CN112538442B

CN112538442B - 一株地衣芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN112538442B
Application number: CN202011246518.5A
Authority: CN
Inventors: 孙云章; 杨红玲; 魏成业; 汪攀; 杨伟
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2040-11-10
Also published as: CN112538442A

Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌及其应用。本发明所提供的地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XCY26，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18463。本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XCY26 CGMCC No.18463可显著改善小丑鱼体色，提高小丑鱼生长速度和存活率。同时，使用本发明的地衣芽孢杆菌菌剂可替代虾青素，成本低，使用方便，易于保存，是一种绿色、安全的水产饲料添加剂。

Description

一株地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株地衣芽孢杆菌XCY26及其应用。

背景技术

海水观赏鱼因其投入高，饲养难度大等特点，一度只是高端水族玩家的宠物。但随着人们生活水平的提高与相关技术的成熟，海水观赏鱼已逐步走入寻常百姓家。小丑鱼是海水观赏鱼里最好养的品种之一，且价格不高，逐渐成为海水观赏鱼的优先品种。

小丑鱼属雀鲷科(Pomacentridae)、海葵鱼亚科(Amphiprioninae)，本亚科可分成双锯鱼属(Amphiprion)和棘颊雀鲷属(Premna)。主要分布在西太平洋低纬度的礁岩海域，在珊瑚礁间游弋，在自然条件下，小丑鱼都与海葵共生，所以又称海葵鱼。小丑鱼因其鲜艳的外表和可爱的形象而为水族爱好者所喜爱。近年来随着海水观赏鱼贸易的发展，其经济价值逐渐被人们所重视。美国及东南亚地区对于小丑鱼类的繁殖技术已较成功，并进行了商业化生产。我国广州、上海、温州等地区也成功进行了人工繁殖，并且有一定数量进入商业化市场。

养殖过程中，由于养殖环境与原生态环境的差异及饲料等原因，常导致小丑鱼体色暗淡，影响其观赏价值。因此，如何保持小丑鱼体色艳丽，提高观赏价值，已成为小丑鱼产业的热点问题。目前饲料中多添加虾青素改善小丑鱼体色，但是虾青素价格昂贵，1公斤的市场价格高达1600元，而且虾青素不易保存，不适合在饲料中长期添加使用。亟待开发新的增加小丑鱼体色的饲料添加剂。

地衣芽孢杆菌(学名:Bacillus licheniformis)是一种在土壤中常见的革兰氏阳性细菌。研究发现，地衣芽孢杆菌能够产生多种抗菌物质，具有较好的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，且具有以菌治菌的作用，因此，被广泛地应用于医药、饲料添加剂、农药和兽药等方面。在水产养殖应用中地衣芽孢杆菌具有促进动物生长、减少病害和净化水质等方面的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种地衣芽孢杆菌及其生物学纯培养物、及其在制备菌剂或饲料中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用了以下技术方案：

一种地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称：CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCCNo.18463。

上述的地衣芽孢杆菌的生物学纯培养物。

上述的衣芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的生物学纯培养物在制备菌剂或饲料中的应用。

一种菌剂，其包括上述的地衣芽孢杆菌。

一种饲料，其包括上述的地衣芽孢杆菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)XCY26 CGMCC No.18463，能显著改善小丑鱼体色，提高小丑鱼生长速度和存活率。本发明将地衣芽孢杆菌干燥得到的地衣芽孢杆菌菌剂，可以作为添加剂用于制备小丑鱼饲料。该饲料可显著改善小丑鱼体色，且能提高小丑鱼生长速度和存活率。同时，使用本发明的地衣芽孢杆菌菌剂可替代虾青素，成本低，使用方便，易于保存，是一种绿色、安全的水产饲料添加剂。

保藏说明

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2019年09月02日

菌种名称：地衣芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus licheniformis

菌株编号：XCY26

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18463

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为地衣芽孢杆菌XCY26生理生化鉴定结果。

图2为基础饲料组成。

图3为小丑鱼胸部体色检测结果。

图4为小丑鱼腹部体色检测结果。

图5为小丑鱼生长指标和存活率检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供地衣芽孢杆菌XCY26的分离与鉴定

一、地衣芽孢杆菌XCY26的分离

S1.菌株来源

体色较深公子小丑鱼(Amphiprion ocellaris)肠道。

S2.菌株的分离

公子小丑鱼体表经75％酒精擦拭消毒，无菌解剖取出肠道，肠道组织与1mL0.85％的无菌生理盐水充分混匀，匀浆后取0.5mL悬浮液，利用0.85％无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，依次得到10^-1-10^-6的稀释液，每个稀释液取100μL涂布于2216E、TCBS、MRS固体培养基平板，每个稀释度做3个平行，置于30℃培养箱培养24h。

选择生长疏密适当的稀释度的平板进行菌落形态观察，根据菌落大小，光泽、质地、边缘特征、表面特征、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色、生长速度等特征和培养性状初步进行统计编号，统计各种类型菌落数量。挑选平板中的优势单菌落，进行第一次平板划线，后面根据培养的结果，再进行第二，三次划线，分离纯化出单菌落。

S3.菌株的培养

用接种环挑取适量地衣芽孢杆菌XCY26菌体接种到装有50mL培养基1的250mL三角瓶中进行培养。

其中，培养基1的组成为：蛋白胨8-12g，牛肉膏4-6g，葡萄糖16-25g，氯化钠4-6g，蒸馏水1000mL。

培养条件为：培养温度28-30℃；初始pH值6.9-7.2；摇床转速200-260rpm；培养时间为20-24h。

二、地衣芽孢杆菌XCY26的鉴定

S1.形态学鉴定

一方面，将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并筛选得到的菌株XCY26进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。另一方面，对处于对数生长期的所述菌株XCY26，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

分离并筛选得到的单菌落为：乳白色，菌落透明，形状不规则，菌落含有较多的液体，呈山丘状隆起。

分离并筛选得到的菌株XCY26的细胞为杆状，细胞直径0.8μm，有芽孢形成，芽孢中生呈椭圆形，革兰氏染色阳性。

S2.生理生化特征测定

细菌生理生化鉴定采用菌悬液法：取一内盛2ml无菌水试管，用接种针从平板挑取已纯化单个菌落至无菌水中仔细研磨形成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液，滴入需要试验的试管或安瓿瓶中，每管3滴，放置于30℃培养箱中培养24h，观察试验结果。

菌株XCY26的生理生化特征测定结果如图1所示。

S3.16S rDNA序列同源性分析

1)DNA提取

采用菌落PCR方法扩增S1所得的菌株XCY26的16SrDNA片段。细菌总DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Tiangen DP302-02)提取。

2)16S rDNA基因PCR扩增

PCR引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

引物采用细菌通用引物，其引物序列为：

正向引物为27f(对应于Escherichia coil第8-27位碱基，如SEQ ID NO:2所示)：5′-agagtttgatcctggctcag-3′；

反向引物为1495r(对应于Escherichia coil第1495-1515位碱基，如SEQ ID NO:3所示)：5′-ctacggctaccttgttacga-3′。

反应体系(50μL)：

PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化片段长度约1500bp的阳性产物。

3)序列测定

PCR产物纯化后，送上海美吉生物医药科技有限公司进行序列测定，其序列如下(如SEQ ID NO:1所示)：

agtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgattgaaccgcatggttcaatcataaaaggtggcttttagctaccacttgcagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggyaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggcttccycttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttgagccagccgccgaaggtgacaga

该序列与NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)已知标准菌株比对表明，该菌株与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DSM 13＝ATCC 14580(AccessionNo.NC_006270.3)的同源性最高，达99.7％。

上述形态特征、生理生化特征分析和16srDNA序列同源性分析结果表明该菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。该菌株已于2019年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.18463，其分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XCY26。

实施例2

本实施例提供地衣芽孢杆菌XCY26菌剂的制备

S1.一级种子培养液制备

用接种环挑取适量斜面保存的地衣芽孢杆菌XCY26菌体接种到6-10个装有50mL培养基1的250mL三角瓶中进行培养。其中，培养基1的组成为：蛋白胨8-12g，牛肉膏4-6g，葡萄糖16-25g，氯化钠4-6g，蒸馏水1000mL；培养条件为：培养温度28-30℃；初始pH值6.9-7.2；摇床转速200-260rpm；培养时间为20-24h；得到300-500mL的一级种子培养液。

S2.二级种子培养液制备

按照2-4％的比例将一级种子培养液接种到20-30个装有400mL培养基2的2000mL三角瓶中。其中，培养基2的组成为：蛋白胨8-12g，牛肉膏4-6g，葡萄糖16-25g，氯化钠4-6g，蒸馏水1000mL；培养条件为：培养温度28-30℃；初始pH值6.9-7.2；摇床转速200-260rpm；培养时间为18-24h；得到8-12L的二级种子培养液。

S3.液体发酵

液体发酵具体为：按照3％-5％的比例将二级种子培养液接种到培养基3中，其中培养基3的组分为玉米粉10-16g，豆粕粉8-12g，玉米浆4-8g，硫酸铵5-8g，七水硫酸镁0.8-1.2g，三水合磷酸氢二钾2-4g，硫酸锰0.04-0.06g，自来水1000mL；在500L发酵罐进行液体发酵，发酵条件为：发酵温度28-30℃；初始pH值6.9-7.2；搅拌转速200-260rpm；装液系数0.5；发酵时间为20-28h。

S3.菌剂制备

按照S2发酵后，离心收集菌体(转速为4000-5000rpm；离心时间为10min-20min)，在菌体中加入玉米淀粉作为载体(质量比为1:2-1:4)，经振动流化床干燥(干燥条件为：进风温度60℃-100℃，出风温度40℃-60℃)、粉碎、过80目筛、真空包装，获得可常温保存的衣芽孢杆菌XCY26菌剂，每克菌粉中地衣芽孢杆菌XCY26活菌含量1.0×10¹⁰CFU；

实施例3

本实施例提供地衣芽孢杆菌XCY26菌剂的应用

将由实施例2制备的地衣芽孢杆菌XCY26菌剂按照0.05％-1.0％的比例添加到小丑鱼基础饲料(基础饲料组成如图2所示)中，地衣芽孢杆菌XCY26在每克基础饲料中含量达到5.0×10⁶-1.0×10⁸CFU/g。优选每克基础饲料中的XCY26含量达到1.0×10⁷CFU/g，可显著改善公子小丑鱼体色(如图3、图4所示)，且能提高公子小丑鱼生长速度和存活率(所图5所示)。

S1.试验材料

试验动物：选取公子小丑鱼。

地衣芽孢杆菌菌剂：按照实施例2方法制备的地衣芽孢杆菌菌剂5.0×10⁶-1.0×10⁸CFU/g)。

S2.试验分组

实验共分为5组：

对照组(基础饲料，不添加益生菌粉)；

试验组1，基础饲料中添加5.0×10⁶地衣芽孢杆菌XCY26；

试验组2，基础饲料中添加1.0×10⁷地衣芽孢杆菌XCY26；

试验组3，基础饲料中添加5.0×10⁷地衣芽孢杆菌XCY26；

试验组4，基础饲料中添加1.0×10⁸地衣芽孢杆菌XCY26。

S3.饲养管理

实验在集美大学水产学院水产养殖实验室进行。

试验用水为曝气海水，光照为自然光，24h持续增氧。每天8:00，12:00和18:00定时饱食投喂，投喂前应关闭循环系统，每次投喂后用虹吸法吸出缸底粪便，每次视缸中水体清澈程度控制换水量为1/3-1/2。

养殖期间水质状况：盐度1.026-1.028，水温22-28℃，pH 7.5±0.3，溶氧>7.0mg/L，氨氮浓度<0.2mg/L。每日记录下每缸小丑鱼的摄食情况、健康状况以及死亡情况。

定期清洗过滤棉，过滤袋，以保持水体清澈。饲养周期为28天。

S4.检测指标和方法

用分光测色仪(型号CM-700d)测定小丑鱼体色，测定时选择白色背景板，保持仪器垂直于白色背景板进行测定读数。

分别记录小丑鱼胸部黄色带及腹部黄色带L(亮度)、a(红度)、b(黄度)值，每个部位测量三次以减少测量误差。

S5.数据处理

所有数据均采用Excel进行整理，结果以平均值±标准误差表示，使用SPSS 23.0进行独立样本t检验进行方差分析，P＜0.05表示差异显著。

S6.试验结果

1)地衣芽孢杆菌对小丑鱼体色的影响

从图3中可以看出，与对照组相比，饲料中添加0.05％、0.1％、0.5％、1.0％地衣芽孢杆菌组(每克基础饲料中的XCY26含量分别为5.0×10⁶、1.0×10⁷、5.0×10⁷、1.0×10⁸CFU)小丑鱼胸部亮度值均显著降低，红度值和黄度值均显著上升(P<0.05)。其中，小丑鱼胸部红度值和黄度值的最大值均出现在添加0.1％益生菌粉组，提示在饲料中添加1.0×10⁷CFU/g地衣芽孢杆菌XCY26改善小丑鱼胸部体色效果最佳。

从图4中可以看出，与对照组相比，饲料中添加0.05％-1.0％地衣芽孢杆菌组(每克基础饲料中的XCY26含量分别为5.0×10⁶、1.0×10⁷、5.0×10⁷、1.0×10⁸CFU)小丑鱼腹部亮度值均显著降低，红度值和黄度值均显著上升(P<0.05)。其中，小丑鱼腹部红度值和黄度值的最大值均出现添加0.1％益生菌粉组，提示在饲料中添加1.0×10⁷CFU/g地衣芽孢杆菌XCY26改善小丑鱼腹部体色效果最佳。

2)地衣芽孢杆菌对小丑鱼生长和存活率的影响

由图5可知，与对照组相比，添加0.05％、0.1％、0.5％、1.0％地衣芽孢杆菌组(每克基础饲料中的XCY26含量分别为5.0×10⁶、1.0×10⁷、5.0×10⁷、1.0×10⁸CFU)小丑鱼体增重、体长增长、存活率均显著上升(P<0.05)。其中，小丑鱼体增重、体长增长、存活率的最大值均出现添加0.1％益生菌粉组，提示饲料中添加1.0×10⁷CFU/g地衣芽孢杆菌XCY26改善小丑鱼生长和存活率效果最佳。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 集美大学

<120> 一株地衣芽孢杆菌及其应用

<130> P66984

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1426

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

agtcgagcgg accgacggga gcttgctccc ttaggtcagc ggcggacggg tgagtaacac 60

gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgc 120

ttgattgaac cgcatggttc aatcataaaa ggtggctttt agctaccact tgcagatgga 180

cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg 240

acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300

agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 360

gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg 420

cggyaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggttt 540

cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac 600

ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg 660

aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg 720

tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt 780

gttagagggt ttccgccctt tagtgctgca gcaaacgcat taagcactcc gcctggggag 840

tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 900

gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc 960

tagagatagg gcttccyctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1020

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca 1080

gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1140

cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg ggcagaacaa 1200

agggcagcga agccgcgagg ctaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca 1260

gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1320

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc 1380

gaagtcggtg aggtaacctt ttgagccagc cgccgaaggt gacaga 1426

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Bacillus licheniformis)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Bacillus licheniformis)

<400> 3

ctacggctac cttgttacga 20

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌XCY26（Bacillus licheniformis XCY26），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18463。

2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在制备菌剂或饲料中的应用。

3.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的地衣芽孢杆菌。

4.一种饲料或饲料添加剂，其特征在于，所述饲料或饲料添加剂包括权利要求1所述的地衣芽孢杆菌。