CN108251335B - 一种具有乳酸活性的粪肠球菌hkf7及其筛选培养方法和应用 - Google Patents

一种具有乳酸活性的粪肠球菌hkf7及其筛选培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有乳酸活性的粪肠球菌HKF7及其筛选培养方法和应用。本发明的菌株其分类命名为：(Enterococcus faecalis)HKF7，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2017297，保藏日期为2017年5月31日。该菌株是从海南热带养殖海水和海南热带活体凡纳滨对虾肠道中分离筛选获得的。本发明的粪肠球菌HKF7不具溶血活性，疏水活性好、自凝聚率高，人工胃肠液耐受能力、胆盐耐受能力，抑菌能力均较强，将本发明的粪肠球菌HKF7作为饲料添加剂投喂凡纳滨对虾，经过养殖试验验证它能够较好地提高机体免疫力，促进对虾生长，且效果稳定，为一种具有良好应用前景的菌株。

Description

一种具有乳酸活性的粪肠球菌HKF7及其筛选培养方法和应用
技术领域
本发明属于菌种领域，涉及一种粪肠球菌，更具体地说，本发明涉及一种具有乳酸活性的粪肠球菌HKF7及其筛选培养方法和应用。
背景技术
为了追求高效、快速的养殖效益，不断加大养殖密度，扩大养殖规模，导致水产动物生长速度下降，饵料系数增大，弧菌病等常见病害频发，并导致抗生素等化学渔药滥用。这不仅增加了养殖成本，而且对水产品的质量安全和人类健康构成了巨大威胁。因此，寻找一种高效、健康、安全的养殖方法已成为当前水产养殖技术的研究热点。
应用微生态制剂拌料投喂具有促进水产动物生长、提高免疫力、抑制病原菌生长、成本低、无再污染、等优点，已成为无公害水产动物健康养殖模式中的主要关注焦点之一。其中，乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是目前水产动物养殖拌料投喂中最常用的菌种之一，而粪肠球菌(Enterococcus faecalis)属于乳酸菌，是一种厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，对人和水产动物体及环境安全，能够大量产生乳酸、乙酸和甲酸，以及胞外水解酶类而促进水产动物对营养物质的消化吸收，也维持了水产动物消化道菌群的稳定，并且对环境具有较强的适应能力、能在水产动物肠道快速定值的细菌。乳酸菌具有提高水产动物免疫力作用，乳酸菌通过在水产动物肠道内定植，产生乳酸、各种酶、细菌素的小分子物质、过氧化氢以及降解氨基酸产生吡啶多胺衍生物这些物质能够刺激水产动物作出免疫应答，使水产动物处于免疫活跃的状态，从而提高水产动物的免疫能力。
乳酸菌对肠道菌群具有调节作用，水产动物的健康状况与肠道内的微生物具有密切关系，肠道中的微生物是水产动物内生态环境的重要组成部分，影响动物的许多机能。乳酸菌通过黏附素(S-层蛋白、脂磷壁酸、脂多糖、肽聚糖等)黏附在动物胃肠道的上皮细胞中并定植在宿主的肠道中，在肠道黏膜表面形成一道“生物膜”的屏障。“生物膜”屏障有效地阻挡了其他有害菌在肠道表面的定植，从而使动物的肠道有害菌减少，菌群生态更稳定。乳酸菌黏附或者定植胃肠道道中，在肠道中占位，对其他有害细菌在胃肠道中生存形成细菌干扰。乳酸菌产生的有机酸，主要为乳酸、乙酸、丙酸等能有效降低胃肠道的pH值，从而抑制了其他耐酸性不强的有害细菌在胃肠道中的存活。乳酸菌在胃肠道中产生的过氧化氢具有一定的杀菌作用。
乳酸菌能够合成维生素(叶酸、维生素B12等)、各种消化酶(蛋白酶等)、γ-氨基酸、胞外多糖(夹膜多糖等)、共轭亚油酸，这些乳酸菌分泌物或合成产物能提供动物一定的营养物质，有助于动物对营养物质的消化吸收，促进动物的健康生长。相关研究研究表明乳酸菌在水产应用方面取得显著效果，例如，Kongnum等研究表明，采用乳杆菌拌料投喂凡纳滨对虾6周后，对虾的免疫力增强，饲料转化率、增重率、成活率和对弧菌的抵抗力均得到提高。Dawood等研究表明，在饲料中添加乳杆菌和乳酸乳球菌投喂红鲷鱼56天，免疫指标和生长指标显著提升，饵料系数降低。苟小兰等研究发现，乳酸菌对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)等致病菌均有明显的抑制作用。不同生长环境的地衣芽胞杆菌菌株对应于本地环境下的养殖水体净化具有较好的效果，而对异地环境则经常表现出净化效果差，净化效果不稳定等特点。
目前，国内有关地乳酸菌微生态制剂的专利主要集中在肥料生产的发酵菌种和食品等方面，有关养殖饲料添加的粪肠球菌专利较少，未见关于乳酸乳球菌和粪肠球菌海南岛地理种群的相关专利。
发明内容
本发明针对背景技术中所指出的问题及现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供一种具有乳酸活性的粪肠球菌HKF7，本发明的另一目的在于提供上述所述粪肠球菌HKF7的筛选培养方法，本发明的还一目的在于提供上述所述粪肠球菌HKF7的应用，特别是将所述粪肠球菌HKF7用于养殖饲料添加剂投喂凡纳滨对虾。
为了实现本发明上述发明的第一个目的，本发明采用的技术方案为：一种具有乳酸活性的粪肠球菌HKF7，其分类命名为：(Enterococcus faecalis)HKF7，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCC NO:M2017297，保藏日期：2017年5月31日。
本发明所述的粪肠球菌HKF7，该菌株是从海南文昌养虾场水域和海南热带活体凡纳滨对虾肠道体内分别采集的海水样品和活体虾肠道样品中分离筛选获得的。所述粪肠球菌HKF7菌无血细胞溶解性，具有较好的疏水活性，较高的自凝聚率，安全性高，且此菌还具有较强的产酸能力、人工胃肠液耐受能力、较强的胆盐耐受能力和较强的拮抗致病菌能力：对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌均具有较强的抑制作用。将本发明所述的粪肠球菌HKF7作为饲料添加剂投喂凡纳滨对虾，经过养殖试验验证它还能够较好地提高机体免疫力，促进对虾生长，且效果稳定，为一种具有良好应用前景的菌株。
本发明上述所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HKF7还具有如下性质：
1、微生物学特征
粪肠球菌HKF7是革兰氏阳性菌，菌株在MRS培养基上菌落为乳白色、扁平、表面粗糙、湿润、边缘整齐，37℃培养24h后的菌落直径为2～4mm，菌落形态如图1所示。
2、16S rRNA分析
利用16S rRNA ITS序列的相应引物，上、下游引物序列各为：5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3ˊ和5ˊ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ˊ对粪肠球菌HKF7进行PCR扩增，测序后分别获得1422bp的片段，在GenBank的登录号为MF037702，该菌的16s rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
为了实现本发明的第二个目的，本发明提供一种上述所述粪肠球菌HKF7的分离筛选方法，所述方法主要包括以下步骤：
(1)样品采集
分别从海南文昌养虾场水域和海南热带活体凡纳滨对虾肠道体内采集海水样品和活体虾肠道样品，采集的海水样品取少量待用；将活体虾肠道样品放入灭菌生理盐水中，剪碎虾肠道，震荡混合成虾肠道混合液，取少量混合液待用，整个操作过程均在超净台上进行；
(2)样品菌株扩大培养
将步骤(1)所述待用的海水样品和虾肠道混合液分别接种至装有MRS液体培养基中，于30℃、180r/min，摇床中震荡培养24h；
(3)菌株初步分离
对菌株的分离和纯化采用平板划线法与涂布法相结合，取步骤(2)中培养后的菌液涂布至含0.5％～3％轻质CaCO3的MRS固体培养基中，于30℃恒温箱中培养48h，对长有菌落的平板进行观察，挑取有明显溶钙圈的菌株，划线至含0.5％～3％轻质CaCO3的MRS固体培养基，重复3以上次划线培养，直至平板上长出的菌落，形态特征完全一致，最终获得分离纯化的目的菌株；
(4)菌株产酸筛选保存
挑取步骤(3)所述分离纯化后的目的菌株，接着划线至含0.5％～3％轻质CaCO3的MRS固体培养基上，于30℃恒温箱中培养48h，用游标卡尺测量各菌株的溶钙圈大小，筛选溶钙圈较大的菌株，用50％甘油溶液保存于-20℃冰箱中。
进一步的，所述粪肠球菌HKF7接种量为0.5％～5％，pH值为6.8～8.0。
一种粪肠球菌HKF7在抑制溶藻弧菌生长中的用途。
一种粪肠球菌HKF7在制备微生态制剂中的用途。
一种微生态制剂，含有上述的粪肠球菌HKF7。
一种菌粉，是采用上述的粪肠球菌HKF7制备而成的。
上述微生态制剂作为水产养殖饲料添加剂的用途。
一种凡纳滨对虾饲料，含有上述粪肠球菌HKF7，所述粪肠球菌HKF7的活菌数为1×107～1×1010cfu/g。
进一步优选地，本发明上述所述的对虾饲料添加剂，含有上述粪肠球菌HKF7，所述粪肠球菌HKF7的活菌数为1×108cfu/g。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明提供的一种粪肠球菌HKF7无血细胞溶解性，具有较好的疏水活性，较高的自凝聚率和高安全性，且此菌还具有较强的产酸能力、人工胃肠液耐受能力、较强的胆盐耐受能力和较强的拮抗致病菌能力：对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌均具有较强的抑制作用，对溶藻弧菌的抑制效果最显著，而且本发明的粪肠球菌HKF7还能够较好地抑制动物体内细菌繁殖，提高机体免疫力，促进动物生长，其应用前景广泛，可以将其应用于微生态制剂，也可以将其制成菌粉，作为水产养殖饲料添加剂添加到饲料中，用来抑制动物体内致病菌生长，降低动物尤其是对虾的死亡率的同时能促进对虾生长，是一种应用前景非常广泛的益生菌种。
附图说明
图1是本发明粪肠球菌HKF7菌株在MRS固体培养基上的菌落形态图；
图2是本发明粪肠球菌HKF7菌株在显微镜下的形态图；
图3为本发明实施例4中粪肠球菌HKF7菌株溶血性能测试效果图；
图4为本发明实施例5中粪肠球菌HKF7疏水率测试结果图；
图5为本发明实施例6中粪肠球菌HKF7自凝集率测试结果图；
图6为本发明实施例7中粪肠球菌HKF7人工胃液的耐受性测试结果图；
图7为本发明实施例8中粪肠球菌HKF7人工肠液的耐受性测试结果图；
图8为本发明实施例11中粪肠球菌HKF7菌株投喂凡纳滨对虾在不同的投喂周期感染死亡率对照图。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
以下实施例所使用的培养基配方为：
本发明MRS培养基是参考《微生物培养基的制造与应用》方法制得的。
MRS液体培养基：
取蛋白胨10g，牛肉粉10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾5g，氯化钠5g，柠檬酸三铵5g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，吐温801.0g加蒸馏水1000ml溶解后121℃高压蒸气灭菌，置4℃冰箱备用。
MRS固体培养基：
取蛋白胨10g，牛肉粉10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾5g，氯化钠5g，柠檬酸三铵5g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，吐温801.0g加蒸馏水1000ml溶解后加入琼脂粉20g，121℃高压蒸气灭菌，置4℃冰箱备用。
本发明分离筛选方法采用的MRS固体培养基在上述MRS固体培养基配方基础上还添加了1％(V/W)的轻质碳酸钙(CaCO3)。
实施例1粪肠球菌HKF7的分离筛选方法，主要包括以下步骤：
(1)样品采集
从海南文昌养虾场水域采集海水样品，采集的样品取少量待用，整个操作过程均在净化超净台上进行；
(2)样品菌株扩大培养
取0.1mL步骤(1)所述采集的海水样品接种至装有MRS液体培养基离心管(10mL/50mL，V/V)中，每份样品1支管，于30℃、180r/min，摇床中震荡培养24h；
(3)菌株初步分离
对菌株的分离和纯化采用平板划线法与涂布法相结合，对步骤(2)中培养好的菌株，取0.1mL菌液涂布至MRS固体培养基(含1％轻质CaCO3，V/W，下同)中，于30℃恒温箱中培养48h，对长有菌落的平板进行观察，挑取有明显溶钙圈的菌株，划线至MRS固体培养基(含1％轻质CaCO3)，重复3以上次划线培养，直至平板上长出的菌落，形态特征完全一致，分离纯化目的菌株；
(4)菌株产酸筛选保存
挑取纯化后的菌株，接着划线至MRS固体培养基上(含1％轻质CaCO3)，于30℃恒温箱中培养48h，用游标卡尺测量各菌株的溶钙圈大小，筛选溶钙圈较大的菌株，用50％甘油溶液保存于-20℃冰箱中。
菌落特征：
粪肠球菌HKF7是革兰氏阳性菌，菌株在MRS培养基上菌落为乳白色，扁平，表面粗糙，湿润，边缘整齐，37℃培养24h后，菌落直径为2～4mm，菌落形态如图1所示。
MRS平板是乳酸菌专用筛选平板，和其他平板比更有利于乳酸菌的生长。无菌玻璃珠有利于肠道研磨得更充分，这样液体中的菌浓度更高，有利于筛选到更多有利微生物。重新划板有利于挑选活性更好的菌落，优化菌种。
实施例2粪肠球菌HKF7的分子鉴定。
为鉴定菌株，先采用扫描电镜观察细胞形态以及测试菌株的部分生理生化反应，显微图如图2所示，可以初步判断该菌株为粪肠球菌。
利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’，见SEQID No.2和下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，见SEQ ID No.3，对粪肠球菌HKF7的16srRNA基因片段进行PCR扩增，克隆并测序，测序后分别获得1422bp的片段，在GenBank的登录号为MF037702，经过测序得到该菌属于粪肠球菌，扩增片段的测序结果见SEQ ID No.1。
实施例3粪肠球菌HKF7的产酸能力测试。
产酸能力测试：先用接种环挑取初筛的目的菌株，将菌株无菌操作接种于MRS液体培养基中，然后于30℃培养箱中180rpm振荡培养24h，备用；配制MRS固体培养基(加1％轻质CaCO3)，每个培养皿倒20mL培养基，采用稀释后108cfu/mL的菌液100μL涂布于固体培养基上，将培养皿置于30℃培养箱中静置培养48h，用游标卡尺测量溶钙圈直径，每个样品设3个重复，取平均值，最终确定粪肠球菌HKF7溶钙圈直径达5.00～7.00mm，如图1所示，由图1溶钙圈直径大小可知，粪肠球菌HKF7产酸能力较强。
实施例4粪肠球菌HKF7溶血性能测试。
溶血性能测试：采用溶血培养基(马血)，将纯化后的菌株划线于血平板上，30℃培养箱静置培养48h，观察培养皿溶血情况。图3为溶血性能测试效果图，溶血性测试结果为血平板颜色无变化，无溶血活性，为γ溶血。
实施例5粪肠球菌HKF7疏水性能测试。
疏水性能测试：将初筛目标菌株于30℃、180r/min摇床中振荡培养24h。取菌液进行离心，温度为4℃，转速4000rpm离心10min。用PBS(pH＝7.4)溶液重悬并离心，重复两次。再用PBS溶液重悬，使菌液的OD600值约等于1.00；然后将等体积菌液与二甲苯混合，涡轮振荡2min，静置1h，取水相测定OD600值，计算出目的菌株的疏水率。疏水率的计算公式为：疏水率(％)＝[(A0-AT)]/A0]×100。
图4为本实施例粪肠球菌HKF7疏水性能测试结果图，由图4可知，粪肠球菌HKF7具有较好的疏水性能。
实施例6粪肠球菌HKF7自凝集性能测试。
自凝集性能测试：取4mL菌悬液于5mL试管，涡旋10s，常温静置，分别静置1h、2h、3h、4h、5h、10h后吸取1mL清液测定OD600值，结果计为A1、A2、A3、A4、A5、A6。自凝集(％)＝1-(At/A0)×100，At为1h、2h、3h、4h、5h、10h时OD600的吸光值，A0为混合前的OD600值。图5为本实施例粪肠球菌HKF7自凝集性能测试结果图，由图5可知，粪肠球菌HKF7具有较好的自凝集性能。
实施例7粪肠球菌HKF7的人工胃液耐受性测试。
测试方法如下：
1)培养目的菌株：用50mL/250mL(V/V)MRS液体培养基培养目的菌株，30℃、180r/min摇床中培养24h；
2)配置人工胃液：把氯化钠(0.5％)和胃蛋白酶(0.3mg/mL)加到灭菌的PBS溶液中，混匀分装，用1mol/L的HCl溶液调整pH至3.5，接着用0.22μm无菌滤膜过滤掉胃液中的杂菌；
3)制备目的菌悬液：首先将培养好的目的菌液，4000rpm离心10分钟，接着用PBS溶液洗涤并离心，重复2次，最后再用PBS溶液重悬为浓度109cfu/mL的菌液；
4)接种培养和活菌计数按5％接种量接种目的菌液至人工胃液中20mL/50mL(V/V)。30℃、180r/min摇床中培养，培养至0h、2h、4h时，进行活菌计数，计算目的菌株在不同人工胃液和不同培养时间下的存活率。
存活率(％)＝(Nt/N0)×100，其中：N0表示目的菌株培养0h时的活菌数，Nt表示不同培养时间的活菌数。
图6为本实施例粪肠球菌HKF7人工胃液的耐受性测试结果图。由图6可知，2h后的存活率为76.36％，4h后的存活率为98.81％。
实施例8粪肠球菌HKF7的人工肠液耐受性测试。
测试方法如下：
1)配置人工肠液，将胰蛋白酶(0.1mg/L)加入到灭菌的PBS溶液中，再用1mol/L的NaOH溶液调整pH至6.8，最后用无菌的0.22μm滤膜过滤人工肠液，除掉杂菌；
2)用制备好的菌悬液，按5％接种量接种目的菌液至人工肠液中20mL/50mL(V/V)。30℃、180r/min摇床中培养，培养至0h、2h、4h时，进行活菌计数。计算目的菌株在不同人工肠液和不同培养时间下的存活率。
存活率(％)＝(Nt/N0)×100，其中：N0表示目的菌株培养0h时的活菌数，Nt表示不同培养时间的活菌数。
图7为本实施例粪肠球菌HKF7人工肠液的耐受性测试结果图。由图7可知，2h后的存活率为131.82％，4h后的存活率为124.39％。
实施例9粪肠球菌HKF7的人工胆盐耐受性测试。
测试方法如下：
用50mL/250mL(V/V)MRS液体培养基培养目的菌株，30℃、180r/min摇床中振荡培养24h。配制成浓度为109cfu/mL菌悬液。配制含有0％、0.15％、0.3％、0.6％(W/V)胆盐的MRS液体培养基，装液量为20mL(20mL/50mL，V/V)。目的菌悬液以1％的接种量接种至含有胆盐的MRS液体培养基中，30℃、180r/min摇床中培养4h。采用平板计数法，检测目的菌株在不同胆盐浓度中培养4h后的活菌数，并计算出存活率。
存活率(％)＝(Nt/N0)×100，其中：N0表示菌株培养0h时的活菌数，Nt表示培养th后的活菌数，本实施例粪肠球菌HKF7胆盐耐受测试结果如表1所示。
表1粪肠球菌HKF7菌株在不同胆盐浓度下培养4h后的成活率情况表
Figure BDA0001551287580000081
Figure BDA0001551287580000091
从表1中可以得出，乳酸乳球菌HKF7在浓度为0.15％～0.3％胆盐溶液中培养4h后，依然能存活，说明能够在高胆盐浓度条件下存活，具有一定胆盐耐受性。
从实施例7～9的测试结果可以看出，本发明的粪肠球菌HKF7的抗逆性较强，可以耐受人工胃液，人工肠液，人工胆盐，因此可以作为水产养殖饲料添加剂使用，能够保证大量的菌体顺利通过动物的肠道，在肠道中存活，发挥其益生功能。
实施例10粪肠球菌HKF7的拮抗实验。
测试方法如下：
1)准备平板：采用琼脂平板扩散法进行拮抗试验，配制2216E海水固体培养基，高温高压灭菌121min，冷却至40～45℃。分别往培养基中加入4％指示菌株的菌液，指示菌株为哈维氏弧菌、无乳链球菌(使用BHI固体培养基培养)、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌，菌液浓度为6.0×108cfu/mL。混合均匀，倒平板，每个平板倒培养基20mL。制成接种有不同指示菌株的平板；
2)打孔加拮抗菌株：采用无菌打孔器(口径5mm)进行打孔，每个平板打5个孔。往孔中加入50μL粪肠球菌HKF7，同一个平板的不同孔中分别加入粪肠球菌HKF7，1个孔加入无菌生理盐水作对照；
3)恒温箱培养：把加有拮抗菌的平板放入30℃恒温箱中正置培养24h，每个实验3个重复，取平均值；
4)抑菌圈测量：用游标卡尺测量抑菌圈，与对照孔有较明显的圈即为抑菌圈，测量抑菌圈直径，按照抑菌圈的大小评估其抑菌效果。
本实施例粪肠球菌HKF7抑菌测试结果如表2所示。粪肠球菌HKF7对水产养殖中几种常见的致病菌哈维氏弧菌、迟缓爱德华菌、溶藻弧菌具有明显的抑菌圈，说明粪肠球菌HKF7对这几种致病菌均具有较好的抑菌效果。
表2粪肠球菌HKF7菌株抑菌结果
Figure BDA0001551287580000101
实施例11将粪肠球菌HKF7作为饲料添加剂饲养凡纳滨对虾的应用实施例。
实验方法：
(1)取12个200mL养殖水槽，设4组，分别为粪肠球菌HKF7低浓度组(1×107cfu/g)、HKF7中浓度组(1×108cfu/g)、HKF7高浓度组(1×109cfu/g)、阴性对照组(0.9％生理盐水)，每个组3个重复，水体盐度20～22，放养规格为体重0.73±0.20g，体长4.30±1.20cm虾苗，每个养殖水槽放养45尾，拌料投喂60天，每14天随机从每组养殖水槽中抽取10尾虾，肌肉注射方法进行人工感染弧菌试验，具体投喂参数见表3，并测量计算虾的终体重(finalweight)、终体长(final length)、饵料系数、增重率(Weight gain rate)、特定生长率(specific Weight gain rate SGR)、成活率(survival rate SR)具体结果见表4；
(2)投喂与日常管理：根据试验设计，使用拌料浓度为1×107cfu/g、1×108cfu/g、1×109cfu/g饲料进行投喂，每天4次，投喂时间及投喂量分别为：6：30(1％)、12:00(0.5％)、18:00(1.5％)、23:00(1％)，投喂周期为60天，每两天换水30％，盐度为20～22，溶解氧含量6.5mg/L以上，水温28～30℃，pH值为7.5～8.2。
本实施例粪肠球菌HKF7菌株投喂凡纳滨对虾各实验组参数表参见表3，对虾生长情况见表4，另外，本实施例对虾在不同的投喂周期感染死亡率的情况见图8。
从表4可知，粪肠球菌HKF7组的对虾的饵料系数明显低阴性组的增长率(WGR)、特定生长率(SGR)终体重、终体长均高于阴性对照组，低于阳性对照组，表明粪肠球菌HKF7拌料投喂对促进对虾生长具有良好效果。
从图8中可以看出，在60天的投喂试验中，在投喂的第15天和第30天，对虾死亡率较平稳；投喂第45天对虾感染死亡率下降较为明显，且低于阴性对照组，说明粪肠球菌HKF7拌料投喂对虾对促进对虾生长具有良好效果。
表3粪肠球菌HKF7菌株投喂凡纳滨对虾各实验组参数表
Figure BDA0001551287580000111
表4粪肠球菌HKF7菌株不同拌料浓度投喂凡纳滨对虾各实验组生长指标表
Figure BDA0001551287580000112
注：a，b，c为同一列数据的差异性，(α＝0.05)。
Note:a,b,c for the same,the difference of the column data,(α＝0.05).
序列表
<110> 海南大学
<120> 一种具有乳酸活性的粪肠球菌HKF7及其筛选培养方法和应用
<130> 无
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 粪肠球菌(Enterococcus faecalisHKF7)
<400> 1
cagtcgaacg cttctttcct cccgagtgct tgcactcaat tggaaagagg agtggcggac 60
gggtgagtaa cacgtgggta acctacccat cagaggggga taacacttgg aaacaggtgc 120
taataccgca taacagttta tgccgcatgg cataagagtg aaaggcgctt tcgggtgtcg 180
ctgatggatg gacccgcggt gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggccac 240
gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcg gcaatggacg aaagtctgac cgagcaacgc 360
cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta aaactctgtt gttagagaag aacaaggacg 420
ttagtaactg aacgtcccct gacggtatct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc 540
gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600
aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct ggtctgtaac tgacgctgag 720
gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agcaaacgca ttaagcactc 840
cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960
tttgaccact ctagagatag agctttccct tcggggacaa agtgacaggt ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt 1080
gttagttgcc atcatttagt tgggcactct agcgagactg ccggtgacaa accggaggaa 1140
ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200
gggaagtaca acgagtcgct agaccgcgag gtcatgcaaa tctcttaaag cttctctcag 1260
ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat gaagccggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320
gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gccggtcaca ccacgagagt 1380
ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttggagcca gc 1422
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 扩增粪肠球菌(Enterococcus faecalisHKF7上游引物)
<400> 2
agagtttgat cctggctca 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 扩增粪肠球菌(Enterococcus faecalisHKF7下游引物)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

1.一种具有乳酸活性的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）HKF7，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2017297，保藏日期：2017年6月12日，所述粪肠球菌HKF7的 16S rRNA 基因序列如 SEQ ID No：1 所示。
2.根据权利要求1所述的粪肠球菌HKF7在制备微生态制剂中的用途。
3.一种微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂含有权利要求1所述的粪肠球菌HKF7。
4.权利要求3所述的微生态制剂制备水产养殖饲料添加剂的用途。
5.一种菌粉，其特征在于：所述菌粉是采用权利要求1所述的粪肠球菌HKF7制成的。
6.一种凡纳滨对虾饲料，其特征在于：所述饲料中含有权利要求1所述的粪肠球菌HKF7，所述粪肠球菌HKF7的活菌数为1×107～ 1×1010cfu/g。
7.根据权利要求6所述的凡纳滨对虾饲料，其特征在于：所述粪肠球菌HKF7的活菌数为1×108cfu/g。
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