病微生物中的应用，其特征在于，所述致病微生物包括肠道致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli EPEC)O127:K63、产肠毒素大肠埃希氏菌(Escherichia coli ETEC)O78:K80、肠道出血性大肠埃希氏菌(Escherichia coli EHEC)O157:H7、单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)或肠沙门氏菌肠亚种(Salmonella enterica subsp. enterica)。
3.权利要求1所述的菌株在制备益生菌菌剂中的应用。
4.一种用于调节动物肠道菌群平衡的益生菌菌剂，其特征在于，所述益生菌菌剂的活性成分包括权利要求1所述的菌株。
5.一种动物饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂中含有权利要求4所述的益生菌菌剂。
6.一种动物饲料，其中含有添加剂，其特征在于，所述添加剂为权利要求5所述的动物饲料添加剂。
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