CN104245943A - 包含来自枯草芽孢杆菌的发酵产物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗污染组合物，所述抗污染组合物包含一种或多种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株(如，选自：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18)的无细胞发酵产物；其中所述发酵产物包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。此外，本发明还涉及制备所述组合物的方法、使用所述组合物的方法、包含所述组合物的产品及其用途。

Description

包含来自枯草芽孢杆菌的发酵产物的组合物
优先权声明
本申请要求2012年2月21日提交的美国专利申请No.61/601,154的优先权，所述美国专利申请全文以引用方式并入。
技术领域
本发明涉及抗污染组合物、制备其的方法及其防止诸如食品、表面涂层材料和农产品的产品的微生物污染的用途。具体地讲，本发明涉及抗污染组合物，所述抗污染组合物包含枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株例如22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18的发酵产物。
背景技术
产品的微生物污染是多个行业的问题。
例如，在涂料行业中，水基涂料在湿润状态下易受到微生物污染(如，腐败)。此类污染可导致涂料中的变色、析气、恶臭、粘度损失、粘丝(即粘液)和相分离。
在食物、饲料和农业行业中，由于其组成的原因，食物、饲料、作物和种子易充当微生物的培养基，这构成了对人和/或动物健康的可能风险。因此，此类产品需要针对微生物污染进行保护。
通常在储存或操作过程因受外部环境影响而发生微生物污染。
防止此种情况的一种常规方法是使用外部屏障。这些屏障是物理的，并且在一些情况下，是化学的。
在物理屏障中，除了包装外，还使用了塑料聚合物和共聚物涂层，例如聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚酯、聚酰胺和聚醚涂层、天然和合成弹性体及橡胶涂层、蜡质涂层、纤维素涂层和水胶体聚合物涂层，例如藻酸盐、卡拉胶、黄原胶/刺槐豆胶混合物、琼脂、明胶和果胶。
然而，许多产品(如食品)在储存过程中需要与环境进行湿度或味道交换，例如在一些肉和奶酪产品中。对于此类产品，使用无孔物理屏障是不适当的。然而，当使用多孔屏障时，微生物可穿越屏障并增殖。
此外，在使用中，在产品完全消费或应用之前可能打开和/或移除了包装较长的一段时间。例如，在一些干燥产品中，如干燥食品(例如宠物食物)中，使用者首次打开产品与最终消费之间的时间段可能延长，从而使微生物污染产品。
已将用于保护此类产品的化学屏障施加于产品自身的表面上，其与其他组分例如颜料、抗氧化剂、增稠剂、油、凝胶剂、增溶剂、乳化剂、风味剂或乳浊剂一起分散在溶液中或包含于涂层聚合物悬浮液、溶液或熔化混合物中。通常使涂层干燥或固化以便固定。用于化学屏障的化学化合物中的一些为山梨酸盐、苯甲酸盐、硫衍生的化合物、亚硝酸盐、硝酸盐、丙酸盐、乳酸盐、醋酸盐、硼酸盐和对羟基苯甲酸酯。
然而，需要使用更多天然化合物防止产品例如农产品、食品、表面涂层材料和乳液的污染和/或腐败。
附图说明
图1示出了pH和不同热处理对DCS 1579(枯草芽孢杆菌菌株22C-P1)的无细胞发酵物抗大肠杆菌(E.coli)的活性的效应。
图2示出了pH和不同热处理对DCS 1580(枯草芽孢杆菌菌株15A-P4)的无细胞发酵物抗大肠杆菌的活性的效应。
图3示出了pH和不同热处理对DCS 1581(枯草芽孢杆菌菌株3A-P4)的无细胞发酵物抗大肠杆菌的活性的效应。
图4示出了pH和不同热处理对DCS 1582(枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1)的无细胞发酵物抗大肠杆菌的活性的效应。
图5示出了pH和不同热处理对DCS 1583(枯草芽孢杆菌菌株ABP278)的无细胞发酵物抗大肠杆菌的活性的效应。
图6示出了pH和不同热处理对DCS 1584(枯草芽孢杆菌菌株BS18)的无细胞发酵物抗大肠杆菌的活性的效应。
图7示出了pH和不同热处理对DCS 1579(枯草芽孢杆菌菌株22C-P1)的无细胞发酵物抗单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)的活性的效应。
图8示出了pH和不同热处理对DCS 1580(枯草芽孢杆菌菌株15A-P4)的无细胞发酵物抗单核细胞增多性李斯特菌的活性的效应。
图9示出了pH和不同热处理对DCS 1581(枯草芽孢杆菌菌株3A-P4)的无细胞发酵物抗单核细胞增多性李斯特菌的活性的效应。
图10示出了pH和不同热处理对DCS 1582(枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1)的无细胞发酵物抗单核细胞增多性李斯特菌的活性的效应。
图11示出了pH和不同热处理对DCS 1583(枯草芽孢杆菌菌株ABP278)的无细胞发酵物抗单核细胞增多性李斯特菌的活性的效应。
图12示出了pH和不同热处理对DCS 1584(枯草芽孢杆菌菌株BS18)的无细胞发酵物抗单核细胞增多性李斯特菌的活性的效应。
图13示出了发酵物与各种酶一起温育对抗大肠杆菌DCS 229的活性的效应，表示为与未处理样品相比的残余活性(％)。
图14示出了发酵物与各种酶一起温育对抗单核细胞增多性李斯特菌DCS 1081的活性的效应，表示为与未处理样品相比的残余活性(％)。
图15示出了来自枯草芽孢杆菌菌株BS8、15A-P4、22C-P1、3AP-4和BS2084的基因组草图的基因组相似性。
图16示出了平均光密度(扣除阴性对照)相对于30℃下的温育时间的图。
图17示出了对于每条曲线而言与y＝0.1相对应的x值的外推以及推导的x值的自然对数(lm)相对于每条曲线代表的样品浓度作图。
图18示出了ln(达到0.1的OD的时间)与样品浓度的线性相关性。
图19示出了用于分析不同发酵物制剂的方法的示意图。
图20示出了来自菌株芽孢杆菌DCS 1580的发酵物抗若干目标微生物的平均活性。数据源自发酵物制备的三个生物学平行样。误差条显示±1SD。
图21示出了来自菌株芽孢杆菌DCS 1581的发酵物抗若干目标微生物的平均活性。数据源自发酵物制备的三个生物学平行样。误差条显示±1SD。
图22示出了来自菌株芽孢杆菌DCS 1582的发酵物抗若干目标微生物的平均活性。数据源自发酵物制备的三个生物学平行样。误差条显示±1SD。
图23示出了来自菌株芽孢杆菌DCS 1584的发酵物抗若干目标微生物的平均活性。数据源自发酵物制备的三个生物学平行样。误差条显示±1SD。
图24示出了在-20℃下储存14天后不同液体发酵物制剂的平均活性。
图25示出了在4℃下储存21天后不同冻干发酵物制剂的平均活性。
图26示出了与未处理对照样品相比，来自芽孢杆菌DCS 1580(F 1580)的发酵物抗超高温灭菌乳中的大肠杆菌库的抗微生物活性。误差条指示±1SD。
图27示出了来自芽孢杆菌DCS 1580(F 1580)的发酵物抗超高温灭菌乳中的沙门氏菌菌种(Salmonella spp.)库的抗微生物活性。误差条指示与未处理对照样品相比的±1SD。
图28示出了与未处理对照样品相比，来自芽孢杆菌DCS 1581(F 1581)的发酵物抗超高温灭菌乳中的大肠杆菌库的抗微生物活性。误差条指示±1SD。
图29示出了与未处理对照样品相比，来自芽孢杆菌DCS 1581(F 1581)的发酵物抗超高温灭菌乳中的沙门氏菌菌种库的抗微生物活性。误差条指示±1SD。
图30示出了与未处理对照样品相比，来自芽孢杆菌DCS 1582(F 1582)的发酵物抗超高温灭菌乳中的大肠杆菌库的抗微生物活性。误差条指示±1SD。
图31示出了与未处理对照样品相比，来自芽孢杆菌DCS 1582(F 1582)的发酵物抗超高温灭菌乳中的沙门氏菌菌种库的抗微生物活性。误差条指示±1SD。
图32示出了与未处理对照样品和冻干CASO添加剂相比，来自芽孢杆菌DCS 1584(F 1584)的发酵物抗超高温灭菌乳中的大肠杆菌库的抗微生物活性。误差条指示±1SD。
图33示出了与未处理对照样品和冻干CASO添加剂相比，来自芽孢杆菌DCS 1584(F 1584)的发酵物抗超高温灭菌乳中的沙门氏菌菌种库的抗微生物活性。误差条指示±1SD。
图34示出了从宠物食物设施分离的肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonellaenterica subsp.enterica)菌株的系统树图。
图35示出了当在抑制肉汤测定法中测试时来自BS18和15AP4的发酵物对从宠物食物设施分离的肠道沙门氏菌肠道亚种菌株的效应。数据是针对10％体积比和50％体积比的发酵物与目标生物体培养物示出的。结果示出为相对于阴性对照(无发酵物)所计算的百分比抑制值。
图36示出了当在抑制肉汤测定法中测试时来自BS18和15AP4的发酵物对涉及多种宠物食物的中毒/召回的已表征的肠道沙门氏菌肠道亚种菌株的效应。数据是针对10％体积比和50％体积比的发酵物与目标生物体培养物示出的。结果示出为相对于阴性对照(无发酵物)所计算的百分比抑制值。
图37示出了当在抑制肉汤测定法中测试时来自22CP1、LSSA01、3AP4和BS2084的发酵物对从宠物食物设施分离的肠道沙门氏菌肠道亚种菌株的效应。数据是针对10％体积比和50％体积比的发酵物与目标生物体培养物示出的。结果示出为相对于阴性对照(无发酵物)所计算的百分比抑制值。
图38示出了当在抑制肉汤测定法中测试时来自22CP1、LSSA01、3AP4和BS2084的发酵物对涉及多种宠物食物的中毒/召回的已表征的肠道沙门氏菌肠道亚种菌株的效应。数据是针对10％体积比和50％体积比的发酵物与目标生物体培养物示出的。结果示出为相对于阴性对照(无发酵物)所计算的百分比抑制值。
图39示出了当在抑制肉汤测定法中测试时来自ABP278的发酵物对从宠物食物设施分离的肠道沙门氏菌肠道亚种菌株的效应。数据是针对10％体积比和50％体积比的发酵物与目标生物体培养物示出的。结果示出为相对于阴性对照(无发酵物)所计算的百分比抑制值。
图40示出了当在抑制肉汤测定法中测试时来自ABP278的发酵物对涉及多种宠物食物的中毒/召回的已表征的肠道沙门氏菌肠道亚种菌株的效应。数据是针对10％体积比和50％体积比的发酵物与目标生物体培养物示出的。结果示出为相对于阴性对照(无发酵物)所计算的百分比抑制值。
图41示出了涂布在狗粮上的4种不同冻干枯草芽孢杆菌发酵物(15A-P4(DCS 1580)、3A-P4(DCS 1581)、LSSAO1(DCS 1582)和BS18(DCS1584))抗沙门氏菌属库的抗微生物活性。这与阴性对照进行比较，在阴性对照中，狗粮未涂布有发酵物。显示了随时间推移(天)，沙门氏菌菌种的Log10(CFU/g)减少。误差条指示±1SD。
发明内容
本发明的根本发现在于枯草芽孢杆菌菌株的无细胞发酵产物具有防止污染物和/或微生物污染的示例性效用。
本发明人首次表明，通过培养枯草芽孢杆菌菌株22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18中任一种或其组合获得的无细胞发酵物具有抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌的广谱活性。
本发明的另一个惊奇发现是发酵物中的化合物可在储存过程中保持处于代谢活性状态。
本发明基于该惊奇发现，预测可使此类无细胞发酵物(即从活细菌分离)储存稳定并具有在广泛应用中作为抗污染组合物的效用。
基于这些发现，我们提供具有下列优点中的一者或多者的抗污染组合物：其是天然抗污染组合物；其易于制备；其生产具有成本效益；和/或其具有广谱的抗污染活性。
发明陈述
在第一方面，本发明提供抗污染组合物，所述抗污染组合物包含选自如下的一种或多种枯草芽孢杆菌菌株的无细胞发酵产物：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18。
在第一方面，本发明提供抗污染组合物，所述抗污染组合物包含选自如下的一种或多种枯草芽孢杆菌菌株的无细胞发酵产物：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS2084和BS18；其中所述发酵产物包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素(bacillibactin)、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
有利地，已发现此类组合物可能具有抗污染微生物的广谱抑制活性。
此外，此类组合物在多种行业中可能是高度期望的，所述行业例如为食物行业，在食物行业中，消费者要求使用更多天然防腐剂。
在另一个方面，本发明的抗污染组合物还包含一种或多种附加组分，例如载体、辅助剂、增溶剂、悬浮剂、稀释剂、氧气清除剂、抗氧化剂或食物材料。适当地，一种附加组分可为氧气清除剂和/或抗氧化剂。
有利地，氧气清除剂和/或抗氧化剂的使用可增加本发明的抗污染组合物的储存稳定性和/或可延长施加抗污染组合物的产品的货架期。
在一个方面，本发明的抗污染组合物包含选自如下的多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在一个方面，本发明的抗污染组合物包含选自如下的一种或多种部分分离的化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在另一个方面，本发明的无细胞发酵产物或抗污染组合物可为无细胞发酵物。有利地，该方面可提供制备抗污染组合物的成本效益和/或简便性。另外或在替代形式中，该方面可提供抗污染微生物的广谱抑制活性。
在一个方面，本发明的无细胞发酵产物或抗污染组合物可包含一种或多种附加抗污染剂。
在一个方面，本发明的组合物可有效抵抗革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或真菌中的一种或多种。优选地，本发明的组合物可有效抵抗多种微生物，如选自如下的微生物：革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌。
在一个方面，本发明的组合物有效抵抗来自选自如下的属的一种或多种革兰氏阴性细菌：沙门氏菌属；埃希氏菌属(Escherichia)；哈夫尼菌属(Hafnia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；假单胞菌属(Pseudomonas)；志贺菌属(Shigella)和耶尔森菌属(Yersinia)。
在一个方面，本发明的组合物有效抵抗如下一种或多种：肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)；大肠杆菌(Escherichia coli)；蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；福氏志贺菌(Shigella flexneri)；宋内志贺菌(Shigella sonnei)和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)。
在一个方面，本发明的组合物有效抵抗肠道沙门氏菌菌株。
适当地，本发明的组合物可有效抵抗如下一种或多种：肠道沙门氏菌鸭血清型(Salmonella enterica ser.Anatum)；肠道沙门氏菌布灵得卢柏血清型(Salmonella enterica ser.Braenderup)；肠道沙门氏菌德尔卑血清型(Salmonella enterica ser.Derby)；肠道沙门氏菌肠炎血清型(Salmonellaenterica ser.Enteritidis)；肠道沙门氏菌哈达尔血清型(Salmonella enterica ser.Hadar)；肠道沙门氏菌婴儿血清型(Salmonella enterica ser.Infantis)；肠道沙门氏菌凯道古血清型(Salmonella enterica ser.Kedougou)；肠道沙门氏菌姆班达卡血清型(Salmonella enterica ser.Mbandaka)；肠道沙门氏菌蒙得维的亚血清型(Salmonella enterica ser.Montevideo)；肠道沙门氏菌诺伊斯特尔血清型(Salmonella enterica ser.Neumuenster)；肠道沙门氏菌新港血清型(Salmonella enterica ser.Newport)；肠道沙门氏菌俄亥俄血清型(Salmonellaenterica ser.Ohio)；肠道沙门氏菌史华氏血清型(Salmonella enterica ser.Schwarzengrund)；肠道沙门氏菌桑夫顿堡血清型(Salmonella enterica ser.Senftenberg)；肠道沙门氏菌田纳西血清型(Salmonella enterica ser.Tennessee)；肠道沙门氏菌汤普森氏血清型(Salmonella enterica ser.Thompson)以及肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型(Salmonella enterica ser.Typhimurium)。
适当地，本发明的组合物可有效抵抗埃希氏菌(如，大肠杆菌(Escherichia coli))。
适当地，本发明的组合物可有效抵抗如下一种或多种：大肠杆菌DCS15(如，大肠杆菌0157：H7)、大肠杆菌DCS 492、大肠杆菌DCS 493、大肠杆菌DCS 494、大肠杆菌DCS 495、大肠杆菌DCS 496、大肠杆菌DCS497、大肠杆菌DCS 546、大肠杆菌DCS 558、大肠杆菌DCS 1336以及大肠杆菌DCS 1396。
在一个方面，本发明的组合物有效抵抗来自选自如下的属的一种或多种革兰氏阳性细菌：李斯特菌属(Listeria)；芽孢杆菌属(Bacillus)；环丝菌属(Brochothrix)；梭菌属(Clostridium)；肠球菌属(Enterococcus)；乳杆菌属(Lactobacillus)；明串珠菌属(Leuconostoc)以及葡萄球菌(Staphylococcus)。
在一个方面，本发明的组合物有效抵抗如下一种或多种：单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)孢子；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；地衣芽孢杆菌孢子；枯草芽孢杆菌孢子；热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)；产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfrmgens)；生孢梭菌(Clostridium sporogenes)孢子；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)；香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)；发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)；肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)；无害李斯特菌(Listeria innocua)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。
在一个方面，本发明的组合物有效抵抗来自选自如下的属的一种或多种真菌：曲霉属(Aspergillus)；假丝酵母属(Candida)；德巴利酵母属(Debaryomyces)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)；青霉属(Penicillium)；毕赤酵母属(Pichia)；红酵母属(Rhodotorula)；酵母属(Saccharomyces)以及接合酵母属(Zygosaccharomyces)。
在一个方面，本发明的组合物有效抵抗如下一种或多种：寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)；杂色曲霉(Aspergillus versicolor)；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)；热带假丝酵母(Candida tropicalis)；弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)；汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；团青霉(Penicillium commune)；异常毕赤酵母(Pichia anomala)；粘红酵母(Rhodotorula glutinis)；胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)。
在一个方面，本发明的组合物为固体、半固体、液体或凝胶形式，例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、液体、悬浮液、分散剂或乳液。
在一个方面，本发明的组合物被密封。
在一个方面，本发明的组合物被气密封。
在另一个方面，本发明提供制备抗污染组合物的方法，该方法包括：
a)将包含选自如下的至少一种枯草芽孢杆菌菌株的一种或多种细菌：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18培养在底物之上或之中，以产生包含至少一种抗污染化合物的发酵物，所述至少一种抗污染化合物例如为选自脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物的化合物；和
b)使活细胞分离和/或失活。
适当地，也可将细菌孢子从发酵物分离和/或使之失活。
适当地，根据本发明的枯草芽孢杆菌菌株的培养可在5至9的pH范围内的pH下进行。
此外或在替代形式中，可将发酵产物的pH调节到pH 6至10的范围内的pH。
令人惊奇的是，已发现在中性和/或碱性pH下培养或储存本发明的抗污染组合物增加了抗污染组合物的储存稳定性和/或使组合物的抗污染活性稳定。
在一个方面，发酵物可进行一个或多个(另外的)分离和/或离析步骤以产生发酵物的上清液或其级分或组分。适当地，其级分或组分可包含选自如下的至少一种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在另一个方面，选自如下的至少一种化合物被分离和/或纯化：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。适当地，多种化合物可被分离和/或纯化。
适当地，本发明的组合物可包含化合物脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物中的2种或更多种、适当地3种或更多种、适当地4种或更多种。
在一个方面，培养步骤处于约10至约55℃温度范围内的温度下。
在一个方面，培养物的底物包含允许细菌生长的任何合适营养培养基。例如，底物可包含脱脂干奶粉、蔬菜(如，玉米、马铃薯、卷心菜)、淀粉、谷粒(如，水稻、小麦、大麦、蛇麻子)、水果(如，葡萄、苹果、橙子)、糖、甘蔗、肉(如，牛肉、家禽肉、猪肉、腊肠)、心浸液、培养的右旋糖、其组合、以及含有最适生长所需的蛋白质、碳水化合物和矿物的培养基。
在另一个方面，培养物的底物可包含下列的任何一种：碳水化合物、蛋白胨、磷酸盐、盐、缓冲盐或其组合。
仅以举例的方式，培养物的底物可包含TSB或CASO培养基(如，CASO肉汤)或其组合。
在一个实施例中，培养物的底物为CASO培养基、适当地CASO肉汤。
在一个方面，底物可包括淀粉、大豆、酵母提取物和盐中的一种或多种。
在一个方面，使用选自如下的多种枯草芽孢杆菌菌株进行培养：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18。
在一个方面，培养物可包含一种或多种附加细菌。
在一个方面，培养步骤进行约1至约48小时。
在一个方面，用于制备根据本发明的抗污染组合物的方法包括添加氧气清除剂和/或抗氧化剂。
抗氧化剂的例子包括：抗坏血酸、多酚、维生素E、β-胡萝卜素、迷迭香提取物、甘露醇和BHA。
在一个方面，用于制备本发明的抗污染组合物的方法包括如在容器例如包装中密封(优选地气密封)发酵物或上清液、其级分或组分的步骤。容器(如包装)也可包含清除氧气的化合物。
在一个方面，本发明涉及由本发明的方法制备的抗污染组合物。
在另一个方面，本发明涉及防止和/或减少产品的微生物污染的方法，所述方法包括使产品的至少一种组成组分、产品本身和/或产品的包装与根据本发明的或通过根据本发明的方法制备的抗污染组合物接触的步骤。
本文所用的术语“产品”包括：食品(例如肉制品、动物饲料和宠物食物)；表面涂层材料(例如涂料)和农产品(例如作物和种子)。
在一个方面，将产品的组成组分或产品本身与本发明的抗污染组合物混合。
在另一个方面，将本发明的抗污染组合物施加于产品、其组成组分和/或产品包装的表面。
在一个方面，防止和/或减少本发明的产品的微生物污染的方法使得革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或真菌中的一种或多种所致的微生物污染得以防止和/或减少。
在一个方面，防止和/或减少本发明的产品的微生物污染的方法使得至少一种革兰氏阳性细菌、至少一种革兰氏阴性细菌和至少一种真菌所致的微生物污染得以防止和/或减少。
在另一个方面，本发明涉及包含本发明的抗污染组合物的产品或根据本发明制备的产品和/或因进行本发明的方法而导致具有减少的微生物污染的产品。
在一个方面，根据本发明的抗污染组合物为作物保护剂或被配制为作物保护剂，如杀真菌剂或杀细菌剂。
在另一个方面，本发明涉及使用根据本发明的抗污染组合物防止产品的微生物污染。适当地，产品为下列的任何一种：本文所用的术语“产品”包括：食品(例如肉制品、动物饲料和宠物食物)；表面涂层材料(例如涂料)和农产品(例如作物、种子等等)。
在又一个方面，本发明涉及用于筛选有效抵抗一种或多种目标污染微生物的抗污染组合物的方法，所述方法包括：
a)将包含选自如下的至少一种枯草芽孢杆菌菌株的一种或多种细菌：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18培养在底物之上或之中，以产生发酵产物；
b)使活细胞分离和/或失活，并且任选地，使孢子分离和/或失活；
c)测试发酵产物抗目标污染微生物的抗微生物活性；和
d)选择具有抗目标污染微生物的抗微生物活性的发酵产物；
其中步骤b)可在步骤c)和d)之前、期间和/或之后进行。
此类方法也可包括一个或多个(另外的)分离和/或离析步骤。
在一个方面，如果按照本文教导的“平板扩散测定法”方案观察到至少2mm的抑菌区/圈，则认为抗污染组合物或发酵产物或无细胞发酵产物能有效抵抗污染微生物(一种或多种)。
在另一个方面，如果在本文教导的“抑制肉汤测定法”中具有至少约20％抑制，则认为抗污染组合物或发酵产物或无细胞发酵产物能有效抵抗污染微生物(一种或多种)。
在另一个方面，如果在通过本文教导的“有效浓度测定法”测量时具有至少约100％(体积比)的有效浓度，则认为抗污染组合物或发酵产物或无细胞发酵产物能有效抵抗污染微生物(一种或多种)。
在另一个方面，如果具有不止一种、优选地所有三种下列活性，则认为抗污染组合物或发酵产物或无细胞发酵产物能有效抵抗微生物：如果按照“平板扩散测定法”方案观察到至少2mm的抑菌区；“抑制肉汤测定法”中的至少约20％抑制；通过“有效浓度测定法”测得的至少约100％(体积比)的有效浓度。
在一个实施例中，本发明的发酵产物可包含选自如下的一种或多种化合物的类似物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin和LCI。
适当地，所述类似物可为选自如下的一种或多种化合物的类似物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素。
在一个实施例中，本发明的发酵产物可包含选自如下的一种或多种化合物的同源物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin和LCI。
适当地，所述同源物可为选自如下的一种或多种化合物的同源物：plantazolicin(小菌素)和LCI。
在一个实施例中，本发明所用的枯草芽孢杆菌菌株为22C-P1。因此适当地，抗污染组合物可包含枯草芽孢杆菌22C-P1的无细胞发酵产物。枯草芽孢杆菌22C-P1的无细胞发酵产物可包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在一个实施例中，本发明所用的枯草芽孢杆菌菌株为15A-P4。因此适当地，抗污染组合物可包含枯草芽孢杆菌15A-P4的无细胞发酵产物。枯草芽孢杆菌15A-P4的无细胞发酵产物可包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在一个实施例中，本发明所用的枯草芽孢杆菌菌株为3A-P4。因此适当地，抗污染组合物可包含枯草芽孢杆菌3A-P4的无细胞发酵产物。枯草芽孢杆菌3A-P4的无细胞发酵产物可包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在一个实施例中，本发明所用的枯草芽孢杆菌菌株为LSSA01。因此适当地，抗污染组合物可包含枯草芽孢杆菌LSSA01的无细胞发酵产物。枯草芽孢杆菌LSSA01的无细胞发酵产物可包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在一个实施例中，本发明所用的枯草芽孢杆菌菌株为ABP278。因此适当地，抗污染组合物可包含枯草芽孢杆菌ABP278的无细胞发酵产物。枯草芽孢杆菌ABP278的无细胞发酵产物可包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在一个实施例中，本发明所用的枯草芽孢杆菌菌株为BS2084。因此适当地，抗污染组合物可包含枯草芽孢杆菌BS2084的无细胞发酵产物。枯草芽孢杆菌BS2084的无细胞发酵产物可包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在一个实施例中，本发明所用的枯草芽孢杆菌菌株为BS18。因此适当地，抗污染组合物可包含枯草芽孢杆菌BS18的无细胞发酵产物。枯草芽孢杆菌BS18的无细胞发酵产物可包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在一个实施例中，发酵产物包含脂肽(如，表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素或其组合)。
在一个实施例中，发酵产物包含聚酮化合物(如，地非西丁、大环内酰亚胺、Bacillaene或其组合)。
在一个实施例中，发酵产物包含嗜铁素。
在一个实施例中，发酵产物包含杆菌溶素。
在一个实施例中，发酵产物包含抗荚膜菌素。
在一个实施例中，发酵产物包含plantazolicin。
在一个实施例中，发酵产物包含LCI。
在一个实施例中，发酵产物包含plantazolicin的同源物。
在一个实施例中，发酵产物包含LCI的同源物。
在一个实施例中，本发明提供抗污染组合物，所述抗污染组合物包含选自如下的一种或多种枯草芽孢杆菌菌株的无细胞发酵产物：LSSA01、ABP278、BS2084和BS18；其中所述发酵产物包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
在一个实施例中，本发明的脂肽选自：表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素或其组合。
在另一个实施例中，本发明的聚酮化合物选自：地非西丁、大环内酰亚胺、bacillaene或其组合。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，20ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)(Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》，第20版，约翰威利父子出版公司，纽约，1994年)以及Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)(Marham，《哈珀柯林斯生物学词典》，哈珀永久出版社，纽约，1991年)为技术人员提供本公开所使用的许多术语的通用词典。
本公开文本并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开文本的实施方案的实施或试验。数值范围包括限定该范围的数字。
本文提供的标题并非对本公开文本的各个方面或实施方案的限制，这些方面或实施方案可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施方案之前，应理解本公开并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体的实施方案的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。
在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定的范围中的任何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开文本内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开文本中，但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开文本中。
必须指出，本文和所附权利要求书中用到的名词既有单数含义也有复数含义，除非上下文另有清楚规定。因此，例如，提到“发酵产物”则包括多个这种候选剂，而提到“饲料”则包括提到一种或多种饲料以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。
本文述及的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不能被解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
本文所用的术语“无细胞发酵产物”是指在细菌细胞(包括优选地孢子)中的一些或所有已移除和/或失活后在合适培养基中培养(如，发酵)枯草芽孢杆菌菌株22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS2084和BS18中的一种或多种所得的组合物；或其上清液或级分或组分。在一个方面，无细胞发酵产物包含选自脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物的至少一种或多种代谢物。适当地，化合物(一种或多种)是正培养(如，发酵)的细菌的代谢物(一种或多种)。
在一个实施例中，抗污染组合物是无细胞发酵产物。例如，本发明的抗污染组合物可仅是这样的发酵物，其已被修饰来移除和/或失活细菌细胞以提供无细胞发酵物。
如本文所用，术语“发酵物”是指在培养枯草芽孢杆菌菌株22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18中的一种或多种后(如，在培养结束时)存在的组成组分的混合物。因此，本文所用的术语“发酵物”可包括一种或多种抗污染化合物(例如脂肽(如，表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素或其组合)、聚酮化合物(如，地非西丁、大环内酰亚胺、bacillaene或其组合)、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物以及LCI的同源物)以及其他组分例如培养过程中未利用的颗粒物、固体、底物，碎片、培养基、细胞废物等。在一个方面，将细菌细胞(和优选地，孢子)从发酵物移除和/或失活以提供无细胞发酵物。
本文所用的术语“无细胞”是指发酵产物(优选发酵物)基本上不含活的细菌细胞，通常包含小于约105个活的细菌细胞/毫升发酵产物，小于约104个活的细菌细胞/毫升发酵产物，小于约103个活的细菌细胞/毫升发酵产物，小于约102个活的细菌细胞/毫升发酵产物，或小于约10个活的细菌细胞/毫升发酵产物。优选地，发酵产物基本上不含细胞，通常包含小于约105个细胞/毫升发酵产物，小于约104个细胞/毫升发酵产物，小于约103个细胞/毫升发酵产物，小于约102个细胞/毫升发酵产物，或小于约10个细胞/毫升发酵产物。
适当地，发酵产物(优选发酵物)可基本上不含活的细菌细胞，通常包含小于约102个活细胞/毫升发酵产物。
适当地，发酵产物(优选发酵物)可基本上不含活的细菌细胞，通常包含小于约10个活细胞/毫升发酵产物。
适当地，发酵产物(优选发酵物)可基本上不含活的细菌细胞，通常包含零个(或基本上零个)活细胞/毫升发酵产物。
在一些方面，术语“无细胞”是指发酵产物基本上不含活孢子以及活细胞，通常包含小于约105个活孢子/毫升发酵产物，小于约104个活孢子/毫升发酵产物，小于约103个活孢子/毫升发酵产物，小于约102个活孢子/毫升发酵产物，或小于约10个活孢子/毫升发酵产物。优选地，发酵产物基本上不含孢子，通常包含小于约105个孢子/毫升发酵产物，小于约104个孢子/毫升发酵产物，小于约103个孢子/毫升发酵产物，小于约102个孢子/毫升发酵产物，或小于约10个孢子/毫升发酵产物。
适当地，发酵产物(优选发酵物)可基本上不含活孢子，通常包含小于约102个活孢子/毫升发酵产物。
适当地，发酵产物(优选发酵物)可基本上不含活孢子，通常包含小于约10个活孢子/毫升发酵产物。
适当地，发酵产物(优选发酵物)可基本上不含活孢子，通常包含零个(或基本上零个)活孢子/毫升发酵产物。
在一个方面，本文所用的术语“无细胞”是指发酵产物(优选发酵物)基本上不含活的细菌细胞和活孢子，通常包含小于约105个活的细菌细胞和活孢子/毫升发酵产物，小于约104个活的细菌细胞和活孢子/毫升发酵产物，小于约103个活的细菌细胞和活孢子/毫升发酵产物，小于约102个活的细菌细胞和活孢子/毫升发酵产物，或小于约10个活的细菌细胞和活孢子/毫升发酵产物。优选地，发酵产物基本上不含细胞和/或孢子，通常包含小于约105个细胞和/或孢子/毫升发酵产物，小于约104个细胞和/或孢子/毫升发酵产物，小于约103个细胞和/或孢子/毫升发酵产物，小于约102个细胞和/或孢子/毫升发酵产物，或小于约10个细胞和/或孢子/毫升发酵产物。
适当地，发酵产物(优选发酵物)可基本上不含活的细菌细胞和活孢子，通常包含小于约102个活细胞和/或活孢子/毫升发酵产物。
适当地，发酵产物(优选发酵物)可基本上不含活的细菌细胞和活孢子，通常包含小于约10个活细胞和/或活孢子/毫升发酵产物。
适当地，发酵产物(优选发酵物)可基本上不含活的细菌细胞和活孢子，通常包含零个(或基本上零个)活细胞和/或活孢子/毫升发酵产物。
在一些方面，可对本发明的发酵产物(优选地发酵物)进行处理(如，热处理或辐射)，使得无细胞或孢子或其组合保持活性。
本文所用的术语“活的”是指具有代谢活性或能够分化的微生物细胞或孢子。因此，当孢子是休眠的并能够萌发时，它们是“活的”。
本文所用的术语“抗污染组合物”和“抗污染剂”是指在使用中可抵抗(即，反作用于、妨碍、对抗、减少、防止或抑制)病原微生物的生长和/或在使用中可抵抗(如，减少或防止或抑制)产品的腐败(优选地，微生物腐败)的任何组合物/试剂。因此，“抗污染”可为抗病原和/或抗腐败的。在一些方面，“抗污染组合物”可为延长货架期的组合物。
本文所用的术语“污染物”是指任何微生物，例如病原微生物和腐败微生物。在一个方面，术语“污染物”是指病原微生物和/或腐败微生物。
术语“腐败微生物”是指在外观、味道、气味和产品其他特性方面造成有害变化(优选地由微生物生长引起)的微生物。“腐败微生物”可存在于产品使用期的任何时间点，例如源自下列的一种或多种：从中获得产品的环境和/或处于原料或未加工状态(如，产品天然状态)的产品的微生物学特性和/或任何处理和/或加工步骤和/或包装的有效性/无效性和/或产品的储存条件。
术语“病原微生物”是指能够使人和/或动物发病的微生物。“病原微生物”可存在于产品使用期的任何时间点，例如源自下列的一种或多种：从中获得产品的环境和/或处于原料或未加工状态(如，产品天然状态)的产品的微生物学特性和/或任何处理和/或加工步骤和/或包装的有效性/无效性和/或产品的储存条件。
本文所用的术语“抑制”是指当与不存在抗污染剂/组合物的情况下的污染微生物的生长或存活相比时破坏、防止、控制、降低、减缓或以其它方式干扰污染微生物的生长或存活。在一个方面，“抑制”是当与不存在抗污染剂/组合物的情况下的污染微生物的生长或存活相比时破坏、防止、控制、降低、减缓或以其它方式干扰污染微生物的生长或存活至少约5％至至少约100％，或例如至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或100％之间的任何值。在另一个方面，“抑制”是当与不存在抗污染剂/组合物的情况下的污染微生物的生长或存活相比时破坏、防止、控制、降低、减缓或以其它方式干扰污染微生物的生长或存活至少约1倍或更多，例如约1.5倍至约100倍，或例如至少约2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95倍之间的任何值。
本文所用的与微生物污染物相关的术语“减小”是指当与未施加抗污染或抗微生物剂的对照产品相比时微生物生长的水平和/或产品腐败的速度减小。在一个方面，术语“减小”和“减小的”可与术语“抑制”和“抑制的”互换使用。
在一个方面，本文所用的术语“防止”是指包含本发明的抗污染组合物的产品或施加本发明的抗污染组合物的产品受微生物污染时在存在特定量的污染物之前具有延长的货架期和/或增加的时间期限。在一个实施例中，当与不具有所施加的抗污染组合物或抗微生物剂的对照产品相比时货架期和/或时间期限延长和/或增加。
例如，当污染物是病原微生物(如，病原细菌)时，“污染物的特定量”可以是例如FDA认为产品使用不安全的水平。在一些情况下，取决于病原微生物，污染物的特定量可以是零。当病原微生物是例如李斯特菌菌种时，这可能是如此。在其他情况下，污染物的特定量可小于约100CFU/g或mL或者小于约10CFU/g或mL，例如当病原细菌是例如大肠杆菌菌种时。
当污染物是非病原腐败细菌时，“特定量的污染物”可以是感官条件不再可接受的水平或者消费者可见产品腐败的水平。特定的量可取决于微生物。然而，在一些情况下，其可为如103或104CFU/g或CFU/mL的存在量。
菌株
至少一种芽孢杆菌属(如，枯草芽孢杆菌)菌株用来生成用于本文所公开的组合物、方法和用途的发酵产物。适当地，至少一种菌株可为选自如下的枯草芽孢杆菌菌株：3A-P4(PTA-6506)；15A-P4(PTA-6507)；22C-P1(PTA-6508)；LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-50105)；BS 18(NRRL B-50633)；BS 2084(NRRL B-500130)以及ABP 278(NRRL B-50634)。
现有技术的一些建议是，可将枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)；15A-P4(PTA-6507)；22C-P1(PTA-6508)；LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-50105)；BS 18(NRRL B-50633)；BS 2084(NRRL B-500130)以及ABP 278(NRRL B-50634)重新分类为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subspecies plantarum)。为避免疑义，如果这些菌株中的任何一种重新分类为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens)，此类菌株(一种或多种)仍然被本发明涵盖。
菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)和22C-P1(PTA-6508)可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)公开获得。
菌株2084(NRRL B-500130)和LSSA01(NRRL-B-50104)可从美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，NRRL)公开获得。菌株枯草芽孢杆菌LSSA01有时候称为枯草芽孢杆菌8或BS8。
这些菌株在US 7,754,469 B2中进行了教导。
枯草芽孢杆菌BS 18和枯草芽孢杆菌BS 278分别以保藏号NRRL B-50633和NRRL B-50634由美国(W227 N752 Westmound Dr.Waukesha，WI53186)的Andy Madisen或美国(W227 N752 Westmound Dr.Waukesha，WI53186)的丹尼斯克美国公司(Danisco USA Inc.)于2012年1月9日按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏于美国(1815North University Street，Peoria，Illinois 61604)的美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection，NRRL)。菌株BS 278在本文也称为ABP 278。
美国(W227 N752 Westmound Dr.Waukesha，WI 53186)的Andy Madisen和美国(W227 N752 Westmound Dr.Waukesha，WI 53186)的丹尼斯克美国公司授权丹麦的杜邦营养生物科学公司(以前的丹尼斯克公司)(Langebrogade 1，PO Box 17，DK-1001，Copenhagen K)在本专利申请中参考这些保藏的生物材料并且无保留地且不可撤销地同意将所述保藏材料成为可公共获得的。
在一个方面，多种枯草芽孢杆菌菌株用来生成用于本文所公开的组合物、方法和用途的发酵产物。适当地，所述多种枯草芽孢杆菌菌株可选自3A-P4(PTA-6506)；15A-P4(PTA-6507)；22C-P1(PTA-6508)；LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-50105)；BS 18(NRRL B-50633)；BS2084(NRRL B-500130)以及ABP 278(NRRL B-50634)。
适当地，可使用两种或更多种枯草芽孢杆菌菌株。适当地，所使用的枯草芽孢杆菌菌株中的至少两种包括下表中详述的组合的任何一种：
适当地，可使用下列枯草芽孢杆菌菌株中的三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种、或所有六种：3A-P4(PTA-6506)；15A-P4(PTA-6507)；22C-P1(PTA-6508)；LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-50105)；BS 18(NRRL B-50633)；BS 2084(NRRL B-500130)以及ABP 278(NRRL B-50634)。
适当地，可使用下列枯草芽孢杆菌菌株中的一种或多种：LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-50105)；BS 18(NRRL B-50633)；BS2084(NRRL B-500130)以及ABP 278(NRRL B-50634)。
在一些方面，附加细菌和/或真菌菌株可用于发酵产物的培养。在一些方面，无附加细菌和/或真菌菌株可用于细菌产物的培养。
培养菌株以制备发酵物
可将一种或多种菌株培养在有利于制备一种或多种目标化合物的条件下。
用于培养细胞的培养基可为适于生长所讨论芽孢杆菌菌株和获得包含目标化合物的发酵产物的任何常规培养基。
培养可在存在一种或多种底物(如，可发酵底物)的情况下、在所存在的底物上或在所存在的底物中进行。
可发酵底物为包含可通过本文所公开的细菌的酶促作用转变(即，转化为另一种化合物)的有机化合物，例如碳水化合物的材料。
底物的例子包括但不限于脱脂干奶粉、蔬菜(如，玉米、马铃薯、卷心菜)、淀粉、谷粒(如，水稻、小麦、大麦、蛇麻子)、水果(如，葡萄、苹果、橙子)、糖、甘蔗、肉(如，牛肉、家禽肉、猪肉、腊肠)、心浸液、培养的右旋糖、其组合等、以及含有最适生长所需的蛋白质、碳水化合物和矿物的合适培养基。非限制性示例性培养基为TSB或CASO肉汤。
在一个方面，底物可包括淀粉、大豆、酵母提取物和盐中的一种或多种。
在一个方面，生长培养基可为CASO肉汤。在另一个方面，生长培养基可为TSB肉汤。
枯草芽孢杆菌菌株的培养可进行有利于制备目标化合物的任何合适时间。例如，培养可进行约1至约72小时(h)、约5至约60小时、或约10至约54小时或24至48小时。在一个方面，培养可适当地进行约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、42、48、54、60小时，其中所述值中的任何一个可在适当时构成上或下端点。在另一个方面，培养的时间可大于或等于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60小时。在又一个方面，培养的时间可小于或等于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、606小时。在又一个方面，适当地，培养进行大约24至48小时。
适当地，培养进行大约20至30小时。
在一个方面，可以进行培养直至发生营养物质枯竭(优选全部营养物质)。
在一个方面，培养持续一段有效时间以达到细菌生长的稳定期。
在培养过程中的温度可以从约20至约55℃，从约25至约40℃，或从约30至约35℃。在一个方面，在培养过程中的温度可以从约20至约30℃，从约30至约40℃，或从约40至约50℃。在另一个方面，培养可在约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、或55℃的温度下进行，其中所述值中的任何一个可在适当时构成上或下端点。在又一个方面，培养可在大于或等于约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、或55℃的温度下进行。在又一个方面，培养可在小于或等于约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、或55℃的温度下进行。
在一个方面，培养可在约30至约35℃下进行。在另一个方面，培养可在约32℃下进行。
在一个方面，优选地可在通气条件下进行培养。适当地，通气的水平受到控制。通气水平可表示成溶解氧分压(DOT)，其中DOT是培养物中氧饱和度的百分比(如，100％DOT是指培养物完全被氧饱和)。DOT可按照以引用方式并入本文的Suresh et al.“Techniques for oxygen transfermeasurement in bioreactors：a review”J Chem Technol Biotechnol 2009；84：1091-1103(Suresh等人，“生物反应器中氧传递测量的技术：综述”，《化学技术与生物技术杂志》，2009年，第84卷，第1091-1103页)(以及其中的参考文献)所教导，或按照以引用方式并入本文的Bailey J，BaileyJ，Ollis D，“Biochemical Engineering Fundamentals”，2nd edition，McGraw-Hill，ISBN 0070032122(Bailey J、Bailey J、Ollis D，“生化工程基本原理”，第2版，麦克劳希尔出版社，ISBN 0070032122)(以及其中的参考文献)所教导进行测量。
适当地，培养不在氧含量受限的条件下进行。适当地，通气水平使得培养物中的氧含量大于约20％DOT、大于约30％DOT、大于约40％DOT、大于约50％DOT、大于约60％DOT、大于约70％DOT、大于约80％DOT或大于约90％DOT。在一些方面，通气水平使得培养物中的通气水平为约100％DOT。
适当地，通气水平使得培养物中的氧含量可介于约25％与50％DOT之间。
可通过任何合适方法提供该通气。
在一些实施例中，可通过使空气与培养物混合的任何方式提供该通气。因此，可通过搅动(如，摇动、振荡、搅拌等)或通过使空气(如，氧气)穿过例如培养基或其组合来提供该通气。
表示成vvm(气体体积/液体体积/分钟)的通气速率可按照例如以引用方式并入本文的Bailey J，Bailey J，Ollis D，“Biochemical EngineeringFundamentals”，2nd edition，McGraw-Hill，ISBN 0070032122(Bailey J、Bailey J、Ollis D，“生化工程基本原理”，第2版，麦克劳希尔出版社，ISBN 0070032122)(以及其中的参考文献)所教导进行测量。
在一些实施例中，通气速率可在约0.1至约6vvm的范围内。在通过搅动(如，在搅拌的发酵罐中)提供通气的情况下，则通气速率可在约0.1至约3vvm的范围内。在通过使空气穿过培养基(如，在气升发酵罐中)提供通气的情况下，则通气速率可在约3至约6vvm的范围内。
在一个实施例中，可使用被设计或成形用于支持或提供通气的培养容器。适当地，培养容器可包括一个或多个挡板。挡板的目的可以是促使培养基暴露于氧气(如，空气)。例如，带有挡板的培养容器可与培养容器的摇动或振荡联合使用。仅以举例的方式，培养容器可为US 7,381,559(其主题以引用方式并入本文)中所描述的容器。
适当地，可搅动培养基。这可受到任何常规方式的影响。不希望受理论束缚，当与未搅动的培养基相比时，培养基的搅动可具有多种有益效果，包括但不限于：生长提高和/或细胞结团减少和/或营养物(如，碳水化合物)混合增加和/或营养物分布更佳和/或蛋白质产量增加和/或初级代谢物产量增加和/或次级代谢物产量增加等。在一个方面，搅动培养基所得到的有益效果可由培养基内的湍流形成(如，通过搅拌)所引起。在一个实施例中，搅动可为搅拌。在另一个实施例中，搅动可为摇动或振荡。
在一个方面，通过振荡(如，通过旋转摇动)来搅动培养基。适当地，旋转速度可处于约50至约250rpm、约60rpm至约240rpm、约70rpm至约230rpm、约80rpm至约220rpm、约80rpm至约210rpm、或约90rpm至约200rpm。
适当地，旋转速度可处于约100rpm至约150rpm。
适当地，旋转速度可处于约130rpm。
优选地，培养基被搅动以增加培养基中的通气水平和/或增加培养基中的营养物混合。
已发现培养混合物的通气和/或搅动可导致所产生的发酵物的显著改善。不希望受理论束缚，该改善可通过如下引起：确保培养容器中的细胞密度或细胞团块使得在发酵物中细菌的蛋白质产量和/或初级代谢物产量增加。
在一个方面，培养基可通过搅拌进行搅动。搅拌速度可适当地大于约50rpm，例如介于约50rpm至约1200rpm之间。
可搅拌培养基的速率可取决于适用培养目的的容器。如果包含培养基的容器是小发酵罐(如，小于500L，例如约100至约500L或甚至小于20L)，则搅拌的速度可为例如至少约100rpm至约1200rpm。在一些方面，搅拌的速度可大于约1200rpm。如果包含培养基的容器是工业规模发酵罐(如，大于500L，例如约500至约20,000L)，则搅拌的速度可为例如至少约50rpm至约150rpm或可大于约150rpm。
在另一个方面，在培养过程中培养基的搅动可表示成例如由搅动输入的动力。由搅动输入的动力是每升液体体积所提供的能量数量的表示。由搅动输入的动力可通过首先使用下式确定动力(单位：牛顿)来计算：
P0＝N0ρN3D5
其中：N0为无量纲数(牛顿数)；ρ为液体密度(kg/m3)；N(s-1)为旋转频率并且D为叶轮直径(m)。P0是培养物未通气时搅拌器所牵引的动力。在存在通气的情况下由搅动输入的动力的计算在以引用方式并入本文的Olmos etal.“Effects of bioreactor hydrodynamics on the physiology of Streptomyces”，Bioprocess Biosyst Eng，2012 Aug 25(Olmos等人，“生物反应器流体力学对链霉菌属的生理学的效应”，《生物工艺与生物系统工程》，2012年8月25日)以及其中的参考文献中教导。
在一个方面，在培养过程中每体积由搅动输入的动力可为至少约0.25kW/m3。
适当地，每体积由搅动输入的动力可在约0.25kW/m3至约6kW/m3的范围内。
在另一个方面，每体积由搅动输入的动力可在约0.25kW/m3至约3kW/m3的范围内。
在另一个方面，培养物体积与容器体积之比可小于约1∶1体积比，如，1∶2、1∶3等。
在一些方面，培养物体积与容器体积之比可小于约1∶1体积比、1∶2体积比、1∶3体积比、1∶4体积比、1∶5体积比、1∶6体积比、1∶7体积比、1∶8体积比、1∶9体积比、或1∶10体积比。
在一些方面，培养物体积与容器体积之比可在约1∶1体积比至约1∶10体积比的范围内，适当地在1∶3体积比至约1∶7体积比的范围内。
在一些方面，培养物体积与容器体积之比可为约1∶1体积比、1∶2体积比、1∶3体积比、1∶4体积比、1∶5体积比、1∶6体积比、1∶7体积比、1∶8体积比、1∶9体积比、或1∶10体积比。
适当地，培养物体积与容器体积之比可为约1∶5体积比。
在一个方面，与容器体积相比，培养物体积可例如小于约100％、小于约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％或小于约30％。
在另一个方面，培养物体积可例如在容器体积的约60％至约90％的范围内。
适当地，培养物体积可例如在容器体积的约70％至约85％的范围内。
在培养过程中的pH可以为从约5至约9、从约5至约6、从约6至约7、从约7至约8、或从约8至约9的pH。在另一个方面，培养可在约5、6、7、8、9的pH下进行，其中所述值中的任何一个可在适当时构成上或下端点。在一个方面，在培养过程中，pH为约7与约8之间、从约7至约7.5、从约7.1至约7.3之间的pH。在一个方面，在约pH 7.3下进行培养。
作为另外一种选择或除此之外，可在培养后将pH调节至从约6至约10、或从约8至约10、或从约9至10的pH。适当地，可将pH从约pH 8调节至约pH 9。适当地，可将pH调节至约pH 9。
在一些方面，可使用碱增加pH。适当地，可使用氢氧化钾(KOH)。
适当地，在细菌细胞和培养基分离(如，通过离心)后调节pH。适当地，调节的是上清液的pH。
在一个方面，培养步骤包括在培养阶段中培养条件的一种或多种调节(例如，pH、温度和/或底物的调节)。不希望受理论束缚，在培养过程中调节培养条件(如，pH、温度和/或底物)可增加培养过程中产生的目标化合物的数量。例如，初始培养条件可有利于产生一种目标化合物，并且培养条件的调节可提供产生另一种目标化合物的有利条件。
因此，例如，在培养过程中，约pH 5的初始pH可产生一种目标化合物。在相同培养过程中pH后续调节至pH 7可导致产生另一种目标化合物。
分批和连续培养是本领域的普通技术人员已知的。可使用分批或连续培养来制备包含目标化合物(一种或多种)的本发明发酵产物或其一部分。适当地，可在培养过程中或在培养过程结束时收获发酵产物或其一部分。
在一个方面，在指数期内或在指数期结束时收获本发明的发酵产物。在一个方面，在稳定期或在稳定期内收获本发明的发酵产物。
在本发明的一个方面，可以在商业条件下在大桶中制备发酵产物。
可在合适时间点收获本发明的发酵产物以增加发酵产物中的具体目标化合物的产量。例如，不希望受理论束缚，当芽孢杆菌菌株培养在复合培养基中时，在培养指数期结束时收获可得到具有最佳量的发酵产物或一种或多种目标化合物例如杆菌溶素。
在一个方面，可在抗污染组合物或无细胞发酵产物(如，其至少一种样品)产生在通过“平板扩散测定法”测量时所观察到的至少约2mm的抑菌区/圈时，收获本发明的抗污染组合物。“平板扩散测定法”是本文中名称为““平板扩散测定法“方案”的部分中定义的。适当地，可在抗污染组合物(如，其至少一种样品)产生在通过“平板扩散测定法”测量时所观察到的至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mm的抑菌区/圈时，收获抗污染组合物。
在一个方面，可在抗污染组合物或无细胞发酵产物(如，其至少一种样品)在“抑制肉汤测定法”中具有至少约20％抑制时，收获本发明的抗污染组合物。“抑制肉汤测定法”是本文中名称为““抑制肉汤测定法”方案”的部分中定义的。适当地，可在抗污染组合物(如，其至少一种样品)在“抑制肉汤测定法”中具有至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或100％抑制时，收获抗污染组合物。
在另一个方面，可在抗污染组合物或无细胞发酵产物(如，其至少一种样品)在通过“有效浓度测定法”测量时具有至少约100％(体积比)的有效浓度时，收获本发明的抗污染组合物。“有效浓度测定法”是本文实例8中名称为““有效浓度测定法”方案”的部分中定义的。适当地，可在抗污染组合物(如，其至少一种样品)在通过“有效浓度测定法”测量时具有至少约100％(体积比)、至少约90％(体积比)、至少约80％(体积比)、至少约70％(体积比)、至少约60％(体积比)、至少约50％(体积比)、至少约40％(体积比)、至少约30％(体积比)、至少约20％(体积比)或至少约10％(体积比)的有效浓度时，收获抗污染组合物。适当地，抗污染组合物(如，其至少一种样品)在通过“有效浓度测定法”测量时可具有小于约10％(体积比)的有效浓度。
在一个方面，可在观察到下列不止一种(优选所有三种)时，收获本发明的抗污染组合物：抗污染组合物产生在通过“平板扩散测定法”测量时观察到至少约2mm的抑菌区/圈；抗污染组合物在“抑制肉汤测定法”中具有至少约20％抑制；或抗污染组合物在通过“有效浓度测定法”测量时具有至少约100％(体积比)的有效浓度。
在一个方面，在培养过程中(如在发酵过程中)搅动和/或搅拌培养物。
在一个方面，在培养过程中监测和/或控制充氧水平。
有利于产生目标化合物的培养条件的例子在实例1、8、9和10中提供。
将一个或多个细胞和/或孢子与发酵产物分离
在一个方面，可将一个或多个细胞和/或一个或多个孢子与发酵产物(如发酵物)分离。可以通过本领域中已知的任何方法，包括通过离心和/或过滤完成此类分离。例如，可以过滤发酵产物(在多步骤过程中过滤一次或若干次)以移除如颗粒物、细胞、孢子等此类组分。作为另外一种选择或除此之外，可以通过离心将一个或多个细胞和/或多个孢子中的一个与发酵产物(如发酵物)分离，从而制备上清液。根据离心的速度和持续时间，上清液可以不含细胞(即，无细胞上清液)，或上清液可以包含细胞，可以将包含细胞的上清液进行过滤或进一步离心以提供无细胞上清液。
在一个方面，分离的方法是或包括离心。
离心是本领域熟知的。离心可在例如约5,000rpm、10,000rpm、15,000rpm、20,000rpm、25,000rpm、或30,000rpm下进行。在一个方面，离心的速度可为至少约5,000rpm。
适当地，离心可在约5,000rpm至约15,000rpm之间进行。
在一个方面，离心可在约5,000×g至约15,000×g下、或在约10,000×g至约20,000×g下进行。
适当地，离心可在约9,000×g至约12,000×g下进行。适当地，在约11,000×g至约14,000×g下。
离心的时间可为约5分钟至1小时、约10分钟至约45分钟、或约30分钟。在一个方面，离心的时间为至少约10分钟、或至少约15分钟。
适当地，离心的时间可为约20至40分钟。
在另一个方面，离心的时间可为约5至约15分钟。
在一些方面，使用相同或不同的离心条件进行离心两次或更多次。
在一个方面，可通过过滤将一个或多个细胞和/或一个或多个孢子与发酵物或上清液(如，离心后)分离。可使用各种过滤器过滤包含细胞和/或孢子的发酵物或上清液。例如，孔径为约0.01至约1μm、约0.05至约0.5μm、或约0.1至约0.2μm的微量过滤器。在另一个方面，过滤器可具有约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、0.9、或1μm的孔径，其中所述值中的任何一个可在适当时构成上或下端点。在又一个方面，过滤器可具有大于或等于约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、0.9、或1μm的孔径。在又一个方面，过滤器可具有小于或等于约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、0.9、或1μm的孔径。在另外一个方面，过滤器可具有约0.2μm的孔径，例如可购自马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore(Billerica，Mass.))。发酵物可在一个方面用灭菌过滤器进行过滤。
在一个方面，发酵物或上清液可例如用灭菌过滤器进行过滤。适当地，过滤器(如，灭菌过滤器)可具有约0.1μm至约0.3μm的孔径。适当地，过滤器可具有约0.2μm的孔径。所得产物可视为根据本发明的无细胞发酵产物。
适当地，可冻干根据本发明的抗污染组合物或无细胞发酵物。可通过任何合适的冻干程序进行冻干。冻干可进行约1小时至约10天，约1天至约8天，适当地约1天至约5天。
在一个方面，用于培养一种或多种菌株以获得本发明的无细胞发酵产物和/或抗污染组合物的方法包括如下步骤：
(a).用根据本发明的一种或多种菌株接种任何合适的液体生长培养基(如，CASO肉汤)(如，其中液体生长培养基体积与容器体积之比介于约1∶1体积比至约1∶7体积比之间)，并且在通气(如，在100rpm至约150rpm下旋转摇动)的情况下，在约25℃至约40℃，如32℃下温育(适当地温育约20至约35小时，如24小时)。
(b).将步骤(a)的组合物离心至少一次(如，在约9,000×g至约12,000×g之间、或约11,000×g至约14,000×g之间离心约20分钟至约40分钟之间，或者在约5,000rpm至约15,000rpm之间离心约5分钟至约15分钟之间)以获得上清液；
(c).例如通过添加碱(如，KOH)将步骤(b)中的上清液的pH调节至约pH 8至约pH 10之间，如pH 9；以及
(d).将约600ppm至约900ppm的抗氧化剂添加至步骤(c)的上清液，其中上清液的pH介于约pH 7与pH 10之间；
(e).过滤(如，过滤灭菌)步骤(d)的上清液；
(f).冻干步骤(e)的所得产物(如，无细胞发酵产物)；
其中步骤(c)、(d)和(f)可以是任选的，并且步骤(d)可在步骤(c)之前进行。
在根据本发明的任何方法中可以是任选的其他步骤可为如下：
(a).在任何合适生长培养基中或之上恢复一种或多种菌株，如在有氧的情况下将一种或多种菌株在任何合适琼脂上于约30℃至约35℃下温育约20至约35小时(例如，如果一种或多种菌株以冻存液保存，则这可能是必要的)。
(b).将步骤(a)的一种或多种菌株的一种或多种菌落接种在任何合适的液体生长培养基中(适当地，生长培养基体积与容器体积之比介于约1∶3体积比至约1∶7体积比之间)；
(c).在通气(如，在约100rpm至约150rpm下旋转摇动)的情况下，将步骤(b)的培养物在约25℃至约40℃下温育约20至约35小时；和
(d).使用该培养物或其一部分作为起始培养物(如，以诱导不同(如，较大)培养物或培养容器中的细菌生长)。
使一个或多个细胞和/或孢子失活
用于使活细胞失活的方法是本领域熟知的并且包括热处理和辐射。可以采用使活细胞失活的任何已知方式，前提条件是其不会也使根据本发明的一种或多种目标化合物失活。
在一个方面，可使用热处理来实现活细胞的失活。热处理的合适方法是本领域已知的并且包括下列条件：
·LTLT巴氏灭菌(如，63℃持续30分钟)；
·HTST巴氏灭菌(如，72-75℃持续15-20秒或＞80℃持续1-5秒)；
·超巴氏灭菌(如，125-138℃持续2-4秒)；
·UHT流灭菌(如，135-140℃持续1-2秒)，以及
·容器中的灭菌(如，115-120℃持续20-30分钟)。
热处理的此类方法可与真空或减压相结合。
在一个方面，可使用热处理，例如使用以上提供的UHT流灭菌或容器中的灭菌条件，来实现孢子的失活。
孢子的分离和/或失活可通过在包含细胞和孢子的团粒的离心和排出之后对培养上清液过滤灭菌来进行。
作为另外一种选择或除此之外，可使用双重巴氏灭菌。例如，这可包括第一巴氏灭菌步骤(如，使用以上提供的UHT流灭菌或容器中的灭菌条件)，在一定温度下并在一段时间内温育产品，从而诱导孢子萌发；以及第二巴氏灭菌以使细胞的新繁殖体加热失活。
目标化合物
可将一种或多种菌株培养在有利于制备一种或多种目标化合物的条件下。
该语境下的术语“目标化合物”是指具有抗污染效果的任何化合物。“目标化合物”包括脂肽(如，表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素或其组合)、聚酮化合物(如，地非西丁、大环内酰亚胺、bacillaene或其组合)、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物以及LCI的同源物
以举例的方式，“目标化合物”可包括非核糖体肽、聚酮化合物和核糖体依赖性化合物，包括下列化合物：地非西丁、表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin(小菌素)、大环内酰亚胺、bacillaene和LCI、或其同源物或其类似物。在一些方面，目标化合物为地非西丁、表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin(小菌素)、大环内酰亚胺、bacillaene和LCI、或其同源物或其类似物。
本文所用的术语“类似物”是结构类似于选自下列的一种或多种化合物的化合物：地非西丁、表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin(小菌素)、大环内酰亚胺、bacillaene、LCI，但在一个或多个原子、官能团、或亚结构方面与所述化合物(一种或多种)不同的化合物。在一个实施例中，所述一个或多个原子、官能团、或亚结构可被替换为一个或多个不同原子、基团(如，官能团)、或亚结构。在一个实施例中，所述类似物为抗污染剂(如，抗微生物剂)。适当地，与其所类似的化合物相比，所述类似物具有相同或类似或更好的抗污染活性。
在一个实施例中，所述类似物是非核糖体肽(如，表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素、嗜铁素、杆菌溶素、或抗荚膜菌素)和/或聚酮化合物(如，地非西丁、大环内酰亚胺或bacillaene)的类似物。
在另一个实施例中，所述类似物是核糖体依赖性化合物(如，plantazolicin或LCI)的类似物。
plantazolicin类似物例如是指结构类似于plantazolicin的肽和/或结构与plantazolicin重叠的肽，例如：从plantazolicin缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的肽；从plantazolicin的氨基酸保守置换一个或多个氨基酸的肽；plantazolicin的修饰形式；具有plantazolicin活性的plantazolicin片段；以及具有plantazolicin活性的延长plantazolicin等。
LCI类似物例如是指结构类似于LCI的肽和/或结构与LCI重叠的肽，例如：从LCI缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的肽；从LCI的氨基酸保守置换一个或多个氨基酸的肽；LCI的修饰形式；具有LCI活性的LCI的片段；以及具有LCI活性的延长LCI等。
在一个方面，发酵产物和/或抗污染组合物包含以约50ppm至约1000ppm、约75至约950ppm、或约100至约900ppm范围存在的目标化合物(一种或多种)，其中所列举的值是针对每个目标化合物而言的或针对目标化合物的合计总数而言的。在一个方面，发酵产物和/或抗污染组合物包含以50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ppm的量存在的一种或多种目标化合物，其中所述值中的任何一个可在适当时构成上或下端点并且其中所列举的值是针对每个目标化合物而言的或针对目标化合物(一种或多种)的合计总数而言的。在又一个方面，发酵产物和/或抗污染组合物包含以50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ppm的量存在的一种或多种目标化合物，其中所列举的值是针对每个目标化合物而言的或针对目标化合物的合计总数而言的。
在一个方面，所述培养条件产生约2至11或约2至约8或约2至4种目标化合物。在一个方面，所述培养条件产生大于或等于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种目标化合物。在又一个方面，所述培养条件产生小于或等于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种目标化合物。
在一个方面，产生地非西丁和/或发酵产物包含地非西丁。
适当地，可将一种或多种菌株培养在导致产生多种目标化合物的条件下。
在一个方面，所述培养条件能有效产生具有抗革兰氏阴性细菌的抗污染活性的至少一种目标化合物。在一个方面，所述培养条件能有效产生具有抗革兰氏阳性细菌的抗污染活性的至少一种目标化合物。在一个方面，所述培养条件产生具有抗真菌的抗污染活性的至少一种目标化合物。
适当地，单独或组合的目标化合物(一种或多种)可具有抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌及其组合的广谱活性。
如果单独或组合时一种目标化合物具有(或多种目标化合物具有)抗来自大于或等于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50或60种不同属的一种或多种微生物的抗污染活性，则其具有“广谱活性”。作为另外一种选择或除此之外，如本文所用，如果单独或组合使用时目标化合物(一种或多种)具有抗革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌；或革兰氏阴性细菌和真菌；或革兰氏阳性细菌和真菌；或革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌及真菌的抗污染活性，则其具有“广谱活性”。
在一个方面，如果按照“平板扩散测定法”方案观察到至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mm的抑菌区/圈，则目标化合物具有抗微生物的抗污染活性。
在一个方面，如果在“抑制肉汤测定法”中具有至少约20％抑制活性，则目标化合物具有抗微生物的抗污染活性。适当地，如果观察到至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或100％抑制时，则目标化合物具有抗微生物的抗污染活性。
在一个方面，如果具有通过“有效浓度测定法”测得的至少约100％(体积比)的有效浓度，则目标化合物具有抗微生物的抗污染活性。适当地，如果具有通过“有效浓度测定法”测得的至少约100％(体积比)、至少约90％(体积比)、至少约80％(体积比)、至少约70％(体积比)、至少约60％(体积比)、至少约50％(体积比)、至少约40％(体积比)、至少约30％(体积比)、至少约20％(体积比)或至少约10％(体积比)的有效浓度，则目标化合物具有抗微生物的抗污染活性。适当地，如果具有通过“有效浓度测定法”测得的小于约10％(体积比)的有效浓度，则目标化合物可具有抗微生物的抗污染活性。
适当地，如果其具有不止一种、优选地所有三种下列活性，则目标化合物具有抗微生物的抗污染活性：如果按照“平板扩散测定法”方案观察到至少2mm的抑菌区；“抑制肉汤测定法”中的至少约20％抑制；通过“有效浓度测定法”测得的至少约100％(体积比)的有效浓度。
本发明的组合物和/或发酵产物包含至少一种目标化合物。在一个方面，“化合物”或“目标化合物”可为地非西丁、表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin(小菌素)、大环内酰亚胺、bacillaene，LCI或其同源物或其类似物、或其任何组合。
在一个方面，本文提及的组合物和/或发酵产物包含至少一种非核糖体肽(NRP)和/或本文教导的培养枯草芽孢杆菌菌株的方法有利于产生至少一种NRP。NRP的例子包括：表面活性素、芽孢菌霉素D、丰原素、嗜铁素和杆菌溶素、抗荚膜菌素、或其同源物或其类似物。在该方面，可使用NRP的任何组合。
有利地，NRP可能具有抗污染微生物的广谱活性。
有利地，已惊奇地发现枯草芽孢杆菌菌株15A-P4、2C-P1、3A-P4和LSSA01例如在适当培养条件下可产生下列NRP：表面活性素、芽孢菌霉素D、丰原素、嗜铁素和杆菌溶素、抗荚膜菌素。
在一个方面，本发明的组合物和/或发酵产物包含至少1、2、3、4、5或6种NRP和/或培养枯草芽孢杆菌菌株的方法可产生至少1、2、3、4、5或6种NRP。
在一个方面，目标化合物可为脂肽。如本文所用，“脂肽”包括具有由β-氨基或β-羟基脂肪酸和肽部分组成的环状结构的化合物。氨基酸序列和脂肪酸分支可将脂肽分组为3个家族-表面活性素家族、伊枯草菌素A家族(包括诸如芽孢菌霉素和抗霉枯草菌素的脂肽)以及丰原素家族(Romero等人，2007)。
表面活性素是生物表面活性剂并表现出大体广谱的抗微生物活性。例如，表面活性素可具有抗细菌(革兰氏+/-)、真菌和病毒的效用。Peypoux等人(1999)公开了表面活性素的遗传学、化学和乳化特性相关的信息。
铁和锰对表面活性素的产生可具有刺激效应(Cooper等人，1981)。Peypoux等人(1999)综述称，为使产量优化，数年来一直在研究不同发酵培养基组成，但收效有限。相比之下，氧气限制似乎促进了成分限定的基础培养基中表面活性素的产生(Kim等人，1997)。
芽孢菌霉素D属于具有主要抗真菌活性的伊枯草菌素家族。其具有溶血性并且也可具有一些抗细菌活性。
丰原素可具有抗丝状真菌的特异活性并且可抑制磷脂酶A2。丰原素可与芽孢菌霉素D协同抵抗真菌。
杆菌溶素具有广谱的抗细菌活性(革兰氏+/-)并且也具有一定的抗酵母活性(如，抗白色念珠菌(Candida albicans))。杆菌溶素是一种抗微生物二肽，据报道，其具有抗金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)、表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)、四联微球菌NCTC7501(Micrococcus tetragenusNCTC7501)、干燥棒杆菌NCTC7243(Corynebacterium xerosisNCTC7243)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium de Bary)、藤黄八叠球菌NCTC 8340(Sarcina lurea NCTC 8340)、鼠伤寒沙门氏菌(Salm.typhi)、鸡沙门氏菌(Salm.gallinarum)、粘质沙雷氏菌(Ser.marcescens)和普通变形菌NCTC 4636(Proteus vulgaris NCTC 4636)以及白色念珠菌的抗微生物活性。在低限琼脂上，大肠杆菌对杆菌溶素高度敏感(Kenig和Abraham，1976)。针对植物病原细菌的测试证实，粗提杆菌溶素也具有抗酿酒酵母(Saccharomyces cereviciae)的活性(Loeffler等人，1986)。
在一个方面，本文提及的组合物和/或发酵产物包含至少一种聚酮化合物和/或本文教导的培养枯草芽孢杆菌菌株的方法可产生至少一种聚酮化合物。聚酮化合物的例子包括：地非西丁、大环内酰亚胺和bacillaene。在该方面，可使用聚酮化合物的任何组合。
有利地，聚酮化合物可能具有抗污染微生物的广谱活性。
有利地，还惊奇地发现，枯草芽孢杆菌菌株15A-P4、2C-P1、3A-P4、2084和LSSA01均可产生地非西丁、大环内酰亚胺和bacillaene。
在一个方面，本发明的组合物和/或发酵产物包含至少1、2或3种聚酮化合物和/或培养枯草芽孢杆菌菌株的方法可产生至少1、2或3种聚酮化合物。
bacillaene可为抑制原核蛋白质生物合成(抑菌的)的广谱抑制物质。bacillaene是多烯抑制物质，其于1995年在来自枯草芽孢杆菌的发酵肉汤中发现。经计算，其标称分子量为580Da并且其经验式为C35H48O7。bacillaene具有抗广泛范围的细菌但不抗白色念珠菌的活性，这是其与杆菌溶素的差别所在。其抗大肠杆菌的活性是抑菌的(Patel等人，1995)。Bacillaene可能是极其不稳定的化合物(Butcher等人，2007)。
地非西丁是抑制原核蛋白质生物合成(抑菌的)的广谱抑制物质。其可用于抑制解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovara)(该细菌造成苹果、梨子、和蔷薇科植物的火疫病)。地非西丁是一种三烯大环内酯(C31H45O6P)，分子量为544Da并且m/z为688.3471，如通过EI-MS所计算(Wilson等人，1987)。已发现地非西丁具有抗广泛范围的革兰氏阳性和革兰氏阴性需氧和厌氧细菌的活性(Wilson等人，1987；Zimmerman等人，1987)。就其物化特性而言，地非西丁对pH、温度和氧气敏感。在室温下，在50％乙醇溶液中，地非西丁的t90(如通过HPLC所测试，90％抑制物质保留时的时间)在pH 3.5下为2小时并且在pH 11下为17小时。该抑制物质在高温下经历异构化，但该过程是可逆的，同时同分异构形式自身效力显著更低。其也对空气氧化敏感，尤其是当以固体形式储存时。
大环内酰亚胺也是抑菌、抗菌和抗病毒的。不希望受理论束缚，其可通过抑制污染微生物的细胞分裂起作用。大环内酰亚胺是具有24成员内酯环的多烯大环内酯(Gustafson等人，1989)。已分离并化学表征了超过18种不同大环内酰亚胺。它们被认为大多数来源于海洋细菌。Lu等人(2008)已发表了不同大环内酰亚胺的生物活性的综述。基于其抗微生物效力可用的有限数据，已表明大环内酰亚胺能有效抵抗金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。据报道，大环内酰亚胺V和W具有显著的抗菌活性，并且大环内酰亚胺T具有抗真菌活性(Mojid Mondol等人，2011)。
在一个方面，本文提及的组合物和/或发酵产物包含至少一种目标核糖体依赖性化合物(例如plantazolicin和/或LCI)和/或本文教导的培养枯草芽孢杆菌菌株的方法可产生至少一种目标核糖体依赖性化合物(例如plantazolicin和/或LCI)。LCI蛋白质家族的结构在Gong et alBiochemistry2011，50(18)pp 3621-3627(Gong等人，《生物化学》，2011年，第50卷，第18期，第3621-3627页)中有所教导，所述文献以引用方式并入本文。本文所提及的LCI可为LCI蛋白质家族中的任何蛋白质。plantazolicin可为小菌素，例如小菌素B17(如Scholz et al J.Bacteriol.2011，Jan：193(1)：215-24(Scholz等人，《细菌学杂志》，2011年1月，第193卷，第1期，第215-224页)中所教导，该文献以引用方式并入本文)、或plantazolicinA或plantazolicin B(例如Kalyon et al Org.Lett.20111，June 17；13(12)，2996-9(Kalyon等人，《有机化学通讯》，2011年6月17日，第13卷，第12期，第2996-2999页)中所教导)。
在一个方面，本文提及的组合物和/或发酵产物包含杆菌溶素或抗荚膜菌素中的一种或多种。不希望受理论束缚，枯草芽孢杆菌以称为杆菌溶素的L-ala-L抗荚膜菌素二肽前体的形式产生抗生素抗荚膜菌素。
在一个方面，本文提及的组合物和/或发酵产物包含选自如下的至少两种或更多种(即，多种)类型的目标化合物：NRP、聚酮化合物和核糖体依赖性化合物。除此之外或在替代形式中，本文教导的培养枯草芽孢杆菌菌株的方法有利于产生选自如下的两种或更多种(即，多种)类型的目标化合物：NRP、聚酮化合物和核糖体依赖性化合物。
设想了目标化合物的任何组合。本领域普通技术人员可按常规方式调整本文教导的枯草芽孢杆菌菌株的培养条件以产生一种或多种发酵物中的目标化合物的所需组合。
因此，有利地，本领域普通技术人员可调整培养条件，使得产生适用于所需应用的具有抗污染生物体的活性的目标化合物。例如，在一个方面，如果抗污染组合物要配制成果园的抗污染保护剂，本领域普通技术人员可希望调整培养条件，使得它们产生地非西丁以保护如苹果和梨子树不受解淀粉欧文氏菌影响。
在一个方面，根据本发明的目标化合物包括核糖体合成的化合物，例如细菌素和其他细菌素样物质(BLIS)。一般按照来自乳酸菌的细菌素的分类方案将来自芽孢杆菌菌种的细菌素分成3类。因此，翻译后修饰的肽属于I类并且非翻译后修饰的肽属于II类。芽孢杆菌细菌素的第三类包含大蛋白质复合物。有关来自芽孢杆菌菌种的已知且已表征的细菌素的最新综述，请参见Abriouel等人(2011)。
在一个方面，核糖体合成的化合物不是根据本发明的“目标化合物”。
在另一个方面，细菌素不是根据本发明的“目标化合物”。在一个方面，抗污染组合物和/或无细胞发酵产物不包含细菌素。
在一个方面，可部分地分离和/或纯化发酵产物(如，发酵物)中的目标化合物(一种或多种)。
适当地，目标化合物的部分分离或纯化可包括过氧化氢酶和/或溶菌酶的使用。
污染微生物
在一个方面，污染微生物可以是革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或真菌。在一些方面，污染微生物可以是多种微生物，如选自如下的微生物：革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌。
在另一个方面，污染微生物可以是来自选自如下的属的一种或多种革兰氏阴性细菌：沙门氏菌属；埃希氏菌属；哈夫尼菌属；克雷伯氏菌属；假单胞菌属；志贺菌属和耶尔森菌属。
在一个方面，污染微生物可以是如下的一种或多种：肠道沙门氏菌；大肠杆菌；蜂房哈夫尼菌；产酸克雷伯氏菌；荧光假单胞菌；恶臭假单胞菌；鼠伤寒沙门氏菌；福氏志贺菌；宋内志贺菌和小肠结肠炎耶尔森菌。
在一个方面，本发明的组合物有效抵抗肠道沙门氏菌菌株。
适当地，污染微生物可选自如下一种或多种：肠道沙门氏菌鸭血清型；肠道沙门氏菌布灵得卢柏血清型；肠道沙门氏菌德尔卑血清型；肠道沙门氏菌肠炎血清型；肠道沙门氏菌哈达尔血清型；肠道沙门氏菌婴儿血清型；肠道沙门氏菌凯道古血清型；肠道沙门氏菌姆班达卡血清型；肠道沙门氏菌蒙得维的亚血清型；肠道沙门氏菌诺伊斯特尔血清型；肠道沙门氏菌新港血清型；肠道沙门氏菌俄亥俄血清型；肠道沙门氏菌史华氏血清型；肠道沙门氏菌桑夫顿堡血清型；肠道沙门氏菌田纳西血清型；肠道沙门氏菌汤普森氏血清型以及肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型。
适当地，污染微生物可为埃希氏菌属。
适当地，污染微生物可为大肠杆菌。
适当地，污染微生物可选自如下一种或多种：大肠杆菌DCS 15(如，大肠杆菌0157：H7)、大肠杆菌DCS 492、大肠杆菌DCS 493、大肠杆菌DCS 494、大肠杆菌DCS 495、大肠杆菌DCS 496、大肠杆菌DCS 497、大肠杆菌DCS 546、大肠杆菌DCS 558、大肠杆菌DCS 1336以及大肠杆菌DCS 1396。
在一个方面，污染微生物可以是来自选自如下的属的一种或多种革兰氏阳性细菌：李斯特菌属；芽孢杆菌属；环丝菌属；梭菌属；肠球菌属；乳杆菌属；明串珠菌属以及葡萄球菌。
在另一个方面，污染微生物可以是如下的一种或多种：单核细胞增多性李斯特菌；凝结芽孢杆菌孢子；地衣芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌孢子；枯草芽孢杆菌孢子；热杀索丝菌；产气荚膜梭状芽孢杆菌；生孢梭菌孢子；粪肠球菌；鹑鸡肠球菌；香肠乳杆菌；发酵乳杆菌；植物乳杆菌；清酒乳杆菌；肠膜明串珠菌；无害李斯特菌；金黄色葡萄球菌以及表皮葡萄球菌。
在一个方面，污染微生物可以是来自选自如下的属的一种或多种真菌：曲霉属；假丝酵母属；德巴利酵母属；克鲁维酵母属；青霉属；毕赤酵母属；红酵母属；酵母属以及接合酵母属。
在一个方面，污染微生物可以是如下的一种或多种：寄生曲霉；杂色曲霉；近平滑假丝酵母；热带假丝酵母；弗氏柠檬酸杆菌；汉逊德巴利酵母；马克斯克鲁维酵母；团青霉；异常毕赤酵母；粘红酵母；胶红酵母；酿酒酵母以及拜氏接合酵母。
革兰氏阳性污染微生物的例子包括来自如下属的细菌：李斯特菌属；芽孢杆菌属；环丝菌属；梭菌属；肠球菌属；乳杆菌属；明串珠菌属以及葡萄球菌。例如单核细胞增多性李斯特菌；凝结芽孢杆菌孢子；地衣芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌孢子；枯草芽孢杆菌孢子；热杀索丝菌；产气荚膜梭状芽孢杆菌；生孢梭菌孢子；粪肠球菌；鹑鸡肠球菌；香肠乳杆菌；发酵乳杆菌；植物乳杆菌；清酒乳杆菌；肠膜明串珠菌；无害李斯特菌；金黄色葡萄球菌以及表皮葡萄球菌。
真菌污染微生物的例子包括来自如下属的细菌：曲霉属；假丝酵母属；德巴利酵母属；克鲁维酵母属；青霉属；毕赤酵母属；红酵母属；酵母属以及接合酵母属。例如寄生曲霉；杂色曲霉；近平滑假丝酵母；热带假丝酵母；弗氏柠檬酸杆菌；汉逊德巴利酵母；马克斯克鲁维酵母；团青霉；异常毕赤酵母；粘红酵母；胶红酵母；酿酒酵母以及拜氏接合酵母。
在一个实施例中，优选地，污染微生物选自一种或多种下列属：沙门氏菌属和埃希氏菌属。
例如，污染微生物可选自下列物种中的一种或多种：肠道沙门氏菌或大肠杆菌。
在一些方面，污染微生物可选自：肠道沙门氏菌肠道亚种菌株，如肠道沙门氏菌鸭血清型；肠道沙门氏菌布灵得卢柏血清型；肠道沙门氏菌德尔卑血清型；肠道沙门氏菌肠炎血清型；肠道沙门氏菌哈达尔血清型；肠道沙门氏菌婴儿血清型；肠道沙门氏菌凯道古血清型；肠道沙门氏菌姆班达卡血清型；肠道沙门氏菌蒙得维的亚血清型；肠道沙门氏菌诺伊斯特尔血清型；肠道沙门氏菌新港血清型；肠道沙门氏菌俄亥俄血清型；肠道沙门氏菌史华氏血清型；肠道沙门氏菌桑夫顿堡血清型；肠道沙门氏菌田纳西血清型；肠道沙门氏菌汤普森氏血清型以及肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型。
根据抗污染组合物与之一起使用的产品的不同，污染微生物(一种或多种)可变化。
仅以举例的方式，如果产品是宠物食物(如半湿润宠物食物，如宠物食物的粗粒形式或其他形式、或宠物零食)，则污染微生物可来自沙门氏菌属，如，例如来自肠道沙门氏菌物种。
例如，如果产品是宠物食物，如粗粒食物，则污染微生物可为例如肠道沙门氏菌婴儿血清型或田纳西血清型、肠道沙门氏菌桑夫顿堡血清型或蒙得维的亚血清型。
例如，如果产品是粗粒形式宠物食物，则污染微生物可为肠道沙门氏菌婴儿血清型或田纳西血清型。
如果产品是宠物食物，则污染微生物可为例如肠道沙门氏菌桑夫顿堡血清型或蒙得维的亚血清型。
如果产品是宠物零食，则污染微生物可为例如肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型、新港血清型、鸭血清型、俄亥俄血清型、桑夫顿堡血清型、汤普森氏血清型或诺伊斯特尔血清型。
如果产品是生的宠物食物，则污染微生物可为例如肠道沙门氏菌哈达尔血清型、布灵得卢柏血清型或史华氏血清型。
如果产品是冷冻的宠物食物，则污染微生物可为例如肠道沙门氏菌姆班达卡血清型。
如果产品是猪耳零食，则污染微生物可为例如肠道沙门氏菌婴儿血清型。
如果污染微生物源自宠物食物工厂，则污染微生物可为例如肠道沙门氏菌德尔卑血清型。
如果产品是食品(如，人类食品)，则污染微生物(一种或多种)可变化。
如果产品是人类食物产品(如，乳制品，如奶基产品)，则污染微生物可选自下列属中的一种或多种：埃希氏菌属和沙门氏菌属。
在一些方面，当产品是食品(如，人类食品)时，则污染微生物可为沙门氏菌属。
适当地，当产品是食品时，污染微生物可为例如肠道沙门氏菌。
适当地，当产品是食品时，污染物可选自一种或多种肠道沙门氏菌肠道亚种菌株：例如，肠道沙门氏菌鸭血清型；肠道沙门氏菌布灵得卢柏血清型；肠道沙门氏菌德尔卑血清型；肠道沙门氏菌肠炎血清型；肠道沙门氏菌哈达尔血清型；肠道沙门氏菌婴儿血清型；肠道沙门氏菌凯道古血清型；肠道沙门氏菌姆班达卡血清型；肠道沙门氏菌蒙得维的亚血清型；肠道沙门氏菌诺伊斯特尔血清型；肠道沙门氏菌新港血清型；肠道沙门氏菌俄亥俄血清型；肠道沙门氏菌史华氏血清型；肠道沙门氏菌桑夫顿堡血清型；肠道沙门氏菌田纳西血清型；肠道沙门氏菌汤普森氏血清型；以及肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型。
在一个方面，当产品是食品(如，人类食品)时，则污染微生物可为埃希氏菌属。适当地，污染微生物可为大肠杆菌。
在另一个方面，当产品是食品(如，人类食品)时，污染微生物可为选自如下的一种或多种大肠杆菌菌株：大肠杆菌DCS 15(如，大肠杆菌0157：H7)、大肠杆菌DCS 492、大肠杆菌DCS 493、大肠杆菌DCS 494、大肠杆菌DCS 495、大肠杆菌DCS 496、大肠杆菌DCS 497、大肠杆菌DCS 546、大肠杆菌DCS 558、大肠杆菌DCS 1336以及大肠杆菌DCS1396。
如果产品是乳制品，如奶基产品，则污染微生物可选自下列属种中的一种或多种：大肠杆菌和肠道沙门氏菌，如肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型、桑夫顿堡血清型、或肠炎血清型。
“平板扩散测定法”方案
可使用以下“平板扩散测定法”方案测试无细胞发酵物、上清液或其组分的样品以确定是否其包含“目标化合物”或“有效”抵抗根据本发明的目标污染微生物。
按照如下方式制备用于每种目标污染生物体的平板：将包含3mL 2M磷酸钠(pH 6.5)的30mL熔融的琼脂培养基用150μl目标污染生物体的完全生长的过夜培养物接种并混合均匀。将悬浮液倒入omnitray并让其沉降30分钟。
在琼脂内切孔并且让其在LAF台中再敞开干燥30分钟。
将孔用100μl的样品填充，并在目标污染微生物的最适生长条件下温育24至48小时。在温育时间后，测量抑菌圈直径(即，目测为较清晰抑菌圈的抑菌区)。
如果针对所测试的污染微生物测得至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mm的抑菌圈直径，则认为样品包含目标化合物和/或认为样品能有效抵抗所使用的污染微生物。
在一个方面，大肠杆菌可用作污染微生物，例如大肠杆菌可用作测试抗革兰氏阴性细菌的有效活性的存在的指示物。
在一个方面，单核细胞增多性李斯特菌可用作污染微生物，例如单核细胞增多性李斯特菌可用作测试抗革兰氏阳性细菌的有效活性的存在的指示物。
在一个方面，酿酒酵母可用作污染微生物，例如酿酒酵母可用作测试抗真菌的有效活性的存在的指示物。
“抑制肉汤测定法”方案
可使用以下“抑制肉汤测定法”方案测试无细胞发酵物、上清液或其组分的样品以确定是否其包含“目标化合物”或“有效”抵抗根据本发明的目标污染微生物。
将单个充分分离的污染生物体的菌落挑取到合适营养肉汤(如，脑心浸液肉汤(英国碧迪公司(Becton，Dickenson U.K.Ltd(BD))产品号238400))中并在37℃下生长24小时并用作目标生物体。
为了设置肉汤测定法，将96孔微量滴定板的每孔用0.18mL的合适营养肉汤(如，脑心浸液肉汤(BD产品号238400))填充，以一式两份设置，含和不含10％(体积比)和50％(体积比)浓度的无细胞发酵物、上清液、或其组分。
所有孔均用1％(体积比)的目标生物体接种并且将96孔板在37℃下温育24小时。测量OD595并且针对处理与对照结果报告百分比抑制值。
如果针对所测试的污染微生物测得至少约20％抑制，则认为样品包含目标化合物和/或认为样品能有效抵抗所使用的污染微生物。
在一个方面，大肠杆菌可用作污染微生物，例如大肠杆菌可用作测试抗革兰氏阴性细菌的有效活性的存在的指示物。
在一个方面，单核细胞增多性李斯特菌可用作污染微生物，例如单核细胞增多性李斯特菌可用作测试抗革兰氏阳性细菌的有效活性的存在的指示物。
在一个方面，酿酒酵母可用作污染微生物，例如酿酒酵母可用作测试抗真菌的有效活性的存在的指示物。
附加组分(一种或多种)
在本发明的一个方面，本发明的组合物可包含一种或多种附加组分。优选地，任何附加组分(一种或多种)不会实质影响本发明组合物的抗污染特性。
适当地，所述附加组分(一种或多种)可为载体、辅助剂、增溶剂、悬浮剂、稀释剂、氧气清除剂、抗氧化剂、食物材料、抗污染剂或其组合。
适当地，所述附加组分(一种或多种)对于要利用抗微生物剂的应用是必需的。例如，如果要在农产品之上或之中利用抗污染组合物，则附加组分(一种或多种)可为农业上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。同样地，如果要在食品之上或之中利用抗污染组合物，则附加组分(一种或多种)可为可食用载体、赋形剂或稀释剂。
在一个方面，所述一种或多种附加组分(一种或多种)为载体、赋形剂、稀释剂、氧气清除剂、抗氧化剂和/或食物材料。
“载体”或“溶媒”是指适于化合物施用的材料，包括本领域已知的任何无毒且不会以有害方式与组合物的任何组分发生相互作用的材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等。
营养上可接受的载体的例子包括(例如)水、盐溶液、醇、有机硅、蜡、石油凝胶、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香料油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
赋形剂的实例包括如下中的一种或多种：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖(lactose)、柠檬酸钠、碳酸钙、二碱式磷酸钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇。
稀释剂的实例包括如下中的一种或多种：水、乙醇、丙二醇和丙三醇以及它们的组合。
其他的组分可同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。
组合物或其稀释剂也可包含螯合剂例如EDTA、柠檬酸、酒石酸等。此外，组合物或其稀释剂可包含活性剂，所述活性剂选自脂肪酸酯例如单甘油酯和双甘油酯、非离子表面活性剂例如聚山梨酸酯、磷脂等。乳化剂可增强组合物的稳定性，特别是在稀释后。
抗污染剂
在一个方面，本发明的抗污染组合物可包含一种或多种附加抗污染剂。
术语“附加抗污染剂”是指通过培养枯草芽孢杆菌3A-P4；15A-P4；22C-P1；LSSA01；BS 18；ABP 278中的任一种或其组合不会产生的抗污染剂。
此类“附加抗污染剂”可包括抗微生物剂、抗细菌剂、抗真菌剂和/或抗病毒剂。
在一个实施例中，所述附加抗污染剂是食物等级抗污染剂。
在一个实施例中，所述附加抗污染剂(或食物等级抗污染剂)是由如下组成的组中的一种或多种：食物等级有机酸；植物抗微生物剂，例如儿茶酸(如，来自绿茶)、异硫氰酸烯丙酯(如，来自芥子油)；苯酚(如，来自迷迭香)；植物精油；细菌素；抗微生物乳化剂、脂肪酸、或其酯。
氧气清除剂
在本发明的一个方面，本发明的组合物或无细胞发酵产物可包含氧气清除剂和/或本发明的产品和/或组合物的封装(如，包装)可包含清除氧气的化合物。
不希望受理论束缚，氧气清除剂可用于保持本发明的抗污染组合物或无细胞发酵产物的抗污染活性。抗污染活性的保持可通过抗污染组合物或无细胞发酵产物内的组分的氧化的抑制来实现。
调节发酵产物(或包含发酵产物的组合物)对氧气的暴露(例如通过使用氧气清除剂或抗氧化剂)有利地有助于保持抗污染活性。因此，可有利地延长施加了抗污染组合物的产品的“货架期”。例如，通过限制包装系统中氧气敏感性食物产品对氧气的暴露，可保持食物的品质或新鲜度，减少污染物，和/或延长食物货架期。
在食物包装行业，调节氧气暴露的若干方式是已知的，包括气调包装(MAP)和氧气阻隔膜包装。
氧气暴露的调节可通过“活性包装”实现，从而使包含食物产品的包装以一定方式调整以调节食物对氧气的暴露。一种形式的活性包装使用氧气清除小袋，其装有通过氧化反应清除氧气的组合物。一种类型的小袋装有基于铁的组合物，该组合物氧化成其三价铁状态。另一种类型的小袋装有颗粒吸附剂上的不饱和脂肪酸盐。又一种小袋装有金属/聚酰胺复合物。
另一种类型的活性包装涉及将氧气清除剂结合到包装结构自身中。整个包装更均匀的清除效果通过将清除材料结合到包装中而非将单独的清除剂结构(如，小袋)添加到包装来实现。在包装内部气流受限的情况下，这可尤其重要。此外，将氧气清除剂结合到包装结构中提供在氧气透过包装的壁时截留和清除氧气的方式(本文称为“活性氧气屏障”)，从而保持包装中的最低可能的氧气水平。
可根据本发明使用任何已知的氧气清除剂。本领域普通技术人员可选择适合抗污染组合物的预期用途的氧气清除剂。例如，对于食物应用，本领域普通技术人员可使用具有GRAS认证的氧气清除剂。
可存在于或结合到包装材料中的清除氧气的化合物包括：
·铁粉氧化(例如，可商购获得的产品O2吸收剂、知)；
·抗坏血酸氧化；
·酶促氧化(如，葡糖氧化酶和醇氧化酶)，包括可商购获得的产品，例如Bioka O2吸收剂；
·不饱和脂肪酸(如，油酸或亚麻酸)；和
·固体材料上的固定化酵母。
适当地，此类化合物可与气调包装结合使用。
在一个方面，可在培养根据本发明的一种或多种枯草芽孢杆菌菌株之后添加至少一种氧气清除剂。
适当地，可将所述至少一种氧气清除剂添加到无细胞发酵产物或上清液或其级分或组分中。
抗氧化剂
在本发明的一个方面，本发明的组合物或无细胞发酵产物可包含抗氧化剂和/或本发明的产品和/或组合物的封装(如，包装)可包含为抗氧化剂的化合物。
适当地，抗氧化剂可用于本发明的组合物和产品。
在一个方面，抗氧化剂可用于本发明的方法。例如，可在培养之前、期间或之后添加抗氧化剂。不希望受理论束缚，抗氧化剂可用于保持本发明的抗污染组合物或无细胞发酵产物的抗污染活性。抗污染活性的保持可通过抗污染组合物或无细胞发酵产物内的组分的氧化的抑制来实现。
本文所用的术语“抗氧化剂”是指能够抑制其他分子的氧化的分子。
在一个方面，可在培养根据本发明的一种或多种枯草芽孢杆菌菌株之后添加至少一种抗氧化剂。
适当地，可将所述至少一种抗氧化剂添加到无细胞发酵产物或上清液或其级分或组分中。
抗氧化剂是众所周知的且可商购获得。本领域普通技术人员能够选择适合所需最终用途的抗氧化剂。例如，在抗污染组合物要用于食品中的情况下，可使用天然抗氧化剂，例如抗坏血酸、生育酚、丁基化羟基茴香醚和丁基化羟基甲苯。
在一个方面，合适的抗氧化剂可选自：抗坏血酸、多酚、维生素E、β-胡萝卜素、迷迭香提取物、甘露醇和BHA。
在一个方面，可将介于约0ppm至约900ppm之间的抗氧化剂添加到本发明的抗污染组合物中，即约0ppm至约100ppm、约100ppm至约200ppm、约200ppm至约300ppm、约300ppm至约400ppm、约400ppm至约500ppm、约500ppm至约600ppm、约600ppm至约700ppm、约700ppm至约800ppm、约800ppm至约900ppm。在其他方面，可添加大于约900ppm的抗氧化剂。
在另一个方面，可将介于约600ppm至约900ppm之间的抗氧化剂添加到本发明的抗污染组合物中。
适当地，可将介于约600ppm至约900ppm之间的抗坏血酸添加到本发明的抗污染组合物中。
产品
提供包含本发明的抗污染组合物的产品。
本文涵盖易受污染物(优选地微生物污染物)影响的任何产品。此类产品包括食品、表面涂层材料和农产品。
食品
本发明的组合物可用作食物或用于食物的制备。在此，术语“食品”被广义地使用，并且涵盖人类的食物以及动物的食物(即饲料)。
在一个优选的实施例中，术语“食品”是指“人类食品”。换句话讲，在优选实施例中，术语食品可排除动物的食物(如，饲料)。适当地，术语食品是指人类食品和/或宠物食物。
适当地，如本文所用的术语“食品”可以指即可食用形式的食品。然而，作为另外一种选择或除此之外，本文所用的术语“食品”可以指用于食品制备的一种或多种食物材料。
本文所用的术语“食品”和“食物产品”可互换。
取决于用途和/或应用的模式和/或施用的模式，食物可以为溶液的形式或作为固体。
当用于制备食品时，本发明的抗污染组合物可以与如下一种或多种结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅助剂或营养活性成分。
本发明的抗污染组合物可用于减少或防止各种食品的微生物污染。适当地，根据本发明的食品或食物产品可为或可包括生肉、熟肉、生禽制品、熟禽制品、生海产制品、熟海产制品、即食食物、现成膳食、意大利面调味汁、巴氏杀菌汤、蛋黄酱、沙拉酱、水包油乳液、人造奶油、低脂肪涂抹食品、油包水乳液、蛋、蛋类制品、乳制品、干酪涂抹食品、加工的干酪、乳制甜点、调味乳、乳酪、发酵乳制品、干酪、奶油、炼乳制品、冰淇淋混合料、大豆制品、巴氏杀菌湿蛋品、焙烤食品、糖食产品、水果、水果制品、罐装食物以及具有脂肪基馅或含水馅的食物。
在一个方面，食品为即食食物。本文所用的术语“即食食物”是指无需为实现食物安全进一步制备即可食用的食品。此类产品包括切碎的蔬菜、预洗的沙拉、制备和预洗的水果和加工过的肉类。
在一个方面，食品为现成膳食。术语“现成膳食”是指在出售之前经过一个或多个制备步骤的食物。现成膳食包括冷藏和冷冻即食膳食，其可简单地在消费之前加热。
在一个方面，食品可为包装食品，例如包装沙拉、即食膳食、包装肉制品等。在该方面，本发明的抗污染组合物可施加到食物产品之中或之上。除此之外，或作为另外一种选择，可在包装之中或之上使用抗污染组合物。例如，抗污染组合物可施加到包装上。
在一个方面，食品为或包括现成膳食。
在一个方面，食品可为蛋、液态蛋或蛋类制品。蛋类制品可包括但不限于蛋糕、蛋黄酱、沙拉酱、调味汁、冰淇淋等。
术语“组成组分”是指用于制备产品的一种或多种材料的使用。因此，在食品的语境中，“组成组分”将为用于制备食品的一种或多种食物材料。适当地，可在食品组成组分之中或之上使用本发明的抗污染组合物。
本文所用的术语“人类食品”是指用于人类消费(或主要用于人类消费)的食品。在一个实施例中，如本文所定义，本文所用的术语人类食品排除动物消费的饲料。
烹饪产品
在一个方面，食品(如人类食品)可为或可包括烹饪产品。
在一个方面，烹饪产品可为调味汁、沙拉酱、香料、调味品和/或汤料。
在一个方面，食品(如人类食品)可为或可包括调味汁，诸如佐餐调味汁(包括用作佐餐调味汁的调味汁和多用途并且可用作佐餐调味汁的调味汁)、腌泡汁和/或烹饪调味汁(如在炒、蒸等期间)。
在一个方面，调味汁可为或可包括发酵调味汁。对于每个国家，各种类型的发酵调味汁存在于不同区域，并且包括不同变体。例子包括棕色调味汁、辣椒、伍斯特沙司、李子酱、肉类薄荷酱、塔塔酱、肉类苹果酱、辣根、肉类越橘酱等以及牡蛎酱、海鲜酱等。
在一个方面，调味汁可为或可包括大豆类调味汁或大豆类发酵调味汁。例子包括共混有大豆类调味汁的老抽和生抽，如-照烧(含添加糖和味醂的共混酱油)-寿喜烧(含添加糖、味醂和汤汁)-串烧(含添加味醂、清酒、糖)。
在一个方面，调味汁可为或可包括意大利面调味汁。意大利面调味汁包括直接添加到煮熟的意大利面或提前加热几分钟，或者添加到新鲜原料，如肉或蔬菜，以及加热制成随后添加到煮熟意大利面的调味汁。例子包括波伦亚酱、培根蛋酱、蘑菇酱、番茄酱、蔬菜酱、香蒜酱等。
在一个方面，食品(如人类食品)为或包括湿调味汁/烹饪调味汁，诸如添加到原料(肉和/或蔬菜)来制作膳食的液体(即非脱水)配方烹饪调味汁/糊。这还包括可在烹饪过程(腌泡)前和/或烹饪过程(如蒸、烤、炒、炖等)期间添加的配方调味汁/糊。
在一个方面，食品(如人类食品)可为或可包括干调味汁/粉末混合物。此类调味汁包括在食用前添加沸水或牛奶的干调味汁；干配方粉末混合物和干粉腌泡汁。一些干调味汁可能需要在炉上加热，以便在添加水/牛奶后浓缩调味汁。例子包括荷兰辣酱油、白调味汁、辣椒酱、酸甜酱、意大利面肉酱等。
在一个方面，食品(如人类食品)可为或可包括沙拉酱。合适的该酱可包括常规沙拉酱(标准现成品)和/或干沙拉酱(即以与油/醋混合的小袋包装的粉末)。例子包括油类产品、千岛酱、蓝纹奶酪、凯撒酱、沙拉奶油等。
适当地，该酱可包括：低脂肪沙拉酱(例子包括油类产品、千岛酱、蓝纹奶酪、凯撒酱、沙拉奶油等)；
并且香醋包括所有醋类沙拉酱，诸如香醋
其他调味汁、酱和调味品例子包括1)非发酵佐餐调味汁2)芥末3)非配方泥、糊(如大蒜泥/糊)4)干腌泡汁5)干配方粉末混合物(如法西塔香料混合物)5)脱水配方糊状物/涂料(用于烹饪，如油炸、烤、烘焙)。
在一个方面，食品(如人类食品)可为或可包括汤(诸如罐装汤)、即食汤、脱水汤、速溶汤、冷汤、UHT汤和速冻汤。
罐装汤-包括所有品种的即食或浓缩(含待添加的水)形式罐装汤。块状或蒸煮袋形式的即食或浓缩汤也归为UHT汤。例子包括混合蔬菜汤、豌豆汤、韭葱汤、鱼汤、蘑菇汤、番茄汤、鸡汤、肉汤、牛肉汤、鸡肉和蘑菇汤、杂烩汤等。
脱水汤-粉末汤，在食用前添加水，然后煮几分钟。
速溶汤-粉末汤，临到食用前向其中添加沸水。
冷汤-由新鲜原料制成的汤，保存在冷冻柜里。这些产品通常具有有限的贮藏期限
UHT汤-包括所有品种的即食或浓缩(含待添加的水)形式的汤，在环境下销售(即未保存于冷冻柜里)。产品类型包括混合蔬菜汤、豌豆汤、韭葱汤、鱼汤、蘑菇汤、番茄汤、鸡汤、肉汤、牛肉汤、鸡肉和蘑菇汤
速冻汤-包括所有品种的以冷冻形式销售的汤。产品类型包括混合蔬菜汤、豌豆汤、韭葱汤、鱼汤、蘑菇汤、番茄汤、鸡汤、肉汤、牛肉汤、鸡肉和蘑菇汤、杂烩汤等。
肉类食物产品
根据本发明的肉类食品(如人类食品)为基于肉的任何产品。
肉类食品适合作为食物和/或饲料供人类和/或动物食用。
在本发明的一个实施例中，肉类食物产品为用于饲养动物的饲料产品，例如宠物食物产品。
在本发明的另一个实施例中，肉类食物产品为用于人类的食物产品。
肉类食物产品可包括非肉原料，例如水、盐、面粉、乳蛋白、植物蛋白、淀粉、水解蛋白、磷酸盐、酸、香料、着色剂和/或增稠剂。
根据本发明的肉类食物产品优选包含在5-90％(重量/重量)之间的肉。在一些实施例中，肉类食物产品可包含至少30％(重量/重量)的肉，诸如至少50％、至少60％或至少70％的肉。
在一些实施例中，肉类食物产品为熟肉，例如火腿、里脊、猪肩肉、熏肉和/或五花肉。
肉类食物产品可为如下中的一者或多者：
干腌肉或半干腌肉-诸如用起子培养物干腌和发酵的发酵产品，例如干腊肠、意大利蒜味腊肠、意大利辣香肠和干火腿；
乳化肉制品(如用于冷食用或热食用)，诸如摩泰台拉香肚、法兰克福香肠、午餐肉和肉酱；
鱼类和海鲜，诸如小虾、鲑鱼、重配(reformulated)鱼产品、冷冻的冷装鱼；
新鲜肉肌肉，诸如整块的注入肉肌肉，例如里脊、肩肉火腿、腌肉；
绞制的和/或重组的鲜肉-或重配肉，诸如通过冷凝胶或粘结改良的切肉，例如生猪排、牛排、烤肉、鲜肉香肠、牛肉汉堡、肉丸、俄罗斯饺子；
禽肉产品-诸如鸡胸肉或火鸡胸肉或重配禽肉，如鸡块和/或鸡肉肠；知
蒸煮产品-高压消毒的肉制品，例如肩肉火腿、午餐肉、乳化产品。
在本发明的一个实施例中，肉类食物产品为加工的肉制品，例如香肠、博洛尼亚香肠、肉糜卷、碎肉产品、绞肉、熏肉、猪肉香肠、意大利蒜味腊肠或肉酱。
加工的肉制品可为例如乳化的肉制品，其由肉类乳状液制得，例如摩泰台拉香肚、博洛尼亚香肠、意大利辣香肠、肝肉香肠、鸡肉肠、维也纳香肠、法兰克福香肠、午餐肉、肉酱。
肉类乳状液可煮制、灭菌或烘焙，如以烘焙形式或在装入到例如塑料、胶原、纤维素或天然肠衣的肠衣中之后。加工的肉制品也可为重组的肉制品，例如重组火腿。本发明的肉制品可进行加工步骤，例如盐渍，如干盐渍；腌制，如盐腌；干燥；熏制；发酵；煮制；装罐；蒸煮；切片和/或切碎。
在一个实施例中，要与抗污染组合物接触的肉可为肉糜。
在另一个实施例中，食品可为乳化的肉制品。
肉
如本文所用的术语“肉”意指来自任何类型动物的任何类型组织。
如本文所用的术语肉可为包括来自动物的肌纤维的组织。肉可为动物肌肉，例如整块动物肌肉或从动物肌肉切下的片。
在另一个实施例中，肉可包括动物的内部器官，例如心脏、肝脏、肾脏、脾、胸腺和脑。
术语肉涵盖通过本领域中已知的任何其他适当方法绞制、剁碎或切成较小片的肉。
肉可来自任何类型的动物，诸如来自奶牛、猪、羊羔、绵羊、山羊、小鸡、火鸡、鸵鸟、野鸡、鹿、麋鹿、驯鹿、水牛、野牛、羚羊、骆驼、袋鼠；马、啮齿动物、南美栗鼠、任何类型的鱼，如鲱属小海鱼、鳕鱼、黑线鳕、金枪鱼、海鳗、鲑鱼、鲱鱼、沙丁鱼、鲭鱼、鲹鱼、秋刀鱼、臭肉鲳、绿鳕、比目鱼、凤尾鱼、沙丁鱼、蓝鳕、太平洋鳕鱼、鳟鱼、鲶鱼、鲈鱼、毛鳞鱼、马林鱼、红鲷鱼、挪威鳕和/或狗鳕；任何类型的壳类动物，如蛤蜊、贻贝、扇贝、鸟蛤、玉黍螺、蜗牛、牡蛎、小虾、龙虾、海螯虾、螃蟹、小龙虾、乌贼、鱿鱼和/或章鱼。
在一个实施例中，肉为牛肉、猪肉、鸡肉、羊羔肉和/或火鸡肉。
饲料
在一个方面，“产品”或“食品”可为饲料。
如本文所用的术语“饲料”意指适合于动物食用的食物，诸如适合于奶牛、猪、羊羔、绵羊、山羊、小鸡、火鸡、鸵鸟、野鸡、鹿、麋鹿、驯鹿、水牛、野牛、羚羊、骆驼、袋鼠；马、鱼；猫、狗、豚鼠、啮齿动物(如大鼠、小鼠、沙鼠和毛丝鼠。
可将抗污染组合物自身以已知的方式添加到饲料或组分。
优选地，饲料可为草料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可将根据本发明的抗污染组合物与复合饲料、复合饲料组分混合，和/或将其施加到复合饲料、复合饲料组分，或将其施加至复合饲料的预混物或施加至草料、草料组分或草料的预混物中。
如本文所用的术语草料意指提供给动物(而非动物必须自己觅食)的任何食物。草料涵盖经切割的植物。
术语草料包括干草、稻草、青贮饲料、压制和制丸的饲料、油和混合日粮以及发芽谷物及豆类。
草料可从选自如下的植物中的一者或多者获得：苜蓿(紫苜蓿(lucerne))、大麦、百脉根、芸苔属植物、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、芜菁、三叶草、杂三叶草、红色三叶草、地三叶草、白色三叶草、草、燕麦草、羊茅草、百慕大草、雀麦草、石南荒原草(heath grass)、草地早熟禾(来自天然混合草原草地)、果树草、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用于树-干草的截去树梢的树的嫩枝)、小麦和豆类。
术语“复合饲料”意指以粗粉、丸粒、坚果、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的具体需求配制这些共混物。
复合饲料可为提供所有每日所需营养物质的完全饲料、提供日粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供额外的微量营养物质(例如矿物质和维生素)的补充剂。
用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、大豆、高粱、燕麦和大麦。
合适的是，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抑制性物质、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于掺和进商业日粮内的组合物。
本发明的任何饲料可包含一种或多种选自如下的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米谷蛋白粉、可溶性谷物干酒糟(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰肉、芝麻；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
本发明的饲料可含有至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％或至少60重量％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。
另外或作为另一选择，本发明的饲料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维饲料。高纤维饲料材料的例子包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦、谷类的副产品(例如玉米谷蛋白粉、可溶性谷物干酒糟(DDGS)、麦糠、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁及柑橘渣。一些蛋白质来源也可以视为高纤维的：从诸如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花之类的来源获得的蛋白质。
在本发明中，饲料可为如下中的一者或多者：复合饲料和预混物，包括丸粒、坚果、或(牛)饼；作物或作物残茬：玉米、大豆、高梁、燕麦、大麦、玉米秸秆、椰子干、稻草、糠、糖用甜菜废料；鱼粉；新鲜切草和其他饲用植物；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：干草和青贮饲料；海草；种子和谷物，整体地或通过压碎、碾磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
如本文所用的术语“施加”是指将本发明的组合物间接或直接施加至产品(例如饲料)中。可使用的施加方法的例子包括但不限于，在包含抗污染组合物的材料中处理产品，通过将抗污染组合物与产品混合来直接施加，将抗污染组合物喷涂在产品表面上或将产品浸渍到抗污染组合物的制剂中或用抗污染组合物涂覆产品。
在一个实施例中，本发明的抗污染组合物优选地与产品(如饲料)混合或施加到其上。或者，饲料的乳状液或原始成分中可包括抗污染组合物。
宠物食品
微生物污染由于召回事件的发生率增大而在宠物食物行业日益受到关注。
在一个方面，产品可优选地为宠物食物。如本文所用的术语“宠物食物”意指适合供家养动物食用的食物，家养动物诸如狗、猫、马、猪、鱼、鸟、仓鼠、沙鼠、豚鼠、啮齿动物(如大鼠、小鼠、兔子和南美栗鼠)。
在一个方面，如本文所用的术语“宠物食物”意指适合供家养狗或猫食用的食物。
宠物食物受到微生物诸如沙门氏菌属、李斯特氏菌属、大肠杆菌和梭菌属的污染。例如，干燥的宠物食物在后加工阶段可能特别容易受微生物污染物的影响。
本发明有利地提供用于宠物食物的抗污染组合物，其具有下列一个或多个优点：安全、美味、具有成本效益和稳定，以及有效。
抗污染组合物可施加到宠物食物自身和/或宠物食物的组成组分(一种或多种)(如成分)上或其中。例如，抗污染组合物可施加到美味增强剂(palatant)上或其中。
存在于狗和猫食物中的典型组成组分的例子包括美味增强剂、全玉米粒、粗大豆、鸡肉副产品粉、粉状纤维素、玉米谷蛋白粉、大豆粉、鸡肝香料、大豆油、亚麻仁、焦糖色素、加碘盐、L-赖氨酸、氯化胆碱、氯化钾、维生素(L-抗坏血酸基-2-多磷酸盐(维生素C的来源)、维生素E补充剂、烟酸、硝酸硫胺、维生素A补充剂、泛酸钙、生物素、维生素B12补充剂、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、维生素D3补充剂)、维生素E补充剂、矿物质(如，硫酸亚铁、氧化锌、硫酸铜、一氧化锰、碘酸钙、亚硒酸钠)、牛磺酸、L-肉毒碱、葡萄糖胺、混合生育酚、β-胡萝卜素、迷迭香提取物。
在一个方面，宠物食物可为湿或干的宠物食物，其可为湿润的宠物食物(如包含18-35％的水分)、半湿润的宠物食物(如14至18％的水分)、干的宠物食物、宠物食物补充剂或宠物零食的形式。一些宠物食物形式(如湿润的和半湿润的宠物食物)由于制备宠物食物的加工条件不足以杀死宠物食物上或其中的所有微生物这一事实而特别容易受污染影响。
适当地，宠物食物可为粗粒形式。
在一个方面，宠物食物可适合于狗或猫。
在一个方面，宠物食物可为鱼食物。鱼食物通常含有使养殖鱼保持健康所需的主要营养物质、痕量元素和维生素。鱼食物可以是小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食物还含有诸如β胡萝卜素或性激素之类的添加剂，以人工增强观赏性鱼的颜色。
在一个方面，宠物食物可为鸟食物。鸟食物包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。通常，鸟食物由各种种子组成，但也可涵盖板油(牛或羊脂肪)。
在一个方面，抗污染组合物可例如通过在其上喷涂或沉淀，掺入到宠物食物内或宠物食物的表面上。
在一个方面，配制抗污染组合物以用于宠物食物。在这个方面，抗污染组合物可包含附加抗污染剂，诸如磷酸、丙酸和丙酸盐、亚硫酸盐、苯甲酸和苯甲酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐和对羟苯甲酸酯。或者，抗污染剂可不包含任何化学品。
适当地，可将抗污染组合物添加到宠物食物或其组成组分中使得抗污染组合物按宠物食物的重量计，以约0.1％至约10％，约0.1至约5％，或约0.1至约3％存在。在一个方面，抗污染组合物按宠物食物的重量计以约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0％存在，其中所述值的任一者可在适当的时候形成上或下端值。
在一个方面，宠物食物可为粗粒(如狗粮)。制备粗粒的示例性方法包括以下步骤：
a.过在高温下混合湿的和干的成分进行预处理以形成粗粒面团(kibbledough)；
b.高温和高压下挤出粗粒面团；
c.燥挤出的粗粒；和
d.局部用液体和/或干燥成分包衣(enrobing)或涂覆干燥的粗粒。
适当地，可将抗污染组合物在工艺的任何阶段(诸如在步骤a和/或d)施加到粗粒。
适当地，如本文所用的术语“宠物食物”不涵盖家畜动物的饲料。如本文所用的术语“家畜”是指任何农场动物。优选地，家畜是一种或多种反刍动物，诸如牛(如奶牛或公牛(包括小牛))、单胃动物(诸如家禽(包括肉鸡、小鸡和火鸡))、猪(包括小猪)、鸟或绵羊(包括羊羔)。
农产品
如本文所用的术语“农产品”意指易受微生物污染影响的水果、蔬菜、作物、种子、青贮饲料、花蕾和其他农产品。
在一个方面，农产品可以为种子或谷物或被保存以供将来用作种子(播种)使用的其他增殖性植物组织(如块茎)。在一个方面，农产品可以为种子、谷物或其他植物材料，或供将来用作动物饲料的植物来源材料。
在一个方面，本发明的抗污染组合物可用于对抗污染草、农作物植物和/或混合的家畜营养成分以及用于产生它们的材料，诸如大麦、小麦、裸麦、燕麦、玉米、水稻、油菜、豆类、葵花籽、大豆、糖用甜菜和甘蔗以及其残渣、干草、稻草、花生、鱼粉、肉粉或骨粉。
作物和作物保护剂
在一个方面，农产品为作物。作物的例子包括：谷类、大麦、小麦、玉蜀黍、黑小麦、水稻、燕麦、裸麦、蚕豆、水果作物、蔬菜、苹果、梨、草莓、豌豆、番茄、葡萄、芸苔属植物、烟草、莴苣、高粱、棉花、甘蔗、豆类、观赏植物、盆栽植物、草坪草、糖用甜菜、芹菜、十字花科植物、车前草、香蕉、草类、农作物、家畜营养植物、油菜、向日葵、大豆、花生、西兰花、卷心菜、胡萝卜、柑橘、蒜、洋葱、辣椒(辣椒属)、马铃薯和草莓，包括其种子。
在本发明的一个方面，农产品为谷类、大麦、小麦、玉蜀黍、黑小麦、水稻、燕麦、裸麦、蚕豆、苹果、梨、草莓、豌豆、番茄、葡萄、芸苔属植物、烟草、莴苣、高粱、棉花、甘蔗、豆类、观赏植物、盆栽植物、草坪草、糖用甜菜、芹菜、十字花科植物、车前草、香蕉、草类、油菜、向日葵、大豆和花生的种子或植物。优选地，种子或植物材料为糖用甜菜种子或大麦。
在一个方面，本发明的抗污染组合物为或被配制为作物保护剂。
如本文所用的术语“作物保护剂”是指可用于对抗(例如减少和/或防止和/或抑制)作物的污染物(优选地微生物污染物)的抗污染组合物。
种子保护剂
在一个方面，农产品为种子。
在种子生产中，保持种子的发芽质量和均匀度很重要。
有利地，本发明的抗污染组合物可为种子保护剂，或配制为种子保护剂，以防止种子的污染。
要用作种子的增殖材料通常用包含除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或其混合物的保护剂涂层处理。
在一个方面，抗污染组合物可用作种子的保护剂涂层和/或可包含保护剂涂覆敌菌种子的一种或多种组成组分。
常用的保护剂涂层包含如下化合物，诸如克菌丹、萎锈灵、福美双(TMTD&commat)、甲霜灵(Apron&commat)和甲基嘧啶磷(Actellic&commat)。抗污染组合物可使用任何此类化合物和/或使用制剂领域常用的另外的载体、表面活性剂或促施加助剂进行配制，以提供对抗细菌、真菌或动物害虫造成的污染的保护。
本发明的抗污染组合物或种子保护剂可通过用液体制剂浸渍增殖材料或通过用组合的湿或干制剂进行涂覆来施加。施加的其他方法也是可行的，诸如直接在芽或果实上处理。
种子可在由合适的封装材料构成的袋、容器或器皿中提供，所述袋或容器能够被关闭以包含种子。袋、容器或器皿可设计用于种子的短期或长期储存，或两者。合适的封装材料的例子包括纸(诸如牛皮纸)、刚性的或柔韧的塑料或其他聚合物材料、玻璃或金属。有利地，袋、容器或器皿由相同或不同类型封装材料的多个层构成。在一个实施例中，提供袋、容器或器皿以便排除或限制水和水分接触种子。在一个例子中，对袋、容器或器皿进行密封(例如热密封)以防止水或水分进入。在另一个例子中，吸水材料放置在封装材料层之间或相邻于封装材料层。在一个方面，将本发明的抗污染组合物施加在袋、容器或器皿或构成其的封装材料中或其上。
青贮饲料
在一个方面，农产品为青贮饲料。
在一个方面，抗污染组合物可用于制备青贮饲料(青贮法)。
在青贮饲料中，所需的乳酸发酵常伴有不期望的微生物污染物，尤其是由霉菌和腐败细菌产生的微生物污染物。
抗污染组合物可在制备青贮饲料之前、期间或之后添加，以对抗污染物，优选地微生物污染物。
表面接触材料
在一个方面，产品为表面接触材料，诸如油漆。WO 2009/156851公开了表面接触材料及其用途。WO 2009/156851的教导内容以引用的方式在本文中公开。
在一个方面，本发明涉及如在WO 2009/15861中所定义的表面接触材料，其还包含或被施加本发明的抗污染组合物。
在一个方面，本发明涉及减少和/或防止表面涂层材料的微生物污染物的方法，其包括将表面涂层材料或其组成组分与本发明的抗污染组合物混合。
在一个方面，本发明涉及减少和/或防止表面涂层材料的微生物污染物的方法，其包括将本发明的抗污染组合物施加到表面涂层材料或其组成组分上。
形式
本发明的产品和/或组合物可以任何合适的形式使用-无论是单独使用时还是存在于组合物中时。
抗污染组合物可以任何合适的方式配制，以确保该组合物包含无细胞发酵产物，所述无细胞发酵产物包含目标的活性化合物(一种或多种)。
在一个实施例中，抗污染组合物可配制为液体、干粉或颗粒。
干粉或颗粒可通过本领域技术人员已知的手段，例如，在顶喷式流化床涂布器中、在Wurster型底喷式流化床(buttom spray Wurster)中或通过转鼓制粒(例如高剪切制粒)、挤出、衣锅包衣或在微成分混合器中制备。
适当地，抗污染组合物可提供为喷雾干燥或冷冻干燥粉末。
在一个方面，该组合物为液体制剂形式。此类液体消费品可包含如下中的一者或多者：缓冲液、盐、山梨醇和/或甘油。
在一个实施例中，本发明的抗污染组合物可与至少一种选自如下中的至少一者的生理学上可接受的载体一起配制：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
分离的
在一个方面，优选地根据本发明的一种或多种化合物为分离形式。术语“分离的”意指化合物至少实质上不含发酵物的至少一种其他组分。本发明的化合物可以实质上不含所述化合物原本与之相关联的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可实质上不含一或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。
根据本发明，当移除至少10％的其他发酵物组成组分时化合物为“部分分离的”。适当地，如果移除大于或等于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的其他发酵物组成组分，则化合物为部分分离的。
纯化的
在一个方面，优选地选自如下的化合物中的至少一种为纯化形式：地非西丁、表面活性素、芽孢菌霉素(如芽孢菌霉素D)、丰原素、嗜铁素(bacillibactin)、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin(小菌素)、大环内酰亚胺、bacillaene和LCI，或其同源物或其类似物。该化合物有利地为存在于组合物的发酵产物中的主要组分。术语“纯化的”意指给定化合物以高水平存在。优选地，其是以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑总发酵产物以干重/基于干重来测定。
如本文所用的术语“化合物”是指单个化合物和/或多个化合物。因而，在一个方面，在提到化合物的量和/或水平的情况下，这是指具有抗污染活性的化合物的总组合量和/或水平，优选地以下化合物的总组合量和/或水平：地非西丁、表面活性素、芽孢菌霉素(如芽孢菌霉素D)、丰原素、嗜铁素(bacillibactin)、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin(小菌素)、大环内酰亚胺、bacillaene和LCI，或其同源物或其类似物。
变体/同源物/衍生物
术语“变体”和/或“衍生物”意指与主题分子具有结构和/或功能相似性的实体，其中主题分子和“变体”和/或“衍生物”之间的差别出现在原子水平。
本发明还涵盖多肽的任何氨基酸序列的变体、同源物和衍生物的应用。
在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
在该语境中，同源序列意欲包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列具有至少75、80、85或90％的同一性，优选至少95、96、97、98或99％的同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
在一个实施例中，如本文所教导的同源物为可与核糖体合成的肽(如plantazolicin或LCI)具有至少75、80、85或90％同一性，优选地至少95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中，plantazolicin可包括如下氨基酸序列之一：MTQIKVPTALIASVHGEGQHLFEPMAARCT CTTIISSSSTF(SEQ ID No.1)或MTKITIPTALSAKVHGEGQHLFEPMAARCT CTTIISSSSTF(SEQ ID No.2)或MITTTALPRAAAVTTTVYGEGLHLFEPMAARCTCSTVISTTCTWG(SEQ ID No.3)或MSTLINKLPPAVSTDSSKIVSEVQAFEPTAARCSCTTIPCCCCCGG(SEQ IDNo.4)或MSTLISKLPPAVSTDSSKIVSEVQAFEPTAARCSCTTLPCCCCSGG(SEQ ID No.5)或其同源物、衍生物或变体(或基本上由其组成或由其组成)。
在一个实施例中，如本文所教导的同源物为可与如下氨基酸序列之一：MTQIKVPTALIASVHGEGQHLFEPMAARCT CTTIISSSSTF(SEQ IDNo.1)、MTKITIPTALSAKVHGEGQHLFEPMAARCT CTTIISSSSTF(SEQID No.2)、MITTTALPRAAAVTTTVYGEGLHLFEPMAARCTCSTVISTTCTWG(SEQID No.3)、MSTLINKLPPAVSTDSSKIVSEVQAFEPTAARCSCTTIPCCCCCGG(SEQ IDNo.4)或MSTLISKLPPAVSTDSSKIVSEVQAFEPTAARCSCTTLPCCCCSGG(SEQ ID No.5)具有至少75、80、85或90％同一性，优选地至少95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中，如本文所教导的同源物为可与如下氨基酸序列之一：MTQIKVPTALIASVHGEGQHLFEPMAARCT CTTIISSSSTF(SEQ IDNo.1)、MTKITIPTALSAKVHGEGQH LFEPMAARCT CTTIISSSSTF(SEQID No.2)、MITTTALPRAAAVTTTVYGEGLHLFEPMAARCTCSTVISTTCTWG(SEQID No.3)、MSTLINKLPPAVSTDSSKIVSEVQAFEPTAARCSCTTIPCCCCCGG(SEQ IDNo.4)或MSTLISKLPPAVSTDSSKIVSEVQAFEPTAARCSCTTLPCCCCSGG(SEQ ID No.5)具有至少75、80、85或90％同一性，优选地至少95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，其中所述同源物为抗污染(如抗微生物)剂，例如所述同源物与plantazolicin功能等同。
在一个实施例中，LCI可包括如下氨基酸序列之一：MKFKKVLTGSALSLALLMSAAPAFAASPTASVENSPISTKADAGINAIKLVQSPNGNFAASFVLDGTKWIFKSKYYDSSKGYWVGIYESVDK(SEQ IDNo.6)、MKFKKVLTGSALSLALLMSAAPAFAASPTASASAEN SPISTKADAGINAIKLVQSPNGNFAASFVLDGTKWIFKSKYYDSSKGYWVGIYESVDK(SEQID No.7)、AIKLVQSPNGNFAASFVLDGTKWIFKSKYYDSSKGYWVGIYEVWDRK(SEQ ID No.8)、MFLLVFLCCLHLVISSHTPDESFLCYQPDQVCCFICRGAAPLPSEGECNPHPTAPWCREGAVEWVPYSTGQCRTTCIPYVE(SEQ ID No.9)、MKFKKVLTGSALSLALLMSAAPAFAASPTASASVENSPISTKADAGINAIKLVQSPNGNFAASFVLDGTKWIFKSKYYDSSKGYWVGIYESVDK(SEQID No.10)、MKFKKVLTGSALSLALLMSAAPAFAASPTASASAENSPISTKADAGINAIKLVQSPNGNFAASFVLDGTTWIFKSKYYDSSKGYWVGIYESVDK(SEQ ID No.11)或其同源物、衍生物或变体(或基本上由其组成或由其组成)。
在一个实施例中，如本文所教导的同源物为可与本文示出的氨基酸序列之一，如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11具有至少75、80、85或90％同一性，优选地至少95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中，如本文所教导的同源物为可与本文示出的氨基酸序列之一，如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11具有至少75、80、85或90％同一性，优选地至少95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，其中所述同源物为抗污染(如抗微生物)剂，例如所述同源物与LCI功能等同。
同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的％同源性。
％同源性可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种无空位比对仅在相对短数目的残基范围内进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，将大多数序列比较方法设计产生最佳比对，所述最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会过度罚掉整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每一个空位赋予“空位罚分”，从而对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对结果更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如，当使用GCG WisconsinBestfit程序包时，对于氨基酸序列的默认空位罚分为：空位-12，每个空位延伸-4。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux et al 1984 Nuc.Acids Research 12 p387(Devereux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387页))。其他可进行序列比较的软件的例子包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel et al.，1999 ShortProtocols in Molecular Biology，4th Ed-Chapter 18(Ausubel等人，1999年，《精编分子生物学方案》，第4版，第18章))、FASTA(Altschul et al.，1990 J.Mol.Biol.403-410(Ausubel等人，1990年，《分子生物学杂志》，第403-410页))以及比较工具的GENEWORKS程序包。BLAST和FASTA二者均可用于离线或在线搜索(参见Ausubel et al.，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，pages 7-58 to 7-60(Ausubel等人，1999年，《精编分子生物学方案》，第7-58至7-60页)。然而，对于某些应用，优选使用GCG Bestfit程序。称为BLAST 2Sequences的新型工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 174 1999(2)：247-50(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第174卷第2期，第247-250页)；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第177卷第1期，第187-188页)以及tatiabancbi.nlm.nih.gov)。
尽管最终的同源性百分数(％)也可以就同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见使用手册)。对于某些应用，优选使用GCG软件包的公用默认值，或者在其他软件的情形中，使用默认矩阵，如BLOSUM62。
作为另一种选择，百分比同源性可用DNASISTM(日立软件公司(Hitachi Software))中的多重比对功能，基于类似于CLUSTAL(HigginsDG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244(Higgins DG和Sharp PM，1988年，《基因》，第73卷第1期，第237-244页))的算法来计算。
一旦该软件已经产生最佳比对结果，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。
序列还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，所述缺失、插入或置换产生沉默改变和导致功能等同的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸置换，只要该物质的二级结合活性得以保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的含不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸。
可以例如根据下表进行保守置换。第二列中同一区组内的氨基酸，优选第三列中同一行内的氨基酸可以彼此置换：
本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代都用来指将现有的氨基酸残基用另选的残基进行交换)，即对等置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置换成另一类残基，或者涉及到加入非自然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
也可以用非天然氨基酸进行置换，包括：α*和α-二取代*的氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化衍生物(如三氟酪氨酸*、对氯苯丙氨酸*、对溴苯丙氨酸*、对碘苯丙氨酸*)、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物(如4-甲基-苯丙氨酸*、五甲基-苯丙氨酸*)、L-苯丙氨酸(4-氨基)#、L-酪氨酸(甲基)*、L-苯丙氨酸(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-苯丙氨酸(4-苄基)*。为了上文的讨论(与同源或非同源置换有关)的目的已利用记号*指示衍生物的疏水性，而已利用#指示衍生物的亲水性，#*指示两亲特性。
变体氨基酸序列可以包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另外的形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ et al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371(SimonRJ等人，《美国国家科学院院刊》，1992年，第89卷第20期，第9367-9371页)和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134(HorwellDC，《生物技术趋势》，1995年，第13卷第4期，第132-134页)。
现在将仅以举例的方式，参照如下附图和实例来描述本发明。
实例
实例1-抗细菌样品的制备
抗微生物菌株的生长
菌株：将枯草芽孢杆菌22C-P1(DCS 1579)、15A-P4(DCS 1580)、3A-P4(DCS 1581)、LSSAO1(DCS 1582)、ABP278(DCS 1583)和BS18(DCS 1584)从血琼脂上的深冻储用培养物中复苏。将每个培养物的分离菌落在CASO琼脂上划线并且在32℃下有氧地温育24小时。将每个培养物的一个菌落转移到50mL SARSTEDT管中的10mL CASO肉汤中并且在32℃下以130rpm倾斜振荡温育24小时。将0.5mL生长培养物转移到250mL锥形瓶中的50mL CASO肉汤并且在32℃下以130rpm振荡温育24小时。
抗细菌上清液样品的制备
完全生长的培养物以10.000×g离心两次，每次10分钟。对上清液过滤灭菌(利用真空)并且立即使用滤液。
实例2-抑制范围测定
孔扩散测定法用于评估在实例1中制备的对抗多个目标微生物(表1)的无细胞上清液(CFS)的抑制范围。针对每个指示微生物制备一个板。将包含3mL 2M磷酸钠(pH 6.5)的30mL熔融的琼脂培养基用150μl完全生长的过夜培养物接种并混合均匀。将悬浮液倒入omnitray并让其沉降30分钟。在琼脂内切出6个孔并且让其在LAF台中再敞开干燥30分钟。将每个复孔填满如先前所制备的100μl上清液并且在如表1中示出的相应温度、时间和条件下温育。在温育时间后，评估抑菌圈直径并且划分成抑制菌群。对于包括孔的多达10mm的抑菌圈直径，将活性标记为“+”，对于多达16mm的抑菌圈标记为“++”，并且对于超过16mm的标记为“+++”。
表1-用于第一抑制范围筛选的指示微生物的列表
结果
对抑制范围的实验在下表2至4中示出。测试的所有菌株的发酵物表现出对广范围的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌以及真菌的抑制活性。
表2-发酵物对革兰氏阳性细菌的活性
表3-发酵物对革兰氏阴性细菌的活性
表4-发酵物对真菌的活性
实例3-活性对热处理和各种PH的敏感性
将每个菌株的30mL CFS分成5mL的6个等分试样并且使用5M NaOH或5M HCl将pH调节至pH 4、5、6、7、8或9。将每个经pH调节的5mL等分试样过滤灭菌，分成0.8mL的5个等分试样并且在使用前保存在4℃下。
针对每个CFS，如在表5中所述施加热处理。将6个等分试样(每个pH值一个)在72℃下热处理15秒。温度使用在充有0.8mL CASO肉汤的eppendorf管中穿过盖上的孔的温度探针来监测。从温度达到72℃的时刻起计数15秒。另一组6个等分试样在100℃下热处理10分钟。温度使用在充有0.8mL CASO肉汤的eppendorf管中穿过盖上的孔的温度探针来监测。从温度达到95℃的时刻起计数10分钟。6个等分试样在37℃下温育24小时并且另一组6个在121℃热处理6分钟。最后，立即使用孔扩散测定法测定6个等分试样的活性。简而言之，将27mL混合有2.7mL 2M磷酸钠(pH 6.5)的熔融的PCA琼脂调温并且接种0.5％的单核细胞增多性李斯特菌DCS1081或大肠杆菌DCS 1396的过夜生长培养物。将悬浮液倒入omnitray盘并且让其在LAF台上沉降。使用钻孔器(2×6)在琼脂上打出12个孔并让其在室温下在LAF台中敞开干燥1小时。将100μl样品装入复孔中，并且让其在LAF台中直到所有液体被吸收。然后将板在37℃下过夜温育。孔周围的任何抑菌圈指示抑制。
表5。针对每组6个CFS的热处理方案如下
结果
结果在图1-12中示出。
所有发酵物对大肠杆菌DCS 1396和单核细胞增多性李斯特菌DCS1081均表现出抗微生物活性。来自BS18的未经热处理的发酵物表现出针对大肠杆菌的所有发酵物中的最高活性，而22C-P1和3A-P4的发酵物对单核细胞增多性李斯特菌的活性最强。
一般来讲，发酵物的抗革兰氏阴性菌活性以及抗革兰氏阳性菌活性在略碱性pH(pH 8-9)下保存最佳，而与所接收的样品的热处理无关。所有发酵物对大肠杆菌和单核细胞增多性李斯特菌的活性在pH 6和pH 9之间大部分保持完整。大多数发酵物的抗大肠杆菌活性在pH 4下实际上完全丧失。只有来自菌株DCS 1584的发酵物在此pH下保留其活性的约25％。
实例4-活性对酶的敏感性
以20mg/mL的浓度制备胰蛋白酶、脂肪酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、溶菌酶和过氧化氢酶溶于0.02M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中的样品。
将900μl未经pH调节(pH 6.8-7)的来自每个培养物的CFS与100μl的每种酶制剂混合。将混合物在37℃下温育4小时然后在100℃下热处理5分钟以钝化酶。热处理后，将管直接放在-20℃下5分钟，然后储存在4℃下。所有样品均使用如先前所述的孔扩散测定法测试抗单核细胞增多性李斯特菌DCS 1081和大肠杆菌DCS 1396(表6)的残余活性。
表6。使用酶对CFS和对照的处理
将900μl CASO肉汤与100μl的每种酶混合然后进行相同的温育、加热和冷却程序并且用作阴性对照。将450μl的所有CFS与50μl 0.02M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)混合然后进行相同的温育、加热和冷却程序以用作阳性对照。基准包括CASO中的3％H2O2和CASO肉汤中的100ppm多粘菌素B(西格玛(Sigma))。样品使用如先前所述的孔扩散测定法测试抗单核细胞增多性李斯特菌DCS 1081和大肠杆菌DCS 1396(如在表7中所示)的残余活性。
表7使用酶对基准的处理
结果
结果示于图表13和14中。
一般来讲，蛋白水解酶对发酵物的抗大肠杆菌和抗单核细胞增多性李斯特菌活性的影响是适度的。结果表明，脂肪酶对任一发酵物的任一种活性不太可能有影响，对来自菌株ABP278和BS18的发酵物的抗大肠杆菌活性和来自菌株LSSAO1和ABP278的发酵物的抗李斯特氏菌属活性可能除外。在冷却步骤之后在任一发酵物中添加过氧化氢酶或溶菌酶得到沉淀，其继而对几乎所有活性均具有显著的负面影响。观察到抗大肠杆菌和抗单核细胞增多性李斯特菌活性集中在沉淀物中并且明显不是由于H2O2的降解。导致沉淀物在液相中重悬的强力摇动恢复部分活性。
在有活性的肉汤中添加过氧化氢酶和/或溶菌酶可证明用于抗微生物化合物的部分纯化的备受关注的方法。
实例5-活性保存研究
如先前所述制备来自所测试的全部6个菌株的培养物的CFS。如先前所述将每个培养物上清液调节至pH 9、过滤灭菌并且在100℃下热处理10分钟。然后将每个经热处理的CFS分成30个等分试样并且储存在表20中所述的条件下。为了将等分试样置于暗处，用铝箔包裹小瓶。为了引入真空，使用冷冻干燥。将等分试样倒入配有橡胶盖的冻干玻璃瓶中并插入冷冻干燥器。抽真空直到不再有气泡从液体产生并且盖子在真空下封闭。将金属盖安装在橡胶盖上以保持真空。
步骤3(表19)后使用如先前所述的孔扩散测定法测定所有CFS的制剂抗大肠杆菌DCS 1396和单核细胞增多性李斯特菌DCS 1081的活性并且视为活性基准。在制备后24小时和13天使用如先前所述的孔扩散测定法测定来自所有CFS和所有处理的等分试样的残余活性。
表8-用于活性保存研究的CFS处理组
步骤1 步骤2 步骤3 步骤4
处理1 pH 9 过滤灭菌 在100℃下10分钟 5个等分试样，在4℃下
处理2 pH 9 过滤灭菌 在100℃下10分钟 5个等分试样，在-20℃下
处理3 pH 9 过滤灭菌 在100℃下10分钟 5个等分试样，暗处，在4℃下
处理4 pH 9 过滤灭菌 在100℃下10分钟 5个等分试样，暗处，在-20℃下
处理5 pH 9 过滤灭菌 在100℃下10分钟 5个等分试样，真空*，在4℃下
处理6 pH 9 过滤灭菌 在100℃下10分钟 5个等分试样，真空*，在-20℃下
结果
表9-储存条件对发酵物对大肠杆菌DCS 1336的活性的影响
表10-储存条件对发酵物对大肠杆菌DCS 1336的活性的影响
表11-储存条件对发酵物对大肠杆菌DCS 1336的活性的影响
表12-储存条件对发酵物对大肠杆菌DCS 1336的活性的影响
显然发酵物在真空下的发酵物储存显著地改善了储存期间抗大肠杆菌的活性的保存。这在储存在4℃下的样品中特别明显，其中在真空下的储存成功地保留了几乎100％的发酵物对大肠杆菌的初始活性，相比之下储存在4℃下无真空的样品，其活性在34天储存后完全丧失。
所有发酵物对单核细胞增多性李斯特菌的活性似乎无论采用何种保存方法都不受影响。
实例6-次生代谢物的枯草芽孢杆菌菌株22C-P1、15A-P4、3A-P4、 BS2084和BS8的挖掘和比较基因组学
将来自5个商用芽孢杆菌属菌株(15A-P4，22C-P1，3A-P4，BS2084，BS8)的草图基因组与公开的解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株FZB42比较。菌株FZB42具有一系列涉及合成具有抗真菌、抗细菌和杀线虫活性的脂肽和聚酮化合物的九个巨大基因簇(Chen等人，2007)。挖掘将阐明对病原体抑制的作用模式的次生代谢物的基因组。
结果
表13示出了枯草芽孢杆菌菌株15A-P4、22C-P1、3A-P4、BS2084、 LSSA01、BS18中编码次生代谢物的基因的存在。
Nrs 1和Nrs 2为两个尚未命名的非核糖体肽的标号。
实例7
孔扩散测定法用于评估在实例1中制备的对抗多个目标微生物(表1)的无细胞上清液(CFS)的抑制范围。
使用的平板扩散测定方案在实例2中有所描述。
表14-示出了S18和ABP 278的无细胞上清液对所测试的污染微生物 的广谱活性。
实例8-储存条件对发酵物在超高温灭菌乳食物模型中的活性和应用的 影响
实验
发酵物制备和储存条件对活性的影响数据
“有效浓度测定”方案
在具有平底孔的96孔微量滴定板中，在根据表15的孔中添加CASO肉汤。将一百五十μl的两倍浓度CASO肉汤(即由如制造商推荐的每体积粉末量的双倍组成的CASO肉汤)添加到孔B1、C1、D1、E1、F1、G1、B12、C12、D12、E12、F12和G12。孔B2-B11、C2-C11、D2-D11、E2-E11、F2-F11和G2-G11填有100μl正常浓度CASO肉汤。
表15：用生长培养基填充微量滴定板以用于活性测定。
将150μl含无菌抗微生物剂的样品1添加到孔B1、C1、D1的每一个中，将150μl含无菌抗微生物剂的样品2添加到孔E1、F1、G1的每一个中，将150μl含无菌抗微生物剂的样品3添加到孔B12、C12、D12的每一个中，以及将150μl含无菌抗微生物剂的样品4添加到孔E12、F12和G12的每一个中。随后，通过按顺序从列1至5并且以相反顺序从列12至8水平转移200μl样品(根据表16)来完成样品在这些孔中的1.5×稀释。
无样品添加到孔B6、C6、D6、E6、F6、G6、B7、C7、D7、E7、F7和G7中。
将调节至5×105cfu/mL的95μl正常浓度CASO肉汤和5μl目标菌株制剂(表18)添加至孔B1-B6、B8-B12、C1-C6、C8-C12、D1-D6、D8-D12、E1-E6、E8-E12、F1-F6、F8-F12、G1-G6和G8-G12。将仅100μl CASO肉汤添加至孔C7、D7、E7、F7和G7。
表16：微量滴定板和其中包含抗微生物剂的被制备用于测定样品活性 的样品稀释液的布局的例子
有效地，根据表17在行B1-B6、C1-C6、D1-D6、E1-E6、F1-F6的每一者并且以相反顺序在行B12-B8、C12-C8、D12-D8、E12-E8、F12-F8和G12-G8中水平创建所测定样品的浓度梯度。孔B6、C6、D6、E6、F6、G6用作阳性对照，并且孔B7、C7、D7、E7、F7和G7用作阴性对照。
表17：所测定样品在微量滴定板中的浓度布局。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B 25％ 16.7％ 11.1％ 7.4％ 4.9％ 4.9％ 7.4％ 11.1％ 16.7％ 25％
C 25％ 16.7％ 11.1％ 7.4％ 4.9％ 4.9％ 7.4％ 11.1％ 16.7％ 25％
D 25％ 16.7％ 11.1％ 7.4％ 4.9％ 4.9％ 7.4％ 11.1％ 16.7％ 25％
E 25％ 16.7％ 11.1％ 7.4％ 4.9％ 4.9％ 7.4％ 11.1％ 16.7％ 25％
F 25％ 16.7％ 11.1％ 7.4％ 4.9％ 4.9％ 7.4％ 11.1％ 16.7％ 25％
G 25％ 16.7％ 11.1％ 7.4％ 4.9％ 4.9％ 7.4％ 11.1％ 16.7％ 25％
H
表18：用于本研究的目标微生物
然后将微量滴定板在30℃下温育24-48小时并且通过定期测量(dt＜1h)监测每个孔在620nm下的光密度的增速。
孔A1、B1和C1为相同样品和相同浓度的三重平行样，孔A2、B2和C2为相同样品但是为A1、B1和C1浓度的2/3的三重平行样，以此类推。计算三重平行样的平均光密度值并且扣除空白光密度(列7中每个时间点的三重平行样的平均值)。对时间绘制所得的OD值，如可见于图16中。如可见于该图中，含抗微生物剂样品的浓度越高，OD的增速越慢。
在OD＝0.1处绘制水平阈值并且使用Microsoft Excel函数中两点之间的线性相关外推出针对每一条曲线y＝0.1时的相应x值(图17)。推导的x值的自然对数(ln)相对于每条曲线代表的样品浓度作图。在图17中示出的例子中，发酵物的最高浓度为25％并且稀释液的浓度分别为16.7％、11.1％、7.4％、4.9％和0％(用于阴性对照)。对于y＝0.1，推导出的x值分别为19.66、18.88、18.17、17.58、17.25和16.29小时。在图18中示出了绘制达到OD为0.1的时间的自然对数值与浓度值的图。
样品的有效浓度随意地定义为引起指示微生物培养物达到光密度0.1(620nm)延迟3小时所需的浓度，其由趋势线方程(图18)计算得来，并且其表达为％v/v。
液体样品活性的测定：
样品的抗微生物单位/mL定义为：
三个独立实验和测定中发酵物的制备：
培养条件：
将菌株枯草芽孢杆菌15A-P4(DCS 1580)、3a-P4(DCS 1581)、LSSAO1(DCS 1582)和BS18(DCS 1584)从CASO琼脂上的深冻储用培养物中复苏。将每个培养物的分离菌落在CASO琼脂上划线并且在32℃下有氧地温育直到形成界限清楚的菌落(24-30小时)。将每个菌株的一个菌落转移到50mL管中的10mL CASO肉汤中并且在32℃下以130rpm倾斜振荡温育24小时。将1mL生长培养物转移到500mL锥形瓶中的100mL CASO肉汤中并且在32℃下以130rpm振荡温育24小时。
不同发酵物的制备：
完全生长的培养物以10000×g离心30分钟。将上清液的pH使用5MKOH调节至pH 9并且在95℃下热处理10分钟。冷却后，加入750ppm抗坏血酸并且再次检查pH以确保其在pH 8和pH 9之间。然后对溶液过滤灭菌(0.2μm)。取各5mL的三个等分试样并对其中之一立即测定活性。将另外两个等分试样在测定前冷冻在-20℃下。将发酵物制剂的剩余部分分成无菌塑料杯中的3×25mL等分试样并且冷冻在-80℃下。对冷冻样品进行冷冻干燥2-3天。冷冻干燥后，在真空下将干燥粉末无菌收集和包装在无菌铝箔袋中并且在测定前保存在4℃下。
测定不同发酵物的抗微生物活性：
将两个5mL等分试样在制备后的7天和14天测定(图19)。从冰箱中取出等分试样并且在用于如先前所述的抗微生物活性测定之前放在工作台上解冻。
在制备后7、14和21天测定3个冷冻干燥的样品。将袋中的冷冻干燥的样品在用于如先前所述的抗微生物活性测定之前重悬于25mL的去离子水中。
发酵物在食物模型中的应用：
产发酵物的微生物的培养条件：
将菌株枯草芽孢杆菌15A-P4(DCS 1580)、3A-P4(DCS 1581)、LSSAO1(DCS 1582)和BS18(DCS 1584)从CASO琼脂上的深冻储用培养物中复苏。将每个培养物的分离菌落在CASO琼脂上划线并且在32℃下有氧地温育直到形成界限清楚的菌落(24-30小时)。将每个菌株的一个菌落转移到50mL管中的10mL CASO肉汤中并且在32℃下以130rpm倾斜振荡温育24小时。将1mL生长培养物转移到500mL烧瓶中的6×100mL CASO肉汤中的每一个并且在32℃下以130rpm振荡温育24小时。
不同发酵物样品的制备：
完全生长的培养物以10,000×g离心30分钟。将上清液合并在一起，添加750ppm的抗坏血酸，并且使用5M KOH将pH调节至pH 9。然后对溶液过滤灭菌(0.2μm)。将2mL经过滤灭菌的上清液保存以供测定(参见段落“用于食物模型应用的发酵物制剂的测定”)，并将剩余部分(约600mL)分成广口培养皿中各约150mL的4个等分试样并在-80℃下冷冻。随后对其进行冷冻干燥72小时或直到产生无水分的粉末。在真空下收集、以铝箔小袋包装粉末，并且在使用前保存在4℃下。
用于食物模型应用的发酵物制剂的测定：
刚好在应用于食物模型之前评估发酵物粉末的活性。将一克小袋中的冷冻干燥粉末重悬于水中以达到与制备它的液体样品相同的固体浓度并且使用如先前所述基于微量滴定板的液体测定法测定对大肠杆菌DCS 495的活性。
用于食物模型应用研究的指示菌株的制备：
使用表19中列出的生长条件通过用来自血琼脂平板的菌落接种10mL肉汤将如在表19示出的6个指示菌株生长过夜。完全生长的培养物使用TEMPO EB计数(肠杆菌方案(Enterobacteriaceae protocol)，(生物梅里埃公司(bioMérieux)(Owen M.et al.，“Evaluation of themostprobable number technique for the enumeration of Enterobacteriaceae in foodand dairy products”，Journal of Applied Microbiology，109，1810-1816(Owen M.等人，“用于计数食物和乳制品中肠杆菌的最大或然数法的评估”，《应用微生物学杂志》，第109卷，第1810-1816页))))并且在使用前保存在4℃下(过夜)。大肠杆菌和沙门氏菌菌种的库通过混合单独的培养物制备，以在一个悬浮液中达到等同的cfu/mL计数。
表19：用于食物模型应用研究的指示菌株
*乳酸肉汤：补充有0.1％吐温80的Elliker肉汤。
样品的制备和接种：
从零售商处购买超高温灭菌乳并且用作食物模型研究。对多批700mL超高温灭菌乳补充冷冻干燥的发酵物或冷冻干燥的CASO肉汤以达到每个实验的所需浓度(参加表20-23)。还有一批700mL超高温灭菌乳未用任何添加剂处理并且用作阳性对照。测量各批次的pH，将每批超高温灭菌乳(处理或未处理的)分装到50mL容器中。对用于每个实验的每批6个容器接种如先前所述制备的大肠杆菌或沙门氏菌菌种库(2个目标×3个三重平行样)。3个容器不接种任何目标微生物并且用作对照。所有样品在12℃下温育。所有发酵物在四个不同日期下以单独试验测试(表20-23)。
表20：在第1天的试验安排。
试验 抗微生物剂 浓度 种菌 水平 平行样
1 - - 大肠埃希氏菌库 102CFU/g A，B，C
2 - - 沙门氏菌库 102CFU/g A，B，C
3 - - - - A，B，C
4 S1582 1％w/v 大肠埃希氏菌库 102CFU/g A，B，C
5 S1582 1％w/v 沙门氏菌库 102CFU/g A，B，C
6 S1582 1％w/v - - A，B，C
表21：在第2天的试验安排。
试验 抗微生物剂 浓度 种菌 水平 平行样
7 - - 大肠埃希氏菌库 102CFU/g A，B，C
8 - - 沙门氏菌库 102CFU/g A，B，C
9 - - - - A，B，C
10 S1584 1％w/v 大肠埃希氏菌库 102CFU/g A，B，C
11 S1584 1％w/v 沙门氏菌库 102CFU/g A，B，C
12 S1584 1％w/v - - A，B，C
13 CASO 1％w/v 大肠埃希氏菌库 102CFU/g A，B，C
14 CASO 1％w/v 沙门氏菌库 102CFU/g A，B，C
15 CASO 1％w/v - - A，B，C
表22：在第3天的试验安排。
试验 抗微生物剂 浓度 种菌 水平 平行样
16 - - 大肠埃希氏菌库 102CFU/g A，B，C
17 - - 沙门氏菌库 102CFU/g A，B，C
18 - - - - A，B，C
19 S1580 1％w/v 大肠埃希氏菌库 102CFU/g A，B，C
20 S1580 1％w/v 沙门氏菌库 102CFU/g A，B，C
21 S1580 1％w/v - - A，B，C
表23：在第4天的试验安排。
试验 抗微生物剂 浓度 种菌 水平 平行样
22 - - 大肠埃希氏菌库 102CFU/g A，B，C
23 - - 沙门氏菌库 102CFU/g A，B，C
24 - - - - A，B，C
25 S1581 1％w/v 大肠埃希氏菌库 102CFU/g A，B，C
26 S1581 1％w/v 沙门氏菌库 102CFU/g A，B，C
27 S1581 1％w/v - - A，B，C
样品的微生物学分析：
如受到乳样品的处理影响的污染生物体的存活通过在(生物梅里埃公司(bioMérieux))上计数来监测。从每个样品取出10mL处理或未处理的乳并且在缓冲蛋白胨中进行适当稀释后，对其进行分析。使用EB方案(生物梅里埃公司(bioMérieux)(Owen M.et al.，“Evaluation of themost probable number technique for theenumeration of Enterobacteriaceae in food and dairy products”，Journal ofApplied Microbiology，109，1810-1816(Owen M.等人，“用于计数食物和乳制品中肠杆菌的最大或然数法的评估”，《应用微生物学杂志》，第109卷，第1810-1816页)))对沙门氏菌菌种和大肠杆菌计数。利用TEMPO TVC方案(生物梅里埃公司(bioMérieux)(Crowley et al.，“TVC for the Enumeration of Aerobic Mesophilic Flora in Foods：Collaborative Study”，Journal of AOAC International，Vol.92，No.1，January2008，pp.165-174(10)(Crowley等人，“用于计数食物中的需氧嗜中温菌群的TVC：协作研究”，《国际公职分析化学师协会志》，2008年1月，第92卷，第1期，第165-174页(共10页))))分析未接种的样品以说明背景菌群的生长。
结果
发酵物制备和储存条件对活性的影响数据：
液体发酵物制剂的活性：
在3个不同日期按照相同的程序制备每种发酵物并评估它们抗多个微生物的活性。来自3个不同日期的每种发酵物抗目标微生物中每一个的平均活性在图20-23中示出。
不同储存条件对所有发酵物的活性的影响：
要评估储存条件对所有发酵物的活性的影响，对于第0天、第7天、第14天取抗所有目标微生物并且来自所有三个不同制备日期的平均活性。对于冷冻干燥的样品还包括第21天。活性随时间以及在不同储存条件下的变化示于图24和25中。
发酵物在食物模型中的应用：
发酵物在超高温灭菌乳中的应用：
4种不同的发酵物在掺有大肠杆菌和沙门氏菌菌种库的超高温灭菌乳模型中的抗微生物活性示于图26至33中。
讨论
所有发酵物的活性在作为液体制剂储存在-20℃下或作为冷冻干燥制剂储存在4℃下分别经过至少14和21天期间证明是稳定的。
所有发酵物表现出保持生长或消除大肠杆菌和沙门氏菌(至低于检测限)的能力。与未处理的样品相比并且在12℃的超限温度下经过6天温育期后，在抗所有测试的目标微生物的所有情况下观察到7-8log cfu减少。
在所有发酵物中，DCS1582在杀死分别温育24和48小时的沙门氏菌和大肠杆菌方面表现得比其余的好。该结果是可预期的，因为该特定发酵物的初始活性较高。为了补偿此活性差别，相比于之前使用的1％，在食物中使用1.8％浓度的发酵物DCS1584。因此，该发酵物实现了杀死温育24小时的沙门氏菌，以及在6天后杀死大肠杆菌。来自芽孢杆菌DCS 1580的发酵物表现相当并且这与在四个中第二高的发酵物活性一致。最后，发酵物1581实现在食物模型中以其初始接种率控制大肠杆菌和缓慢减少沙门氏菌菌种，这与刚好在使用前所测量的其活性一致。
实例9-使用枯草芽孢杆菌无细胞上清液BS18和15AP4来控制沙门氏 菌
肠道沙门氏菌肠道亚种是美国食源性疾病的主要原因，并且是温血动物的几乎所有沙门氏菌感染的来源。因为人类紧挨着其宠物居住，所以存在从处理污染的食物物品中获得沙门氏菌感染的可能性，这将构成健康风险。近年来，由于对宠物食物加工设施的审查已不断加强以保持宠物食物产品的质量和安全性并且由于大量的召回，沙门氏菌污染已在宠物食物行业中日益受到关注。
用于本实例中的肠道沙门氏菌肠道亚种菌株的详细信息在表25和26中示出。
从宠物食物加工设施中获得原料样品、后挤出粗磨涂层和环境抽汲样品样品以通过使用16S rRNA基因测序、凝集、测试和RAPD PCR作图来表征涉及污染的沙门氏菌分离菌的多样性。将样品预富集在蛋白胨中，选择性地富集在四硫磺酸盐肉汤培养基(TT)肉汤(Tetrathionate Broth BaseHajana(TT)Broth)，然后涂布在XLT-4琼脂平板上。从如下四种样品中的每一者收集充分分离的菌落：肉粉和骨粉、鸡肉副产品粉、工人靴和用来拖地的橡胶扫帚。16S rRNA测序表明所有分离菌具有与肠道沙门氏菌肠道亚种＞97％的序列同一性。凝集测试确定分离菌属于血清组C(54)、E或G(32)，或不产生反应(9)。通过BioNumerics软件使用未加权组对算数平均法(UPGMA)和Dice相关系数来分析RAPD谱图并按相似性聚类。在80％相似性下，分离菌形成9个主要聚类，主要按样本来源和血清组分组。非沙门氏菌分离菌(柠檬酸杆菌菌种(Citrobacter spp.)、克罗诺杆菌菌种(Cronobacter spp.)和肠杆菌菌种(Enterobacter spp.))用于在构造的树状图中作为比较基础。参照图34，用于树状图中示出的多样性的可视化表示。
在95个分离菌中，将14个分离菌选作多样性的代表(表24)以确定以下菌株BS18和15AP4的枯草芽孢杆菌无细胞上清液的抑菌谱。形成无细胞上清液(发酵物)并且抑制肉汤测定法用于测量这些上清液对目标生物体的影响。
表24：从宠物食物设施获得的被选择用于表示从这些样品中发现的多 样性的肠道沙门氏菌肠道亚种分离菌。
标号 菌种 血清组 来源
E5-13 肠道沙门氏菌 E或G 工人靴
C8 肠道沙门氏菌 C 鸡肉副产品粉
E5-29 肠道沙门氏菌 E或G 工人靴
C30 肠道沙门氏菌 C 鸡肉副产品粉
E 5-16 肠道沙门氏菌 E或G 工人靴
E 5-4 肠道沙门氏菌 E或G 工人靴
C37 肠道沙门氏菌 无反应 鸡肉副产品粉
C19 肠道沙门氏菌 C 鸡肉副产品粉
M5 肠道沙门氏菌 C 肉粉和骨粉
M14 肠道沙门氏菌 C 肉粉和骨粉
E5-9 肠道沙门氏菌 E或G 工人靴
C3 肠道沙门氏菌 C 鸡肉副产品粉
C22 肠道沙门氏菌 C 鸡肉副产品粉
S4 肠道沙门氏菌 E或G 橡胶扫帚
除上述菌株外，还选择肠道沙门氏菌肠道亚种的总共29个另外的代表性分离菌(表25)用于在抑制肉汤测定法中进行测试。表25概述了测试的血清型的种类。所有分离菌均为已知的涉及多种宠物食物(粗粒、零食、猪耳零食、生的宠物食物、冷冻的宠物食物和存在于宠物食物工厂的食物)的中毒/召回的血清型。
表25：与宠物食物召回/中毒相关的多种血清型的肠道沙门氏菌肠道亚 种分离菌
数目 菌种 血清型 血清组 研究鉴定的中毒来源
586 肠道沙门氏菌 鼠伤寒 B 宠物零食
707 肠道沙门氏菌 新港 C 宠物零食
1231 肠道沙门氏菌 哈达尔 C 生的宠物食物
1278 肠道沙门氏菌 婴儿 C 猪耳零食/狗粮
1329 肠道沙门氏菌 布灵得卢柏 C 生的宠物食物
1332 肠道沙门氏菌 鸭 E 宠物零食
1337 肠道沙门氏菌 布灵得卢柏 C 生的宠物食物
1638 肠道沙门氏菌 德尔卑 B 宠物食物工厂
1658 肠道沙门氏菌 史华氏 B 生的宠物食物
1661 肠道沙门氏菌 田纳西 C 狗粮
2274 肠道沙门氏菌 鸭 E 宠物零食
2341 肠道沙门氏菌 姆班达卡 C 冷冻的宠物食物
2637 肠道沙门氏菌 史华氏 B 生的宠物食物
2735 肠道沙门氏菌 俄亥俄 C 宠物零食
2755 肠道沙门氏菌 姆班达卡 C 冷冻的宠物食物
3917 肠道沙门氏菌 哈达尔 C 生的宠物食物
5868 沙门氏菌菌种 鼠伤寒 B 宠物零食
7111 肠道沙门氏菌 婴儿 C 猪耳零食/狗粮
12960 肠道沙门氏菌 桑夫顿堡 E 狗食物/零食
13062 肠道沙门氏菌 田纳西 C 狗粮
13069 肠道沙门氏菌 姆班达卡 C 冷冻的宠物食物
13079 肠道沙门氏菌 新港 C 宠物零食
13168 肠道沙门氏菌 桑夫顿堡 E 狗食物/零食
1255 肠道沙门氏菌 蒙得维的亚 C 狗食物
1492 肠道沙门氏菌 蒙得维的亚 C 狗食物
13071 肠道沙门氏菌 蒙得维的亚 C 狗食物
1336 肠道沙门氏菌 汤普森氏 C 宠物零食
1339 肠道沙门氏菌 汤普森氏 C 宠物零食
3898 肠道沙门氏菌 诺伊斯特尔 C 宠物零食
用于制备枯草芽孢杆菌无细胞上清液的方法
简而言之，将每个培养物的分离菌落在胰酶大豆琼脂(TSA)上划线并且在32℃下有氧地温育24小时。将每个培养物的一个菌落转移到50mL圆底管中的10mL TSB中并且在32℃下以130rpm振荡温育24小时。将生长培养物的0.5mL等分试样转移到250mL锥形瓶中的50mL TSB中并且在32℃下以130rpm振荡温育24小时。完全生长的培养物以10,000×rpm离心两次，每次10分钟。对上清液过滤灭菌然后以单独的等分试样储存在-20℃下。无细胞上清液在用于抑制肉汤测定法中时单独解冻。
抑制肉汤测定法
进行肉汤测定法以确定由于上述CFS而导致的沙门氏菌分离菌的细菌生长的减少。将沙门氏菌分离菌的单个充分分离菌落挑取到脑心浸液肉汤(BHI)(碧迪公司(BD)产品号238400)中并在37℃下生长24小时并用作目标生物体。为了设置肉汤测定法，将96孔微量滴定板的每孔用0.18mL的BHI填充，以一式两份设置，含(经CFS处理)10％(体积比)和50％(体积比)的CFS和不含(对照)CFS(方法1和2制备的)。所有孔均用1％(体积比)的目标生物体接种并且将96孔板在37℃下温育24小时。测量OD595并且针对处理与对照结果报告百分比抑制值。
结果
图35表示从枯草芽孢杆菌菌株BS18和15AP4获得的发酵物的抑制活性。两种发酵物均表现出对从宠物食物加工工厂获得的沙门氏菌多样性的广谱抑制。如从10％(体积比)增加至50％(体积比)的抑制所示，预期CFS的效力在促进细菌减少以及改善菌谱方面具有作用。
来自BS18和15AP4的发酵物使用先前涉及多种宠物食物的中毒/召回的已知血清型的分离菌在抑制肉汤测定法中进行测试时也观察到类似结果(图36)。
这些数据表明来自BS18和15AP4二者的发酵物显示出抗多种肠道沙门氏菌菌株的有效生长抑制。
实例10-使用枯草芽孢杆菌无细胞上清液22CP1、LSSA01、3AP4和 BS2084来控制沙门氏菌
方法
用于测试22CP1、LSSA01、3AP4和BS2084无细胞上清液的目标生物体与实例9中的那些相同，在表25和26中示出。
简而言之，将每个培养物的分离菌落在胰酶大豆琼脂(TSA)上划线并且在32℃下有氧地温育24小时。将每个培养物的一个菌落转移到50mLSARSTEDT管中的10mL TSB中并且在32℃下以130rpm倾斜振荡温育24小时。将生长培养物的0.5mL等分试样转移到250mL带挡板锥形瓶(增加通气)中的50mL TSB中并且在32℃下以130rpm振荡温育24小时。完全生长的培养物以12,000×g离心两次，每次30分钟。对上清液过滤灭菌，加入750ppm抗坏血酸，使用KOH将上清液pH调节至9，最后再次过滤灭菌。在抑制肉汤测定法中，在制备前立即使用无细胞上清液，在实例9中详述。
结果
图37表示从枯草芽孢杆菌菌株22CP1、LSSA01、3AP4和BS2084获得的发酵物的抑制活性。所有发酵物均表现出对从宠物食物加工工厂获得的沙门氏菌多样性的广谱抑制。如从10％(体积比)增加至50％(体积比)的抑制所示，预期CFS的效力在促进细菌减少以及改善菌谱方面具有作用。
当测试从枯草芽孢杆菌菌株22CP1、LSSA01、3AP4和BS2084获得的无细胞上清液抗先前涉及多种宠物食物的中毒/召回的已知血清型的分离菌时，也观察到类似的结果(图38)。
这表明，以类似于无细胞上清液在实例9中进行测试的方式，这些发酵物还表现出抗多种沙门氏菌分离菌的生长抑制。
实例11-使用枯草芽孢杆菌无细胞上清液ABP278来控制沙门氏菌
方法
简而言之，将每个培养物的分离菌落在胰酶大豆琼脂(TSA)上划线并且在32℃下有氧地温育24小时。将每个培养物的一个菌落转移到50mL圆底管中的10mL TSB中并且在32℃下以130rpm振荡温育24小时。将生长培养物的0.5mL等分试样转移到250mL锥形瓶中的50mL TSB中并且在32℃下以130rpm振荡温育24小时。完全生长的培养物以10,000×rpm离心两次，每次10分钟。对上清液过滤灭菌然后以单独的等分试样储存在-20℃下。无细胞上清液在用于抑制肉汤测定法中时单独解冻，如在实例9中所详述。
选择的用于实例9和10的目标生物体用测试ABP278的抑制活性。
结果
图39表示从枯草芽孢杆菌菌株ABP278获得的发酵物的抑制。发酵物表现出对从宠物食物加工工厂获得的沙门氏菌多样性的有效抑制。如从10％(体积比)增加至50％(体积比)的抑制所示，预期CFS的效力在促进细菌减少以及改善菌谱方面具有作用。
当测试从枯草芽孢杆菌菌株ABP278获得的无细胞上清液抗先前涉及多种宠物食物的中毒/召回的已知血清型的分离菌时，也观察到类似的结果(图40)。
这表明，以类似于无细胞上清液在实例9和10中进行测试的方式，这些发酵物还表现出抗多种沙门氏菌分离菌的生长抑制。
实例12-使用干燥的枯草芽孢杆菌发酵物来显示对狗粮上的多种沙门 氏菌分离菌的抑制
宠物食物组合物受到致病菌株(诸如沙门氏菌)的微生物污染，其对宠物及主人都构成潜在的健康风险。将LSSA01(DCS 1582)、BS 18(DCS1584)、ABP278(DCS 1583)和3A-P4(DCS 1581)的冷冻干燥的芽孢杆菌属发酵物涂布在硬挤出的狗粮上并且测试它们抗肠道沙门氏菌菌种(Salmonella enteritica spp.)库的抗革兰氏阴性菌效力。将其与狗粮未涂布有发酵物的阴性对照比较。
方法
培养条件：
将菌株枯草芽孢杆菌15A-P4(DCS 1580)、3A-P4(DCS 1581)、LSSA01(DCS 1582)和BS18(DCS 1584)从CASO琼脂上的深冻储用培养物中复苏。将每个培养物的分离菌落在CASO琼脂上划线并且在32℃下有氧地温育直到形成界限清楚的菌落(24-30小时)。将每个菌株的一个菌落转移到50mL管中的10mL CASO肉汤中并且在32℃下以150rpm倾斜振荡温育24小时。将1mL15A-P4(DCS 1580)、LSSAO1(DCS 1582)和BS18(DCS 1584)的生长培养基转移到500mL带挡板锥形瓶(增加通气)中的100mL CASO肉汤中并且在32℃下以150rpm振荡温育24小时。将1mL3A-P4(DCS 1581)的生长培养物转移到500mL锥形瓶中的100mL CASO肉汤中并且在32℃下以150rpm振荡温育24小时。
不同发酵物的制备：
完全生长的培养物以10000×g离心30分钟。对上清液过滤灭菌。将750ppm抗坏血酸添加到上清液并使用5M KOH将上清液的pH调节至pH9。然后对溶液过滤灭菌(0.2μm)。将发酵物制剂分成无菌塑料杯中的3×25mL等分试样并且冷冻在-80℃下。对冷冻样品进行冷冻干燥2-3天。冷冻干燥后，在真空下将干燥粉末无菌收集和包装在无菌铝箔袋中并且在测定前保存在4℃下。
用于宠物食物模型应用研究的指示菌株的制备：
使用肠道沙门氏菌肠道亚种的不同菌株制备沙门氏菌混合物。这些菌株被选择用于代表先前涉及挤出的宠物食物中沙门氏菌中毒/召回的沙门氏菌的多样性。该多样性包括血清型桑夫顿堡、蒙得维的亚、鼠伤寒、史华氏、肠道和新港，所有血清型都落在血清组E、C和B的范围内。
将如表26中所示的6个指示菌株通过用来自血琼脂平板的菌落接种10mL CASO肉汤在37℃下过夜培养。完全生长的培养物使用EB计数(生物梅里埃公司(bioMérieux)(Owen M.et al.，“Evaluation of themost probable number technique for the enumeration ofEnterobacteriaceae in food and dairy products”，Journal of AppliedMicrobiology，109，1810-1816(Owen M.等人，“用于计数食物和乳制品中肠杆菌的最大或然数法的评估”，《应用微生物学杂志》，第109卷，第1810-1816页)))并且在使用前保存在4℃下(过夜)。沙门氏菌菌种的库通过混合单独的培养物制备，以在一个悬浮液中达到等同的CFU/mL计数。
表26：用于食物模型应用研究的指示菌株(还可参见表25和26)。
数目 菌种 血清型 血清组 来源
586(DCS 2162) 肠道沙门氏菌 鼠伤寒 B 宠物零食
707(DCS 2163) 肠道沙门氏菌 新港 C 宠物零食
1658(DCS 2170) 肠道沙门氏菌 史华氏 B 生的宠物食物
E5-13(DCS 2191) 肠道沙门氏菌 E或G 工人靴
12960(DCS 2180) 肠道沙门氏菌 桑夫顿堡 E 狗食物/零食
1492(DCS 2186) 肠道沙门氏菌 蒙得维的亚 C 狗食物
样品的制备和接种：
按照标准配方在挤出试验中制备挤出的狗粮。对10g干燥的狗粮样品补充冷冻干燥的枯草芽孢杆菌发酵物15A-P4(DCS 1580)、3A-P4(DCS1581)、LSSAO1(DCS 1582)和BS18(DCS 1584)中的每一个的各1％(重量比)。无发酵物添加到对照批次(参见表27)。将对照狗粮和处理过的狗粮分别分成每种条件每个取样时间点三份平行样。所有平行样分别接种如先前所述制备的0.5mL沙门氏菌混合物的(～10E+6CFU/g狗粮)。甚至通过将溶液缓慢地滴在狗粮上并充分混合来实现均匀分布。所有样品在20℃下保存在密封的塑料袋中。
表27：试验概述。
样品的微生物学分析：
从第0天起、24小时后和一周后监测接种的沙门氏菌库的细胞计数变化。根据EB的指南(生物梅里埃公司(bioMérieux)(Owen M.etal.，“Evaluation of themost probable number technique for theenumeration of Enterobacteriaceae in food and dairy products”，Journal ofApplied Microbiology，109，1810-1816(Owen M.等人，“用于计数食物和乳制品中肠杆菌的最大或然数法的评估”，《应用微生物学杂志》，第109卷，第1810-1816页)))进行计数以用于计数肠杆菌。在每个时间点使用缓冲蛋白胨水制备每个样品的10倍稀释液。将狗粮保持30分钟以吸收水分并且被软化以供吞咽。在一个试验中对所有的4个发酵物在相同起始日期进行测试(表27)。
结果
相比于未处理的样品，所有发酵物均表现出消除肠道沙门氏菌肠道亚种至低于100CFU/g的能力(图41)。在抗测试的目标微生物的所有情况下，在20℃下经过6天温育期后，观察到2-3Log CFU减少。
用1％(重量比)冷冻干燥的枯草芽孢杆菌发酵物处理过的狗粮表现出肠道沙门氏菌肠道亚种在每个时间点的显著减少以及在整个测定持续时间内整体速率的降低。
上面说明书中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和精神的条件下对所描述的本发明方法和系统作出多种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施方案进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的所述模式的多种修改旨在处于如下权利要求书的范围内。
参考文献
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Claims (99)

1.一种抗污染组合物，所述抗污染组合物包含选自如下的一种或多种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株的无细胞发酵产物：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18；其中所述发酵产物包含选自如下的一种或多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂肽选自：表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素及其组合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述聚酮化合物选自：地非西丁、大环内酰亚胺、bacillaene及其组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种附加组分。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述附加组分为载体、辅助剂、增溶剂、悬浮剂、稀释剂、氧气清除剂、抗氧化剂和/或食物材料。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含氧气清除剂和/或抗氧化剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含选自如下的多种化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述脂肽选自：表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素及其组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚酮化合物选自：地非西丁、大环内酰亚胺、bacillaene及其组合。
10.根据前述权利要求中一项所述的组合物，其中所述化合物被部分纯化。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中如果按照“平板扩散测定法”方案观察到至少2mm的抑菌区，则所述无细胞发酵产物能有效抵抗一种或多种污染微生物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中如果在“抑制肉汤测定法”中具有至少约20％抑制，则所述无细胞发酵产物能有效抵抗一种或多种污染微生物。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中如果具有通过“有效浓度测定法”测得的至少约100％(体积比)的有效浓度，则所述无细胞发酵产物能有效抵抗一种或多种污染微生物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中如果具有不止一种、优选地所有三种下列活性，则所述无细胞发酵产物能有效抵抗微生物：如果按照所述“平板扩散测定法”方案观察到至少2mm的抑菌区；在所述“抑制肉汤测定法”中的至少约20％抑制；通过所述“有效浓度测定法”测得的至少约100％(体积比)的有效浓度。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述发酵产物为发酵物。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种附加抗污染剂。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其能有效抵抗革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌中的一种或多种。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其能有效抵抗选自如下的多种微生物：革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其能有效抵抗来自选自如下的属的一种或多种革兰氏阴性细菌：埃希氏菌属(Escherichia)；哈夫尼菌属(Hafnia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；假单胞菌属(Pseudomonas)；沙门氏菌属(Salmonella)；志贺菌属(Shigella)和耶尔森菌属(Yersinia)。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其能有效抵抗如下的一种或多种：肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)；大肠杆菌(Escherichiacoli)；蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)；产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；福氏志贺菌(Shigella flexneri)；宋内志贺菌(Shigella sonnei)和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其能有效抵抗沙门氏菌属(Salmonella)。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的组合物，其中所述沙门氏菌属(Salmonella)是肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)。
23.根据权利要求20或权利要求22中任一项所述的组合物，其中所述肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)菌种为如下的一种或多种：肠道沙门氏菌鸭血清型(Salmonella enterica ser.Anatum)、肠道沙门氏菌布灵得卢柏血清型(Salmonella enterica ser.Braenderup)、肠道沙门氏菌德尔卑血清型(Salmonella enterica ser.Derby)、肠道沙门氏菌肠炎血清型(Salmonella enterica ser.Enteritidis)、肠道沙门氏菌哈达尔血清型(Salmonella enterica ser.Hadar)、肠道沙门氏菌婴儿血清型(Salmonella enterica ser.Infantis)、肠道沙门氏菌凯道古血清型(Salmonella enterica ser.Kedougou)、肠道沙门氏菌姆班达卡血清型(Salmonella enterica ser.Mbandaka)、肠道沙门氏菌蒙得维的亚血清型(Salmonella enterica ser.Montevideo)、肠道沙门氏菌诺伊斯特尔血清型(Salmonella enterica ser.Neumuenster)、肠道沙门氏菌新港血清型(Salmonella enterica ser.Newport)、肠道沙门氏菌俄亥俄血清型(Salmonella enterica ser.Ohio)、肠道沙门氏菌史华氏血清型(Salmonella enterica ser.Schwarzengrund)、肠道沙门氏菌桑夫顿堡血清型(Salmonella enterica ser.Senftenberg)、肠道沙门氏菌田纳西血清型(Salmonella enterica ser.Tennessee)、肠道沙门氏菌汤普森氏血清型(Salmonella enterica ser.Thompson)以及肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型(Salmonella enterica ser.Typhimurium)。
24.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其能有效抵抗来自选自如下的属的一种或多种革兰氏阳性细菌：李斯特菌属(Listeria)；芽孢杆菌属(Bacillus)；环丝菌属(Brochothrix)；梭菌属(Clostridium)；肠球菌属(Enterococcus)；乳杆菌属(Lactobacillus)；明串珠菌属(Leuconostoc)以及葡萄球菌(Staphylococcus)。
25.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其能有效抵抗如下的一种或多种：单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)孢子；地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)孢子；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)孢子；热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)；产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)；生孢梭菌(Clostridium sporogenes)孢子；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)；香肠乳杆菌(Lactobacillusfarciminis)；发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)；肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)；无害李斯特菌(Listeriainnocua)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
26.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其能有效抵抗来自选自如下的属的一种或多种真菌：曲霉属(Aspergillus)；假丝酵母属(Candida)；德巴利酵母属(Debaryomyces)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)；青霉属(Penicillium)；毕赤酵母属(Pichia)；红酵母属(Rhodotorula)；酵母属(Saccharomyces)以及接合酵母属(Zygosaccharomyces)。
27.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其能有效抵抗如下的一种或多种：寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)；杂色曲霉(Aspergillusversicolor)；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)；热带假丝酵母(Candida tropicalis)；弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)；汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)；团青霉(Penicillium commune)；异常毕赤酵母(Pichiaanomala)；粘红酵母(Rhodotorula glutinis)；胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)。
28.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物为固体、半固体、液体或凝胶形式，例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、液体、悬浮液、分散剂或乳液。
29.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物被密封。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述组合物被气密封。
31.一种制备抗污染组合物的方法，包括：
a)将包含选自如下的至少一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株的一种或多种细菌：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18培养在任何一种或多种底物之上或之中，以产生包含至少一种化合物的发酵物，所述至少一种化合物选自脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物；
b)使活细胞分离和/或失活。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述脂肽选自：表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素及其组合。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述聚酮化合物选自：地非西丁、大环内酰亚胺、bacillaene及其组合。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中将细菌孢子与所述发酵物分离和/或使细菌孢子失活。
35.根据权利要求31或权利要求34所述的方法，其中步骤a)中的所述培养处于5至9的pH范围的pH。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
c)将所述pH调节至pH 6-10范围内的pH；
其中步骤c在步骤b)之前、期间或之后进行。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中所述方法包括一个或多个(另外的)分离和/或离析步骤以产生包含选自如下的至少一种化合物的所述发酵物的上清液或其级分或组分：脂肽、聚酮化合物、嗜铁素、杆菌溶素、抗荚膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物，其中一个或多个(另外的)分离和/或离析步骤在步骤b)之前或之后进行；或者在c)存在时，在步骤b)和c)之前、期间、之间或之后进行。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述脂肽选自：表面活性素、芽孢菌霉素(如，芽孢菌霉素D)、丰原素及其组合。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述聚酮化合物选自：地非西丁、大环内酰亚胺、bacillaene及其组合。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述步骤d)包括分离所述化合物中的一种或多种。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中所述分离是多种所述化合物的分离。
42.根据权利要求31至41中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述培养处于约10至约55℃的温度范围内的温度下。
43.根据权利要求31至42中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述底物包含下列的任何一种：碳水化合物和/或蛋白胨和/或磷酸盐和/或盐和/或缓冲盐。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述底物包含或为下列的任何一种：CASO肉汤或TSB。
45.根据权利要求31至44中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述培养采用选自如下的多种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS2084和BS18。
46.根据权利要求31至45中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述培养包括一种或多种附加细菌。
47.根据权利要求31至46中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述培养进行约1至约48小时。
48.根据权利要求31至47中任一项所述的方法，其中进行步骤a)中的所述培养直到所述抗污染组合物产生在通过所述“平板扩散测定法”测量时观察到至少约2mm的抑菌区/圈。
49.根据权利要求31至48中任一项所述的方法，其中进行步骤a)中的所述培养直到所述抗污染组合物在所述“抑制肉汤测定法”中具有至少约20％抑制。
50.根据权利要求31至49中任一项所述的方法，其中进行步骤a)中的所述培养直到所述抗污染组合物在通过所述“有效浓度测定法”测量时具有至少约100％(体积比)的有效浓度。
51.根据权利要求31至50中任一项所述的方法，其中进行步骤a)中的所述培养直到观察到下列中的不止一种(优选地，所有三种)：所述抗污染组合物产生在通过所述“平板扩散测定法”测量时观察到至少约2mm的抑菌区/圈；所述抗污染组合物在所述“抑制肉汤测定法”中具有至少约20％抑制；或所述抗污染组合物在通过所述“有效浓度测定法”测量时具有至少约100％(体积比)的有效浓度。
52.根据权利要求31至51中任一项所述的方法，其中所述方法包括氧气清除剂的添加。
53.根据权利要求31至51中任一项所述的方法，其中所述方法包括抗氧化剂的添加。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述抗氧化剂为由如下组成的组中的一种或多种：抗坏血酸、多酚、维生素E、β-胡萝卜素、迷迭香提取物、甘露醇和BHA。
55.根据权利要求31至52中任一项所述的方法，其中所述方法包括在容器中密封(优选地气密封)所述发酵物或上清液、其级分或组分的附加步骤。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述附加的密封步骤为气密封。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述容器包含清除氧气的化合物。
58.一种根据权利要求31至57中任一项所述的方法制备的抗污染组合物。
59.一种防止和/或减少产品的微生物污染的方法，包括使所述产品的组成组分、所述产品本身和/或所述产品的包装与根据权利要求1至26中任一项所述的或根据权利要求31至57中任一项所述所制备的抗污染组合物接触的步骤。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述产品为下列的任何一种：食品(例如肉制品、宠物食物或动物饲料)、表面涂层材料(例如涂料)、和农产品(例如作物、种子或青贮饲料)。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述食品为人类食品。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述食品为宠物食物。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述接触步骤包括将所述产品的组成组分与所述抗污染组合物混合。
64.根据权利要求59至63中任一项所述的方法，其中所述接触步骤包括将所述抗污染组合物施加至所述产品的表面、其组成组分和/或所述产品的包装。
65.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述方法防止和/或减少革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或真菌中的一种或多种所致的微生物污染。
66.根据权利要求59至65中任一项所述的方法，其中所述方法防止和/或减少至少一种革兰氏阳性细菌、至少一种革兰氏阴性细菌和至少一种真菌所致的微生物污染。
67.根据权利要求59至66中任一项所述的方法，其中所述方法防止和/或减少来自选自如下的属的一种或多种革兰氏阴性细菌所致的微生物污染：埃希氏菌属(Escherichia)；哈夫尼菌属(Hafnia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；假单胞菌属(Pseudomonas)；沙门氏菌属(Salmonella)；志贺菌属(Shigella)和耶尔森菌属(Yersinia)。
68.根据权利要求59至67中任一项所述的方法，其中所述方法防止和/或减少如下的一种或多种所致的微生物污染：肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)；大肠杆菌(Escherichia coli)；蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；福氏志贺菌(Shigellaflexneri)；宋内志贺菌(Shigella sonnei)和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)。
69.根据权利要求59至68中任一项所述的方法，其中所述方法防止和/或减少沙门氏菌属(Salmonella)所致的微生物污染。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述沙门氏菌属(Salmonella)是肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述肠道沙门氏菌菌种(Salmonella enterica spp)为下列的一种或多种：肠道沙门氏菌鸭血清型(Salmonella enterica ser.Anatum)、肠道沙门氏菌布灵得卢柏血清型(Salmonella enterica ser.Braenderup)、肠道沙门氏菌德尔卑血清型(Salmonella enterica ser.Derby)、肠道沙门氏菌肠炎血清型(Salmonella enterica ser.Enteritidis)、肠道沙门氏菌哈达尔血清型(Salmonella enterica ser.Hadar)、肠道沙门氏菌婴儿血清型(Salmonella enterica ser.Infantis)、肠道沙门氏菌凯道古血清型(Salmonella enterica ser.Kedougou)、肠道沙门氏菌姆班达卡血清型(Salmonella enterica ser.Mbandaka)、肠道沙门氏菌蒙得维的亚血清型(Salmonella enterica ser.Montevideo)、肠道沙门氏菌诺伊斯特尔血清型(Salmonella enterica ser.Neumuenster)、肠道沙门氏菌新港血清型(Salmonella enterica ser.Newport)、肠道沙门氏菌俄亥俄血清型(Salmonella enterica ser.Ohio)、肠道沙门氏菌史华氏血清型(Salmonella enterica ser.Schwarzengrund)、肠道沙门氏菌桑夫顿堡血清型(Salmonella enterica ser.Senftenberg)、肠道沙门氏菌田纳西血清型(Salmonella enterica ser.Tennessee)、肠道沙门氏菌汤普森氏血清型(Salmonella enterica ser.Thompson)以及肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型(Salmonella enterica ser.Typhimurium)。
72.一种包含根据权利要求1至30中任一项所述的抗污染组合物或包含根据权利要求31至57中任一项所述的抗污染组合物的产品，或一种因进行根据权利要求59至66所述的方法而具有减少和/或防止的微生物污染的产品。
73.根据权利要求72所述的产品，其中所述产品为人类食品。
74.根据权利要求72所述的产品，其中所述产品为宠物食物。
75.根据权利要求1至30中任一项所述的或根据权利要求31至57中任一项制备的组合物，其中所述组合物被配制为作物保护剂。
76.根据权利要求1至30中任一项所述的或根据权利要求31至57中任一项制备的组合物，其中所述组合物被配制为人类食品。
77.根据权利要求1至30中任一项所述的或根据权利要求31至57中任一项制备的组合物，其中所述组合物被配制为宠物食物。
78.根据权利要求1至30和58中任一项所述的组合物防止产品的微生物污染的用途。
79.根据权利要求78所述的用途，其中所述产品为下列的任何一种：食品(例如肉制品、宠物食物或动物饲料)、表面涂层材料(例如涂料)、和农产品(例如作物、种子或青贮饲料)。
80.根据权利要求79所述的用途，其中所述食品为人类食物。
81.根据权利要求79所述的用途，其中所述食品为宠物食物。
82.根据权利要求78至81中任一项所述的用途，其中所述用途防止和/或减少革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或真菌中的一种或多种所致的微生物污染。
83.根据权利要求78至82中任一项所述的用途，其中所述用途防止和/或减少至少一种革兰氏阳性细菌、至少一种革兰氏阴性细菌和至少一种真菌所致的微生物污染。
84.根据权利要求78至83中任一项所述的用途，其中所述用途防止和/或减少来自选自如下的属的一种或多种革兰氏阴性细菌所致的微生物污染：埃希氏菌属(Escherichia)；哈夫尼菌属(Hafnia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；假单胞菌属(Pseudomonas)；沙门氏菌属(Salmonella)；志贺菌属(Shigella)和耶尔森菌属(Yersinia)。
85.根据权利要求78至84中任一项所述的用途，其中所述方法防止和/或减少如下的一种或多种所致的微生物污染：肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)；大肠杆菌(Escherichia coli)；蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；福氏志贺菌(Shigellaflexneri)；宋内志贺菌(Shigella sonnei)和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)。
86.根据权利要求78至85中任一项所述的用途，其中所述用途防止和/或减少沙门氏菌属(Salmonella)所致的微生物污染。
87.根据权利要求78至86中任一项所述的用途，其中所述沙门氏菌属(Salmonella)是肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)。
88.根据权利要求87所述的用途，其中所述肠道沙门氏菌菌种(Salmonella enterica spp)为下列的一种或多种：肠道沙门氏菌鸭血清型(Salmonella enterica ser.Anatum)、肠道沙门氏菌布灵得卢柏血清型(Salmonella enterica ser.Braenderup)、肠道沙门氏菌德尔卑血清型(Salmonella enterica ser.Derby)、肠道沙门氏菌肠炎血清型(Salmonella enterica ser.Enteritidis)、肠道沙门氏菌哈达尔血清型(Salmonella enterica ser.Hadar)、肠道沙门氏菌婴儿血清型(Salmonella enterica ser.Infantis)、肠道沙门氏菌凯道古血清型(Salmonella enterica ser.Kedougou)、肠道沙门氏菌姆班达卡血清型(Salmonella enterica ser.Mbandaka)、肠道沙门氏菌蒙得维的亚血清型(Salmonella enterica ser.Montevideo)、肠道沙门氏菌诺伊斯特尔血清型(Salmonella enterica ser.Neumuenster)、肠道沙门氏菌新港血清型(Salmonella enterica ser.Newport)、肠道沙门氏菌俄亥俄血清型(Salmonella enterica ser.Ohio)、肠道沙门氏菌史华氏血清型(Salmonella enterica ser.Schwarzengrund)、肠道沙门氏菌桑夫顿堡血清型(Salmonella enterica ser.Senftenberg)、肠道沙门氏菌田纳西血清型(Salmonella enterica ser.Tennessee)、肠道沙门氏菌汤普森氏血清型(Salmonella enterica ser.Thompson)以及肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型(Salmonella enterica ser.Typhimurium)。
89.一种制备人类食品或宠物食物的方法，包括将根据权利要求1至26中任一项所述的或根据权利要求31至57中任一项制备的抗污染组合物施加于人类食品或宠物食物；或者人类食品或宠物食物的一种或多种组成组分。
90.一种用于筛选有效抵抗一种或多种目标污染微生物的抗污染组合物的方法，包括：
a)将包含选自如下的至少一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株的一种或多种细菌：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS2084和BS18培养在任何一种或多种底物之上或之中，以产生发酵产物；
b)使活细胞分离和/或失活，并且任选地，使孢子分离和/或失活；
c)测试所述无细胞发酵产物抗目标污染微生物的抗微生物活性；和
d)选择具有抗目标污染微生物的抗微生物活性的发酵产物；
其中步骤b)可在步骤c)和d)之前、期间和/或之后进行。
91.根据权利要求90所述的方法，还包括一个或多个(另外的)分离和/或离析步骤。
92.根据权利要求90或权利要求91所述的方法，其中如果按照所述“平板扩散测定法”方案观察到至少2mm的抑菌区，则所述抗污染组合物或所述发酵产物能有效抵抗一种或多种目标污染微生物。
93.根据权利要求90至92中任一项所述的方法，其中如果在所述“抑制肉汤测定法”中具有至少约20％抑制，则所述抗污染组合物或所述发酵产物能有效抵抗一种或多种目标污染微生物。
94.根据权利要求90至93中任一项所述的方法，其中如果具有通过所述“有效浓度测定法”测得的至少约100％(体积比)的有效浓度，则所述抗污染组合物或所述发酵产物能有效抵抗一种或多种目标污染微生物。
95.根据权利要求90至94中任一项所述的方法，其中如果具有不止一种、优选地所有三种下列活性，则抗污染组合物或所述发酵产物能有效抵抗一种或多种目标污染微生物：如果按照所述“平板扩散测定法”方案观察到至少2mm的抑菌区；在所述“抑制肉汤测定法”中的至少约20％抑制；通过所述“有效浓度测定法”测得的至少约100％(体积比)的有效浓度。
96.一种如本文参照说明书和附图基本上公开的组合物。
97.一种如本文参照说明书和附图基本上公开的方法。
98.一种如本文参照说明书和附图基本上公开的产品。
99.一种如本文参照说明书和附图基本上公开的用途。
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