CN111647533A - 一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用 Download PDF

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CN111647533A CN202010548078.2A CN202010548078A CN111647533A CN 111647533 A CN111647533 A CN 111647533A CN 202010548078 A CN202010548078 A CN 202010548078A CN 111647533 A CN111647533 A CN 111647533A
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郑伯欣
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Abstract

本发明涉及了一种保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯草芽孢杆菌和其在抑菌和促进蛋白分解方面的应用。所述枯草芽孢杆菌产生的抑菌活性强，可强力的对常见病原微生物大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌与铜绿假单胞菌的生长进行抑制，另外，其蛋白酶活性强，也会促进蛋白物质分解。所述枯草芽孢杆菌及其溶剂或包含所述枯草芽孢杆菌组合物可应用于抑菌消毒领域。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用。
背景技术
由于长期滥用抗生素，细菌对抗生素耐药问题已经引起人们的广泛关注， 耐药细菌(如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)在环境中的存在严重威胁人与动物 的健康，若发生耐药细菌感染，治疗成本昂贵，同时存在大范围传播的风险。
化学消毒剂的使用已经有将近200年的历史，近年来，消毒剂在医疗卫生 行业、畜牧兽医行业、食品加工和其他工业环境中的使用越来越多。消毒剂的 使用从家庭清洁、个人卫生，到医疗单位、养殖场地消毒、食品加工工具消毒、 工业防腐等，无处不在。大量研究证明，消毒剂使用的增加同样也会导致细菌 对其产生耐药。细菌对消毒剂耐药的机制分为自身耐药、诱导性耐药和获得性 耐药。自身耐药主要是由于细菌细胞壁和细胞膜的通透性(形态结构、组成成 分)、主动外排系统、药物降解酶、生物膜等表型方面的差异，使细菌对消毒 剂的敏感性不同而导致的耐药。诱导性耐药是指在生长条件改变，或在低浓度 消毒剂的持续作用下，细菌对消毒剂产生生理适应，以及发生基因表达增加或 突变，导致细菌对消毒剂耐药。而获得性耐药是指细菌获得耐药基因或质粒等 引起的对消毒剂耐药，在获得性耐药中转座子和整合子也发挥重要作用。
细菌对消毒剂的耐药性会影响其对抗生素的耐药性，这是由于细菌对这两 种化学成分存在共同的耐药机制而导致了交叉耐药，许多介导消毒剂耐药的机 制，如渗透性降低、主动外排泵系统表达增加和作用靶位点的修饰等也参与介 导抗生素耐药。如革兰氏阴性菌对阳离子消毒剂耐药后，其对某些抗生素的敏 感性也降低。
由于消毒剂的使用越来越广泛，加上消毒剂知识的缺乏，在临床、社区环 境以及家庭中长期使用消毒剂对细菌抗生素耐药的影响应引起关注。因此本领 域的技术人员致力于加强研发绿色、安全消毒剂替代品，如环境净化益生菌， 通过益生菌抑制病原菌生长繁殖，对减少化学消毒剂使用和细菌抗生素耐药性 意义重大。
枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7-0.8×2-3微米，着色 均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微 米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗 糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。枯草芽孢 杆菌为需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传 学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。 广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
枯草芽孢杆菌是一种多功能的微生物，通常可通过营养竞争或空间位点竞 争形成优势菌群，有效地阻止病原微生物的繁殖，在抑菌领域有一定的作用， 但不是所有枯草芽孢杆菌都有较强的抑菌作用。
发明内容
本发明人通过对枯草芽孢杆菌的研究、筛选和验证，提供了一种可高效抑 制细菌生长繁殖的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌株制剂和含有其成分的组合 物，可有效运用于非化学抑菌消毒剂的生产。
为达到本发明的第一个发明目的，本发明提供了保藏于中国普通微生物菌 种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所；分类命名为：枯草芽孢杆菌，Bacillus Subtilis， 保藏编号为：CGMCC NO.19818，保藏日期为2020年5月14日的枯草芽孢杆 菌KKCYBGJ-A1。本发明的枯草芽孢杆菌产生的抑菌活性强，可有效抑制细菌的 生长繁殖细菌。
为达到本发明的第二个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNO.19818的枯草芽孢杆菌在抑制细菌生长繁殖方面的应用
为达到本发明的第三个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为 CGMCCNO.19818的枯草芽孢杆菌在促进蛋白分解方面的应用。
为达到本发明的第四个发明目的，本发明提供一种大肠杆菌生长抑制剂， 所述大肠杆菌生长抑制剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯 草芽孢杆菌作为有效成分。
为达到本发明的第五个发明目的，本发明提供一种沙门氏菌生长抑制剂， 所述沙门氏菌生长抑制剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯 草芽孢杆菌作为有效成分。
为达到本发明的第六个发明目的，本发明提供一种金黄色葡萄球菌生长抑 制剂，所述金黄色葡萄球菌生长抑制剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯草芽孢杆菌作为有效成分。
为达到本发明的第七个发明目的，本发明提供一种白色念珠菌生长抑制剂， 所述白色念珠菌生长抑制剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的 枯草芽孢杆菌作为有效成分。
为达到本发明的第八个发明目的，本发明提供一种铜绿假单胞菌生长抑制 剂，所述铜绿假单胞菌生长抑制剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯草芽孢杆菌作为有效成分。
为达到本发明的第九个发明目的，本发明提供一种抑菌消毒组合物，所述 组合物中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯草芽孢杆菌作为有 效成分。
本发明的有益效果至少包括以下：保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818 的枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌活性，对大肠杆菌抑制率达到98％；对沙门氏菌 抑制率达到98％；对金黄色葡萄球菌抑制率达到99％；对白色念珠菌抑制率达到 98％；对铜绿假单胞菌抑制率达到99％；另外，其蛋白酶活性强，也会促进蛋白 物质分解，避免细菌在蛋白物质中生长、繁殖，进一步增强其抑菌效力，可有 效运用于非化学抑菌消毒剂的生产。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结 合具体实施例详予说明。
实施例1枯草芽孢杆菌的筛选及鉴定(KKCYBGJ-A1)
保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯草芽孢杆菌KKCYBGJ-A1为发 明人在纳豆中分离筛选得到的，其特征包括：(1)极强的抗逆性，能耐高温(在 100℃可存活10min以上)、耐酸(经pH值为2.5的溶液处理2h，存活率仍≥ 95％)、耐胆盐(经胆盐处理2h，存活率仍在98％以上)；(2)可发酵葡萄糖、 蔗糖、麦芽糖和甘露醇，形成酸，不产气，不分解乳糖，不形成吲哚、硫化氢； (3)产酶，包括淀粉酶、蛋白酶；(4)在培养基形成的菌落表面湿润，有突 起，不透明，呈红色，细胞杆状，有芽孢，芽孢椭圆形中生或近中生，芽孢囊 不明显膨大；(4)在7％氯化钠中生长，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，能 从D-甘露醇产酸，不利用丙酸盐；(5)该枯草芽孢杆菌产生蛋白酶能力强，可 快速、强力促进蛋白物质分解。
在分离筛选中，所用的样品为自制纳豆，所用培养基按1L蒸馏水、0.3％ 牛肉膏、1％蛋白胨、1.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖的配方配置，并在 121℃灭菌20分钟，pH控制在7.2-7.4。用灭菌后的生理盐水溶液，稀释样品， 得到样品液。将样品液置于80℃水浴10min后涂布在以上培养基上，在37℃条 件下，培养48小时后，挑选长势良好、菌落形态相似且数目最多的菌落，分离 纯化直至菌落形态一致的单菌。分离出的单菌进行蛋白酶检测试验，筛选出蛋 白酶活性最强的单菌。该枯草芽孢杆菌菌种保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNO.19818。该菌种在牛奶培养基上37℃培养24小时后，水解圈直径为10mm， 菌落直径在5mm，水解圈直径与菌落直径比为2.0。
实施例2一种含枯草芽孢杆菌的制剂(枯草芽孢杆菌芽孢数为3.0× 107CFU/ml)
活化：使用实施例1中的培养基对保存的枯草芽孢杆菌进行划线活化，温 度为37℃，培养时间24h；
种子液制备：将活化的单菌落接种于实施例1中的培养基，不过此时的培 养基中不添加琼脂，以500ml三角瓶37℃条件下振荡培养24-48h，取样进行染 色等鉴定，防止污染；
发酵：使用不锈钢发酵罐及其发酵培养基(实施例1中的培养基，不含琼 脂)，接种量为5％，常温下发酵48h，在显微镜下观察芽孢率，当芽孢率达到 90％以上时，停止搅拌；
吸附与烘干：在枯草芽孢杆菌发酵液中加入吸附载体后进行烘干得到枯草 芽孢杆菌菌粉，(载体添加量以烘干后每克含1000亿CFU为准，载体为30％麸 皮、30％脱脂米糠与40％蒙脱石)；
检测：按照GB/T 26428-2010方法对获得的枯草芽孢杆菌进行计数和蛋白 酶检测；在蛋白酶检测中，烘干步骤得到的发酵液烘干物中，蛋白酶含量≥ 500U/g)
混合：根据检测得到的计数结果，向含有2％表面活性剂(1％椰油亚氨基二 丙酸酯、1％乙氧基化脂肪醇C9-11，作用起泡、增溶、分散、洗涤、防腐、抗 静电等)的纯净水中添加枯草芽孢杆菌菌粉得到含枯草芽孢杆菌的制剂，制剂 中枯草芽孢杆菌芽孢数为3.0×107CFU/ml。
实施例3：实施例2制备的含枯草芽孢杆菌的制剂在抑制大肠杆菌生长繁殖上的应用
(1)规范性引用文件：《中华人民共和国标准QB/T 2738-2012日化产品的抗 菌抑菌效果的评价方法》；
(2)主要仪器与试剂：电子天平、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴 锅、pH计、菌落计数器、超净工作台、超声波清洗器、显微镜等微生物实验必 备仪器；
(3)营养琼脂培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、琼脂粉15.0g、 氯化钠5.0g置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃， 用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角 瓶，121℃高压灭菌20min，冷藏备用；
(4)营养肉汤培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g 置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L 氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角瓶，121℃ 高压灭菌20min，冷藏备用；
(5)结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)：用于大肠菌群的平板菌落计数，产商 为广东环凯微生物科技有限公司。
(6)大肠杆菌(CICC10389)细菌繁殖体悬液的制备：取冻干菌种管，在无菌 操作下打开，用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基于管中将冻干菌粉全部溶 解。取营养肉汤培养基5.0ml-10ml试管，滴入少许菌种悬液，置于37℃培养箱 中培养24h，用接种环取第一代培养的菌悬液，划线接种于斜面上，与37℃培 养箱中培养24h即为第3代培养物；取菌种新鲜培养物，吸取5ml稀释液加入 斜面试管中，反复吹吸，洗下菌苔，随后将洗液移至另一根无菌试管中，用电 动混合器混匀。细菌繁殖体悬液保存在4℃冰箱中备用，应当天使用，不应过夜。
(7)操作步骤：在无菌操作下，吸取大肠杆菌菌悬液1ml接种于100ml营养 肉汤培养基中，加入1ml实施例2制备的含枯草芽孢杆菌的制剂，混合均匀； 另取100ml营养肉汤培养基加入同样的试验菌悬液1ml作为空白对照组，混合 均匀，用平板计数法测定肉汤中大肠杆菌的菌数，吸取样液(或作适当的稀释 后，取其中2-3个稀释度的稀释液)1ml，置于灭菌平板内，每个样液接种两个 灭菌平板。用凉至40-45℃的培养基作倾注，绕8字混合均匀，待培养基凝固后 倒扣平板于37℃培养箱内培养48h，用做活菌菌落计数；将上述混合培养物放 置于37℃、200r/min的恒温培养振荡中振荡培养(200r/min)48小时，共培养 后按照上述方法对试验菌的菌数进行测定并计数。
(8)计算公式
(9)
Figure BDA0002541477090000071
式中：X——抑菌率，％
A——对照组平均菌落数
B——实验组平均菌落数
(10)抑菌效果
Figure BDA0002541477090000072
实施例4：实施例2制备的含枯草芽孢杆菌的制剂在抑制沙门氏菌生长繁殖上的应用
(1)规范性引用文件：《中华人民共和国标准QB/T 2738-2012日化产品的抗 菌抑菌效果的评价方法》；
(2)主要仪器与试剂：电子天平、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴 锅、pH计、菌落计数器、超净工作台、超声波清洗器、显微镜等微生物实验必 备仪器；
(3)营养琼脂培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、琼脂粉15.0g、 氯化钠5.0g置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃， 用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角 瓶，121℃高压灭菌20min，冷藏备用；
(4)营养肉汤培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g 置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L 氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角瓶，121℃ 高压灭菌20min，冷藏备用；
(5)SS琼脂：用于沙门氏菌的平板菌落计数，厂家为广东环凯微生物科技有 限公司。
(6)沙门氏菌(CICC10867)细菌繁殖体悬液的制备：取冻干菌种管，在无菌 操作下打开，用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基于管中将冻干菌粉全部溶 解。取营养肉汤培养基5.0ml-10ml试管，滴入少许菌种悬液，置于37℃培养箱 中培养24h，用接种环取第一代培养的菌悬液，划线接种于斜面上，与37℃培 养箱中培养24h即为第3代培养物；取菌种新鲜培养物，吸取5ml稀释液加入 斜面试管中，反复吹吸，洗下菌苔，随后将洗液移至另一根无菌试管中，用电 动混合器混匀。细菌繁殖体悬液保存在4℃冰箱中备用，应当天使用，不应过夜。
(7)操作步骤：在无菌操作下，吸取沙门氏菌菌悬液1ml接种于100ml营养 肉汤培养基中，加入1ml实施例2制备的含枯草芽孢杆菌的制剂，混合均匀； 另取100ml营养肉汤培养基加入同样的试验菌悬液1ml作为空白对照组，混合 均匀，用平板计数法测定肉汤中沙门氏菌的菌数，吸取样液(或作适当的稀释 后，取其中2-3个稀释度的稀释液)1ml，置于灭菌平板内，每个样液接种两个 灭菌平板。用凉至40-45℃的培养基作倾注，绕8字混合均匀，待培养基凝固后 倒扣平板于37℃培养箱内培养48h，用做活菌菌落计数；将上述混合培养物放 置于37℃、200r/min的恒温培养振荡中振荡培养(200r/min)48小时，共培养 后按照上述方法对试验菌的菌数进行测定并计数。
(8)计算公式
Figure RE-GDA0002566031130000091
式中：X——抑菌率，％
A——对照组平均菌落数
B——实验组平均菌落数
(9)抑菌效果：
Figure BDA0002541477090000092
实施例5上述含益生菌的多功能净化剂在抑制金黄色葡萄球菌生长繁殖上的应用
(1)规范性引用文件：《中华人民共和国标准QB/T 2738-2012日化产品的抗 菌抑菌效果的评价方法》；
(2)主要仪器与试剂：电子天平、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴 锅、pH计、菌落计数器、超净工作台、超声波清洗器、显微镜等微生物实验必 备仪器；
(3)营养琼脂培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、琼脂粉15.0g、 氯化钠5.0g置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃， 用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角 瓶，121℃高压灭菌20min，冷藏备用；
(4)营养肉汤培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g 置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L 氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角瓶，121℃ 高压灭菌20min，冷藏备用；
(5)金黄色葡萄球菌测试片(6491)：用于金黄色葡萄球菌的菌落计数，产商 为明尼苏达矿务及制造业公司。
(6)金黄色葡萄球菌(CICC10384)细菌繁殖体悬液的制备：取冻干菌种管， 在无菌操作下打开，用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基于管中将冻干菌粉 全部溶解。取营养肉汤培养基5.0ml-10ml试管，滴入少许菌种悬液，置于37℃ 培养箱中培养24h，用接种环取第一代培养的菌悬液，划线接种于斜面上，与 37℃培养箱中培养24h即为第3代培养物；取菌种新鲜培养物，吸取5ml稀释 液加入斜面试管中，反复吹吸，洗下菌苔，随后将洗液移至另一根无菌试管中， 用电动混合器混匀。细菌繁殖体悬液保存在4℃冰箱中备用，应当天使用，不应 过夜。
(7)操作步骤：在无菌操作下，吸取金黄色葡萄球菌菌悬液1ml接种于100ml 营养肉汤培养基中加入1ml实施例2制备的含枯草芽孢杆菌的制剂，混合均匀； 另取100ml营养肉汤培养基加入同样的试验菌悬液1ml作为空白对照组，混合 均匀，用平板计数法测定肉汤中金黄色葡萄球菌的菌数，吸取样液(或作适当 的稀释后，取其中2-3个稀释度的稀释液)1ml，置于灭菌平板内，每个样液接 种两个灭菌平板。用凉至40-45℃的培养基作倾注，绕8字混合均匀，待培养基 凝固后倒扣平板于37℃培养箱内培养48h，用做活菌菌落计数；将上述混合培 养物放置于37℃、200r/min的恒温培养振荡中振荡培养(200r/min)48小时，共培养后按照上述方法对试验菌的菌数进行测定并计数。
(8)计算公式
Figure BDA0002541477090000101
式中：X——抑菌率，％
A——对照组平均菌落数
B——实验组平均菌落数
(9)抑菌效果：
Figure BDA0002541477090000111
实施例6上述含益生菌的多功能净化剂在抑制白色念珠菌生长繁殖上的应用
(1)规范性引用文件：《中华人民共和国标准QB/T 2738-2012日化产品的抗 菌抑菌效果的评价方法》；
(2)主要仪器与试剂：电子天平、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴 锅、pH计、菌落计数器、超净工作台、超声波清洗器、显微镜等微生物实验必 备仪器；
(3)营养琼脂培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、琼脂粉15.0g、 氯化钠5.0g置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃， 用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角 瓶，121℃高压灭菌20min，冷藏备用；
(4)营养肉汤培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g 置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L 氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角瓶，121℃ 高压灭菌20min，冷藏备用；
(5)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：用于白色念珠菌的平板菌落计数，产 商为广东环凯微生物科技有限公司。
(6)白色念珠菌CMCC(F)98001细菌繁殖体悬液的制备：取冻干菌种管，在无 菌操作下打开，用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基于管中将冻干菌粉全部 溶解。取营养肉汤培养基5.0ml-10ml试管，滴入少许菌种悬液，置于37℃培养 箱中培养72h，用接种环取第一代培养的菌悬液，划线接种于斜面上，与37℃ 培养箱中培养72h即为第3代培养物；取菌种新鲜培养物，吸取5ml稀释液加 入斜面试管中，反复吹吸，洗下菌苔，随后将洗液移至另一根无菌试管中，用 电动混合器混匀。细菌繁殖体悬液保存在4℃冰箱中备用，应当天使用，不应过 夜。
(7)操作步骤：在无菌操作下，吸取白色念珠菌菌悬液1ml接种于100ml营 养肉汤培养基中，加入1ml实施例2制备的含枯草芽孢杆菌的制剂，混合均匀； 另取100ml营养肉汤培养基加入同样的试验菌悬液1ml作为空白对照组，混合 均匀，用平板计数法测定肉汤中白色念珠菌的菌数，吸取样液(或作适当的稀 释后，取其中2-3个稀释度的稀释液)1ml，置于灭菌平板内，每个样液接种两 个灭菌平板。用凉至40-45℃的培养基作倾注，绕8字混合均匀，待培养基凝固 后倒扣平板于37℃培养箱内培养72h，用做活菌菌落计数；将上述混合培养物 放置于37℃、200r/min的恒温培养振荡中振荡培养(200r/min)72小时，共培 养后按照上述方法对试验菌的菌数进行测定并计数。
(8)计算公式
Figure BDA0002541477090000121
式中：X——抑菌率，％
A——对照组平均菌落数
B——实验组平均菌落数
(9)抑菌效果：
Figure BDA0002541477090000122
实施例7上述含益生菌的多功能净化剂在抑制铜绿假单胞菌生长繁殖上的应用
(1)规范性引用文件：《中华人民共和国标准QB/T 2738-2012日化产品的抗 菌抑菌效果的评价方法》；
(2)主要仪器与试剂：电子天平、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴 锅、pH计、菌落计数器、超净工作台、超声波清洗器、显微镜等微生物实验必 备仪器；
(3)营养琼脂培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、琼脂粉15.0g、 氯化钠5.0g置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃， 用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角 瓶，121℃高压灭菌20min，冷藏备用；
(4)营养肉汤培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g 置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L 氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角瓶，121℃ 高压灭菌20min，冷藏备用；
(5)NAC琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌平板菌落计数，产商为青岛高科技工 业园海博生物技术有限公司。
(6)铜绿假单胞菌(CICC10351)细菌繁殖体悬液的制备：取冻干菌种管，在 无菌操作下打开，用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基于管中将冻干菌粉全 部溶解。取营养肉汤培养基5.0ml-10ml试管，滴入少许菌种悬液，置于37℃培 养箱中培养24h，用接种环取第一代培养的菌悬液，划线接种于斜面上，与37℃ 培养箱中培养24h即为第3代培养物；取菌种新鲜培养物，吸取5ml稀释液加 入斜面试管中，反复吹吸，洗下菌苔，随后将洗液移至另一根无菌试管中，用 电动混合器混匀。细菌繁殖体悬液保存在4℃冰箱中备用，应当天使用，不应过 夜。
(7)操作步骤：在无菌操作下，吸取铜绿假单胞菌菌悬液1ml接种于100ml 营养肉汤培养基中，加入1ml实施例2制备的含枯草芽孢杆菌的制剂，混合均 匀；另取100ml营养肉汤培养基加入同样的试验菌悬液1ml作为空白对照组， 混合均匀，用平板计数法测定肉汤中铜绿假单胞菌的菌数，吸取样液(或作适 当的稀释后，取其中2-3个稀释度的稀释液)1ml，置于灭菌平板内，每个样液 接种两个灭菌平板。用凉至40-45℃的培养基作倾注，绕8字混合均匀，待培养 基凝固后倒扣平板于37℃培养箱内培养48h，用做活菌菌落计数；将上述混合 培养物放置于37℃、200r/min的恒温培养振荡中振荡培养(200r/min)48小时， 共培养后按照上述方法对试验菌的菌数进行测定并计数。
(8)计算公式
Figure BDA0002541477090000141
式中：X——抑菌率，％
A——对照组平均菌落数
B——实验组平均菌落数
(9)抑菌效果：
Figure BDA0002541477090000142
以上试验结果表明，保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818枯草芽孢杆 菌对常见病原微生物大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌与铜 绿假单胞菌具有极强的抑制作用；另外，其蛋白酶活性强，也会促进蛋白物质 分解，避免细菌在蛋白物质中生长、繁殖，进一步增强其抑菌效力。而含有该 枯草芽孢杆菌的制剂，具有优异的去污、净化能力，可显著减少环境中常见肠 杆菌科微生物生物量。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将 一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些 实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包 含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素 的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列 出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的 要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的 要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另 外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括 本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了 基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅 为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说 明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领 域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (9)

1.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯草芽孢杆菌。
2.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯草芽孢杆菌在抑制细菌生长繁殖方面的应用。
3.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19818的枯草芽孢杆菌在促进蛋白分解方面的应用。
4.一种大肠杆菌生长抑制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌。
5.一种沙门氏菌生长抑制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌。
6.一种金黄色葡萄球菌生长抑制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌。
7.一种白色念珠菌生长抑制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌。
8.一种铜绿假单胞菌生长抑制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌。
9.一种抑菌消毒组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。
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