CN109679869B - 一种对虾肠道肠球菌菌株及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对虾肠道肠球菌菌株及其筛选方法和应用，特点是该菌株为NBU1菌株，分类命名为肠球菌（Enterococcussp.），于2018年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16735，该菌株在制备金黄色葡萄球菌抑制剂和/或鳗弧菌抑制剂中以及在制备对虾养殖用益生菌添加剂中的应用，优点是对金葡萄球菌和鳗弧菌都具有较好的抑制作用，经和饲料发酵后饲养对虾可以提高对虾产量、成活率和饲料转化率，并可改善生病对虾的产量和成活率，可以作为一种高效绿色的饲料添加剂和抗生素替代品用于水产动物养殖中。

Description

一种对虾肠道肠球菌菌株及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及一株肠球菌及其应用，尤其涉及一种对虾肠道肠球菌菌株及其筛选方法和应用。
背景技术
对虾养殖一直是我国水产养殖的一个重要支撑产业之一。但是，随着对虾养殖集约化程度的提高，导致对虾疾病频发，极大地制约了我市对虾养殖产业的发展。目前并无有效快速的方法防治对虾疾病，人们通常采用抗生素、化学合成药物等防治水产动物疾病。而长期、大量使用抗生素容易造成南美白对虾耐药性的产生，自身的免疫机能下降，而且容易造成病原菌的变异，产生许多耐药性菌株，为南美白对虾病害的防治埋下隐患。为了解决南美白对虾养殖过程中滥用抗生素造成的问题，寻求一种绿色、安全、无公害的防治病害的方法的研究成为热点，其中通过微生物的方法来提高对虾的免疫机能，达到病害防控的方法受到很多研究者的关注，成为解决南美白对虾病害以及安全性问题的有效途径。
乳酸菌是一类无芽孢、革兰氏染色呈阳性、可发酵碳水化合物（主要指葡萄糖）产大量乳酸的益生菌的总称。乳酸菌能够调节机体肠道正常菌群，保持微生态平衡，提高食物消化率，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌的生长繁殖，从而对机体的生长发育有重要作用。它作为一种益生菌，不但可作为水产动物的饲料添加剂，而且可作为改善水质的微生物调控剂，应用于水产养殖中。但市场上的水产用乳酸菌制剂种类繁杂，有效成分难以证实，且大多都是从环境、土壤、泡菜和酸奶等中分离出来。这些乳酸菌制剂应用于水产养殖中，不一定能尽快成为优势菌并发挥作用。对虾水产养殖动物的养殖水体及其肠道本身是筛选对虾益生菌的重要资源。随着高通量测序技术的广泛应用，发现乳酸菌在多种水产养殖动物中为优势菌群，并可作为宿主健康的指示菌。因此，从对虾肠道分离和筛选出丰度较高的乳酸菌菌株，并应用于对虾养殖，对对虾高密度及健康生态养殖具有重大意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对金黄色葡萄球菌和鳗弧菌具有抑制作用的对虾肠道肠球菌菌株及其筛选方法和应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种对虾肠道肠球菌菌株，该菌株为NBU1菌株，分类命名为肠球菌（Enterococcussp.），于2018年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16735。
该菌株为革兰氏阳性菌，在MRS琼脂培养基上37℃培养24 h，菌落为乳白色，菌体卵圆形；该菌株在 MRS肉汤培养基中培养6 h时，OD600值显著增加，9 h时达到稳定，且此时培养基pH值显著下降，该菌株可以生产酸性物质。
所述的MRS肉汤培养基配方为：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵 2.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠 5.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，硫酸镁 0.58 g，硫酸锰 0.25 g，蒸馏水 1000 mL，pH 6.8～7.0；所述的MRS琼脂培养基为在MRS肉汤培养基中加入MRS肉汤培养基质量18%的琼脂。
上述对虾肠道肠球菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：
（1）乳酸菌的分离纯化
在无菌超净台上，用灭菌牙签挑取活虾肠道装入灭菌的EP管中，加入高压灭菌的PBS缓冲液，剧烈震荡30 s后置于28℃、180 rpm摇床震荡培养30 min；取适量培养后的培养液进行稀释后，均匀涂布于MRS固体培养基上，28℃倒置培养2-3天；用无菌接种环挑取单菌落，继续在MRS平板上纯化培养2次，而后加入无菌甘油保种于-80℃；
（2）抑菌试验
将分离的得到的菌株活化后，用MRS培养基于28℃培养过夜，然后测定OD600并将其OD值调节到0.6-0.8待用；指示菌金黄色葡萄球菌或鳗弧菌用LB或MB培养基于30℃培养过夜，然后与含1.0wt% Agar的LB或MB培养基混合，使其OD600值为0.1，混合均匀后倒入一次性培养皿制作含病原菌的培养基平板，在超净台上风干30 min后，取5 μL待测菌液滴入平板上，待菌液风干后，于30℃培养24 h后测定抑菌圈大小，选取对金黄色葡萄球菌和/或鳗弧菌具有较好抑制作用的菌株，采用16S rDNA测序对该菌株进行鉴定，将该菌株命名为肠球菌（Enterococcussp.），于2018年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16735。
上述对虾肠道肠球菌菌株在制备金黄色葡萄球菌抑制剂和/或鳗弧菌抑制剂中的应用。
上述对虾肠道肠球菌菌株在制备对虾养殖用益生菌添加剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种对虾肠道肠球菌菌株及其筛选方法和应用，该菌株从对虾肠道中分离得到，此菌生长旺盛，培养9 h时其OD600值达到1.8左右；该菌株还具有抑菌活性，尤其对对虾细菌性疾病中常见的弧菌具有较好的抑制作用；使用该菌株作为对虾养殖的益生菌添加剂，可以提高对虾的生长和抗病能力；因此肠球菌NBU1在水产动物养殖，尤其是对虾新型绿色饲料添加剂开发和抗生素代替品等研究上具有重大的经济价值。
对虾肠道肠球菌菌株，该菌株为NBU1菌株，分类命名为肠球菌（Enterococcussp.），于2018年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16735，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为肠球菌NBU1对金葡萄球菌和鳗弧菌形成抑菌圈；图中A为金葡萄球菌抑菌圈，B为鳗弧菌抑菌圈；
图2为肠球菌NBU1随培养时间的pH值变化和OD600值变化；
图3为根据肠球菌NBU1菌株16S rDNA序列构建的聚类树；
图4为添加NBU1菌株的对虾的单位产量（A），存活率（B）和饲料转化率（C）；
图5为添加NBU1菌株可以增加病虾的末产量（A）和成活率（B）。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
1. 本发明菌株的分离纯化
在无菌超净台上，用灭菌牙签挑取活虾肠道装入灭菌的2 ml EP管中，加入高压灭菌的1.5 ml PBS缓冲液（pH 7.0），剧烈震荡30 s后置于28℃、180 rpm摇床震荡培养30min；取适量培养后的培养液进行梯度稀释（10-2、10-3、10-4、10-5），均匀涂布于MRS固体培养基上，28℃倒置培养2-3天；用无菌接种环挑取单菌落，继续在MRS平板上纯化培养2次，而后加入20%的无菌甘油保种于-80℃。
2.本发明菌株的抑菌作用
将分离的得到的菌株活化后，用MRS培养基于28℃培养过夜，然后测定OD600并将其OD值调节到0.6-0.8待用。指示菌金黄色葡萄球菌或鳗弧菌用LB或MB培养基于30℃培养过夜，与含1.0wt% Agar的LB或MB培养基混合，使其OD600值为0.1，混合均匀后倒入一次性培养皿制作含病原菌的培养基平板，在超净台上风干30 min后，取5 μL待测菌液滴入平板上，待菌液风干后，于30℃培养24 h后测定抑菌圈大小，发现菌株NBU1对两种病原菌具有较好的抑制作用（如图1所示），以下采用16S rDNA测序对该菌株进行鉴定。
本发明菌株在MRS琼脂培养基上37℃培养24 h，菌落为乳白色，菌体卵圆形。如图2所示，该菌株在MRS肉汤培养基中培养6 h时，OD600值显著增加，9 h时达到稳定，且此时培养基pH值显著下降，说明该菌株可以生产酸性物质。
本发明中所用的LB培养基配方为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.0；所用的MB培养基配方为商用的2216E培养基（Difco™ Marine Broth2216）：称取37.4 g溶于1000 ml蒸馏水中，调节pH为7.6。
3.本发明菌株的鉴定
16S rDNA 基因的PCR扩增：将筛选出的菌株NBU1用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用引物为：27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'。
PCR反应体系为(20μl)：模板2 μl，kodaq2×PCR MasterMix (Cat. No. G497，abm，Canada)10 μl，引物1 0.5 μl，引物2 0.5 μl，ddH2O 7 μl。
PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR在1.5wt%琼脂糖凝胶上进行电泳，其条带为1500 bp 左右。然后割胶回收纯化后送上海生工公司测序，测得16S rDNA序列为1413 bp。将该序列提交到EZBioCloud比对后发现，该菌株与模式菌株Enterococcus lactis BT159(T)菌株的相似度高达99.8%，因此将该NBU1菌株命名为Enterococcussp.NBU1。该菌株的16S rDNA聚类树见附图3。
实施例2
本实验是在浙江省温州海洋水产养殖研究所永兴基地进行，共设置10个600L（直径1m，高度0.8m）凡纳滨对虾养殖生态实验桶，其中5个桶用作对照，5个用作肠球菌NBU1添加组。统一投放虾苗，每个实验桶放苗210 尾（平均体长为7.08±0.33 cm，平均体重为4.34±0.64 g），养殖密度为500 尾/m3，放苗2天后正式开始实验。菌剂活化与添加：取保存菌株在MRS固体培养基上划板活化，待单菌落长出后，挑取单菌落于10 mL无菌MRS肉汤培养基中培养过夜，然后以2%（V/V）的比例转接于新鲜的MRS肉汤培养基中培养24 h，此时菌液浓度达1×108~5×108 CFU/mL，且pH稳定在5.5-5.8之间，得到肠球菌NBU1菌液。处理组中每千克饲料喷洒200 mL肠球菌NBU1菌液接种，然后将掺入肠球菌的饲料在30℃下气密孵育12 h，对照组每千克饲料喷洒200 mL无菌MRS肉汤培养基。每天投饵量占体重的4 %，平均分三次投喂，分别是早上7:00、中午12:00和下午5:00。实验周期为28天，实验结束后测定对虾的产量，存活率和饲料转化率。研究发现，使用肠球菌组的单位产量和存活率分别比对照组高10.2%和16.1%，而饲料转化率比对照组低6.2%（附图4）。
实施例3
本实验在咸祥水产养殖基地完成，采用规范一致的养殖桶（600L）系统，该系统配备一致的增氧、排换水等装置。选取生病虾苗，规格为2~3 cm，每桶200尾左右（保证添加的总重量一致）。分别设置对照组和NBU1添加组，添加方法为：肠球菌NBU1用MRS培养基培养至菌液浓度的OD600的吸光值约为1.0时，取20g蔗糖加入200 ml菌液，然后取总量5%的菌液搅拌饲料，发酵1h后投喂，其余95%菌液活化后泼洒到养殖桶中，对照菌液用无菌培养基代替。每组设置5个重复。日投喂3次（7:00、12:00、17:00），初始日投喂量占对虾重10%。养殖1个月后测定对虾末重量及其成活率发现，添加NBU1组每桶的末重量比对照组高18.2%，存活率比对照组高29.3%（附图5）。说明添加NBU1可以改善生病对虾的产量和成活率。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 一种对虾肠道肠球菌菌株及其筛选方法和应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 27F
<400> 1
5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 1492R
<400> 2
5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3' 19
<210> 3
<211> 1413
<212> DNA
<213> 菌株NBU1 基因序列
<400> 3
CAGTCGTACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTT 1413

Claims (3)

1.一种对虾肠道肠球菌菌株（ Enterococcus sp. ） ，其特征在于：该菌株为NBU1菌株，分类命名为肠球菌(Enterococcus sp.)，于2018年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16735。
2.一种权利要求1所述的对虾肠道肠球菌菌株在制备金黄色葡萄球菌抑制剂和/或鳗弧菌抑制剂中的应用。
3.一种权利要求1所述的对虾肠道肠球菌菌株在制备对虾养殖用益生菌添加剂中的应用。
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