CN111269865B - 一种侧孢短芽孢杆菌菌株s62-9及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种侧孢短芽孢杆菌S62‑9及其用途，所述的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)菌株S62‑9具有更广谱、更高效的抑菌性，对常见的动物病原菌和植物病原菌均具有较佳的抑菌性，对畜禽类病原菌包括猪链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、坂崎肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌以及植物病原菌包括枯萎病病菌、根腐病病原菌、茎基腐病病原菌、水稻纹枯病和苹果粉红单端孢霉心病病原菌均具有高效抑菌性，可以广泛用于动物如畜禽类和植物作物的病原菌感染方面的防治。

Description

一种侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9及其用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种侧孢短芽孢杆菌S62-9及其用途。
背景技术
侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)为短芽孢杆菌属中的一员，为革兰氏阳性菌，广泛分布于自然环境中，包括植物、动物肠道、海水、土壤和众多食品。自1989年侧孢短芽孢杆菌BOD作为第一株人类商用菌株以来，侧孢短芽孢杆菌的研究从未停止。近几年来，随着对侧孢短芽孢杆菌的深入研究，发现其能产生多种有应用潜力的代谢产物，如抗菌物质、杀虫蛋白等。如2012年赵璟等人报道了一株能产抗菌肽的侧孢短芽孢杆菌 A60。2013年Chunglok报道了侧孢短芽孢杆菌SA14对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及人结肠癌细胞具有良好的抗生物特性。2017年Khaled等从蜜蜂肠道中分离得到的侧孢短芽孢杆菌能够促进宿主生长。2018年M.Marsha Ormskirk报道了两株具有杀虫能力的侧孢短芽孢杆菌1821和1951。
目前，越来越多具有生物活性的侧孢短芽孢杆菌正在被人们所发现。然而，如前所发现的侧孢短芽孢杆菌菌株抑菌谱较窄，仅对某类病原菌具有一定的抑菌效果，如仅对常见的动物病原菌金黄色葡萄球菌、猪链球菌、大肠杆菌、沙氏门菌和小肠结肠炎耶氏菌中的某一种或几种菌具有一定的抑菌效果，或是对常见的植物作物的病原真菌串珠镰刀菌、腐皮镰刀菌、芦笋茎枯病菌、黄瓜黄瓜炭疽病菌和桃根霉病菌中的某一种或几种具有拮抗作用。由于目前所发现的侧孢短芽孢杆菌菌株抑菌谱较窄，限制了侧孢短芽孢杆菌的应用。本发明发现了一种侧孢短芽孢杆菌菌株具有更广谱、高效的抑菌性，对常见的动物病原菌和植物病原菌均具有较佳的抑菌性。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种侧孢短芽孢杆菌菌株 S62-9及其用途，所述菌株S62-9具有更广谱、高效的抑菌性，对常见的动物病原菌和植物病原菌均具有较佳的抑菌性，可以广泛用于动物如畜禽类和植物作物的病原菌感染方面的防治。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)菌株 S62-9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18629，保藏日期为2019年9月27日。
本发明提供了一种含有所述的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的微生物菌剂。
进一步的，在所述的微生物菌剂中，所述的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9 的菌浓度为1×108～1010CFU/g。
本发明提供了一种制备所述的微生物菌剂的方法，包括：将所述的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9进行发酵培养，取发酵液。
进一步的，在所述的制备方法中，包括如下步骤：所述侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的活化、种子液制备、液体发酵和干燥；
所述液体发酵包括：将种子液转入发酵培养基中，震荡培养转速 230-250rpm/min，温度36.8-37.2℃，发酵46-50h，得发酵液；所述的发酵培养基组分包括：葡萄糖25-35g/L，豆粕5-15g/L，无水氯化钙CaCl2 0.30-0.60 g/L，牛肉膏2-4g/L，pH 7.0～7.2；
所述干燥步骤包括：向发酵液中加入玉米浆粉，所述玉米浆粉占发酵液的质量百分比为5-10％后，干燥。
优选的，所述的发酵培养基组分包括：葡萄糖30g/L，豆粕10g/L，无水氯化钙CaCl20.45g/L，牛肉膏3g/L，pH 7.0～7.2。
本发明提供了所述的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9或所述的微生物菌剂具有如下用途:
(1)抑制畜禽类病原菌或植物病原菌中的用途；
(2)制备抑制畜禽类病原菌或植物病原菌的产品中的用途；
(3)提高动物免疫力的用途；
(4)提高动物生长速度的用途；
(5)提高动物饲料利用率的用途；
(6)制备提高动物免疫力的产品的用途；
(7)制备提高动物生长速度的产品的用途；或
(8)制备提高动物饲料利用率的产品的用途。
进一步的，所述的产品包括饲料添加剂或抑菌剂。
进一步的，在所述的用途中，所述畜禽类病原菌包括猪链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、坂崎肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌中的至少一种。
进一步的，在所述的用途中，所述植物病原菌包括枯萎病病菌、根腐病病原菌、茎基腐病病原菌、水稻纹枯病或苹果粉红单端孢霉心病病原菌中的至少一种。
进一步的，在所述的用途中，所述枯萎病病菌包括尖孢镰刀菌；所述根腐病病原菌包括腐皮镰孢；所述茎基腐病病原菌包括藤仓镰刀菌；所述水稻纹枯病包括立枯丝核菌；所述苹果粉红单端孢霉心病病原菌包括粉红单端孢菌。
进一步的，在所述的用途中，所述畜禽类的动物包括猪、鸡、鸭或鹅。
进一步的，在所述的用途中，所述植物包括番茄、瓜类作物、棉花、香蕉、玉米、高粱、水稻或苹果。
本发明提供了一种饲料添加剂，包括所述的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9 或所述的微生物菌剂。
本发明提供了一种抑菌剂，包括所述的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9或所述的微生物菌剂。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)菌株 S62-9，具有更广谱、高效的抑菌性，对常见的动物病原菌和植物病原菌均具有较佳的抑菌性，对畜禽类病原菌包括猪链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、坂崎肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌以及植物病原菌包括枯萎病病菌、根腐病病原菌、茎基腐病病原菌、水稻纹枯病和苹果粉红单端孢霉心病病原菌均具有高效抑菌性，可以广泛用于动物如畜禽类和植物作物的病原菌感染方面的防治。
2.本发明提供一种侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)菌株 S62-9在畜禽类病原菌包括猪链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、坂崎肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌具有抑菌性，使得其或者包含其的微生物菌剂可以广泛应用于动物饲料添加剂，防治畜禽类病菌感染病的防治，增强机体免疫力，进而提高动物机体对饲料的利用率，增加体重。
3.本发明提供一种侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)菌株 S62-9在枯萎病病菌、根腐病病原菌、茎基腐病病原菌、水稻纹枯病和苹果粉红单端孢霉心病病原菌具有高效的抑菌效果，使得其或者包含其的微生物菌剂可以应用于农药抑菌剂，防治植物作物病原菌的感染，促进植物作物生长，提高植物作物的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的16S rDNA 基因序列比对分析结果；
图2是本发明实施例1中的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的显微镜观察结果；
图3是本发明实验例1中的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的对畜禽类病原菌的拮抗作用结果图；图3(a)-(h)依次对应猪链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、坂崎肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌；
图4是本发明实验例2中侧孢短芽孢杆菌S62-9对植物作物病原菌的拮抗作用结果图；图4(a)-(e)依次对应尖孢镰刀菌、腐皮镰孢、藤仓镰刀菌、立枯丝核菌和粉红单端孢菌。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中的营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、PDA培养基为市售。
肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、志贺氏菌购自CMCC，乙型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰孢、藤仓镰刀菌、立枯丝核菌和粉红单端孢菌购自CICC，猪链球菌、坂崎肠杆菌购自ATCC。
实施例1侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9
(1)分离
取自中国江苏无锡惠山山坡的土壤(经度:120.304，纬度:31.688)，采用梯度稀释法将10g土壤与90mL无菌生理盐水混合制成悬浮液，以无菌生理盐水制备105、106倍稀释液，各取100μL涂布与营养琼脂(NA)培养基平板，每个处理重复3次，将上述培养基置于37℃培养24h，挑取单菌落转至NA培养基平板划线纯化，得到侧孢短芽孢杆菌S62-9，纯化菌株于 -80℃甘油保存。(2)鉴定
将所得的菌株S62-9液体培养16h后，提取基因组DNA，采用通用引物进行16S rDNA基因序列的PCR扩增，PCR产物经电泳检测、纯化后进行测序，得到16S rDNA基因序列。上述16S rDNA基因序列比对分析结果如图1所示，菌株S62-9与侧孢短芽孢杆菌BPM3(GenBank:EU159585) 的同源性为99％，将16S rDNA提交GenBank进行注册，注册序列号为 EU709016。
(3)形态学观察
将所得的菌株S62-9采用显微镜对其芽孢体进行形态学观察，结果如图 2所示。
将上述经过鉴定和形态学观察的菌株S62-9命名为Brevibacillus laterosporusS62-9，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18629，保藏日期为2019年9月27日。
实施例2侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的微生物菌剂
本实施例提供了一种侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保藏编号为CGMCC No.18629的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9接种至营养肉汤培养基，240rpm/min，37℃恒温振荡摇床，培养24h，得到活化后的菌液，备用；
(2)种子液的制备
将上述活化后的菌液按照3％(V/V)的接种量接种于营养肉汤培养基， 240rpm/min，37℃恒温振荡摇床，培养48h，得到种子液；
(3)液体发酵
将上述获得的种子液按照3％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，转速240rpm/min，温度37℃恒温振荡摇床，发酵48h，得到发酵液；所述的发酵培养基组分包括：葡萄糖30g/L，豆粕10g/L，无水氯化钙CaCl2 0.45 g/L，牛肉膏3g/L，pH 7.0～7.2,121℃高压蒸汽灭菌20min；
(4)干燥
向得到的发酵液中加入玉米浆粉，所述玉米浆粉占发酵液的质量百分比为8％，将得到的混合物喷雾干燥得到微生物菌剂。
将上述得到的微生物菌剂用生理盐水重悬后采用平板涂布法测得其菌落数约为2.0×109CFU/g。
实施例3侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的微生物菌剂
本实施例提供了一种侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保藏编号为CGMCC No.18629的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9接种至营养肉汤培养基，230rpm/min，37℃恒温振荡摇床，培养24h，得到活化后的菌液，备用；
(2)种子液的制备
将上述活化后的菌液按照3％(V/V)的接种量接种于营养肉汤培养基， 230rpm/min，37℃恒温振荡摇床，培养46h，得到种子液；
(3)液体发酵
将上述获得的种子液按照3％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，转速230rpm/min，温度37℃恒温振荡摇床，发酵46h，得到发酵液；所述的发酵培养基组分包括：葡萄糖25g/L，豆粕5g/L，无水氯化钙CaCl2 0.30 g/L，牛肉膏2g/L，pH 7.0～7.2,121℃高压蒸汽灭菌20min；
(4)干燥
向得到的发酵液中加入玉米浆粉，所述玉米浆粉占发酵液的质量百分比为5％，将得到的混合物喷雾干燥得到微生物菌剂。
将上述得到的微生物菌剂用生理盐水重悬后采用平板涂布法测得其菌落数约为1.0×108CFU/g。
实施例4侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的微生物菌剂
本实施例提供了一种侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保藏编号为CGMCC No.18629的侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9接种至营养肉汤培养基，250rpm/min，37℃恒温振荡摇床，培养24h，得到活化后的菌液，备用；
(2)种子液的制备
将上述活化后的菌液按照3％(V/V)的接种量接种于营养肉汤培养基， 250rpm/min，37℃恒温振荡摇床，培养50h，得到种子液；
(3)液体发酵
将上述获得的种子液按照3％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，转速250rpm/min，温度37℃恒温振荡摇床，发酵50h，得到发酵液；所述的发酵培养基组分包括：葡萄糖30g/L，豆粕10g/L，无水氯化钙CaCl2 0.45 g/L，牛肉膏3g/L，pH 7.0～7.2,121℃高压蒸汽灭菌20min.；
(4)干燥
向得到的发酵液中加入玉米浆粉，所述玉米浆粉占发酵液的质量百分比为10％，将得到的混合物喷雾干燥得到微生物菌剂。
将上述得到的微生物菌剂用生理盐水重悬后采用平板涂布法测得其菌落数约为1.0×1010CFU/g。
实验例1侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9对畜禽类病原菌的拮抗作用
采用划线法，将侧孢短芽孢杆菌S62-9划平行线于各病原菌指示菌平板，培养24h，结果如图3(a)-(h)所示，侧孢短芽孢杆菌S62-9能够抑制猪链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、坂崎肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的生长。
各病原菌指示菌平板的制备方法：接种以下病原菌于5mL营养肉汤培养基,37℃培养12h后，以3％(v/v)的接种量与45～50℃的营养琼脂培养基混合均匀，倾倒20mL于平板内至凝固备用。病原菌：猪链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、坂崎肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌。
实验例2侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9对植物作物病原菌的拮抗作用
采用点种法，将侧孢短芽孢杆菌S62-9接种于各病原菌PDA平板，培养5天，结果如图4(a)-(e)所示，侧孢短芽孢杆菌S62-9能够抑制尖孢镰刀菌、腐皮镰孢、藤仓镰刀菌、立枯丝核菌和粉红单端孢菌的生长。
各病原菌指示菌平板的制备方法：以点种法接种以下病原菌孢子悬液涂布于PDA平板。病原菌：尖孢镰刀菌、腐皮镰孢、藤仓镰刀菌、立枯丝核菌和粉红单端孢菌。
实验例3侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的应用
一、实验小鼠：4周龄清洁级KM幼鼠，雄性，体重(20±2)g。
二、小鼠饲料营养成分(％)：粗脂肪5.0％，粗蛋白20.0％，碳水化合物68.0％，混和无机盐4.0％，混合维生素2.0％，纤维素1.0％，热能16.1kJ/g。
三、侧孢短芽孢杆菌S62-9菌悬液：取实施例2中制备的微生物菌剂加入灭菌的生理盐水中，分别配制成侧孢短芽孢杆菌S62-9浓度为 6.0×106CFU/mL和6.0×107CFU/mL的菌悬液；生理盐水：浓度为0.9％ (g/ml)。
四、分组：将购买的KM小鼠在实验室预喂养适应3d，随机分为5组，每组10只，分别为：空白组，给予生理盐水；试验组1，给予6.0×106CFU/mL 侧孢短芽孢杆菌S62-9菌悬液；试验组2，给予6.0×107CFU/mL侧孢短芽孢杆菌S62-9菌悬液。
五、实验方法：
1、增重和料重比的计算
饲养管理：单笼喂养，自由摄食饮水，同时每天灌胃400μL侧孢短芽孢杆菌S62-9菌悬液，连续灌胃14天。在灌胃第0、3、7、10、14d称量体重和料重，计算各组小鼠各阶段增重和料重比。
2、免疫器官指数的计算
将灌胃第14d以及灌胃结束后第7d(即总饲养第21d)，各取3只体重接近平均值的小鼠，取脾脏称重，计算免疫器官指数。
免疫器官指数＝免疫器官重量(mg)×1000/小鼠体重(g)。
六、实验结果：
1、增重和料重比的计算结果
各试验组小鼠各阶段增重结果如下表1所示：
表1各试验组小鼠阶段增重
Figure RE-GDA0002478908220000121
注：相同字母表示二者无显著性差异(P>0.05)，不同字母表示二者有显著性差异(P<0.05)
各试验组小鼠各阶段料重比结果如下表2所示：
表2各试验组小鼠各阶段料重比
Figure RE-GDA0002478908220000122
由以上表1-2可知，6.0×106CFU/mL、6.0×107CFU/mL浓度的侧孢短芽孢杆菌S62-9菌悬液可以使小鼠体重增加且增长速率高于空白组，同时降低料重比，提高小鼠对饲料的利用率。
2、免疫器官指数的计算结果
各试验组小鼠各阶段免疫器官指数如下表3所示：
表3各试验组小鼠各阶段免疫器官指数
Figure RE-GDA0002478908220000131
结果如表3所示，灌胃侧孢短芽孢杆菌S62-9浓度为6.0×106CFU/mL 的菌悬液能够提高小鼠免疫器官指数，增强免疫能力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (3)

1.侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）菌株S62-9或其微生物菌剂在制备提高动物免疫力的产品中的用途；所述提高动物免疫力是指提高动物免疫器官指数；
所述侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9，保藏编号为CGMCC No.18629。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的微生物菌剂中侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的菌浓度为1×108~1010 CFU/g。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的微生物菌剂的制备包括如下步骤：所述侧孢短芽孢杆菌菌株S62-9的活化、种子液制备、液体发酵和干燥；
所述液体发酵包括：将种子液转入发酵培养基中，振荡培养转速230-250 r/min，温度37℃，发酵46-50h，得发酵液；所述的发酵培养基组分为：葡萄糖25-35g/L，豆粕5-15g/L，无水氯化钙0.30-0.60 g/L，牛肉膏2-4g/L，pH 7.0～7.2；
所述干燥步骤包括：向发酵液中加入玉米浆粉，所述玉米浆粉占发酵液的质量百分比为5-10%，随后干燥。
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