CN106701645B - 具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌b7及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7及应用方法，该菌分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016128。实验证明本发明的菌株能提高半滑舌鳎免疫机能，有效抵抗病原微生物侵袭，疾病发病率降低至4％以下，养殖成活率提高到96％以上；提高半滑舌鳎消化酶活性和饲料利用率，饵料系数降低12％以上，特定生长率提高4％以上；有效降低抗生素及化学药物使用量，减少环境污染，保障养殖产品质量安全，具有良好的生态效益。解决了制约半滑舌鳎养殖业健康发展的病害防治关键技术难题，绿色环保高效健康养殖。

Description

具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7及其应用方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7及应用方法。
背景技术
半滑舌鳎是我国重要的经济名贵鱼类，肉味鲜美，具有广温、广盐和适应多变环境的特点，是理想的养殖品种之一。随着海水工厂化养殖业的发展，半滑舌鳎成为主养品种之一。长期高密度集约化养殖，导致病害发生愈来愈严重，主要病害有：溃烂病、腹水病、脾肾坏死病等，患病鱼死亡率高达70％以上，经济损失巨大，严重制约了半滑舌鳎养殖业的健康发展。传统治疗方法是使用大剂量抗生素或化学药物浸泡或口服，长期使用的结果导致了致病菌抗药性的产生，不仅没有获得良好的治疗效果，还产生了因药物残留导致的食品安全问题，受到社会各界高度关注。探索新的水产养殖经济动物疾病防治技术成为解决目前困局的有效方法和途径。疫苗免疫技术具有绿色环保高效的特点，但水产养殖环境、养殖品种及养殖模式具有多样性，致病微生物复杂多样，再加上水生动物生活在水中，疫苗免疫接种技术还未取得重大突破，生产应用还只限于局部地区或某个养殖品种的生产应用实验，还不能在水生动物疫病防控中发挥应有的重要作用。近年来，借鉴益生菌技术，筛选具有免疫促生长作用的微生物，通过优化改善水产养殖经济动物肠道菌群结构，进而提高机体免疫力，促进养殖动物健康生长成为疾病防治技术研究热点之一。已报道的研究结果表明，该项技术具有绿色环保、实用高效的优点，但还未形成可供水产养殖生产应用的技术和产品，特别是针对海珍品鱼类半滑舌鳎具有免疫促生长作用的技术产品还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7。
本发明的第二个目的是提供具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7的应用。
本发明的技术方案概述如下：
具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016128。
上述具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7的发酵液添加到饲料中的应用。
本发明的优点：
实验证明具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7能显著提高养殖半滑舌鳎免疫机能，有效抵抗病原微生物侵袭，疾病发病率显著降低至4％以下，养殖成活率显著提高到96％以上；显著提高半滑舌鳎消化酶活性，提高饲料利用率，促进生长发育，饵料系数降低12％以上，特定生长率提高4％以上，经济效益显著。该菌株的应用，有效降低抗生素及化学药物使用量，减少环境污染，保障养殖产品质量安全，具有良好的生态效益。解决了制约半滑舌鳎养殖业健康发展的病害防治关键技术难题，实现了绿色环保高效健康养殖目标。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
我们针对半滑舌鳎养殖的特点和现状，设计半滑舌鳎免疫促生长作用微生物筛选方案，从健康的半滑舌鳎肠道分离获得大量菌株，经过溶血性、消化酶活性及抑菌活性测试分析，并开展生产应用实验，观察了半滑舌鳎生长发育情况，测定了半滑舌鳎免疫指标、生长指标及存活率，筛选获得没有溶血性、具有消化酶活性、抑菌活性，同时具有提高半滑舌鳎免疫机能、促生长作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B7菌株。
实施例1
解淀粉芽孢杆菌B7的获得：
(1)分离及纯化：取体重15g左右的健康半滑舌鳎于无菌条件下解剖取肠道，去除肠道内容物，用无菌生理盐水冲洗3次，称重后放到预冷的无菌玻璃匀浆器中匀浆，匀浆液100℃水浴10min，杀死非芽孢菌体，再梯度稀释至10-2，分别取匀浆原液、10-1、10-2三个梯度的稀释液100μL涂布在营养琼脂平板上，30℃恒温培养箱中培养48h。观察各个平板的菌落数量、形态、颜色及大小，挑取单菌落纯化培养，将纯化获得的菌株用简单复红染色镜检，剔除非芽孢杆菌，用石碳酸复红染色法进行革兰氏染色和芽孢染色，获得芽孢杆菌14株并保种备用。
(2)菌株的筛选：以获得对半滑舌鳎具有免疫促生长作用的芽孢杆菌为目标，将分离纯化的芽孢杆菌进行溶血性、消化酶活性和抑菌活性筛选。
首先将分离得到的芽孢杆菌在无菌营养肉汤中培养过夜，点种于血琼脂平板上，30℃恒温培养箱中培养24h，根据菌落周围是否形成透明圈，来判断溶血素的产生与否，筛选出不产生溶血素的芽孢杆菌9株；
分别用淀粉培养基和脱脂乳培养基鉴别上述9株芽孢杆菌的产淀粉酶和蛋白酶能力，筛选出既产淀粉酶又产蛋白酶的菌株7株，采用牛津杯法对筛选出的7株芽孢杆菌进行抑菌活性测定，筛选出具有抑菌活性的菌株4株。综上，筛选获得不产溶血素、产淀粉酶、产蛋白酶且具有较强抑菌活性的芽孢杆菌一株，命名为B7。
(3)菌株的鉴定：采用16S rDNA和gyrB基因序列分析方法，对分离筛选的芽孢杆菌B7进行属种鉴定。16S rDNA基因序列与NCBI数据库中解淀粉芽孢杆菌序列同源性达99％以上，gyrB基因序列与NCBI数据库中解淀粉芽孢杆菌序列同源性达99％以上；委托中国工业微生物菌种保藏管理中心进行生化鉴定，其生化特征与解淀粉芽孢杆菌较为一致。综合分子生物学及生化鉴定结果，芽孢菌株B7鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
(4)菌株的保存：将解淀粉芽孢杆菌B7，分类命名解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B7于2016年3月17日送至位于武汉大学校内的“中国典型培养物保藏中心”进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2016128。地址：中国，武汉，武汉大学)
所述的营养琼脂平板是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养琼脂(NA)加蒸馏水溶解，加热，煮沸，灭菌，冷却倒板制成的；
所述的无菌营养肉汤是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养肉汤(NB)加蒸馏水溶解煮沸灭菌制成的；
所述的血琼脂平板是北京陆桥技术股份有限公司生产的；
所述的淀粉培养基是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养琼脂(NA)加蒸馏水，每1000mL的培养基加2g可溶性淀粉，加热，煮沸，灭菌，冷却制成的平板；
所述的脱脂乳培养基是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养琼脂(NA)加蒸馏水，每1000mL的培养基加12g脱脂奶粉，加热，煮沸，灭菌，冷却制成的平板。
实施例2
解淀粉芽孢杆菌B7的特点：
(1)菌落特征：接种于营养琼脂平板上30℃培养24h，菌落白色，粗糙，平坦，边缘不整齐；革兰氏阳性，菌体呈杆状，单个、成对或链状排列。
(2)溶血性：将分离纯化得到的解淀粉芽孢杆菌B7接种在无菌营养肉汤中，30℃150rpm振荡培养24h，取10μl点种于血琼脂平板上，30℃恒温培养箱中培养24h，观察发现菌落周围没有形成透明圈，说明解淀粉芽孢杆菌B7不产生溶血素。
(3)淀粉酶活性：将解淀粉芽孢杆菌B7接种到无菌营养肉汤中，于30℃150rpm振荡培养24h，4500rpm离心20min，取100μL上清液加入到放置在淀粉培养基上的牛津杯中，30℃恒温培养箱中培养24h。滴加少量碘液于培养基表面，轻轻旋转，使碘液铺满整个平板，发现牛津杯周围有透明圈，说明解淀粉芽孢杆菌B7分泌的淀粉酶将牛津杯周围的淀粉水解了。牛津杯的直径为8mm，水解形成的透明圈直径越大，说明产淀粉酶能力越强(详见表1)。
(4)蛋白酶活性：将解淀粉芽孢杆菌B7接种到无菌营养肉汤中，于30℃150rpm振荡培养24h，4500rpm离心20min，取100μL上清液加入到放置在脱脂乳培养基上的牛津杯中，30℃恒温培养箱中培养24h，观察发现脱脂乳培养基上牛津杯周围形成了溶蛋白圈，牛津杯的直径为8mm，牛津杯周围溶蛋白圈直径越大，说明产蛋白酶能力越强(详见表1)。
表1解淀粉芽孢杆菌B7的消化酶活性测试记录
培养基 淀粉培养基 脱脂乳培养基
消化酶 淀粉酶(mm) 蛋白酶(mm)
检测结果 21 22
(5)抑菌活性：用本实验室保存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及6种海水鱼的常见致病菌(溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌和哈维氏弧菌)做指示菌，分别取浓度为1×108CFU/mL各指示菌悬液100μL均匀的涂布在营养琼脂平板上，
放上牛津杯，每个平板均匀放置4个牛津杯。将培养24h的解淀粉芽孢杆菌B7悬液用无菌营养肉汤调整菌悬液浓度至1×108CFU/mL，分别取100μL加到3个牛津杯中，另一个牛津杯加100μL无菌营养肉汤作为对照，观察解淀粉芽孢杆菌B7对8种指示菌的抑菌活性，观察测定抑菌圈直径记录于表2，牛津杯的直径为8mm，抑菌圈直径越大，说明抑菌作用越强。测定结果表明：解淀粉芽孢杆菌B7对大肠杆菌生长没有抑制作用，对其他7种指示菌的生长都有明显的抑制作用。
表2解淀粉芽孢杆菌B7的抑菌活性测试记录
Figure BDA0001254785900000041
所述的无菌营养肉汤是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养肉汤(NB)加蒸馏水溶解煮沸灭菌制成的；
所述的血琼脂平板是北京陆桥技术股份有限公司生产的；
所述淀粉培养基是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养琼脂(NA)加蒸馏水，每1000mL的培养基加2g可溶性淀粉，加热，煮沸，灭菌，冷却制成的平板；
所述的碘液是先将2g碘化钾溶解在50mL蒸馏水中，再将1g碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，再加入250mL蒸馏水混匀即可；
所述的脱脂乳培养基是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养琼脂(NA)加蒸馏水，每1000mL的培养基加12g脱脂奶粉，加热，煮沸，灭菌，冷却制成的平板。
实施例3
解淀粉芽孢杆菌B7发酵液制备方法：
实验室制备方法为：
(1)种子液培养：将解淀粉芽孢杆菌B7活化，接种到无菌营养肉汤中，30℃，150rpm振荡培养24h，即得种子液；
(2)发酵：在1L的三角瓶中装400mL的无菌营养肉汤，将种子液以10％接种量接种到三角瓶中，30℃，150rpm恒温振荡培养48h，细菌数达8×108CFU/mL～1×109CFU/mL；
(3)收获：将上述培养好的发酵液转移到500mL的无菌三角瓶中于4℃低温避光保存。
规模化制备方法为：
(1)种子液培养：按上述实验室制备方法，制备种子液4L；
(2)发酵培养基：50L发酵罐装36L培养基，培养基配方为葡萄糖0.5％～1％，豆饼粉1.0％～1.5％，硫酸锰0.02％～0.03％，氯化钠0.5％～0.7％，磷酸氢二钾0.02％～0.03％，碳酸钙0.5％～0.7％，115°灭菌30分钟；
(3)发酵：将4L种子液接种到准备好的发酵培养基中，转速100-250rpm，溶氧20-30％。使用消泡剂进行消泡。发酵时间为48h，细菌数为8×108CFU/mL～1×109CFU/mL，芽孢形成率为75％～85％；
(4)收获：将上述培养好的发酵液转移到5L的无菌塑料桶中低温避光保存。
实施例4
解淀粉芽孢杆菌B7提高半滑舌鳎免疫机能：
将解淀粉芽孢杆菌B7发酵液按照体积质量比1:50(单位mL/g)添加到半滑舌鳎鱼饲料(海旗半滑舌蹋鱼饲料)中，与未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的半滑舌鳎鱼饲料间隔投喂，即投喂添加了解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料4天后再投喂未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料4天，依次循环，此为实验组；同时设对照组，对照组一直投喂未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料，投喂3个月后，检测发现：半滑舌鳎血清溶菌酶活性较对照组提高31％，超氧化物歧化酶活性较对照组提高177％，过氧化氢酶活性较对照组提高121％，白细胞吞噬指数较对照组提高30％以上，白细胞吞噬百分比较对照组提高14％以上。统计实验组半滑舌鳎养殖存活率提高到96％以上，疾病发病死亡率降低到4％以下。实验组半滑舌鳎发病死亡率降低、存活率提高的结果与免疫指标显著提高的实验结果一致，说明口服解淀粉芽孢杆菌B7发酵液，能够有效提高半滑舌鳎机体免疫机能，提高抵抗病原微生物侵袭能力。
表3解淀粉芽孢杆菌B7提高半滑舌鳎免疫机能
Figure BDA0001254785900000061
表注：U/mL：1mL样品所含的酶活力单位，*：差异显著
实施例5
解淀粉芽孢杆菌B7促进半滑舌鳎生长：
将解淀粉芽孢杆菌B7发酵液按照体积质量比1:50(单位mL/g)添加到半滑舌鳎鱼饲料(海旗半滑舌蹋鱼饲料)中，与未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的半滑舌鳎鱼饲料间隔投喂，即投喂添加了解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料4天后再投喂未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料4天，依次循环，此为实验组；同时设对照组，对照组一直投喂未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料。每天记录实验组、对照组饲料投喂量，投喂3个月后，抽样测定实验组、对照组半滑舌鳎体重，计算增重率、特定生长率和饵料系数，发现：实验组的增重率较对照组提高10％以上，特定生长率较对照组提高4％以上，饵料系数较对照组降低12％以上，且实验组的增重率、特定生长率和饵料系数与对照组存在显著性差异，说明口服解淀粉芽孢杆菌B7发酵液能够显著促进半滑舌鳎生长。
表4解淀粉芽孢杆菌B7促进半滑舌鳎生长
Figure BDA0001254785900000071
注：*差异显著
实施例6
解淀粉芽孢杆菌B7的应用1：
(1)解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的添加：将解淀粉芽孢杆菌B7发酵液按照体积质量比1:50(单位mL/g)添加到半滑舌鳎鱼饲料(海旗半滑舌蹋鱼饲料)中，即发酵液100mL喷洒到5000g半滑舌鳎鱼饲料中，搅拌均匀，现用现拌料，外层包裹1‰海藻酸钠，阴干，1g饲料携带的解淀粉芽孢杆菌B7的数量约2×107CFU。
(2)半滑舌鳎投喂方案：应用对象是体重15-20g工厂化养殖半滑舌鳎5000尾，分实验组和对照组，随机取实验组和对照组鱼各50尾，称量体重，计算平均值。实验组连续投喂添加了解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料4天，再连续投喂未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料4天，依次循环，两种饲料间隔投喂2个月；对照组一直投喂未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料。
(3)半滑舌鳎免疫酶类活性测定：按照上述投喂方案连续投喂2个月时，分别抽取实验组、对照组半滑舌鳎20尾，分别尾静脉取血，测定血清免疫酶活性及白细胞吞噬活性，记录于表5。由表5可以看出：实验组半滑舌鳎血清溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、白细胞吞噬指数和吞噬百分比等5项非特异性免疫指标均显著高于对照组，说明解淀粉芽孢杆菌B7能提高半滑舌鳎机体免疫机能。
(4)半滑舌鳎生长性能测定：投喂养殖过程中，记录两个组饲料摄食情况。连续投喂2个月，随机取实验组和对照组半滑舌鳎各20尾，称量体重，计算平均增重、增重率、特定生长率，结合摄食情况，计算饵料系数，记录于表6。由表6可以看出：实验组的增重率和特定生长率显著高于对照组，而饵料系数又显著低于对照组，说明同样饵料用量情况下，口服解淀粉芽孢杆菌B7能够提高养殖鱼类增重量，从而降低养殖成本。
表5半滑舌鳎免疫酶类活性测定记录表
Figure BDA0001254785900000081
表注：U/mL：1mL样品所含的酶活力单位，*：差异显著
表6半滑舌鳎生长性能测定记录表
Figure BDA0001254785900000082
表注：*差异显著
实施例7
一株解淀粉芽孢杆菌B7的应用2：
(1)解淀粉芽孢杆菌B7的添加：将解淀粉芽孢杆菌B7发酵液按照体积质量比1:50(单位mL/g)添加到半滑舌鳎饲料(海旗半滑舌蹋鱼饲料)中，即发酵液100mL喷洒到5000g半滑舌鳎鱼饲料中，搅拌均匀，现用现拌料，外层包裹1‰海藻酸钠，阴干，1g饲料携带的解淀粉芽孢杆菌B7的剂量约2×107CFU。
(2)半滑舌鳎苗种投喂方案：应用对象是体重15-20g工厂化养殖半滑舌鳎20000尾，分实验组和对照组，随机取实验组和对照组鱼各50尾，称量体重，计算平均值。实验组连续投喂添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料4天，再连续投喂未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料4天，依次循环，两种饲料间隔投喂3个月；对照组一直投喂未添加解淀粉芽孢杆菌B7发酵液的饲料。
(3)半滑舌鳎免疫酶类活性测定：按照各自的投喂方案，两组鱼在投喂相应饲料3个月时，尾静脉取血，测血清非特异性免疫酶活性及白细胞吞噬活性，记录于表7。由表7可以看出：实验组半滑舌鳎血清溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、白细胞吞噬指数和吞噬百分比5项非特异性免疫指标均显著高于对照组，且养殖成活率为96.4％，说明解淀粉芽孢杆菌能提高半滑舌鳎机体免疫机能。
(4)半滑舌鳎生长性能测定：养殖生产中，记录两个组饲料的进食情况。两种饲料间隔投喂3个月，随机取实验组和对照组鱼各50尾，称量体重，计算平均值，结合实验初各组鱼的均重计算平均增重、增重率、特定生长率，结合摄食情况，计算饵料系数，记录于表8。由表8可以看出：对照组的增重率和特定生长率显著高于对照组，而饵料系数又显著低于对照组，说明同样饵料用量情况下，解淀粉芽孢杆菌B7提高养殖鱼类增重量，促进鱼体生长，降低养殖成本。
表7半滑舌鳎免疫酶类活性测定记录表
Figure BDA0001254785900000091
表注：U/mL：1mL样品所含的酶活力单位，*：差异显著
表8半滑舌鳎生长性能测定记录表
Figure BDA0001254785900000092
注：*差异显著

Claims (2)

1.具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2016128；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B7是从健康的半滑舌鳎肠道分离获得、没有溶血性、具有消化酶活性、抑菌活性，同时具有提高半滑舌鳎免疫机能、促生长作用。
2.权利要求1的具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7的发酵液添加到饲料中的应用。
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